Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia oczyszczonych albumin zwierzecych, nadajacych sie do badan diagnostycznych.Znane jest otrzymywanie czystych bialek zwie¬ rzecych typu albumin-globulin i immunoglobulin z plazmy lub surowicy krwi. Produkty te otrzymuje sie wedlug metody Cohna, przewaznie droga frak¬ cjonowania alkoholem lub wysalania elektrolita¬ mi.Znana jest równiez metoda otrzymywania czy¬ stych frakcji bialkowych z plazmy lub krwi przez wytracanie kompleksów metalami na przyklad cynkiem.Sposoby oparte o te metode maja mniejsze zna¬ czenie ekonomiczne, sa zmudne z uwagi na ko¬ niecznosc pózniejszego usuwania metali z komplek¬ sów bialkowych.Inne znane sposoby otrzymywania preparatów . bialkowych o wyjatkowej wysokiej czystosci elek- troforetycznej i nie zmienionej czystosci struk¬ turalnej opieraja sie na stosowaniu zeli, wymienia¬ czy jonowych oraz polietylenoglikolu.Celem wynalazku jest otrzymywanie czystych albumin zwierzecych, nadajacych sie do badan diagnostyki klinicznej przy zastosowaniu jako su¬ rowca wyjsciowego frakcji odpadowej przy pro¬ dukcji immunoglobulin zwierzecych. Frakcja ta powstaje przy przerobie surowicy lub plazmy krwi zwierzecej na drodze wysalania immunoglobulin 10 20 25 30 za pomoca siarczanu sodowego i praktycznie sta¬ nowi bezuzyteczny odpad.Stwierdzono, ze z frakcji tej mozna otrzymac albuminy zwierzece o stopniu czystosci wymaga¬ nym do celów diagnostyki laboratoryjnej, jezeli proces oczyszczania prowadzi sie najpierw obni¬ zajac zawartosc siarczanu sodowego w odpadowym plynie z okolo 13% do okolo 3,5—4% przez krysta¬ lizacje w temperaturze obnizonej od 0°C—(—5)°C, a nastepnie dalsze frakcjonowanie i oczyszczanie albumin prowadzi sie w obecnosci resztek siarcza¬ nu sodowego za pomoca alkoholu etylowego.Jak bowiem stwierdzono, obecnosc niewielkiej ilosci siarczanu sodu w oczyszczonym ukladzie al¬ bumin dziala jako aktywator oddzielania sie ho- mopigmentów od albumin w trakcie procesu frak¬ cjonowania etanolem. W ukladzie tym istnieje zwiekszona sila jonowa, pochodzaca z siarczanu so¬ du, co jak stwierdzono zgodnie z wynalazkiem za¬ pewnia prawidlowy rozdzial homopigmentów od al¬ bumin.Otrzymany sposobem wedlug wynalazku produkt odznacza sie -wysoka czystoscia elektroforetyczna i bardzo mala lub sladowa zawartoscia homopig¬ mentów i w pelni odpowiada stawianym wymo¬ gom.Proces prowadzi sie poczatkowo przy wartosci pH 7 obnizajac temperature do 0°—(—5)°C. Nastepuje wtedy krystalizacja siarczanu sodu z równoczes- 114 8413 114 841 4 nym usunieciem czesci homopigmentów. Otrzymany odcinek, który zawiera glównie albuminy zanie¬ czyszczone jeszcze homopigmentami jak równiez bialkami globulinowymi doprowadza sie do pH 5,1—5,3 i zadaje etanolem do stezenia okolo 15% doprowadzajac jednoczesnie temperature stopnio¬ wo do —4°C. W warunkach tych wytracaja sie resztki bialek globulinowych oraz homopigmen¬ tów.Po oddzieleniu fazy cieklej od osadu, na drodze wirowania w temperaturze do —4°C w odcieku znajduja sie albuminy, które wymagaja dalszego oczyszczania. W tym celu doprowadza sie wartosc pH odcieku do 4,8 i zadaje oziebionym etanolem do 40% stezenia. Caly uklad oziebia sie do tempera¬ tury —8°C.Otrzymany osad zanieczyszczonej albuminy prze¬ mywa sie 40% etanolem i rozpuszcza w wodzie destylowanej do zawartosci bialka okolo 4%, do- - prowadza pH roztworu do wartosci pH 5,3 i do¬ daje NaCl w celu doprowadzenia sily jonowej roz¬ tworu od 0,3—0,6.Mieszanine oziebia sie do temperatury —5°C i doprowadza stezenie ietanolu do 25%. Powstaly o- sad balastowy oddziela sie na drodze wirowania, zas odciek po doprowadzeniu pH do 4,8 zadaje etanoleirr-"do stezenia 40% i utrzymuje temperature —8°C.Wytracony osad albumin oddziela sie przez wi¬ rowanie i poddaje dializie, a nastepnie suszeniu poprzez liofilizacje kib metoda roizpylowa.Do korekty wartosci pH stosuje sie odpowiednio 1 n HC1 lub 1 n NaOH.Albuminy oczyszczane sposobem wedlug wyna¬ lazku sa wolne od homopigmentów i w pelni od¬ powiadaja wymogom stawianym dla preparatów stosowanych w diagnostyce klinicznej.Siarczan sodu wyodrebniony w trakcie tego pro¬ cesu i po rekrystalizacji stanowi chemiczny siar¬ czan sodu.Przyklad I. W ,100 kg surowicy bydlecej o pH 7,0—7,8 rozpuszcza sie w temperaturze +37°C— —+39°C 14,5 kg bezwodnego siarczanu sodu. Wy¬ pada gesty osad globulin bedacy w przewazajacej czesci gammaglobulina.Osad ten po odwirowaniu stanowi produkt wyj¬ sciowy do otrzymania w toku dalszego oczyszcza¬ nia immunoglobuliny bydlecej do uzytku wetery¬ naryjnego.Równoczesnie otrzymuje sie okolo 100 kg cen¬ tryfugatu bedacego plynem odpadowym, zawiera¬ jacym alfa, beta, gammaglobuliny (w niewielkiej ilosci) oraz prawie cala albumine. Zawartosc bialka spada z 7% wyjsciowych na okolo 5,5% w plynie odpadowym z czego okolo 3% stanowia albuminy.Plyn ten oziebia sie do —3°C pozwalajac na po¬ wolna krystalizacje siarczanu sodu w ciagu 2—3 dni.W temperaturze bliskiej zera odsacza sie krysta- lizat od plynu. Otrzymuje sie okolo 75 1 filtratu zawierajacego okolo 3,5% siarczanu sodu i okolo 6% bialka.Za pomoca In HC1 koryguje sie pH roztworu do 5,3, obniza stopniowo temperature do —4°C wkraplajac do. stezenia 15!% oziebiony bezwodny etanol. Wypada osad dalszych globulin balasto¬ wych.Po odwirowaniu otrzymuje sie osad balastowy oraz okolo 80 dm3 centryfugatu o zawartosci oko¬ lo 3% bialka.. Obnizajac pH do 4,8 wkrapla sie o- ziebiony etanol do stezenia 40% w temperaturze —8°C. Wypada zanieczyszczony osad albuminowy w ilosci okolo 10 kg. Osad przemywa sie 40(% e- tanolem i otrzymuje sie lekko zanieczyszczone al¬ buminy prawie wolne od siarczanu sodu. Osad ten rozpuszcza sie w 50 1 wody destylowanej do za¬ wartosci bialka okolo 41% i doprowadza sie pH do 5,3 za pomoca In NaOH i dodaje sie 900 g NaCL Nastepnie obniza sie stopniowo temperature do —5°C dodajac oziebiony etanol do stezenia 25%.Wypadaja resztki zanieczyszczen globulinowych.Osad balastowy oddziela sie przez wirowanie.Otrzymane okolo 60 1 centryfugatu po obnizeniu pH ponownie do 4,8 za pomoca In HC1 doprowadza sie do koncentracji etanolu równej 40%. Obnizajac stopniowo temperature do —8°C wypada okolo 7 kg jasnego osadu albuminy zwierzecej.Otrzymany osad zawiesza sie do dializy celem otrzymania roztworu o niskiej zawartosci soli i poddaje sie nastepnie liofilizacji. Otrzymany pro¬ szek w ilosci okolo 1,2 kg jest koncowym prepa¬ ratem. Jego czystosc elektroforetyczna w buforze weronalowym o pH 8 i sile jonowej 0,075 wynosic musi nie mniej niz 95%v Produkt moze zawierac do 1% popiolu. Wilgo¬ ci nie mniej niz 2%. Wydajnosc procesu okolo 40%.Zastrzezenie patentowa 60 Sposób otrzymywania oczyszczonych albumin zwierzecych, nadajacych sie zwlaszcza do badan diagnostycznych, polegajacy na frakcjonowaniu al¬ koholem lub wysalaniu elektrolitami, znamienny ©5 tym, ze frakcje odpadowe przy produkcji immuno- 15 20 25 30 Przyklad II. Do 100 1 plazmy bydlecej o pH 7,0 dodaje sie 7,0 kg bezwodnego siarczanu sodu.Wypada osad fibrynogenu w ilosci okolo 3,0 kg.Powstaly osad odwirowuje sie. Do centryfugatu w ilosci 92 1 dodaje sie 6,9 kg bezwodnego siar¬ czanu sodu. Wypada gesty osad globulinowy sta¬ nowiacy produkt wyjsciowy do otrzymania im- munoglobulin bydlecych. Dalsze postepowanie jak w przykladzie I.Przyklad III. Do momentu otrzymania diali¬ zatu proces oczyszczania albumin przebiega zgodnie z opisem w przykladzie I. Otrzymany dializat pod- 50 daje sie suszeniu w suszarni rozpylowej. Otrzyma¬ ny proszek "stanowi produkt finalny albuminy by¬ dlecej do celów diagnostycznych.Sucha albumina otrzymana w procesie suszenia metoda rozpylowa rózni sie od otrzymanej na dro- 55 dze liofilizacji jedynie postacia zewnetrzna. Tak o- trzymana albumina ma postac zbita drobnokoloi- dalna i rozpuszcza sie nieco wolniej.114 841 5 6 globulin uwalnia sie od nadmiaru siarczanu sodo- w plynie odpadowym, a nastepnie dalsze frakcjo- wego przez krystalizacje w temperaturze od 0 do nowanie i oczyszczanie albumin prowadzi sie w ^°C do zawartosci 3,5—4°/o siarczanu sodowego znany sposób. PL