Przedmiotem wynalazku jest sposób unieruchamiania izomerazy glukozowej, stosowanej przy wytwarzaniu syropu wysokofruktozowego, nadajacej sie do uzytku w ciaglym procesie izomeryzacji glukozy do fruktozy.Dotychczas znanych jest szereg sposobów unieruchamiania enzymu izomerazy glukozowej, zezwalajacych na ponowne uzycie enzymu w procesie ciaglym, z czego czesc dotyczy unieruchomienia izomerazy glukozowej wyodrebnionej z macierzystego mikroorganizmu i czesciowo oczyszczonej. Sposoby prowadzone z zastosowa¬ niem rozpuszczalnych preparatów izomerazy glukozowej, zezwalaja wprawdzie na uzyskanie wysokiej aktywnosci preparatu, jednakze wyodrebnianie izomerazy glukozowej z komórek macierzystego organizmu i oczyszczanie go jest procesem pracochlonnym i kosztownym. Nadto w operacji tej zachodzi czesciowa inaktywacja enzymu.Inne znane sposoby, zmniejszajace wyzej wymienione niedogodnosci, dotycza unieruchamiania calych komórek zawierajacych izomeraze glukozowa. Najprostszy sposób, opisany w opisie patentowym Stanów Zjedno¬ czonych Ameryki nr 3788945, polega na unieruchomieniu izomerazy glukozowej w komórkach macierzystego mikroorganizmu. Inny opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3838007 podaje sposób unierucho¬ mienia komórek zawierajacych izomeraze glukozowa poprzez okluzje w zelatynie, natomiast w opisie patento¬ wym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3758396 opisano sposób unieruchomienia komórek na kolagenie. Zna¬ ny jest takze sposób unieruchamiania komórek zawierajacych izomeraze na wlóknach celulozowych opisany, w czasopismie „Proces Biochemistry", 12/7-8/, 14, 1977.We wszystkich znanych sposobach unieruchamiania komórek zawierajacych aktywna izomeraze glukozowa odzysk aktywnosci enzymu w preparacie nie przekracza 60%.Stwierdzono, ze zgodnie z wynalazkiem komórki bakteryjne, zawierajace izomeraze glukozowa, mozna unieruchomic sposobem radiacyjnej polimeryzacji akryloamidu w stanie zamrozonym, uzyskujac preparat cha¬ rakteryzujacy sie wysokim odzyskiem aktywnosci enzymu.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze do zawiesiny komórek zawierajacych aktywna izomeraze glukozowa, dodaje sie roztwór zawierajacy akryloamid, N,N'-metylenobisakryloamid i dekstran, po czym po dokladnym wymieszaniu skladników, calosc poddaje sie szybkiemu zamrozeniu, korzystnie w cieklym azocie.2 113309 Tak otrzymany uklad poddaje sie w stanie zamrozonym, korzystnie w temperaturze -196°C napromieniowaniu dawka 1-5 kGy z szybkoscia dawkowania 1—2 kGy/godzine. Nastepnie przechowuje sie uzyskany preparat w temperaturze od —10 do —20°C w czasie do 24 godzin w celu zainicjowania polimeryzacji poradiacyjnej, po czym rozmraza sie preparat powoli do temperatury pokojowej, zas otrzymany zel homogenizuje sie, przemywa dokladnie woda destylowana w celu usuniecia monomerów, suszy i rozdrabnia do zadanej srednicy ziaren, ko¬ rzystnie 0,1—0,5 mm.W sposobie wedlug wynalazku na 1-3% wagowych komórek zawierajacych aktywna izomeraze glukozowa stosuje sie mieszanine zawierajaca 15-25% wagowych akryloamidu, 0,5-2% wagowych N.N^metylenobisakrylo- amidu oraz 1-4% wagowych dekstranu.Dodatek w sposobie wedlug wynalazku monomeru dwufunkcyjnego NjN^metylenobisakryloamidu, jako czynnika sieciujacego, oraz dekstranu, generujacego aktywne osrodki polimeryzacji, zezwala na obnizenie dawki t "tMromieniowania jyezbednej do zainicjowania polimeryzacji. Prowadzenie polimeryzacji w bloku, w ukladzie za- Wóz0nym,'zaz£ta|a na stosowanie dowolnej skali procesu.; Komórki zabierajace izomeraze glukozowa unieruchomione sposobem wedlug wynalazku wykazuja duza I tfwaio*6f^yczf)ai bardzo dobra stabilnosc i Wysoki odzysk aktywnosci, wynoszacy 85-95%. Jest to szczególnie korzystnej.gdyz odzysk aktywnosci w znanych dotychczas sposobach nie przekracza 60%.Komórki zawierajace izomeraze glukozowa unieruchomione sposobem wedlug wynalazku, znajduja szcze¬ gólne zastosowanie w procesie izomeryzacji glukozy prowadzonym w systemie kolumnowym.Sposób wedlug wynalazku zilustruje blizej, podany nizej przyklad nie ograniczajacy jego zakresu.Przyklad. Do 20 ml 0,1 M buforu fosforanowego o pH = 7,0 dodano 2,5 g komórek Actinoplanes missouriensis zawierajacych aktywna izomeraze glukozowa. Zawiesine komórek zmieszano szybko z roztworem zawierajacym 20 g akryloamidu i 1 g N^-metylenobisakryloamidu rozpuszczonych w 70 ml wody destylowanej oraz 2g dekstranu rozpuszczonego w 10 ml wody destylowanej, po czym natychmiast zamrozono w cieklym azocie w temperaturze -196°C. Zamrozony blok napromieniono w temperaturze —196°C dawka 4 kGy z szybkoscia dawkowania - 2 kGy/h. Napromieniony preparat przechowywano w temperaturze -15°C w czasie 24 godzin, po czym rozmrozono go do temperatury pokojowej. Otrzymany w wyniku powyzszych operacji zel, rozdrobniono w homegenizatorze oraz przemyto woda destylowana. Przemyte ziarna wysuszono w temperaturze pokojowej na powietrzu, a nastepnie rozdrobniono i przesiano przez sita o srednicy otworów 0,44 mm.Otrzymano preparat, który wykazywal 90% poczatkowej aktywnosci komórek oraz wykazywal odpornosc na wymywanie enzymu.Unieruchomiona sposobem wedlug wynalazku izomeraze glukozowa, wykorzystano w procesie izomeryza¬ cji glukozy prowadzonym w systemie kolumnowym. W tym celu 10 g unieruchomionego enzymu umieszczono w kolumnie 2,5 x 15 z plaszczem grzejnym utrzymujacym temperature 60°C. Do reakcji uzyto 40% roztwór glukozy oczyszczonej na weglu aktywnym z dodatkiem 10"2M jonów Mg2+ w postaci MgS04*7H20 i 10"3M jonów Co2+ w postaci CoCl2*6H20 o pH = 7,0. Roztwór substratu pompowano przez kolumne od dolu ku górze z szybkoscia 15 ml/h. Osiagniety stopien konwersji glukozy do fruktozy okreslony metoda polarymetryczna wynosil 42%. W miare trwania procesu, celem utrzymania stalego stopnia konwersji, zmniejszano szybkosc przeplywu roztworu substratu przez kolumne wypelniona unieruchomionym enzymem. Wyznaczono czas, po którym aktywnosc unieruchomionej izomerazy glukozowej spadla do polowy. Czas ten wynosil 300 godzin.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób unieruchamiania izomerazy glukozowej, znamienny tym, ze do zawiesiny komórek, zawierajacych aktywna izomeraze glukozowa dodaje sie roztwór, zawierajacy akryloamid, N^-metylenobisakry- loamid i dekstran, po czym, po dokladnym wymieszaniu skladników, calosc poddaje sie szybkiemu zamrozeniu, korzystnie w cieklym azocie i w stanie zamrozonym poddaje sie napromieniowaniu dawka 1—5 kGy z szybkoscia dawkowania 1—2 kGy/h, nastepnie przechowuje sie uzyskany preparat w temperaturze od —10 do -20°G, w cza¬ sie nie przekraczajacym 24 godziny, po czym rozmraza sie preparat powoli do temperatury pokojowej, a otrzy¬ many zel homogenizuje sie, przemywa woda destylowana, suszy i rozdrabnia do zadanej srednicy ziaren, korzy¬ stnie 0,1-0,5 mm. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze na 1-3% wagowych komórek zawierajacych aktywna izomeraze glukozowa stosuje sie roztwór zawierajacy w procentach wagowych 15—25% aikryloamidu, 0,5—2,0% N,N'-metylenobisakryloamidu oraz 1-4% dekstranu.Prac. Poljgr. UP PRL. Naklad 120 + 18 egz.Cena 45 zl. PL