Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia preparatu enzymatycznego, sluzacego do otrzy¬ mywania kwasu 6-aminopenicylanowego przez hydrolize benzylopenicyliny. Kwas 6-aminopenicy- lanowy jest podstawowym pólproduktem przy otrzymywaniu penicylin pólsyntetycznych.Enzymatyczna hydrolize penicylin naturalnych do kwasu 6-aminopenicylainowego prowadzono do¬ tychczas przy uzyciu calych komórek drobnoustro¬ jów — producentów amidazy penicylinowej (bio¬ masy) lub tez przy uzyciu enzymu wyodrebnione¬ go z tych komórek, oczyszczonego i ewentualnie przeprowadzonego w odpowiedni preparat enzy¬ matyczny przez immobilizacje na nosniku, naj¬ czesciej polimerycznym. Pierwsza z tych metod daje produkt zanieczyszczony substancjami wy- sokoczasteczkowyim, glównie bialkami, które uwal¬ niaja sie z komórek drobnoustroju i powoduja odczyny alergiczne. Natomiast stosowanie prepa¬ ratów amidazy penicylinowej immobilizowanej na nosnikach, jakkolwiek umozliwia otrzymanie czy¬ stego produktu, jest kosztowne ze wzgledu na skomplikowany proces wydzielania i oczyszczania enzymu.Problem ten zostal rozwiazany przez opracowa¬ nie metody hydrolizy penicyliny przy uzyciu ca¬ lych komórek drobnoustroju wytwarzajacego amidaze penicylinowa, unieruchomionych na po¬ limerycznym nosniku.W polskim opisie patentowym nr 94 936 przed¬ stawiano sposób unieruchamiania komórek drobno¬ ustrojów produkujacych enzymy, polegajacy na tym, ze komórki kontaktuje sie ze zdolnym do 5 polimeryzacji monomerem etylenowym, posiada¬ jacym grupe reaktywna wzgledem zawartych w komórkach grup aminowych, hydroksylowych i sulfonowych (na przyklad grupe epoksydowa, chlorowcokarbonylowa, chlorowcometylokarbony- io Iowa). Nastepnie zwiazany z komórka monomer polimeryzuje sie lub kopolimeryzuje w obecnosci monomeru sieciujacego, korzystnie metylenobis-a- kryloamidu i ukladu inicjujacego, oraz poddaje dzialaniu wielofunkcyjnego reagenta sieciujacego, 15 korzystnie aldehydu glutarowego, celem zmniej¬ szenia strat enzymu z komórek.Z publikacji T. Sato, T. Tosa, I. Chibata, Europ.J. Applied Microbiol. 1976, 2, 153, znane jest otrzymywanie komórkowego preparatu enzyma- 20 tycznego przez polimeryzacje akryloamidu w za¬ wiesinie komórek Escherichia coli w obecnosci metylenobis-akryloamidu jako srodka sieciujacego.Pomimo to istnieje nadal potrzeba podniesienia oplacalnosci procesu enzymatycznej hydrolizy 25 penicyliny. Mozna to osiagnac przez przedluzenie okresu stosowania preparatu enzymatycznego i zmniejszenia strat jego aktywnosci oraz przez wprowadzenie bardziej ekonomicznych, ciaglych metod prowadzenia samej hydrolizy (zwlaszcza 30 metody fluidalnej). W tym celu konieczne jest126 358 wytwarzanie preparatu enzymatycznego o odpo¬ wiednich wlasciwosciach fizykochemicznych.Z polskiego opisu patentowego nr 102 256 znany jest preparat enzymatyczny, otrzymywany z wy¬ odrebnionej z komórek drobnoustroju i oczyszczo¬ nej amidazy penicylinowej, immobilizowanej na zelu poliakryloamidowym usieciowanym za pomo¬ ca dwualttlodwuamidów kwasów dwukarboksylo- wych, przy czym enzym jest trwale zwiazany z zelem dzieki uzyciu bezwodnika nienasyconego kwasu dwukarboksylowego. Wyodrebniony i oczy¬ szczony enzym poddaje sie reakcji z bezwodnikiem nienasyconego kwasu dwukarboksylowego i tak otrzymany, zmodyfikowany enzym poddaje sie po¬ limeryzacji w -ukladzie akryloamid/dwualMlodwu- amid kwasu dwukarboksylowego. Wytrzymalosc mechaniczna i ehemiczna tego preparatu jest do¬ bra, lecz jeszcze nie wystarczajaca do prowadze¬ nia ciaglej hydrolizy penicyliny w ukladzie flui¬ dalnym, najbardziej dogodnym w skali przemy¬ slowej. Preparat ten jest przy tym dosc kosztowny ze wzglejdu na koniecznosc wyodrebniania i oczy¬ szczania enzymu.W wyniku przeprowadzonych badan opracowa¬ no sposób wytwarzania nowego, komórkowego pre¬ paratu enzymatycznego, sluzacego do otrzymywa¬ nia kwasu 6-aminopenicylanowego przez hydrolize benzylopenicyliny w srodowisku wodnym przy wartosci pH 6,0—0,0. Preparat ten posiada bardzo korzystne wlasciwosci, pozwalajace na prowadze¬ nie hydroHzy w ukladzie fluidalnym, a koszt jego wytwarzania jest niewielki.Sposób wedlug wynalazku polega ha tym, ze cale komórki drobnoustroju produkujacego ami¬ daze penicylinowa, zwlaszcza komórki Escherichia coli, knmobilimje sie w zelu poliakryloamidowym usieciowanym za pomoca dwuatlilodwuamidu kwa¬ su dwukarboksylowego, korzystnie dwuallilodwu- amidu kasu winowego lub kwasu makmowego, i poddaje dzialaniu aldehydu glutarowego.Preparat enzymatyczny otrzymywany sposobem wedlug wynalazku rózni sie od preparatu przed¬ stawionego w polskim opisie patentowym nr 102256 uzyciem calych, nienaruszonych komórek drobnoustroju produkujacego enzym zamiast wy¬ odrebnionego i oczyszczonego enzymu. Cale ko¬ mórki drobnoustroju zawieraja, oprócz zadanego enzymu, takze duza ilosc innych zwiazków che¬ micznych o róznorodnym charakterze, a ponadto otoczone sa blona komórkowa. Jest wiec oczywiste, ze charakter polimerycznych preparatów enzyma¬ tycznych, otrzymanych przy uzyciu wyodrebnione¬ go enzymu lub przy uzyciu nienaruszonych ko¬ mórek, Jest odmienny. Róznica pomiedzy calymi komórkami drobnoustroju i czasteczkami wyod¬ rebnionego enzymu pociaga za soba równiez róz¬ nice metod chemicznych, stosowanych dla' unie¬ ruchomienia enzymu w nosniku poMmerycznym.W sposobie wedlug polskiego opisu patentowego nr 102256 konieczne Jest uprzednie zmodyfikowa¬ nie enzymu przez poddanie go reakcji z bezwod¬ nikiem nienasyconego kwasu dwukarboksylowego.Dopiero tak otrzymany zmodyfikowany enzym mozna poddac procesowi poMmeryzacjL Natomiast 20 25 30 w sposobie wedlug wynalazku komórki drobno¬ ustroju, zawierajace enzym, mozna poddawac poli¬ meryzacji bez uprzedniego przeksztalcenia che¬ micznego i przeprowadzenia w postac zmodyfiko- 5 wana. Obróbka chemiczna za pomoca aldehydu glutarowego, stosowana w qpasobde wedlug wy¬ nalazku, moze byc prowadzona zarówno przed pro¬ cesem polimeryzacji, jak i po nim. Ma ona na celu zmniejszenie strat bialka, lecz nie jest ko- 10 nieczna dla przeprowadzenia polimeryzacji.Immobilizowane komórki drobnoustroju wytwa¬ rza sie przez polimeryzacje akryloamidu i czyn¬ nika sieciujacego jako uklad katalizator — incja- tor stosuje sie zwiazki, uzywane zazwyczaj w tego w typu reakcjach; korzystnie stosuje sie ropuszczal- ny w wodzie nadsiarczan (np. nadsiarczan sodu) i N^^N^^tetrameltyaoetylenodwuamine.Uzycie dwuallilodwuamidu kwasu dwukarboksy¬ lowego jako srodka usieciowujacego poiiakryto- amid jest korzystniejsze od stosowanie metyleno- bis-akryloamidu, poniewaz uzyskany usieciowany zel poUakrytoamidowy lepiej nadaje sie do pro¬ wadzenia reakcji hydrolizy penicyliny w ukladzie fluidalnym. W doswiadczeniach z róznymi zelami zaobserwowano, ze zele poliakryloamidowe, usie- ciowane za pomoca dwiuaMilodwuamidu kwafru winowego (DATA) i dwuallilodwuamidu kwasu malonowego (DAMA) w warunkach fluidacji zwie¬ kszaja o kilkadziesiat procent swoja objetosc po¬ zorna przy identycznej | szybkosci objetosciowej plynu w porównaniu z zelem otrzymanym z me- tyleno-bis-akryloamidu (BIS) (rys 1). Jesli chodu o równomiernosc przeplywu plynu przez fluidalna M zawiesine zeli, to najlepszy zel uzyskany z DAMA, dla którego jednakowej szybkosci objetosciowej przeplywu stwierdzono najmniejsza szybkosc linio¬ wa przeplywu przez zawiesine fluidalna (rys.2).Proces polimeryzacji mozna prowadzic w srodo- ^ wisku wodnym w atmosferze azotu. Uzyskany zel przeciera sie przez sito, kroi lub rozdrabnia w in¬ ny sposób w celu uzyskania czastek o odpowied¬ nich rozmiarach. Polimeryzacje mozna prowadzic równiez w dwufazowym ukladzie wodno-organicz- tt nym, przy czym ciezar wlasciwy fazy organicznej powinien byc zblizony do ciezaru wlasciwego fazy wodnej. Korzystnie faze organiczna stanowi roz¬ twór chlorowanych weglowodrów w weglowodo¬ rach aromatycznych lub alicyklkznych, a zwlaszcza M roztwór chloroformu lub czterochlorku wegla w cykloheksanie lub toluenie. Uzyskany zel ma wów¬ czas postac malych, okraglych kuleczek i nie wy¬ maga dalszego rozdrabniania. Dodatek srodków powierzchniowo czynnych, rozpuszczalnych w roz¬ puszczalnikach organicznych, takich jak np. olei- nian sorbitolu, znany w handlu pod nazwa Span 80, umozliwia powstawanie kuleczek o odpowied¬ niej srednicy i zapobiega ich zlepianiu sie. Ko¬ rzystne jest równiez przemywanie komórek drob¬ noustroju przed polimeryzacja roztworami o wyso¬ kiej sile jonowej, co takze zapobiega zlepianiu sie powstajacych kuleczek zelu podczas gwaltownej polimeryzacji.Istotna cecha sposobu wedlug wynalazku jest traktowanie hnmobilizowanych komórek drobnou- 55f 126 358 stroju /idehydem glutarowym, co zapobiega szyb¬ kiemu jiwamianiu sie bialka or^z amidazy penicy¬ linowej z otrzymanego zelu podczas inkubacji w roztworach buforowych. W tym celu zel wytrzasa sie w buforowanym roztworze aldehydu gluta-ro- wego, a Yiastepnie przeplukuje. Po -takiej operacji stabilnosci termiczna amidazy w immobilizowanych komórkach znacznie wzrasta, a ilosc bialka, uwal¬ nianego podczas inkubacji w temperaturze 37°C, jest znikor^a. Zamiast obróbki zelu aldehydem glu¬ tarowym :hozna traktowac tym zwiazkiem zawie¬ sine komórek przed immobilizacja, co przedstawio¬ no na rys. 2.Otrzymany zel wykazuje 60—70^/0 aktywnosci a- midazy penicylinowej w stosunku do aktywnosci zawiesiny komórek, uzytej do immobilizacji. Przez oznaczenie absolutnej ilosci enzymu metoda mia¬ reczkowania za pomoca fenylometylosulfonylofluor- ku (3hvyadas et al., Bioorganiczeskaja Chimia 1977, 3, 546—554) stwierdzono, ze immobilizowane ko¬ mórki zawieraja 70—80f/o amidazy w porównaniu z iloscia enzymu w komórkach uzytych do immobili- zacjL Immobilizowane komórki Escherichia coli zacho¬ wuja nie zmieniona aktywnosc amidazy penicyli¬ nowej przy wielotygodniowym przechowywaniu w chlodni, natomiast ogrzewane w temperaturze 37°C w buforze fosforanowym przy wartosci pH 7,8 w ciagu trzech tygodni traca okolo 40^/i aktywnosci, co przedstawiono na rys. 3.Hydrolize benzylopenicyliny przy uzyciu prepa¬ ratu enzymatycznego, otrzymywanego sposobem we¬ dlug wynalazku, prowadzi sie w temperaturze o- kolo 37°C i przy wartosci pH wynoszacej korzyst¬ nie okolo 7,8, która to wartosc utrzymuje sie, do¬ dajac porcjami lub w sposób ciagly alkalia. Jako substrat stosuje sie latwo rozpuszczalna w wodzie sól benzylopenicyliny, zwlaszcza sól potasowa.Reakcje hydrolizy mozna prowadzic w ukladzie stacjonarnym, mieszajac granulki zelu w roztworze soli penicyliny. Korzystniejsze jest jednak prowa¬ dzenie procesu w sposób ciagly, a zwlaszcza w ukladzie fluidalnym ze wzgledu na opisane powy¬ zej wlasciwosci zelu. W przypadku tej ostatniej metody szczególnie dogodne jest stosowanie zelu w postaci granulek, a zwlaszcza kuleczek. Zawie¬ sine granulek zelu utrzymuje sie w stanie flui- dyzacji przez odpowiedni, stosunkowo szybki prze¬ plyw buforowanego roztworu penicyliny. Kulisty ksztalt granulek zelu zmniejsza ich podatnosc na scieranie i ulatwia ich utrzymanie w stanie jed¬ norodnej zawiesiny w reaktorze fluidalnym.Sposób wedlug wynalazku jest objasniony na¬ stepujacymi przysiadami.Przyklad I: Otrzymywanie immobilizowa- nych komórek Escherichia coli, szczep nr 271, w postaci kuleczek zelu.Komórki Escherichia coli szczep nr 271, wydzie¬ lone z hodowli przez wirowanie, przemywa sie dwukrotnie sola fizjologiczna, po czym zawiesza w 4 otojetosciach 1 M NaCl w 0,05 M buforze fo¬ sforanowym o wartosci pH 5,8 i miesza w tempe¬ raturze 25°C przez 30 minut. Uzyskana po odwi¬ rowaniu biomase ponownie miesza sie z buforowa¬ nym roztworem NaCl, a po odwirowaniu przemy¬ to 16 20 25 35 40 45 50 55 wa 0,1 M buforem fosforanowym o wartosci pH 5,8 i zawiesza w 1 objetosci tego buforu.Otrzymywanie fazy wodnej. Do 3 cm1 otrzyma¬ nej zawiesiny komórek o aktywnosci amidazy pe¬ nicylinowej okolo 10 j/g wkrapla sie 1 cm1 3^/t roztworu nadsiarczanu amonu i miesza w tempera¬ turze 0°C przez 30 minut. Nastepnie do zawiesiny wkrapla sie 2 cm1 roztworu 45^/t akryloamidu i 4,5f/t dwuallilodwuamidu kwasu malonowego w 0,1 M buforze fosforanowym o wartosci pH 5,8.Otrzymywanie fazy organicznej. Faza organiczna sklada sie z czterochlorku wegla i cykloheksanu w stosunku 35:65 (v/v) z dodatkiem 3§/e srodka po¬ wierzchniowo czynnego o nazwie Span 85.Do 25 cm* fazy organicznej wkrapla sie w atmo¬ sferze azotu 6 cm* fazy wodnej, mieszajac i chlo¬ dzac woda z lodem. Po uplywie 2—3 minut wkra¬ pla sie 1 cm1 2,5f/t roztworu tetrametyloetyleno- dwuaminy w fazie organicznej. Nastepnie tempera¬ ture lazni wodnej podnosi sie w ciagu 15—20 mi¬ nut do 25°C i utrzymuje mieszanine w tej tempe¬ raturze przez 30 minut. Utworzone kuleczki zelu odsacza sie, przemywa roztworem 0,2Vt srodka po¬ wierzchniowo czynnego o nazwie handlowej Tween 20 w 0,1 M buforze fosforanowym, a nastepnie sa¬ mym buforem fosforanowym.Uzyskany zel zawiesza sie w 4 objetosciaeh 2,5f/t roztworu aldehydu ghitarowego w 0,1 M buforze fosforanowym o wartosci pH 5,8 i wytrzasa w tem¬ peraturze 37°C przez 2 godziny, a nastepnie prze¬ mywa trzykrotnie porcjami po 50 cm1 0,1 M bu¬ foru fosforanowego o wartosci pH 7,8. Uzyskuje sie Okolo 16 cm1 upakowanych kuleczek immobili- zowanych komórek o aktywnosci amidazy penicy¬ linowej 0,65 j/om3. Metoda miareczkowania za po¬ moca fenylometylosulfonylofluorku stwierdzono, ze preparat zawiera 158 pmoli amidazy/cms, natomiast komórki natywne uzyte do immobilizacji — 1720 pmoli amidazy/cm1 biomasy (rys. 4). Wyliczony z tych wartosci wspólczynnik immobilizacji dla ab¬ solutnej ilosci amidazy wynosi 0,872.Przyklad II. Otrzymywanie immobilizowa- nych komórek Escherichia coli w postaci granulek.Do 10 g biomasy komórkowej ochlodzonej lo¬ dem, zawieszonej w 10 ml 0,2 M buforu fosforano¬ wego o wartosci pH 5,8, wkrapla sie 20 ml 309/* roztworu akryloamidu i 3f/# dwuallilodwuamidu kwasu winowego, a nastepnie zawiesine miesza sie z 1 ml 109/« roztworu nadsiarczanu amonowego i 1 ml lOP/t roztworu teftrametyloetylenodwuaminy.Uzyskana zawiesine szybko wysyca sie azotem i pozostawia w temperaturze 25°C przez 30 minut.Uzyskany zel przeciera sie przez sito uzyskujac granulki wielkosci 0,2—0,4 mm, które po przemy¬ ciu 0,1 M buforem fosforanowym o wartosci pH 5,8 miesza sie przez 2 godziny w temperaturze 37°C z 4 objetosciami 2*/t aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze fosforanowym o wartosci pH 5,8. Na¬ stepnie granulki przemywa sie trzykrotnie 0,1 M buforem fosforanowym o wartosci pH 7,8.Przyklad III. Otrzymywanie immobilizowa- nych komórek Escherichia coli, poddawanych dzia¬ laniu aldehydu glutarowego przed immobilizacja. 10 g biomasy komórek miesza sie w temperatu¬ rze 37°C przez 2 godziny z 4 objetosciami 29/t7 126 358 8 roztworu aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze fosforanowym o war'.osci pH 5,8. Nastepnie ko¬ mórki przemywa sie 0,1 M buforem fosforanowym o wartosci pH 5,8 i uzywa do immobilizacji spo¬ sobem opisanym w przykladzie I lub II. Uzyska¬ ne kuleczki lub granulki zelu przemywa sie 0,1 M buforem fosforanowym o wartosci pH 7,8.Przyklad IV. Hydroliza penicyliny G w re¬ aktorze periodycznym. 20 ml kulistych granulek zelu poliakryloamido- wego z immobilizowanymi komórkami Escherichia coli miesza sie w temperaturze 37°C z roztworem 0,8 g soli potasowej penicyliny G w 60 ml 0,03 M fosforanu potasu (wartosc pH 7,8). Wartosc pH utrzymuje sie na stalym poziomie za pomoca 0,5 N roztworu KOH przy uzyciu automatycznego ti- tratora. W poczatkowym okresie hydrolizy zuzy¬ wania KOH oraz uwalnianie sie kwasu 6-amino- penicylanowego jest funkcja liniowa w zaleznosci od czasu. Po 6 godzinach reakcji zuzywa sie lacz¬ nie 2 mmole KOH (92V«) i równoczesnie uwalnia sie 1,9 mmola kwasu 6-aminopenicylanowego (87,5 •/•). Po odsaczeniu granulki zelu ponownie uzywa sie do hydrolizy penicyliny G, natomiast z prze¬ saczu wydziela sie kwas 6-ammopenicylanowy zna¬ nymi metodami.Przyklad V. Hydroliza penicyliny G w re¬ aktorze fluidalnym.Przez 20 ml kuleczek zelu z immobilizowanymi komórkami Escherichia coli w kolumnie o wy¬ miarach 1,7x30 cm w temperaturze 37°C przepom¬ powuje sie 0,05 M roztwór penicyliny G w 0,02 M buforze fosforanowym o wartosci pH 7,5 (fosforan potasu) w ilosci 100 ml z szybkoscia 12 ml/minute.W tych warunkach granulki zelu utrzymywane sa w stanie fluidacji. Wyplywajacy z kolumny roz¬ twór jest przetlaczany do oddzielnego naczynia, w którym wartosc pH utrzymuje sie w granicach 7,8—8,0 przez dodawanie 0,5 N roztworu KOH z automatycznego titratora, i ponownie zawracany na kolumne. Po zuzyciu okolo 4,5 mmola KOH, co odpowiada okolo 90°/t hydrolizie penicyliny G, 5 roztwór oddziela sie od zelu i z 6upernatantu wy¬ dziela kwas 6-aminopenicyIanowy, a kuleczki zelu uzywa do nastepnej hydrolizy.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania preparatu enzymatyczne¬ go, sluzacego do otrzymywania kwasu 6-aminope¬ nicylanowego przez hydrolize benzylopenicyliny w srodowisku wodnym przy wartosci pH 6,0—0,0, po¬ legajacy na tym, ze amidaze penicylinowa immo- bilizuje sie w zelu poliakryloamidowym usiecio- wanym za pomoca dwuallilodwuamidu kwasu dwukarboksylowego i poddaje dzialaniu aldehydu glutarowego, znamienny ityn\ «ze immobilizacji pod¬ daje sie cale komórki drobnoustroju produkujace¬ go amidaze penicylinowa, korzystnie komórki Escherichia coli. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze komórki drobnoustroju immobilizuje sie przez po¬ limeryzacje akryloamidu w zawiesinie komórek w obecnosci' dwuallilodwuamidu kwasu dwukarboksy¬ lowego oraz katalizatora i inicjatora polimeryzacji. 3. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2, namienny tym, ze jako dwuallilodwuamid kwasu dwukarbo¬ ksylowego stosuje sie dwuallilodwuamid kwasu wi¬ nowego lub kwasu malonowego. 4. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze komórki drobnoustroju poddaje sie dzialaniu al¬ dehydu glutarowego przed polimeryzacja. 5. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze komórki drobnoustroju poddaje sie dzialaniu al¬ dehydu glutarowego po polimeryzacji. 15 25 30126 358 WpTyH czynnika sieciujacego immobilizoHanych komórek na pozorna objetosc zelu u reaktorze fluidalnym. -^ 2.0 I C3 C O N O O. 15 1.0 K/f* te m i l 1 BIS DATA DAMA czynnik 5\eciajacij O stor? poczatkom 0 szybkosc ob/'efojciowa= Ofo^ g szybkosc 0b/cto4ciowa*af0 Rys. 1 Wpfyn czynnika sieciujacego immob\lizoHanqch komórek na szybkosc przeplywu bufora przez fluidalna zawiesine. (szubkote objetokioHd dla uszystklch zeli*0,08) a. iS i«l 120\ 90 40 1 DAHA DATA 31* czynnik, sieciujacii ^95.2126 358 WpTyw czasu inkubacjiuO.lH.baf.fos.pHJjB na akfywnos* amidazy penicy/inone| ~«- O 10 U £0 (dni) czas inkubacji 57° o Komórki irnmobJrakio}4ane aldehydem glutarowym. • kamerki traktowane aldehydem glutarowgm i \mmobttizouane a Komórki immob. nil traktonane aldehgdein gjatarowgm .Rys. 3 WptyN 5iazeniQ ImAmeh/osUfonylofluorku (pmsf) no aktywnosc amidazy • KOMdftKl NATYWNE *HfflfiRKI- IMMO0IUZOWANE pmoie PMSF/mi upakowanego materialu Rys.4 Sklad: B„Z.Graf.Druk: Prac.Poligraficzna UP PRL Naklad 100 egz. Cena 100 zl. PL