Przedmiotem wynalazku jest sposób wydziela¬ nia D-fenyloglicyny z mieszaniny racemicznej N- -acylo-DL-fenyloglicyny, metoda enzymatyczna.D^fenyloglicyna jest waznym pólproduktem w syntezie niektórych pólsyntetycznych penicylin i cefalosporyn. Aminokwas ten otrzymuje sie przez wydzielanie go z racematu DL-fenylogiicyny. Ra- oemat uzyskuje sie syntetycznie przez dzialanie amoniaku na kwas fenyloglioksalowy (J. Am. Soc. 42.2264) lub bromofienylooctowy (J. Biol. Ghem. 18, 47) badz tez z aldehydu benzoesowego metoda .Sltreckera (Antibiotyki, 9.875).Dotychczas opisane metody wydzielania D-fe^ nyloglicyny mozna podzielic na dwie grupy: ohe- miiozne i enzymatyczne.Metody chemiczne polegaja na frakcjonowanej krystalizacji soli D-fenyloglicyny z odpowiednim kwasem.Najczesciej sa to polaczenia z kwasem DJkam- fosulfonowym lub abietylowym (J. Am. Chem.Soc. 42, 21266, opisy patentowe Japonii Nr 73.7/8.137, 76.79.036, 74.76.703, opisy patentowe RFN Nr 2 710504, 2655 624, opisy patentowe Wielkiej Bry¬ tanii Nr 1314 739 i 1455 710).Wedlug innych metod rozdzialu racematu do¬ konuje sie za pomoca odpowieKiniich kwasów airy- losuLfonowych (opisy patentowe Japonii Nr 76.95j038, 77.1j00.441, 77.100.440, 77.87.140, 77.67.107, opis patentowy Francji Nr 2226 376, opis paten- 10 15 20 25 towy St. 3jedn. Am. Nr 3 983 902), kwasu wino¬ wego (opisy patentowe RFN Nr 2 163 033 i 2 227 011, opisy patentowe Japonii Nr 73.29.715) lub niektó¬ rych kwasów nieorganicznych (opisy patentowe Ja¬ ponii Nr 72.25.147, 73.14.645).W metodach enzymatycznych wykorzystuje sie stereospecyiicznosc niektórych enzymów wobec po¬ chodnych Lnizomarów. W oparciu o opis patento¬ wy RFN Nr 2 621 076, D^fenyloglicyne otrzymano z DL^hydantoiny za pomoca hydirolazy hydiropirymi- dynowej. Jednak najczesciej sa stosowane enzy¬ my, które specyficznie hydrolizuja pochodne L-fe- nyloglicyny. Tak np. wykorzystujac leucyloamino- peptydaze z Pseudomonas i nenki wieprzowej roz¬ dzielono amid DL-fenyloglicyny na oba enancjo- mery (opisy patentowe RFN Nr 2 526 594, 2 700 456).Do rozkladu enzymatycznego wykorzystuje sie takze drobnoustroje swoiscie hydrolizujace N^acylo_ we pochodne L^fenyloglicyny. Stosujac np. komór¬ ki Azotobacter i Piseudomonas, z NHchloroacetylo- -DL-fenyloglicyny i Nnbenzoilo-iDLL-fenyloglicyny wydzielono odpowiednie antypody (opisy patentowe Japonii Nr 70.08.634, 70.08.635, 74.50.1)91, 74.80.290).Wedlug opisu patentowego RFN Nr 2 344 060 do rozdzialu enancjomerów, miedzy innymi N^acetylo- -DL-fenyloglicynianu amonu, stosuje sie acylaze z dowolnego mikroorganizmu (nie wyszczególniono konkretnego szczepu).Wedlug opisu patentowego Wielkiej Brytanii Nr 117 797 s3 117 797 4 nia rozpuszczalnosci w wodzie zwiazki te stosuje sie w postaci soli sodowych.Sposobem wedlug wynalazku enzym specyficz¬ nie hydrolizujacy N-acylo-L-fenyloglicyne otrzy¬ muje sie przez zawieszenie homogenatu bakteryj¬ nego w slabo zalkalizowanym buforze fosforano¬ wym, korzystnie o pH = 8, odwirowanie i wy¬ tracenie z supernatantu enzymu. Enzym wytraca sie w temperaturze obnizonej do okolo 1—4°C za pomoca acetonu uzytego w stosunku objetoscio¬ wym okolo 1:1. Nastepnie osad odwirowuje sie i suszy strumieniem zimnego powietrza.Uzyskany proszek acetonowy, w celu imimobi- lizacji enzymu rozpuszcza sie w slabo alkalicz¬ nym buforze fosforanowym o pH = 7—8,8 i w temperaturze pokojowej miesza sie otrzymany roztwór z sorbentem w postaci anionitu o silnie rozwinietej powierzchni sorpcyjnej, korzystnie z DEAE-celuloza uprzednio zrównowazona buforem fosforanowym równiez do pH = 7—8,8. Nastepuje trwale zwiazanie enzymu z nosnikiem, przy czym jego pierwotna aktywnosc nie ulega spadkowi.Tak otrzymany imimobilizowany staly preparat enzymatyczny po odsaczeniu i przemyciu do za¬ niku bialka w przesaczu, stosuje sie do specyficz¬ nej hydrolizy enzymatycznej wodnego roztworu so¬ li N^acylo-DLnfienyloglicyny i dokonuje sie roz¬ dzialu enancjomerów w znany sposób. 1369 462 rozdzialu racematu dokonuje sie za po¬ moca amidazy penicylinowej zawartej w komór¬ kach E. coli szczepu Nr 893.418, swoiscie hydroli- zujacej niektóro N-acytowe pochodne L-fenylogli- cyny takie jak: N-ifenytoacetylo-, 2-furyloacetylo-, nnpropoiksyacetylo-2, 2-4ionylo-, n^heksanoilo- lub nnheksenoiloglicyne. Rozklad enzymatyczny pro¬ wadzi sie albo za pomoca komórek bakteryjnych albo tez enzymem immobilizowanym. Wiadomo przy tym, ze zastosowanie calych komórek bakte¬ ryjnych porwala tylko na jednorazowe uzycie bio¬ masy, znacznie podnosi koszty metody, a otrzy¬ mane produkty czesto sa zanieczyszczone wysoko- czasteczkowymi substancjami, dajacymi odczyny alergiczne. Z powyzszych wzgledów znacznie ko¬ rzystniejsze jest stosowanie enzymu immobilizo- wanego.Wedlug wyzej cytowanego opisu patentowego Wielkiej Brytanii immob&izowany enzym otrzy¬ muje sie z homogenatu bakteryjnego, który pod¬ daje sie odwirowaniu, a z supernatantu wytraca enzym za pomoca siarczanu amonowego. Osad roz¬ puszcza sie nastepnie w wodzie, dializuje i lio¬ filizuje. Tak oczyszczony enzym osadza sie za po¬ srednictwem gluitaraldehydu na nosniku z odpo¬ wiednio spreparowanej celulozy.Celem wynalazku bylo opracowanie sposobu wydzielania D-ifenyloglicyny z mieszaniny race- mdcznej, przy uzyciu preparatu enzymatycznego nadajacego sie do wielokrotnego stosowania i po¬ siadajacego zwiekszona odpornosc na ogrzewanie i przecihowywanie, a takze nie zanieczyszczajacego produktów reakcijd.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze N-acylowa pochodna DL^fenylo^licyny poddaje sie dzialaniu enzymu specyficznie hydrolizujacego N^cylo-L-fenyloglicyne, wyodrebnia sie ze srodo¬ wiska pohydrolitycznego L-fenyloglicyne i nastep¬ nie deacyluje sie pozostala w tym srodowisku N- ^acylo-JDnfenyloglicyne do D-ifenyloglicyny.Wedlug wynalazku stosuje sie enzym wyodreb¬ niony w okreslonych warunkach z homogenatu bakteryjnego i immobilizowany na anionicie o roz¬ winietej powierzchni sorbcyjnej, korzystnie na DEAE-celulozie.Jako zródlo enzymu asymetrycznie rozkladajace* go N^acylowe pochodne DL-fenyloglicyny stosu¬ je &iq mase bakteryjna, otrzymana z nastepuja¬ cych rodzajów bakterii: Nocardia, Mycobacterium, Mycococous, Brevibaoterium, Erwinia, Pseudomo- nas, Pectobaoterium, Proyódencia, Micrococcus.Szczególnie korzystne efekty uzytkuje sie przy zastosowaniu enzyimu wytwarzanego przez szczep Mk!rococcu» agilis CCM 2131.Jako N-acylowe pochodne DL-fenyloglicyny mo¬ zna stofcorwac tata* pochodne jak N-ecetylowa, N- -butyrylowa, N-cWoroocetylowa^ lMIuoroacetylo- wa, przy czym najkarzy*tniej sfaluje sie pochodna N-acetylowa, ze wzgledu na prostate jej otrzymy¬ wania, mozliwosc prowadzenia enzymatycznej hy¬ drolizy roztworów wodnych na kolumnie z immo¬ bilizowanym enzymem i latwosc rozdzialu pro¬ duktów enzymatycznego rozkladu.. Dla zwiekaze- Hydrolize mozna prowadzic w ukladzie stacjo¬ narnym, lecz szczególnie dogodnym jest stosowa¬ nie kolumny upakowanej immobilizowanym enzy¬ mem, która mozna uzywac do ciaglego rozkladu wodnych roztworów N-acylowyoh pochodnych fe- nyloglicyny. Stopien hydrolizy substratu reguluje sie szybkoscia przeplywu uzytego roztworu oraz temperatura, która utrzymuje sie na poziomie 20— —67°C. W eluacie produkty rozkladu oznacza sie dwoma metodami: kolorymetryczna z zastosowa¬ niem ninihydryny (Aroh. Blochem. Biophys. 67. 10—il9) i polarymetryczna przez oznaczenie skre- calnosci optycznej N-acetylo-D-fenyloglricyny.Produkt hydrolizy enzymatycznej w postaci eiu- atu zawiera niezmieniona N-acetylo-iD-fenyloglicy- ne oraz Lnfenyloglicyine. W celu wyodrebnienia L- -fenytloglicyny eluat zageszcza sie i doprowadza do punktu izoelekirycznego (pH = 5,6). Wytraco¬ ny osad L-fenyloglicyny odsacza sie, a przesacz zawierajacy N-acetylo-D-fenyloglicyne zakwasza do pH ponizej 3. Wytracona w tych warunkach pochodna acylowa D-fenyloglicyny deacyluje sie w znany sposób za pomoca kwasu solnego do D- -ienylogiicyny. Poniewaz w wyniku wyzej opisa¬ nego postepowania nie cala ilosc acylowanej po¬ chodnej D-fenyloglicyny ulega wytraceniu, pozo¬ stala jej ilosc, obecna jeszcze w przesaczu eks¬ trahuje sie z roztworu octanem etylu. Ekstrakt po odpedzeniu rozpuszczalnika laczy sie z wytra¬ cona N-acykHD-fenyloglicyna i poddaje hydroli¬ zie.Tfeytikana w trakcie procesu L^fienyloglicyne ra- cemtaije sie w znany sposób do DL-fenyloglicyny i przeprowadza w pochodna acylowa, po czyni za¬ wraca de obiegu. ; Sposób wedlug wynalazku wykazuje szereg za- 10 15 20 25 30 35 40 45 50 ss5 11T797 6 let w porównaniu z metodami dotychczasowymi.Enzym wyodrebniony z homogenatu bakteryjnego przez wytracenie acetonem stanowi proszek, który mozna przechowywac w suchym miejscu przez okres co najmniej kilku miesiecy bez utraty ak¬ tywnosci enzymatycznej. PtWHaek ten rozpuszcza sie w rozcienczonym buforze, korzystnie w 0,01 M buforze fosforan/u potasu o wartosci pH = 8,0 a nastepnie wdaze na odpowiednim aniondcie, ko¬ rzystnie na DEAE-ceLukazie. Zawiazanie enzymu z nosnikiem nastepuje bezposrednio, bez koniecz¬ nosci stosowania substancji ,ypomocndozej" jak np. glutaraldehydu (jak to podano w w/w patencie Wielkiej Brytanii). Jako nosnik mozna stosowac bezposrednio DEAE-celuloze, bez koniecznosci spe¬ cjalnego preparowania jej.Sposób wedlug wynalazku jest objasniony na¬ stepujacym przykladem.Przyklad. Przygotowanie biomasy. fSaczep Mferaceccus agilis OCM 213a hoduje sie na podlozu kompleksowym o skladzie: Baoto pep¬ ton — l#/«, hydrolizat kazeiny 0,2, wyciag z droz¬ dzy — 0,2f/o, chlorek sodowy — 0,6*/o w wodzie destylowanej. Roztwór doprowadza sie do pH 7,2—7,4 za pomoca 6N NaOH. Material poeiewowy mozna otrzymac przez wysianie zliofitoowanych komórek na skosy agairowe, które imkubuje sie w temperaturze 2fi°C przez 24 godziny. Dla uzyska¬ nia triomasy szczepi sie li50 ma wymienionego po¬ dloza 15 ml inokulum i wytrzasa na wytrzasarce poziomej przfez 36 godzin w temperaturze 26°C.Otrzymana biomase odwirowuje sie i przemywa dwukrotnie 0,9*/t roztworem chlorku sodowego.Przygotowanie immofottizowanego enzymu.Jedna czesc biomasy uzyskanej jak wyzej za¬ wiesza sie w trzech czesciach 0,01'M buforu fosfo¬ ranowego o pH = 8,0 i homogenizuje sie w de- zintegratorze Brauna. Homogenat odwirowuje sie przy wzglednej sile odsrodkowej wiekszej 10 900 razy od przyspieszenia ziemskiego przez 15 minut.Do supernatantu w temperaturze 3°C wkrapla sie równa objetosc acetonu, ochlodzonego do —ill0oC. Powstaly osad usuwa sie przez wiórowanie, a z uzyskanego supernatantu wy¬ dziela sie preparat enzymatyczny przez wkro- plenie jednej objetosci zimnego acetonu. Odwiro¬ wany osad suszy sie strumieniem zimnego powie¬ trza uzyskujac proszek acetonowy posiadajacy 93f/« aktywnosci wyjsciowego supernatantu i 2,5 razy wyzsza aktywnosc swoista (2,5 mg proszku zawiera 1 mg bialka i w pH 8,0 rozklada w ciagu 1 minuty 0,5 mikromoli N-acetylo-L-ifenyloglicy- ny). Nastepnie proszek adetonowy rozpuszcza sie w 0,01 M buforze fosforanowym o pH = 8,0 w ilosci K25 mg na 10 ml. Uzyskany roztwór miesza sie w temperaturze pokojowej przez 2 godziny z 2,5 ml DE-52 celuloza (firmy Wihatman) zrówno¬ wazonej uprzednio buforem fosforanowym o pH = = 8,0.^Nierozpuszczalny preparat odsacza sie na lejku Buchnera i przemywa 0,01 M buforem fosforano¬ wym o pH = 8,0, az do zaniku bialka w przesa¬ czu. Uzyskany w ten sposób immebilizowany en¬ zym przy pH = 8,0 rozklada 7 mikromoli N-ace- tylo-L-fenyloglicyny w przeliczeniu na minute i na 1 ml prepatraitu.Hydroliza N-acetylo-DL-fenyloglicyny.Przez kolumne (0,4X1,9 cm) upakowana immo- bilizowanym enzymem przepuszcza sie w tempe¬ raturze 37°C z szybkoscia 12 ml na godzine 0,05 M wodny roztwór soli sodowej N-acetylo-DL-feny- loglicyny, uzyskanej jak podano wyzej o pH = 8,0 z dodatkiem 1 milimola CoCiyiOOO ml. Zbiera sie dobowe porcje eluatu, w których oznacza sie me¬ toda ninhydorynowa powstajaca L-fenyloglicyne i polarymetrycznie, pozostala N-acetylo-D-ienylogli- cyne. Wplyw czasu pracy kolumny z immobilizo- wanym enzymem na hydrolize roztworu 0,05 M N-acetylo-DL-fenyloglicyny ilustruje wykres przed¬ stawiony na zalaczonym rysunku.Do oznaczenia polarymetrycznego pobiera sie 3 ml eluatu, który zakwasza sie 5 N HCl do pH = = 1,0 i trzykrotnie ekstrahuje po 5 ml octanem etylu. Polaczone ekstrakty suszy sie Na2S04 (bez¬ wodnym). Na 13 ml ekstraktu nalezy uzyc 320 mg bezwodnego Na^SO* W przesaczu stezenie zawar¬ tej N-acety4oJ4enyloglicyny mierzy sie przez pomiar skrecainosci przy 576 nm. Dla czystej N- nacetylo-IMenylogllcyny rozpuszczonej w octanie etylu wyznacza sie /o/*e — —428. Uzyskuje sie zaleznosc liniowa pomiedzy stezeniem N-acetylo- -D-fenyloglicyny w octanie etylu, a skrecalnoscia.Rozdzial produktów hydrolizy enzymatycznej.Porcje eluatu (700 ml) powstalego przez hydro¬ lize N-acetylo-DL-fenyloglicyny, zageszcza sie w temperaturze 40°C w wyparce pod zmniejszonym cisnieniem do 1/5 objetosci wyjsciowej. Nastepnie pH roztworu doprowadza sie do 5,6 za pomoca 5 N HC1, a powstala zawiesine pozostawia sie w temperaturze 4°C na noc. Krystaliczny osad od¬ sacza sie i przemywa niewielka iloscia wody. Po wysuszeniu w eksykatorze nad bezwodnym CaCl* odzyskuje sie 1,5 g preparatu o skrecalnosci lal %= 206/C=X 2,5 N HC1). Preparat ten jest chromatograficznie identyczny z L-ifienylogKcyna.Powstaly przesacz zakwasza sie do pH — 1,0 i po¬ zostawia na noc w temperaturze 4°C. Osad od¬ sacza sie na lejku Buchnera i suszy w eksykato¬ rze prózniowym. Uzyskuje sie 1,96 g preparatu, który posiada /«/£?« = —43H/c=l, etanol/. Prepa¬ rat ten zidentyfikowano jako N-acetylo-D-fenylo- glicyne. Dodatkowa porcje (500 mg) tego acetylo- wanego aminokwasu uzyskuje sie z przesaczu przez ekstrakcje octanem etylu.Otrzymywanie D-fenyloglicyny. i849 mg (4,39 mMola) acetylo^D-fenylogSlicyny za¬ wiesza sie w 110,6 ml 2,5 N HC1 (26,4 mMola) i gotuje pod chlodnica zwrotna przez 14 godzin.Nastepnie roztwór zageszcza sie pod zmniejszo¬ nym cisnieniem, a uzyskany suchy osad zawiesza sie w H2O i doprowadza do pH = 5,6. Zawiesi¬ ne pozostawia sie na noc w temperaturze 4°C i wytracony krystaliczny osad odsacza na lejku Buchnera, przemywa niewielka iloscia zimnej wo¬ dy i suszy w eksykatorze nad bezwodnym CaCl2 i NaOH. Otrzymuje sie preparat o skrecalnosci /«/2L = —887ifc=l, 2,5 N HC1/ zidentyfikowa- 40 507 117 797 8 ny chromatograficznie jako Dnfenyloglicyna.Racem&zacja L^fienyloglicyny. 500 mg L-fenylogilicyny zawiesza sie w 6 ml 80% kwasu octowego i gotuje pod chlodnica zwrotna przez 12 godzin. Po ochlodzeniu lodem osad odsacza sie i po przemyciu niewielka iloscia wody suszy sie w suszarce w 40°C. Wydajnosc preparacja 450 mg. Uzyskana DL-fenyloglicyne identyfikuje sie nastepujacymi sposobami: polary¬ metrycznie, /«/ 576 = O/c—1, 2,5 N HOl/, spaktro- fotaiiefcryiczinde w zakresie od 200—400 mm i chro¬ matograficznie. 3 milimole uzyskanej mieszaniny racemAcznej fenyloglicyny rozpuszcza sie w 2 ml 2 N wodorotlenku sodowego, ochlodzonego lo¬ dem i do tak uzyskanego roztworu stale mie¬ szanego, wkrapla sie 4,5 milimoia bezwodnika octowego, utrzymujac pH okolo 9,0 przez rów¬ noczesne wkraplanie 2 N wodorotlenku sodowe¬ go.Nastepnie roztwór miesza sie przez godzine i do¬ prowadza do pH = 1,0 za pomoca 2 N kwasu solnego. Po calonocnym staniu w lodówce, osad odsacza sie i przemywa niewielka iloscia zakwa¬ szonej wody, a nastepnie suszy w eksykatorze prózniowym. Uzyskuje sie 2,7 milimoia N-acetylo- -DL-fenyloiglicyny. Z próbki soli sodowej tej sub¬ stancji immobilizowany enzym uwalnia najwyzej 50°/o fenyloglicyny.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wydzielania D-fenyloglicyny z mie¬ szaniny racemicznej N-acylo-tDL^fenyloglicyny me¬ toda enzymatyczna, przez dzialanie na wodny roz- 10 15 20 25 30 twór racemaitu immohilLzowanyin enzymem spe¬ cyficznie hydrolizujacym N-acylo-L-fenyloglicyne, kolejne wyoidirebniiaoiie ze srodiowiislka pohydroli- tycznego L-fienyloglicyny i nastepne deacylowa- nie pozostalej w tym srodowisku N-acylo-D^feny- loglicyny do D-fenyloglicyny, znamienny tym, ze do specyficznej hydrolizy racematu stosuje sie immobilizowany enzym otrzymany z homogenatu bakteryjnego w buforze fosforanowym, odwiro¬ wanie i wytracenie z supernatantu za pomoca acetonu, osadu zawierajacego enzym, immobilizo- wanie enzymu przez rozpuszczenie osadu w slabo alkalicznym buforze fosforanowym o pH = 7—8,8 i zmieszanie otrzymanego roztworu z sorbentem w postaci anionitu o silnie rozwinietej powierz¬ chni sorpcyjnej, korzystnie z DEAE-celuloza. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako N-acylowa pochodna DL-tfenyloglicyny sto¬ suje sie N-acetylo^DL-fenyloglicyne. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze N-acylowa pochodna DL-fenyloglicyny stosuje sie w postaci wodnego roztworu jej soli sodo¬ wej. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze specyficzna hydrolize racematu prowadzi sie na kolumnie upakowanej irciniobilizowanyni en¬ zymem. 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze L^fenyloglicyne otrzymana jako produkt hy¬ drolizy poddaje sie racemizacji, przeprowadza w pochodna acylowa i zawraca do obiegu. 6. Sposób wedlug zastrz. ll, znamienny tym, ze stosuje sie enzym wytwarzany przez szczep Micrococcus agilis CCM 2131. [motel [litr] 0,025 0,020 0,015 ] 2 6 10 14 18 22 rd/)ij — stezenie fenyloglicyny *-* stezenie N-acetylo-D- fenyloglicyny DN-3, zam. 488/82 Cena 100 zl PL