PL104946B1 - Sposob otrzymywania estru metylowego l-piroglutamylo-l-histydyny - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania estru metylowego L-piroglutamylo-L- histydyny, przeznaczonego do wytwarzania peptydów, w szczególnosci tyreoliberyny, luliberyny, ich fragmentów i analogów.

Znane dotychczas sposoby otrzymywania estru metylowego L-piroglutamylo-L-histydyny opisano ponizej ujmujac je w dwie grupy.

Pierwsza grupa starszych sposobów otrzymywania estru metylowego L-piroglutamylo-L- histydyny obejmuje dwa sposoby trójetapowe. Kazdy z nich sklada sie z nastepujacych etapów: w etapie pierwszym chroni sie azot laktamowy kwasu L-piroglutaminowego przez wytworzenie kwasu benzyloksykarbonylo-L-piroglutaminowego, w etapie drugim przereagowuje sie go z estrem metylowym L-histydyny i w etapie trzecim — usuwa oslone benzyloksykarbonylowa. Sposoby te róznia sie rodzajem czynnika aktywujacego w etapie drugim. W pierwszym sposobie jest to dicykloheksylokarbodiimid, w drugim — mieszany bezwodnik. Sumaryczna wydajnosc konco¬ wego produktu w sposobie pierwszym wynosi 26%, w sposobie drugim — 59%, w obu przypadkach w przeliczeniu na kwas L-piroglutaminowy. W drugim sposobie wymagane jest jednakze oczy¬ szczanie pólproduktu, a mianowicie estru metylowego benzyloksykarbonylo-L-piroglutamylo-L- histydyny przy uzyciu kolumny chromatograficznej, co jest klopotliwe.

Grupa sposobów otrzymywania estru metylowego L-piroglutamylo-L-histydyny, opisana w powyzszym ustepie, z powodu wieloetapowosci konsumuje czas, energie, odczynniki i rozpuszczal¬ niki. Wydajnosci koncowego produktu sa albo niskie, albo uzyskiwane przy zastosowaniu klopot¬ liwych technik laboratoryjnych.

Druga grupa sposobów otrzymywania estru metylowego L-piroglutamylo-L-histydyny to sposoby nowsze charakteryzujace sie tym, ze we wszystkich wychodzi sie z wolnego, tj. niechronio- nego na azocie laktamowym, kwasu L-piroglutaminowego. W pierwszym z nich — jednoetapo¬ wym — jako czynnika aktywujacego uzywa sie dicykloheksylokarbodiimidu. Podawana wydajnosc oryginalnej syntezy wynosi 55%. Przy próbach powtórzenia tego sposobu stwierdzono jednak niedostateczna czystosc produktu do dalszych celów preparatywnych. Tak otrzymany produkt trzeba kilkakrotnie krystalizowac, co bardzo znacznie obniza wydajnosc. Fakt ten spowo¬ dowal opracowanie dalszych — tym razem dwuetapowych — sposobów otrzymywania estru metylowego L-piroglutamylo-L-histydyny. Polegaja one na tym, ze w pierwszym etapie wytwarza2 104 946 sie, izoluje i krystalizuje forme aktywna kwasu L-piroglutaminowego, tj. esteraktywny, a w drugim etapie — przereagowuje go z estrem metylowym L-histydyny. W pierwszym sposobie forma aktywna jest ester 4-nitrogwajakolowy, w sposobie drugim — ester 2,4,5-trójchlorofenolowy.

Sumaryczna wydajnosc produktu koncowego w sposobie pierwszym wynosi 35%, a w drugim sposobie — 42%, w obydwu przypadkach w przeliczeniu na kwas L-piroglutaminowy.

Jak z powyzszego ustepu widac, jednoetapowy sposób otrzymywania estru metylowego L-piroglutamylo-L-histydyny z wolnego kwasu L-piroglutaminowego nie zdal egzaminu, a spo¬ soby dwuetapowe konsumuja czas, energie, odczynniki i rozpuszczalniki, a poza tym sa malo wydajne.

, Natomiast znanej metody syntezy wiazan peptydowych przy pomocy dicykloheksylokarbodii- midu i l-hydroksybenzotriazolu, laczacej w sobie zalety bezposredniej metody z dicykloheksylo- karbodiimidem i metody estrów aktywnych a eliminujacej wady obydwu metod, nie stosuje sie do syntezy peptydów rozpuszczajacych sie w wodzie (do których nalezy ester metylowy L- piroglutamylo-L-histydyny), gdyz nie mozna w prosty sposób, bez uzycia kolumny chromatografi¬ cznej, oddzielic l-hydroksybenzotriazolu od tych peptydów.

Celem niniejszego wynalazku jest opracowanie sposobu otrzymywania estru metylowego L-piroglutamylo-L-histydyny z wolnego kwasu L-piroglutaminowego w postepowaniu jednoeta¬ powym, cechujacym sie wysoka wydajnoscia koncowego produktu i latwoscia jego wydzielania z mieszaniny poreakcyjnej.

Istota wynalazku jest otrzymywanie estru metylowego L-piroglutamylo-L-histydyny z kwasu L-piroglutaminowego i estru metylowego L-histydyny w srodowisku rozpuszczalnika organi¬ cznego, w obecnosci l-hydroksybenzotriazolu i dicykloheksylokarbodiimidu jako czynników aktywujacych. Po reakcji kondensacji kwasu L-piroglutaminowego i estru metylowego L- histydyny oddziela sie dicykloheksylomocznik, usuwa fcczpuszczalnik, pozostalosc rozpuszcza w metanolu, dodaje trietyloamine i ester metylowy L-piroglutamylo-L-histydyny wyodrebnia przez wytracenie eterem etylowym i nastepnie poddaje go krystalizacji, rozpuszczajac w metanolu i wytracajac eterem etylowym.

Sposobem wedlug wynalazku otrzymuje sie ester metylowy L- piroglutamylo-L-histydyny z wydajnoscia rzedu 85% chromatograficznie jednorodny, o prawidlowej temperaturze topnienia mieszczacej sie w waskim przedziale. Efekt ten uzyskuje sie, po pierwsze, dzieki udzialowi w srodowisku reakcji 1-hydroksybenzotriazolu, który powoduje zmniejszenie reakcji ubocznych, konstytucyjnych i sterycznych w porównaniu do przebiegu reakcji przy uzyciu samego dicyklohe¬ ksylokarbodiimidu jako czynnika aktywujacego, po drugie, zastosowanie do wyodrebnienia pro¬ duktu dodatku trietyloaminy powoduje wiazanie l-hydroksybenzotriazolu na sól o innych wlasciwosciach rozpuszczalnosci niz ester metylowy L-piroglutamylo-L-histydyny, co stwarza latwosc wydzielenia koncowego produktu z mieszaniny poreakcyjnej w drodze prostej krystaliza¬ cji. Opracowany sposób charakteryzuje sia prostota wykonania, krótkim czasem prowadzacym do produktu koncowego i znacznie mniejszym zuzyciem odczynników i rozpuszczalników w stosunku do sposobów znanych.

Wynalazek ilustruje przyklad.

Przyklad. 18.45 g (109 mM) estru metylowego L-histydyny rozpuszczono w 47 ml dimetylo¬ formamidu, dodano 12.91 g (100 mM) kwasu L-piroglutaminowego i 16.90 g (100 mM) wodzianu l-hydroksybenzotriazolu i mieszano do rozpuszczenia. Roztwór oziebiono do —10°C i dodano w trzech porcjach, przy intensywnym mieszaniu, roztwór 22.69 g(l 10mM) dicykloheksylokarbodii¬ midu w 10 ml dimetyloformamidu. Reakcje prowadzono godzine w temperaturze od —5°C do 0°C i 16 godzin w temperaturze 20°C. Odsaczono dicykloheksylomocznik a rozpuszczalnik odparowano pod cisnieniem 5 mm Hg w temperaturze 40°C do amorficznego proszku. Pozostalosc rozpu¬ szczono w 60 ml absolutnego metanolu, dodano 13.91 ml (100 mM) trietyloaminy i 100 ml absolut¬ nego eteru etylowego, wytracono surowy produkt, który krystalizowano przez ponowne rozpuszczenie w metanolu i wytracenie eterem etylowym. Otrzymano 24.00 g estru metylowego L-piroglutamylo-L-histydyny, co stanowi 85% wydajnosci. Ester ma temperature topnienia 211.5-213.5°C (podawane w literaturze temperatury topnienia mieszcza sie w przedziale od 199-201°C do 212-214°C), i na 0,20 mm warstwie silikazelu jest chromatograficznie jednorodny w nastepujacych ukladach rozpuszczalników:104946 chloroform — dioksan — metanol — stez. amoniak (12:5:7:1) Rf=0.49 n — butanol — kwas octowy — octan etylu — woda (1:1:1:1) Rf=0.50 n — butanol — kwas octowy — pirydyna — woda (5:1:4: l) = Rf=0.44 2 — butanol — pirydyna — kwas octowy — woda (10:15:2:15) Rf=0.35 chloroform — metanol (1:10) Rf=0.52 etanol — woda (7:3) Rf=0.52 Skrecalnosc wlasciwa [a]22546 =—36° (cl, H2O) [a]2°D = —52° (c 1, kwas octowy).

Analiza dla wzoru C12H16N4O4 (M = 280.12) Obliczone: C 51.44% H 5.71% N 19.99% Znalezione: C 51.45% H 5.89% N 20.00%

Claims (1)

Zastrzezenie patentowe Sposób otrzymywania estru metylowego L-piroglutamylo-L-histydyny z kwasu L- piroglutaminowego i estru metylowego L-histydyny w srodowisku rozpuszczalnika organicznego, w obecnosci

1. -hydroksybenzotriazolu i dicykloheksylokarbodiimidu jako czynników aktywuja¬ cych, znamienny tym, ze po reakcji kondensacji kwasu L-piroglutaminowego i estru metylowego L-histydyny oddziela sie dicykloheksylomocznik, usuwa rozpuszczalnik, pozostalosc rozpuszcza w metanolu, dodaje trietyloamine i ester metylowy L-piroglutamylo-L-histydyny wyodrebnia przez wytracenie eterem etylowym i nastepnie poddaje krystalizacji, rozpuszczajac w metanolu i wytraca¬ jac eterem etylowym.