Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia kwasu monowego, pólproduktu do wytwarza¬ nia nowych estrów kwasu monowego, wykazuja¬ cych czynnosc przeciwbakteryjna w stosunku do pewnych organizmów Gram^dodatnich i Gram- -ujemnych, zwlaszcza Haemophilis influezae i Neis- seria genorrhoeas oraz wysoka czynnosc przeciw- mykoplazmatyczna. Powyzsze zwiazki nadaja sie dc stosowania w leczeniu zakazen bakteryjnych przenoszonych droga plciowa, zwlaszcza w leczeniu zapalenia oskrzeli i chorób wenerycznych u ludzi.Rzezaczke od wielu lat leczy sie rutynowo anty¬ biotykami penicylinowymi. Jednakze pewne szcze¬ py gonokoków sa mniej wrazliwe na penicyliny, a stopien takiej odpornosci stale wzrasta, co wy¬ maga zwiekszenia stosowanych dawek antybioty¬ ków. Ponadto przedstawiono doniesienia o wyste¬ powaniu szczepów wytwarzajacych penicyline i w zwiazku z tym wysoce odpornych na penicy¬ line. W British Medical Journal (1976) na stronie 963 stwierdza sie, ze obecnie perspektywy leczenia rzezaczki radykalnie pogorszyly sie w zwiazku z _ doniesieniem o istnieniu szczepów calkowicie odpornych, zawdzieczajacych swa odpornosc wy¬ twarzaniu penicylinazy, enzymu niszczacego peni¬ cyline, znajdowanego u wielu innych bakterii.Obecnie stwierdzono, ze pewna klasa zwiazków wykazuje wysoka czynnosc w stosunku do wielu organizmów, w tym N.gonorrhoeae, a poniewaz zwiazki te nie sa pokrewne antybiotykom typu /?-laktamowego (tj. penicylinom i cefalosperynom), nie ulegaja one dzialaniu penicylinazy.Kwas pseudomonowy, o wzorze 1, jest w bry¬ tyjskim opisie patentowym nr 1 395907 opisany jako zwiazek wykazujacy czynnosc przeciwbakteryjna.Obecnie stwierdzono, ze pochodne kwasu mono¬ wego równiez wykazuja czynnosc przeciwbakteryj¬ na.Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowego kwasu monowego o wzorze 2, stano¬ wiacego pólprodukt do otrzymywania nowych es?trów kwas.u minowego.Zwiazek o wzorze 2 zawiera trójpodstajwipny uklad podwójnego wiazania i w zwiazku z tym moze wystepowac w postaci E (naturalnej) lub Z (izo). Nalezy rozumiec, ze w zakres wynalazku wchodzi sposób wytwarzania obu izomerów geo- motrycznych, jak równiez ich mieszanin.Zwiazek o wzorze 2, w którym podwójne wiaza- 20 nie jest w konfiguracji E nazywa sie „kwasem monowym". Odpowiedni izomer Z jest nazywany „kwasem izomonowym". Przyjmuje sie, ze kwas monowy ma absolutna stereochemie przedstawiona wzorem 3 (we wzorze przedstawiono numeracje H pierscienia czterowodoropiranowego).Wedlug wynalazku sposób wytwarzania kwasu monowego o wzorze 2 lub jego soli polega na tym, ze poddaje sie hydrolizie w warunkach alkalicz¬ nych zwiazek o wzorze ogólnym 4, w którym R „ oznacza grupe alkilowa o 1—4 atomach wegla lub 10 18 115 133115 133 3 grupe o wzorze -(CH2)8C02H lub sól albo ester al¬ kilowy tego kwasu o grupie alkilowej zawieraja¬ cej 1—4 atomów wegla, albo zwiazek o ogólnym wzorze 4, w którym R oznacza grupe alkilowa o 1—4 atomach wegla lub grupe o wzorze -(CHjOsCC^H lub sól albo ester alkilowy tego kwa¬ su o grupie alkilowej zawierajacej 1—4 atomów wegla, poddaje sie reakcji ze zwiazkiem o wzorze ogólnym 5, w którym R3 oznacza atom wodoru lub grupe alkilowa o 1—6 atomach wegla, a R4, R5 i R6 oznaczaja grupe alkilowa o 1—6 atomach wegla, a nastepnie hydrolizuje sie uzyskany zwiazek w srodowisku alkalicznym, po czym usuwa sie grupy ochronne w slabo kwasnym srodowisku.Kwas monowy wytwarzany sposobem wedlug wynalazku jest pólproduktem do wytwarzania estrów kwasu monowego. 10 15 Nizej podano dane biologiczne uzyskane po prze¬ badaniu dzialania estrów kwasu monowego w po¬ równaniu z danymi uzyskanymi dla kwasu pseudo- monowego.Surowice wiazace: ester etylowy i ester metylo¬ wy kwasu monowego wiaze ludzka surowice pro¬ teinowa tylko w 30%, podczas gdy kwas pseudo- monowy w 95%. W zwiazku z tak wysokim stop¬ niem wiazania, aktywnosc antybakteryjna kwasu pseudomonowego jest w obecnosci surowicy w spo¬ sób znaczacy obnizona, natomiast nie ma to wply¬ wu na aktywnosc estru etylowego i metylowego kwasu monowego. jak to przedstawiono wv tabli¬ cy 1.Tablica 1 Stopien wiazania z surowica ludzka i wplyw surowicy na aktywnosc dla estru etylowego i metylo¬ wego kwasu monowego oraz kwasu pseudomonowego.Zwiazek ester etylowy kwasu mono¬ wego ester metylowy kwasu mono¬ wego kwas pseudomo- I nowy Procent wiazania z surowica ludzka 30 30 95 S.( Aktywnosc aureus Dxford 0 0,5 1,0 0,12 50 f V'yj? 1,0 1,0 (fig/ml) w obecnosci 0% lub 50% surowicy ludzkiej S. aureus Russell 0 'r-:. C'-^'*" ..." ^.\^,*.:¦• 0,5 m^.^y. 2,5 0,25 :-. ^^rngms 50 0,5 * 2,5 5,0 aa&- Str. pyogenes CN 10 0 1,0 5,0 0,05 50 2,5 10 0,5 Poziom we krwi: poziom we krwi estrów etylo-^ wego i metylowego kwasu monowego oraz kwasu pseudomonowego badano u gryzoni, psów, malp amerykanskich i swin. W wiekszosci przypadków, ester etylowy i metylowy kwasu monowego po¬ woduje, ze ich poziom we krwi jest wyzszy i dlu¬ zej aie utrzymuje niz w przypadku kwasu mono- RE— wego. U myszy, z powodu gwaltownej deaktywacji 40 metabolizmu nie stwierdzono zadnego poziomu kwasu pseudomonowego przy podawaniu doust¬ nym. Poziom we krwi trzech zwiazków, po ich do¬ ustnym zastosowaniu u myszy podano w tabli- « cy 2, a u malp w tablicy 3.Tablica 2 Poziom we krwi u myszy po zastosowaniu doustnym w ilosci 50 mg/kg Zwiazek ester etylowy kwasu mono¬ wego ester metylowy kwasu mono¬ wego kwas pseudo- 1 monowy* Stezenie w ^g/ml w minutach po zastosowaniu 5 7,1 10,4 10 4,8 9,3 <0,5 20 3,2 8,8 <0,5 30 2,2 5,3 <0,5 60 1,2 2,5 <0,5 120 <0,4 <0,6 <0,5 240 <0,4 <0,6 <0,5 1 * poziom nie wykrywalny115! 193 Tablica 3 Boziom we krwi u malp amerykanskich po zastosowaniu doustnym w ilosci 50 mg/kg Zwiazek ester etylowy kwasu mono- wego ester metylowy kwasu mono- wego kwas pseudo- monowy Stezenie w ug/ml w minusach po zastosowaniu 10 ,36,5 15 20,4 31,0 13,7 .¦30 19,5 21,8 7,2 60 12,2 14,1 i 1,8 120 4,0 9,8 0,1 240 0,3 1,6 -360 <0,8 Otrzymane sposobem wedlug wynalazku anty- biotyczne zwiazki mozna uzywac -w medycynie lub weterynarii przygotowujac je jakimkolwiek dogod¬ nym sposobem, analogicznym do sposobów formu¬ lowania innych antybiotyków. Kompozycje farma¬ ceutyczne zawieraja zwiazek o wzorze 2 lacznie z farmaceutycznym nosnikiem lub wypelniaczem.Kompozycje mozna formowac do podawania.ja¬ kakolwiek droga, zaleznie od leczonej choroby.Kompozycje moga miec. postac tabletek, kapsulek, proszków, granulek, drazetek lub preparatów ciek¬ lych, jak doustne lub sterylne, pozajelitowe roz¬ twory lub zawiesiny.Tabletki i kapsulki do podawania doustnego moga zawierac dawki jednostkowe skladnika czyn¬ nego oraz konwencjonalne wypelniacze, -jak czyn¬ niki wiazace, np. syrop, gume^arabska, zelatyne, sorbit, tragakant lub poliwinylopiroiidon, laktoze, sa charoze, skrobie kukurydziana, fosforan wapnia lub glicyne, czynniki smarne, np. stearynian •-mag¬ nezu, * talk, glikol polietylenowy lub krzemionke, czynniki dezintegrujace, jak skrobia ziemniaczana lub dopuszczalne czynniki zwilzajace, jak laurylo- siarczan sodu. Tabletki moga byc powlekane spo¬ sobami dobrze znanymi w praktyce farmaceutycz¬ nej. Ciekle preparaty doustne moga miec postac np. wodnych lub oleistych zawiesin, roztworów, emulsji, syropów lub eliksirów lub produktu-su¬ chego, przed uzyciem rozpuszczonego w wodzie lub odpowiednim nosniku. Takie ciekle preparaty moga zawierac konwencjonalne-dodatki, jak czyn¬ niki zawiesinotwórcze, np. sorbit, syrop, metylo- celuloze, syrop glukozowy, zelatyne, hydroksyety- loceluloze, karboksymetyloceluloze, zel -steary¬ nianu glinu lub uwodornione oleje jadalne, czyn¬ niki emulgujace np. lecytyne, monoleinian sorbitanu lub gume arabska, nosniki niewodne (które moga obejmowac oleje jadalne), np. olej migdalowy, frakcjonowany olej kokosowy, -estry ¦ oleiste, jak gliceryny, glikolu propylenowego, lub alkoholu ety¬ lowego, srodki konserwujace, np. ester metylowy . lub propylowy kwasu p-hydroksybenzeesowego lub kwas sorbowy i, jezeli to jest pozadane, konwen¬ cjonalne czynniki zapachowe lub barwiace.Czopki beda zawierac konwencjonalne podstawy czopków, jak maslo kakaowe lub inne glicerydy.Do stosowania pozajelitowego sporzadza sie ciek¬ lo le dawki jednostkowe zwiazku czynnego i steryl¬ nego nosnika, korzystnie wody. Zaleznie od nos¬ nika i stezenia, zwiazek moze byc w nosniku za¬ wieszony lub rozpuszczony. Przy sporzadzaniu roz¬ tworów zwiazek mozna rozpuscic w wodzie i ste- 25 rylizowac przez saczenie, przed rozlaniem "do od¬ powiednich fiolek lub ampulek i zamknieciem. Ko¬ rzystnie, w nosniku mozna rozpuscic takie dodatki jak czynniki znieczulajace miejscowo, srodki kon¬ serwujace i bufory. Dla zwiekszenia trwalosci, * po *•* rozlaniu do ampuiek kompozycje mozna liofili¬ zowac. Ampulke z suchym, liofilizowanym prosz¬ kiem zatapia sie, a przed uzyciem preparat po¬ nownie rozpuszcza w wodzie. Poza^elitowo zawie¬ siny sporzadza sie w zasadniczo taki sam sposób .j5 z tym, ze zwiazek zawiesza sie w nosniku, a nie rozpuszcza, a sterylizacji nie mozna dokonywac przez saczenie. Zwiazek mozna sterylizowac przez wystawienie na dzialanie tlenku etylenu, przed-za¬ wieszeniem go w sterylnym nosniku. Korzystnie, 40 dla ulatwienia równomiernego rozprowadzenia zwiazku,'do kompozycji dodaje sie srodka powierz¬ chniowo czynnego lub zwilzajacego. irKompozycje,moga zawierac, zaleznie od sposobu podawania, 0„1—99, ykorzystnie 10^60% wagowych 45 skiadnika czynnego. W przypadku kompozycji -za¬ wierajacych dawki jednostkowe, ilosc skladnika czynnego wynosi .korzystnie 50—500 mg. -Dawki stosowane.w.-leczeniu^doroslyeh ludzi wynosza ko¬ rzystnie 100—*3000 mg dziennie, np. 1500 •mg *dzien- 50 nie, naleznie od drogi i czestotliwosci, podawania.Wynalazek jest ilustrowany ponizszymi przykla¬ dami.Przyklad I. ^Wytwarzanie kwasu ..3*(3R,4R- -dwuhydroksy-5S-}2S£S epoksy*5S - hydroksy - 4S- -metyloheksylo)-2,3,5,6-czterowodoropiran --2S - ylo)- -2-metylopropeno*lE*karboksylowego-l (kwasu mo- ;nowego) ¦i*Y:7t kwasu pseudoroonowego (bez ochrony) W 2ml wody rozpuszcza sie 10 mg soli sodowej kwasu pseudomonowego i 15 mg weglanu potasu.Roztwór doprowadza ¦ sie do ©09C, a przebieg reakji sledzi analityczna wysokocisnieniowa chromato¬ grafie cieczowa. Po uplywie 1,5 godziny nastepuje c§ optymalna konwersja do kwasu monowego. 607 115133 8 Dla potwierdzenia, obecnosci kwasu monowego, mieszanine reakcyjna oziebia sie, rozciencza 3 ml wody wysyconej chlorkiem sodu, pokrywa 10 ml octanu etylu i przy silnym mieszaniu doprowadza do pH 2,0. Warstwe organiczna oddziela sie, faze wodna reekstrahuje octanem etylu (2X10 ml).Bezbarwne ekstrakty organiczne laczy sie, zadaje nadmiarem eterowego roztworu dwuazometanu i odparowuje do sucha. Otrzymana mieszanine estrów bada sie wysokocisnieniowa chromatografia cieczowa w kilku ukladach. Glówne pasma na chromatogramie maja czasy retencji identyczne, jak ester metylowy kwasu monowego i ester me¬ tylowy kwasu pseudomonowego, co potwierdza obecnosc w hydrolizacie kwasu pseudomonowego (produktu wyjsciowego) i kwasu monowego. b) Z estru metylowego kwasu monowego Roztwór 10 mg estru metylowego kwasu mono¬ wego w 0,5 ml metanolu dodaje sie do roztworu 15 mg weglanu potasu w 0,5 ml wody. Polaczone roztwory podgrzewa sie do 60°C. Po uplywie 0,5 godziny porównanie czasów retencji w wyso¬ kocisnieniowej chromatografii cieczowej przy uzy¬ ciu próbki kwasu monowego, potwierdza obecnosc tego kwasu w hydrolizacie.Przyklad II. Kwas 3-(3R,4R-dwuhydroksy- -5S-)2S-3S-epoksy-5S-hydroksy-4S - metyloheksylo)- -2,3,5,6-czterowodoropiran-2S-ylo)12-metylopropeno- -lE-karboksylowy-1 (kwas monowy) (z ochrona) W 50 ml ortomrówczanu trójmetylu rozpuszcza sie 10 g (20 ml) kwasu pseudomonowego. Do roz¬ tworu dodaje sie 20 g kwasu p-toluenosulfonowego, po czym miesza roztwór w temperaturze pokojowej w ciagu 0,5 godziny, a nastepnie pod zmniejszo¬ nym cisnieniem odparowuje do sucha. Otrzymany olej rozpuszcza sie w 100 ml IN roztworu wodoro¬ tlenku sodu (100 ml), po czym roztwór miesza w ciagu 2 godzin w 65°C. Po zakonczeniu hydrolizy (wysokocisnieniowa chromatografia cieczowa) roz¬ twór oziebia sie i kwasem solnym doprowadza do pH 7,0. Z kolei dodaje sie 75 ml metanolu, 5N kwasem solnym doprowadza sie pH 2,0 i miesza .w ciagu 0,25 godziny w temperaturze pokojowej.Roztworem wodorotlenku sodu ponownie dopro¬ wadza sie mieszanine do pH 9—9,5 i pozostawia do pelnego przebiegu hydrolizy O-mrówczanu (okolo 3 godziny w temperaturze pokojowej, wy¬ sokocisnieniowa chromatografia cieczowa). Po do¬ prowadzeniu do pH 7,0 roztwór odparowuje sie do malej objetosci (10—20 ml), wysyca chlorkiem sodu, zalewa octanem etylu i przy mieszaniu doprowa¬ dza do pH 3,0, Warstwe octanu etylu oddziela sie, przemywa nasycona solanka, suszy nad siarczanem magnezu i odparowuje do oleju, który rozpuszcza sie w wodzie, dodajac IN roztworu wodorotlenku sodu do pH 7,5.Otrzymany roztwór soli sodowej kwasu mono¬ wego i kwasu 9-hydroksynonanowego odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem do sucha (12,64 g).Powyzsze cialo stale ekstrahuje sie etanolem (2X50 ml) i odsacza. Etanolowy przesacz odparo¬ wuje sie do sucha, otrzymujac 9,62 g soli sodowej kwasu monowego w postaci ciala stalego barwy bialej. Powyzszy produkt rozpuszcza sie w miesza¬ ninie wody z octanem etylu i zakwasza do pH 3,0.Ekstrakt przemywa sie nasycona solanka, suszy nad siarczanem magnezu i pod zmniejszonym cis¬ nieniem odparowuje do oleju (8,48 g). Rozcieranie z suchym eterem daje kwas monowy w postaci i ciala stalego barwy bialej, które odsacza sie i suszy (2,62 g, 38%). Temperatura topnienia 133—135°C (krysztaly z etanolu 146—147°C). (Znaleziono: C 59,0, H 8,2, wartosci obliczone dla C17H28O7: C 59,3, H 8,26). Chromatografia cienkowarstwowa w ukla- 10 dzie chloroform-aceton-kwas octowy 12 : 5 : 3 wy¬ kazuje obecnosc jednego skladnika o Rf = 0,44, równiez pojedynczy pik wystepuje w wysokocis¬ nieniowej chromatografii cieczowej. [a]D — 13° (c 1,0 EtOH) i —20°'(c 1,0, 1% NaHC03), vmax(KBr) 15 3300, 2960, 2950, 1690, 1640, 1450, 1250 cm"1, X 1Pax 221 nm (11200), 8 H (DMSO-d6) 5,55 (1H, s, =CH), 2,05 (3 H, s, C(CH3) =C) 1,05 (3 H, d, =CHCH3) i 0,80 (3 H, d, =CHCH3), d C (DMSO-d6) 2 sygnaly pod sygnalami DMSO), 167,3, 156,4, 117,6, 74,5, 69,4, M 68,4, 67,7, 64,6, 59,0, 54,6, 37,3, 31,47, 20,0, 18,4 i 11,6, m/e 227 (82%, M+—H20- C5H702), 141 (43%) 111, (100%).Przyklad III. Sól sodowa kwasu monowego 3,44 g (1 mM) kwasu monowego, otrzymanego w 25 przykladzie II zawiesza sie w 10 ml wody. Do mieszanej zawiesiny dodaje sie 10 ml 0,1 N roz¬ tworu wodorotlenku sodu, uzyskujac roztwór o pH 7,5, który liofilizuje sie i suszy pod zmniejszonym cisnieniem nad P205(3,66vg 100%). [a]D — 20° (c 1,0, w HzO), vmax (KBr) 3400, 2970, 1650, 1550 cm"i.I max(EtOH) 214 nm (s 14600), ó H (DMSO-d6) 5,16 (1H, s, =CH), 1,95 (3H, s, =CCH3), 1,05 (3 H, d, =CHCH3 i 0,79 (3 H, d, =CHCH3).Przyklad IV. Ulepszone wyodrebnianie kwa- 35 su monowego 1,00 g (2 mM) czystego, krystalicznego kwasu pseudomonowego rozpuszcza sie w 10 ml ortomrów¬ czanu trójmetylu i w temperaturze pokojowej mie¬ sza w ciagu 30 minut z 10 mg p-toluenosulfono¬ wego. Pod zmniejszonym cisnieniem odpedza sie rozpuszczalnik, a pozostaly olej natychmiast roz¬ puszcza w 10 ml IN NaOH (10 mM). Roztwór miesza sie w ciagu 3 godzin w 65°C, oziebia i ste¬ zonym HC1 doprowadza do pH 7,0. Dodaje sie 45 10 ml metanolu, 5N HC1 doprowadza do pH 2,0 i w ciagu 15 minut miesza w temperaturze poko¬ jowej. Z kolei za pomoca NaOH podnosi sie pH do 9,0—9,5 i utrzymuje na tym poziomie w ciagu 3 godzin, w którym to czasie nastepuje pelna hyd- 50 roliza O-mrówczanu, wykazana wysokocisnieniowa chromatografia cieczowa. Po doprowadzeniu do pH 7,0, pod zmniejszonym cisnieniem odparowuje sie roztwór do sucha. Pozostaly olej rozpuszcza sie w wódzie (20 ml) wysyconej NaCl, zalewa octanem F5 etylu i zakwasza do pH 3. Warstwe organiczna od¬ dziela sie, a warstwe wodna dalej ekstrahuje 5X50 ml octanu etylu. Polaczone ekstrakty suszy sie nad bezwodnym siarczanem magnezu i pod zmniejszonym cisnieniem odpedza rozpuszczalnik, uzyskujac 1,377 g oleju barwy zóltej. Po roztarciu z suchym eterem dwuetylowym uzyskuje sie kwas monowy (czystosc 90% w wysokocisnieniowej chromatografii cieczowej i w chromatografii cien¬ kowarstwowej) w postaci ciala stalego barwy bia- C5 lej (0,393 g). Dalsze 0,146 g ciala stalego barwy115 133 bialej uzyskuje sie z lugów macierzystych. Laczna wydajnosc wynosi 0,539 g (78%), temperatura top¬ nienia 130—133°C. Wysokocisnieniowa chromato¬ grafia cieczowa i chromatografia cienkowarstwowa (chloroform/octan etylu/kwas octowy 50 : 50 : 7) wy¬ kazuje identycznosc produktu z kwasem monowym.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowego kwasu monowego o wzorze 2 lub jego soli, znamienny tym, ze pod¬ daje sie hydrolizie w warunkach alkalicznych zwia¬ zek o ogólnym wzorze 4, w którym R oznacza gru¬ pe alkilowa o 1—4 atomach wegla lub grupe o wzo¬ rze -(CH2)8C02H lub sól albo- ester alkilowy tego kwasu o grupie alkilowej zawierajacej 1—4 ato¬ mów wegla. 10 19 2. Sposób wytwarzania nowego kwasu monowego o wzorze 2 lub jego soli, z lamienny tym, ze zwia¬ zek o ogólnym wTzorze 4, w którym R oznacza gru¬ pe alkilowa o 1—4 atomach wegla lub grupe o wzo¬ rze -(CH2)8C02H lub sól albo ester alkilowy tego kwasu o grupie alkilowej zawierajacej 1—4 ato¬ mów wegla, poddaje sie reakcji ze zwiazkiem o wzorze ogólnym 5, w którym R3 oznacza atom wo¬ doru lub grupe alkilowa o 1—6 atomach wegla, a R4, R5 i RG oznaczaja grupe alkilowa o 1—6 ato¬ mach wegla, a nastepnie hydrolizuje sie uzyskany zwiazek w srodowisku alkalicznym, po czym usu¬ wa sie grupy ochronne w slabo kwasnym srodo¬ wisku. ayoy8co2H WZOR! OH / 3 HO I CH2.C=CHC02H WZOR 2 "'. ¦¦¦¦¦-;* OH CH3. CV XV^C02" ^"^"° CH3 OH WZÓR 3115 133 CH.OH ^3 f3 ^^Cc^.^cHCO^ OH WZÓR A OR4 R-C-OR5 OR6 WZÓR 5 OZGrnf. Z.P. Dz-wo, z. 400 (904-15) 12.H2 Cenu 100 '/I PL PL PL PL PL PL PL