OA18055A - Anticancer thiosemicarbazone targeting human ribosome L36AL. - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne la Thiosemicarbazone anticancéreuse ciblant le L36AL du ribosome humain. Il s'agit des molécules candidates pour la conception des médicaments anticancéreux. Avantageusement lesdites molécules présentent des propriétés thérapeutiques anti tumorales. En particulier ces molécules sont issues de la condensation d'un substrat (thiosemicarbazides) et d'un réactif (composés carbonylés contenu dans l'huile essentielle de Cymbopogon citrates) caractérisées en ce qu'elles présentent d'intéressantes activités biologiques in vitro dont notamment : l'activité anti tumorale, ainsi que leur utilisation dans la conception des médicaments notamment pour le traitement du cancer. L'essence de l'invention repose sur l'action inhibitrice des molécules (1 : UCK-159, 2 : UCK36, 3 : UCK-37 et 4 : UCK-160 selon le tableau 1) sur le crosslink issu de l'interaction entre la protéine L36AL et le tRNAox. En particulier elles comportent des propriétés thérapeutiques anti tumorales caractérisées en ce que, par leur action inhibitrice sur l'interaction entre la protéine L36AL et le tRNAox, elles bloquent le développement du cancer en arrêtant la prolifération des cellules cancéreuses. The present invention relates to the anticancer Thiosemicarbazone targeting L36AL of the human ribosome. These are candidate molecules for the design of anticancer drugs. Advantageously, said molecules exhibit anti-tumor therapeutic properties. In particular, these molecules result from the condensation of a substrate (thiosemicarbazides) and of a reagent (carbonyl compounds contained in the essential oil of Cymbopogon citrates) characterized in that they exhibit interesting biological activities in vitro including in particular : anti-tumor activity, as well as their use in the design of medicaments, in particular for the treatment of cancer. The essence of the invention is based on the inhibitory action of the molecules (1: UCK-159, 2: UCK36, 3: UCK-37 and 4: UCK-160 according to Table 1) on the crosslink resulting from the interaction between the L36AL protein and tRNAox. In particular, they have anti-tumor therapeutic properties characterized in that, by their inhibitory action on the interaction between the L36AL protein and tRNAox, they block the development of cancer by stopping the proliferation of cancer cells.
Description
Thiosemicarbazone anticancéreuse ciblant le ribosome humainAnticancer thiosemicarbazone targeting the human ribosome
La présente invention concerne des molécules candidates pour la conception des médicaments anticancéreux. Avantageusement lesdites molécules présentent des propriétés thérapeutiques anti tumorales. En particulier ces molécules sont issues de la condensation d’un substrat (thiosemicarbazides) et d’un réactif (composés carbonylés contenu dans l’huile essentielle de Cymbopogon citratus) caractérisées en ce qu’elles présentent d’intéressantes activités biologiques in vitro dont notamment: l’activité antimicrobienne ainsi que leur utilisation dans la conception des médicaments notamment pour le traitement du cancer.The present invention relates to candidate molecules for the design of anticancer drugs. Advantageously, said molecules exhibit anti-tumor therapeutic properties. In particular, these molecules result from the condensation of a substrate (thiosemicarbazides) and of a reagent (carbonyl compounds contained in the essential oil of Cymbopogon citratus) characterized in that they exhibit interesting biological activities in vitro including in particular : antimicrobial activity as well as their use in the design of drugs, especially for the treatment of cancer.
Dans le monde entier, le cancer constitue un problème de santé publique majeur car étant largement répandu. Aussi son traitement fait il l’objet de recherche continue. En effet, le cancer est une maladie caractérisée par une prolifération cellulaire anormalement importante au sein d'un tissu de l'organisme. C'est un phénomène qui touche n’importe quelle partie du corps (organes, tissus). Il dérive d’un clone de cellule ayant acquis certaines propriétés leurs permettant de se multiplier indéfiniment. Cependant bien que traitable, les études statistiques effectuées par l’organisation mondiale de la santé (OMS) en 2012 dénombrent près de 8,2 millions de décès soit 13% de mortalité, et environ 70% de mortalité dû au cancer dans les pays en voie de développement. Responsable de la grande partie de mortalité, il est réparti sous différents types dont notamment: le cancer du poumon (1,59 million de décès), le cancer du foie (745 000 décès), le cancer de l’estomac (723 000 décès), le cancer colorectal (694 000 décès), le cancer du sein (521 000 décès), le cancer de l'œsophage (400 000 décès) etc. OMS., 2012. Cet état de chose a mis en branle toute la communauté scientifique qui ne cesse d’investir dans les recherches pour concevoir des modes de traitement et des remèdes efficaces. Par traitement il faut entendre tout acte destiné à améliorer l’état de santé des patients que ce soit par des soins curatifs ou préventifs. Ce terme fait également référence à l'amélioration ou l'éradication d'une maladie ou des symptômes associés à une maladie (qui est ici le cancer). Mais les traitements existant ne répondent pas encore aux besoins de l’état de la technique.Throughout the world, cancer is a major public health problem because it is widespread. Its treatment is therefore the subject of continuing research. Indeed, cancer is a disease characterized by an abnormally high cell proliferation within a tissue of the body. It is a phenomenon that affects any part of the body (organs, tissues). It is derived from a cell clone that has acquired certain properties that allow them to multiply indefinitely. However, although treatable, statistical studies carried out by the World Health Organization (WHO) in 2012 counted nearly 8.2 million deaths, i.e. 13% mortality, and around 70% mortality due to cancer in developing countries. developing. Responsible for the large part of mortality, it is divided into different types including: lung cancer (1.59 million deaths), liver cancer (745,000 deaths), stomach cancer (723,000 deaths ), colorectal cancer (694,000 deaths), breast cancer (521,000 deaths), cancer of the esophagus (400,000 deaths) etc. WHO., 2012. This state of affairs has set in motion the entire scientific community, which continues to invest in research to design effective methods of treatment and remedies. Treatment should be understood to mean any act intended to improve the state of health of patients, whether through curative or preventive care. This term also refers to the amelioration or eradication of a disease or symptoms associated with a disease (which here is cancer). But the existing treatments do not yet meet the needs of the state of the art.
A nos jours les traitements adaptés nécessitent une combinaison thérapeutique comprenant une ou plusieurs modalités dont la chirurgie et/ou la radiothérapie, et/ ou la chimiothérapie, et/ ou l’hormonothérapie, la thérapie génique, etc. Cependant, nombre de ces traitements restent coûteux et présentent divers inconvénientsToday, suitable treatments require a therapeutic combination comprising one or more modalities including surgery and / or radiotherapy, and / or chemotherapy, and / or hormone therapy, gene therapy, etc. However, many of these treatments remain expensive and have various drawbacks.
Dans le cas de la chirurgie qui permet d'éliminer les cellules cancéreuses et d'arrêter leur prolifération après l’opération, le mode opératoire ainsi que la tumeur doivent être définis et localisés avec précision avant l’intervention. Malgré son coût élevé II est souvent difficile avec ce mode de traitement d’éliminer toutes les cellules cancéreuses puisque les environs de la tumeur sontIn the case of surgery, which eliminates cancer cells and stops their proliferation after the operation, the procedure and the tumor must be defined and precisely located before the operation. Despite its high cost It is often difficult with this method of treatment to eliminate all cancer cells since the surrounding area of the tumor is
atteints de cellules cancéreuses qui peuvent reprendre leurs processus de développement (risque de récidive).with cancer cells which can resume their developmental processes (risk of recurrence).
Pour la radiothérapie, elle consiste à exposer une partie précise du corps à des radiations ionisantes, rayons X et électrons produits par les accélérateurs linéaires, plus rarement maintenant les rayons gamma produits par les bombes au cobalt. Il est donc nécessaire de déterminer la partie de la tumeur concernée qui sera irradiée. Généralement au cours de ce mode de traitement à cout très élevé les rayonnements ionisants produits éliminent aussi bien les cellules cancéreuses que saines, ce qui s’explique chez le patient par des phénomènes inflammatoires (type brûlures internes ou externes) (P. Hammel et al., Mars 2016).For radiotherapy, it consists of exposing a specific part of the body to ionizing radiation, X-rays and electrons produced by linear accelerators, more rarely now the gamma rays produced by cobalt bombs. It is therefore necessary to determine the part of the tumor concerned which will be irradiated. Generally during this mode of treatment at very high cost, the ionizing radiation produced eliminates both cancerous and healthy cells, which is explained in the patient by inflammatory phenomena (such as internal or external burns) (P. Hammel et al. ., March 2016).
En ce qui concerne l’immunothérapie, elle est une méthode de traitement destinée à modifier les moyens de défense naturels de l'organisme, soit par injection de sérum ou d'immunoglobuline qui apporte les anticorps spécifiques (immunothérapie passive), soit par la vaccinothérapie qui suscite la production de ces anticorps (immunothérapie active).Regarding immunotherapy, it is a treatment method intended to modify the body's natural means of defense, either by injection of serum or immunoglobulin which provides specific antibodies (passive immunotherapy), or by vaccine therapy. which causes the production of these antibodies (active immunotherapy).
Dans le traitement contre le cancer, elle a pour but de venir en aide à l'organisme ou plus exactement au système immunitaire pour non seulement combattre la maladie mais aussi pour protéger le corps contre certains effets secondaires provoqués par les traitements, cependant, la biodisponibilité des immunoglobulines(antigènes ou anticorps) dans la lutte contre le cancer pose le problème de dérèglement du système immunitaire puisque l’organisme grâce à son système immunitaire est autorisé à combattre les cellules du soi, « les cellules cancéreuses ». Aussi ce mode de traitement ne concerne t-il que peu de patients, essentiellement ceux disposant des moyens nécessaires puisqu’il coûte excessivement cher dans son élaboration en amont (congrès Américain sur le cancer, 2013).In the treatment against cancer, it aims to come to the aid of the organism or more exactly the immune system to not only fight the disease but also to protect the body against certain side effects caused by the treatments, however, the bioavailability immunoglobulins (antigens or antibodies) in the fight against cancer poses the problem of deregulation of the immune system since the organism, thanks to its immune system, is authorized to fight the cells of the self, "cancer cells". This method of treatment therefore concerns only a few patients, mainly those with the necessary means since it is excessively expensive to develop upstream (American Congress on Cancer, 2013).
Par rapport à l’hormonothérapie, elle est une thérapie qui consiste à lutter contre un certain type de cancers qui utilisent les hormones pour se développer. Ce traitement a donc pour but d'empêcher les cellules cancéreuses de capter et d'utiliser les hormones dont elles ont besoin. Il s'agit donc de substances antihormones. Ce traitement inclut des médicaments dont l'action consiste à stopper la production de certaines hormones et à modifier leur fonctionnement.Compared to hormone therapy, it is therapy that works against a certain type of cancer that uses hormones to develop. This treatment therefore aims to prevent cancer cells from picking up and using the hormones they need. They are therefore antihormone substances. This treatment includes drugs whose action consists of stopping the production of certain hormones and modifying their functioning.
L'hormonothérapie peut parfois nécessiter un acte chirurgical destiné à retirer les organes, tels les ovaires ou les testicules, qui fabriquent des hormones. Cependant ce traitement présente plusieurs limites dont le cout élevé ainsi que les effets secondaires : les fatigues, la rétention d'eau, la prise de poids, bouffées de chaleur, nausées et vomissements, modification de l'appétit, saignements utérins.Hormone therapy can sometimes require surgery to remove organs, such as the ovaries or testes, that make hormones. However, this treatment has several limitations including high cost as well as side effects: fatigue, fluid retention, weight gain, hot flashes, nausea and vomiting, change in appetite, uterine bleeding.
Relativement à la thérapie génique, elle constitue un autre mode de traitement d'un trouble génétique par lequel on insère ou intègre de nouveaux gènes dans les cellules humainesRelative to gene therapy, it constitutes another mode of treatment of a genetic disorder by which new genes are inserted or integrated into human cells.
cancéreuses. Elle présente néanmoins des limites notamment en ce qui concerne le cout mais aussi elle peut conduire à d’autres formes de pathologie dues aux vecteurs (adéno virus, rétro virus, adénoretro assossiés) utilisés pour intégrer les gènes toxiques dans la cellule cancéreuse afin de l’éliminer.cancerous. However, it has limits, particularly with regard to cost, but also it can lead to other forms of pathology due to vectors (adeno virus, retro virus, adenorethro assossiates) used to integrate toxic genes into the cancer cell in order to 'eliminate.
Quant à la chimiothérapie, c’est le mode de traitement par lequel les cellules cancéreuses sont détruites grâce à des molécules cytotoxiques qui constituent les principes actifs des médicaments anticancéreux utilisés comme la 5-Fluoro-Uracile (5-FU) qui se lie à la thymidilatesynthétase, et bloque la méthylation de l'uracile en thymine.As for chemotherapy, it is the mode of treatment by which cancer cells are destroyed thanks to cytotoxic molecules which constitute the active principles of the anticancer drugs used such as 5-Fluoro-Uracil (5-FU) which binds to the thymidilatesynthetase, and blocks the methylation of uracil to thymine.
Il n'y a pas de médicament spécifique aux cellules cancéreuses : tous les médicaments utilisés sont toxiques aussi bien pour les cellules cancéreuses que normales. Cette thérapie exige dans la majeure partie du temps l’association de plusieurs médicaments afin d’augmenter l’efficacité, ce qui présente pour le sujet plusieurs effets indésirables au cours du traitement dont : les pertes de cheveux ou alopathie, les mucites, les troubles digestifs, les fatigues, la thrombopénie (diminution des plaquettes sanguins), la neutropénie (dimunition des globules blancs) ( Chibaudel et al., 2015), l’anémie les fièvres et même la mort quelque fois. Or c’est la chimiothérapie qui est la plus usitée aujourd’hui avec tous les effets indésirables y relatif.There is no specific drug for cancer cells: all drugs used are toxic to both cancer cells and normal cells. This therapy requires in most of the time the combination of several drugs in order to increase the effectiveness, which presents for the subject several undesirable effects during the treatment including: hair loss or alopathy, mucositis, disorders digestive system, fatigue, thrombocytopenia (decrease in blood platelets), neutropenia (decrease in white blood cells) (Chibaudel et al., 2015), anemia, fevers and sometimes even death. But it is chemotherapy that is the most used today with all the related side effects.
Il est également constant et connu de tous que les chimiothérapies anti-cancéreuses actuelles n’éliminent pas précisément le moteur moléculaire responsable de la prolifération des cellules tumorales, parce que celui-ci n'est toujours pas connu à ce jour de la communauté des Scientifiques, Biologistes ou Médecins . Toutefois le Laboratoire UPMC-UR6 Enzymologie de l'ARN est la première au monde qui vient d’identifier ce moteur moléculaire, la protéine L36AL (appelée aussi eL42) de la grande sous-unité 60S du ribosome des cellules eucaryotes (par exemple des cellules humaines).It is also constant and known to all that current anti-cancer chemotherapies do not precisely eliminate the molecular motor responsible for the proliferation of tumor cells, because it is still not known to this day by the scientific community. , Biologists or Doctors. However, the UPMC-UR6 RNA Enzymology Laboratory is the first in the world to identify this molecular motor, the L36AL protein (also called eL42) of the large 60S subunit of the ribosome of eukaryotic cells (for example cells human).
Après avoir identifié cette protéine comme une cible de choix pour les chimiothérapies anticancéreuses, il a été entrepris de rechercher, grâce à ce modèle biologique innovant, des molécules bioactives capables de bloquer la prolifération des cellules tumorales en bloquant la protéine L36AL.After having identified this protein as a target of choice for anticancer chemotherapies, it was undertaken to search, thanks to this innovative biological model, for bioactive molecules capable of blocking the proliferation of tumor cells by blocking the L36AL protein.
Par conséquent il existait un besoin de mettre au point une molécule dont l’utilisation dans les divers traitements anticancéreux faciliterait la tache à la communauté scientifique et à l’humanité toute entière.Therefore there was a need to develop a molecule whose use in various cancer treatments would make life easier for the scientific community and for humanity as a whole.
La présente invention vient combler ce besoin. Les inventeurs ont ainsi compris que le traitement anticancéreux était bien possible, facile, efficace et à moindre coût grâce à l’utilisation de ladite molécule dans la conception des médicaments anticancéreux.The present invention fulfills this need. The inventors have thus understood that anti-cancer treatment is quite possible, easy, effective and inexpensive thanks to the use of said molecule in the design of anti-cancer drugs.
La présente invention a ainsi pour objet de proposer des traitements de thérapie moléculaire ciblée en Cancérologie, c'est-à-dire des traitements qui ne ciblent sélectivement que les acteurs spécifiques de la prolifération des cellules tumorales. Avantageusement et particulièrement, l’invention élimine la protéine L36AL. Certains de ces traitements peuvent être aussi utilisés comme des médicaments dédiés à la prévention.The object of the present invention is thus to provide targeted molecular therapy treatments in cancerology, that is to say treatments which selectively target only the specific players in the proliferation of tumor cells. Advantageously and particularly, the invention eliminates the L36AL protein. Some of these treatments can also be used as drugs dedicated to prevention.
L’essence de l’invention repose sur l’action inhibitrice des molécules (1: UCK-159, 2: UCK-36, 3: UCK-37 et 4: UCK-160 selon le tableau 1) sur le crosslink issu de l’interaction entre la protéine L36AL et le tRNAox.The essence of the invention is based on the inhibitory action of the molecules (1: UCK-159, 2: UCK-36, 3: UCK-37 and 4: UCK-160 according to Table 1) on the crosslink obtained from the interaction between the L36AL protein and tRNAox.
Avantageusement ces molécules sont issues de la condensation d’un substrat (thiosemicarbazides) et d’un réactif (composés carbonylés contenus dans l’huile essentielle de Cymbopogon citratus). En particulier elles comportent des propriétés thérapeutiques anti tumorales caractérisées en ce que, par leur action inhibitrice sur l’interaction entre la L36AL et le tRNAox, elles bloquent le développement du cancer en arrêtant la prolifération des cellules cancéreuses. Plusieurs figures et tableau illustrent les différents modes d’action.Advantageously, these molecules result from the condensation of a substrate (thiosemicarbazides) and of a reagent (carbonyl compounds contained in the essential oil of Cymbopogon citratus). In particular, they have anti-tumor therapeutic properties characterized in that, by their inhibitory action on the interaction between L36AL and tRNAox, they block the development of cancer by stopping the proliferation of cancer cells. Several figures and tables illustrate the different modes of action.
La figure 1 présente le Schéma montrant la formation de la base de Schiff (chemdraw). Ce schéma représente le modèle type pour les quatre molécules, parce que chacune des molécules entre en compétition avec le tRNAox pour la liaison sur le résidu catalytique du site actif du ribosome, le résidu lysine-53 de la protéine L36AL.Figure 1 shows the Schematic showing the formation of Schiff's base (chemdraw). This diagram represents the typical model for the four molecules, because each of the molecules competes with tRNAox for binding to the catalytic residue of the active site of the ribosome, the lysine-53 residue of the L36AL protein.
La figure 2 présente la photo du gel montrant l’action inhibitrice des molécules (1: UCK159, 2: UCK-36, 3: UCK-37 et 4: UCK-160) sur le crosslink et 5: UCK-118 utilisée comme témoin négatif. Ces résultats obtenus montrent l’existence effective d’une action inhibitrice de ces molécules sur le crosslink objet de la prolifération des cellules cancéreuses.Figure 2 shows the photo of the gel showing the inhibitory action of molecules (1: UCK159, 2: UCK-36, 3: UCK-37 and 4: UCK-160) on the crosslink and 5: UCK-118 used as a control negative. These results obtained show the effective existence of an inhibitory action of these molecules on the crosslink which is the object of the proliferation of cancer cells.
La figure 3 présente l’analyse autoradiographique de l’interaction entre la protéine L36a et le tRNAox «crosslink» (puit 2) et l’action inhibitrice de la molécule UCK-36 sur le crosslink (puit 3). Les puits 1 à 4 désignent ici l’espace dans le gel d’électrophorèse où on a fait migrer les molécules L36AL, tRNAox ou le complexe covalent entre les deux (complexe L36AL-tRNAox encore appelé crosslink). En effet dans le puit 2 (Ribosome 60S + tRNAox) la protéine L36a (L36AL) forme un complexe covalent avec le tRNAox. Parmi la cinquantaine de protéines présentes dans le ribosome 60S, une seule, la L36a est capable de former un complexe covalent (crosslink) avec le tRNAox. Dans ce puit on révèle au moyen des anticorps, la présence de la protéine libre (bande L36a) et du crosslink (bande tRNA-L36a). Quant au puit 3 II contient le ribosome 60S et le tRNAox comme le puit 2, mais il contient en plus la molécule UCK36 qui entre en compétition avec le tRNAox pour empêcher ce dernier de former le complexe covalent (crosslink). La bande tRNA-L36a disparaît donc, et il ne reste que la bande L36a correspondant à la protéine libre.Figure 3 shows the autoradiographic analysis of the interaction between the L36a protein and the "crosslink" tRNAox (well 2) and the inhibitory action of the UCK-36 molecule on the crosslink (well 3). Wells 1 to 4 here denote the space in the electrophoresis gel where the molecules L36AL, tRNAox or the covalent complex between the two (L36AL-tRNAox complex also called crosslink) have been migrated. In fact, in well 2 (Ribosome 60S + tRNAox), the L36a protein (L36AL) forms a covalent complex with tRNAox. Among the fifty proteins present in the 60S ribosome, only one, L36a, is capable of forming a covalent complex (crosslink) with tRNAox. In this well, the presence of the free protein (L36a band) and of the crosslink (tRNA-L36a band) is revealed by means of the antibodies. As for well 3, it contains the 60S ribosome and tRNAox like well 2, but it also contains the UCK36 molecule which competes with tRNAox to prevent the latter from forming the covalent complex (crosslink). The tRNA-L36a band therefore disappears, and only the L36a band corresponding to the free protein remains.
La figure 4 présente le mode d’action entre la protéine L36AL et la Cycloheximide. Il s’agit d’un mode d’action qui illustre parfaitement celui de la protéine L36AL et les molécules de la présente invention. Les molécules (1: UCK-159, 2: UCK-36, 3: UCK-37 et 4: UCK-160 selon le tableau 1) agissent de la même manière que la cycloheximine sur la L36AL. En effet le mode d’action entre la protéine L36a (ou L36AL) et la cycloheximide n’a jamais été clairement élucidé. L’on pense que le groupement carbonyle C=O de la cycloheximide, de même que le groupement C=S des thiosemicarbazones peuvent former une liaison covalente par l’attaque nucléophile du groupement ε-NFL de la lysine-53 sur le carbone (δ+) du carbonyle. Ce mode d’action est probable pour la cycloheximide et pour les molécules UCK36 et UCK37 (vu l’effet compétiteur radical exercé sur le crosslink), mais cela n’a jamais été démontré. Au contraire, dans les structures cristallographiques disponibles, c’est une liaison hydrogène qui lie un groupement carbonyle de la cycloheximide à la chaîne latérale de la lysine-53 (voir Figure 4). Peu importe qu’il s’agisse d’une liaison hydrogène ou d’une liaison covalente, c’est l’effet inhibiteur des molécules sur le crosslink qui valide la protéine L36a comme la cible de ces molécules.Figure 4 shows the mode of action between the L36AL protein and Cycloheximide. This is a mode of action which perfectly illustrates that of the L36AL protein and the molecules of the present invention. The molecules (1: UCK-159, 2: UCK-36, 3: UCK-37 and 4: UCK-160 according to Table 1) act in the same way as cycloheximine on L36AL. Indeed, the mode of action between the L36a protein (or L36AL) and cycloheximide has never been clearly understood. It is believed that the C = O carbonyl group of cycloheximide, as well as the C = S group of thiosemicarbazones can form a covalent bond by nucleophilic attack of the ε-NFL group of lysine-53 on the carbon (δ +) carbonyl. This mode of action is likely for cycloheximide and for the molecules UCK36 and UCK37 (given the radical competitive effect on the crosslink), but it has never been demonstrated. In contrast, in the available crystallographic structures, it is a hydrogen bond which links a carbonyl group of cycloheximide to the side chain of lysine-53 (see Figure 4). Regardless of whether it is a hydrogen bond or a covalent bond, it is the inhibitory effect of the molecules on the crosslink that validates the L36a protein as the target of these molecules.
La figure 5 présente l’équation de la réaction de la formation des citralthiosemicarbazones substituées.Figure 5 shows the reaction equation for the formation of substituted citralthiosemicarbazones.
La figure 6 présente l’équation de la réaction de la formation de la pipéritonesemicarbazone.Figure 6 shows the reaction equation for the formation of piperitonesemicarbazone.
Le tableau 1 présente les molécules avec leurs composés, masses, volumes et concentrations.Table 1 shows the molecules with their compounds, masses, volumes and concentrations.
La présente invention se rapporte à des molécules ayant les mêmes effets inhibiteurs sur la molécule L36AL. Il s’agit des molécules (1: UCK-159, 2: UCK-36, 3: UCK-37 et 4: UCK-160 selon le tableau 1) qui sont obtenues grâce à la condensation d’un substrat (thiosemicarbazides) et d’un réactif (composés carbonylés contenus dans l’huile essentielle de Cymbopogon citratus).The present invention relates to molecules having the same inhibitory effects on the L36AL molecule. These are the molecules (1: UCK-159, 2: UCK-36, 3: UCK-37 and 4: UCK-160 according to Table 1) which are obtained thanks to the condensation of a substrate (thiosemicarbazides) and a reagent (carbonyl compounds contained in the essential oil of Cymbopogon citratus).
Partant du fait que des études ont déjà révélé l’existence d’une protéine L36AL de poids moléculaire 12kD, pHi : 10,67 appartenant à la grande sous-unité ribosomale au site hybride P/E, jouant la fonction de peptidyl-transférase et surexprimée dans la quasi-totalité dp inventeurs ont compris qu’en ciblant cette protéine, ils pouvaient agir sur la prolifération des cellules cancéreuses. Ce qui les a amené à étudier les thiosemicarbazones qui sont une famille connue comme étant d’excellent chélateurs de cofacteurs d’enzymes ou de protéines et possédant plusieurs activités biologiques dont l’activité antitumorale (Amoussatou et al., 2012 ; Umasankar et al., 2012). C’est ainsi qu’ils ont préparé et mis en place des molécules susceptibles de se lier directement ou indirectement à cette protéine pour bloquer son action et empêcher la prolifération des cellules tumorales. Ainsi sont ils parvenu aux molécules (1: UCK-159, 2: UCK-36, 3: UCK-37 et 4: UCK-160 selon le tableau 1) qui inhibent l’interaction entre la L36AL et le tRNAox. Ils en déduisent donc que ces molécules peuvent être considérées comme des molécules bioactives susceptibles de déboucher sur des médicaments chimiothérapeutiques anti-cancéreux.Based on the fact that studies have already revealed the existence of an L36AL protein of molecular weight 12kD, pHi: 10.67 belonging to the large ribosomal subunit at the P / E hybrid site, playing the function of peptidyl-transferase and overexpressed in almost all of the inventors have understood that by targeting this protein, they could act on the proliferation of cancer cells. This led them to study thiosemicarbazones which are a family known to be excellent chelators of enzyme or protein cofactors and possessing several biological activities including antitumor activity (Amoussatou et al., 2012; Umasankar et al. , 2012). This is how they prepared and put in place molecules that could bind directly or indirectly to this protein to block its action and prevent the proliferation of tumor cells. Thus they arrived at the molecules (1: UCK-159, 2: UCK-36, 3: UCK-37 and 4: UCK-160 according to Table 1) which inhibit the interaction between L36AL and tRNAox. They therefore deduce that these molecules can be considered as bioactive molecules capable of leading to anti-cancer chemotherapeutic drugs.
Pour évaluer leur mécanisme d’action, les inventeurs ont utilisé la méthode mise au point par le professeur HOUNTONDJI et al., 1978 qui consiste à oxyder les fonctions OH des positions 2’ et 3’ du sucre de l’adénine du CCA du tRNA par du NaIO4 en fonction aldéhyde pour former avec la fonction NH2 du résidu K53 de la protéine situé au site P/E une base de schiff, se traduisant par un crosslink (figure 1). Ils constatent que les molécules (1: UCK-159, 2: UCK-36, 3: UCK-37 et 4: UCK-160 selon le tableau 1) montrent leur activité en inhibant l’interaction entre le tRNAox et la protéine L36AL dans la formation du crosslink. Ce résultat suggère que les molécules (1: UCK-159, 2: UCK-36, 3: UCK-37 et 4: UCK-160 selon le tableau 1) dans cette inhibition masquent chacune en ce qui la concerne l’extrémité NH2 de la lysine K53, situé au site catalytique de la protéine L36AL par son groupement (C=S) empêchant la formation de base de Schiff synonyme de crosslink entre le tRNAox et la protéine.To evaluate their mechanism of action, the inventors used the method developed by Professor HOUNTONDJI et al., 1978 which consists in oxidizing the OH functions of the 2 'and 3' positions of the adenine sugar of the CCA of the tRNA. with NaIO4 as an aldehyde function to form, with the NH2 function of the K53 residue of the protein located at the P / E site, a schiff base, resulting in a crosslink (FIG. 1). They find that the molecules (1: UCK-159, 2: UCK-36, 3: UCK-37 and 4: UCK-160 according to Table 1) show their activity by inhibiting the interaction between tRNAox and the L36AL protein in the formation of the crosslink. This result suggests that the molecules (1: UCK-159, 2: UCK-36, 3: UCK-37 and 4: UCK-160 according to Table 1) in this inhibition each mask with respect to the NH2 end of lysine K53, located at the catalytic site of the L36AL protein by its group (C = S) preventing the formation of the Schiff base synonymous with crosslink between the tRNAox and the protein.
Ce résultat se rapporte à ceux de Brian W. et al., 2010 qui ont trouvé que certains composés à l’exemple de la cycloheximide grâce à leur groupement carbonylé inhibent la L36AL.This result relates to those of Brian W. et al., 2010 who found that certain compounds such as cycloheximide, thanks to their carbonyl group, inhibit L36AL.
Les inventeurs ont conclu que l’action inhibitrice de ces thiosemicarbazone sur l'interaction entre le tRNAox et la protéine L36a empêche de formation de la liaison peptidique qui représente l’étape-clé de la biosynthèse des protéines. Les thiosemicarbazones peuvent être utilisées pour diminuer la vitesse de synthèse protéique dans le but de bloquer l’hyper-prolifération des cellules tumorales.The inventors concluded that the inhibitory action of these thiosemicarbazones on the interaction between tRNAox and the L36a protein prevents the formation of the peptide bond which represents the key step in protein biosynthesis. Thiosemicarbazones can be used to decrease the rate of protein synthesis in order to block the hyperproliferation of tumor cells.
Matériels et Méthodes:Materials and methods:
Les différentes molécules ont été obtenues par la technique de synthèse conformément à la méthodologie suivante :The different molecules were obtained by the synthesis technique in accordance with the following methodology:
-Synthèse de la citral-4-phényl-3-thiosemicarbazone (2 = UCK-36)-Synthesis of citral-4-phenyl-3-thiosemicarbazone (2 = UCK-36)
La citral-4-phényl-3-thiosemicarbazone (2 = UCK-36) a été hémi-synthétisée en une seule étape. Au cours de cette réaction d’hémi-synthèse, l’huile a été considérée comme étant constituée de 100% de citral. La réaction est équimolaire. Mais cette huile ne contenant que 70,13% de citral, il y a donc un léger excès de réactif (semicarbazide ou thiosemicarbazide) qui sera éliminé au cours des recristallisations.Citral-4-phenyl-3-thiosemicarbazone (2 = UCK-36) was hemi-synthesized in a single step. During this semi-synthetic reaction, the oil was considered to be 100% citral. The reaction is equimolar. But this oil containing only 70.13% citral, there is therefore a slight excess of reagent (semicarbazide or thiosemicarbazide) which will be eliminated during recrystallizations.
Protocole de Synthèse de la citral-4-phényl-3-thiosemicarbazone (2 = UCK-36)Citral-4-phenyl-3-thiosemicarbazone Synthesis Protocol (2 = UCK-36)
On prépare un mélange de 0,001 mol d’huile de C. citratus (152 mg) dissoute dans 1,5 ml d'éthanol à 95° et 0,001 mol de thiosemicarbazide (167 mg 4-phényl-3-thiosemicarbazide) dissous dans 2 ml d'acide chlorhydrique IN. Le mélange des deux solutions est maintenu sous agitation à température ambiante jusqu'à l'obtention des cristaux de thiosemicarbazone. L'agitation est maintenue pendant une heure. Le précipité est ensuite filtré, lavé à l’eau distillée, séché, pesé puis recristallisé dans l'éthanol. L’équation de la figure 5 illustre ladite réaction.A mixture of 0.001 mol of C. citratus oil (152 mg) dissolved in 1.5 ml of 95 ° ethanol and 0.001 mol of thiosemicarbazide (167 mg 4-phenyl-3-thiosemicarbazide) dissolved in 2 ml is prepared. IN hydrochloric acid. The mixture of the two solutions is kept under stirring at room temperature until crystals of thiosemicarbazone are obtained. Stirring is maintained for one hour. The precipitate is then filtered, washed with distilled water, dried, weighed and then recrystallized from ethanol. The equation in Figure 5 illustrates said reaction.
-Synthèse de Pipéritonethiosemicarbazones ((3 = UCK-36)-Synthesis of Piperitonethiosemicarbazones ((3 = UCK-36)
La 4-phényl-3-thiosemicarbazone de la pipéritone a aussi été hémi-synthétisées en une seule étape comme dans le premier cas. On prépare un mélange de 0,002 mol d’huile de C. schoenantus (304 mg) dissoute dans 1,5 ml d'éthanol à 95° et 0,001 mol de thiosemicarbazide (91 mg) dissous dans 2 ml d'acide chlorhydrique IN. Ce mélange est maintenu sous agitation jusqu'à l'obtention des cristaux de thiosemicarbazone. L'agitation est aussi maintenue pendant une heure. La réaction a lieu à température ambiante. Le précipité est ensuite filtré, lavé à l’eau distillée, séché, pesé puis recristallisé dans l'éthanol. L’équation de la figure 6 illustre ladite réaction.The 4-phenyl-3-thiosemicarbazone of piperitone was also hemi-synthesized in a single step as in the first case. A mixture of 0.002 mol of C. schoenantus oil (304 mg) dissolved in 1.5 ml of 95 ° ethanol and 0.001 mol of thiosemicarbazide (91 mg) dissolved in 2 ml of IN hydrochloric acid is prepared. This mixture is kept under stirring until the crystals of thiosemicarbazone are obtained. Stirring is also maintained for one hour. The reaction takes place at room temperature. The precipitate is then filtered, washed with distilled water, dried, weighed and then recrystallized from ethanol. The equation in Figure 6 illustrates said reaction.
-Synthèse de la Benzoïne-4-phenylthiosemicarbazone (1=UCK-159) et la l-(4chlorophényl) phénylmethanone-4-phenylthiosemicarbazone (4=UCK 160)-Synthesis of Benzoïne-4-phenylthiosemicarbazone (1 = UCK-159) and l- (4chlorophenyl) phenylmethanone-4-phenylthiosemicarbazone (4 = UCK 160)
Dans un ballon rodé à fond rond de 100 mL, on introduit à température ordinaire successivement 1.65 g de Benzoïne ou l-(4-chlorophényl) phénylmethanone selon qu’on veut avoir UCK-159 ou UCK-160 et 1.67 g (10 mmol) de 4’-phénylthiosemicarbazide et immédiatement 50 mL de méthanol pour analyse. A ce stade, on ajoute en une seule portion une solution composée extemporanément de 0.5 mL d’aniline fraîchement redistillée ainsi que 0.5 mL d’acide chlorhydrique IN. Le mélange réactionnel (assez homogène au départ) est alors mis sous agitation au moyen d’un barreau magnétique. En période réputée «estivale» au Bénin, il est préférable d’immerger le ballon contenant le milieu réactionnel dans un bain d’eau (~ 20°C) en vue de stabiliser sa température vers la température-cible (~ 20°C) en profitant de l’inertie thermique de l’eau. On maintient l’agitation durant le temps prescrit dans les tables relevantes.1.65 g of Benzoïne or 1- (4-chlorophenyl) phenylmethanone are successively introduced into a ground-jointed 100 mL round-bottomed flask, at ordinary temperature, depending on whether we want UCK-159 or UCK-160 and 1.67 g (10 mmol) of 4'-phenylthiosemicarbazide and immediately 50 mL of methanol for analysis. At this stage, a solution composed immediately of 0.5 mL of freshly redistilled aniline as well as 0.5 mL of IN hydrochloric acid is added in a single portion. The reaction mixture (fairly homogeneous at the start) is then stirred by means of a magnetic bar. In a period deemed to be "summer" in Benin, it is preferable to immerse the flask containing the reaction medium in a water bath (~ 20 ° C) in order to stabilize its temperature towards the target temperature (~ 20 ° C) by taking advantage of the thermal inertia of the water. Stirring is maintained for the time prescribed in the relevant tables.
Après 24 heures, inter alia par exemple, dans les conditions ici réunies le rendement pondéral est virtuellement quantitatif. La masse cristalline abondante jaune citron clair est essorée après séjour au réfrigérateur. On recristallise ce premier jet de cristallisation dans de l’éthanol ordinaire. Les cristaux ainsi obtenus sont essorés et séchés au four (~80°C) jusqu’à une masse constante.After 24 hours, inter alia for example, under the conditions met here, the weight yield is virtually quantitative. The abundant light lemon-yellow crystalline mass is wrung out after refrigeration. This first crystallization jet is recrystallized from ordinary ethanol. The crystals thus obtained are drained and dried in an oven (~ 80 ° C) to a constant mass.
1-) Mécanisme de formation du crosslink1-) Crosslink formation mechanism
La méthode utilisée est celle mise au point par le Professeur Codjo HOUNTONDJI en 1978.The method used is that developed by Professor Codjo HOUNTONDJI in 1978.
Principe: L’approche chimique consiste à oxyder les fonctions alcools des positions 2’ et 3’ du sucre de l’adénine à l'extrémité CCA du tRNA en dialdéhyde. La liaison peut se créer au contact de la fonction NH2 du résidu lysine 53 (K53) de la protéine L36AL pour former une base de Schiff ce traduisant par un crosslink (figure 1).Principle: The chemical approach consists in oxidizing the alcohol functions of the 2 'and 3' positions of the adenine sugar at the CCA end of tRNA to dialdehyde. The bond can be created on contact with the NH 2 function of the lysine residue 53 (K53) of the L36AL protein to form a Schiff base which translates into a crosslink (FIG. 1).
1-1-) Ribosomes, ARNm, ARNt et ARNt oxydé(ARNtox)1-1-) Ribosomes, mRNA, tRNA and oxidized tRNA (tRNAtox)
Les sous-unités 40S et 60S ribosomales ont été isolées à partir de placenta humain. Avant utilisation, les sous-unités ont été réactivées par incubation dans du tampon de liaison A (50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, KC1 100 mM, MgC12 10 mM et EDTA 0,5 mM) à 37 ° C pendant 10 min. Les ribosomes SOS ont été obtenus par l'association des sous-unités 40S et 60S prises dans un rapport équimolaire. Un analogue de l'ARNm court (oligoribonucléotide GAA UUU GAC AAA) a été acheté auprès de Sigma Aldrich (Evry, France). Le tRNAAsp de la levure et le tRNAPhe du boeuf utilisés ont été purifiés par Chromatographie Current-Conter, suivie d'une séparation par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Leurs capacités d'accepter les acides aminés étaient 1,400 unités pmol / A260 et 1300 unités pmol / A260 respectivement pour le tRNAAsp et le tRNAPhe. Le marquage des ARNt à l'extrémité 5’ a été réalisée après déphosphorylation par phosphatase alcaline (Roche), en présence [32P] ATP et de la polynucleotide kinase. ARNt oxydé (tRNAox) a été préparé comme décrit dans la suite.The 40S and 60S ribosomal subunits have been isolated from human placenta. Prior to use, the subunits were reactivated by incubation in binding buffer A (50mM Tris-HCl, pH 7.5, 100mM KCl, 10mM MgCl2, and 0.5mM EDTA) at 37 ° C for 10 minutes. The SOS ribosomes were obtained by the association of 40S and 60S subunits taken in an equimolar ratio. A short mRNA analog (oligoribonucleotide GAA UUU GAC AAA) was purchased from Sigma Aldrich (Evry, France). The yeast tRNAAsp and beef tRNAPhe used were purified by Current-Conter chromatography, followed by separation by polyacrylamide gel electrophoresis. Their capacities to accept amino acids were 1,400 pmol / A260 units and 1,300 pmol / A260 units for tRNAAsp and tRNAPhe, respectively. The tRNA labeling at the 5 ′ end was carried out after dephosphorylation by alkaline phosphatase (Roche), in the presence of [32P] ATP and polynucleotide kinase. Oxidized tRNA (tRNAox) was prepared as described below.
1-2) Marquages des protéines ribosomiques par le tRNAox1-2) Labeling of ribosomal proteins by tRNAox
Le complexe ARNt Aspox marqué au [32P] avec le ribosome 80S humain au niveau du site P a été obtenu à 37 0 C dans le tampon A contenant 0,5 mM de ribosomes 80S et 5 mM du GAA dodecaribonucleotide UUU GAC AAA comme un ARNm, dans un volume total de 25 ul. Ces mélanges ont été préincubés pendant 5 min à 37The [32P] labeled Aspox tRNA complex with the human 80S ribosome at the P site was obtained at 37 ° C. in buffer A containing 0.5 mM of 80S ribosomes and 5 mM of GAA dodecaribonucleotide UUU GAC AAA as an mRNA , in a total volume of 25 µl. These mixtures were preincubated for 5 min at 37
C. La réaction de marquagc^étéTffitiéerpar l'addition de 5 mM de [32P] tRNAAspox et du cyanoborohydrure de sodium 5 mM (NaBHSCN) et l'incubation a été poursuivie pendant 1 h. Dans l'expérience témoin, le tRNAAspox[32P] a été remplacé par [32P] tRNAAsp (5 mM) au niveau du site P dans le mélange réactionnel. Pour la protection de la formation du complexe L36AL de 80S et du tRNAox marqué, 15 mM tRNAAsp a été préincubées pendant 5 min à 37°C avant l’initiation de la reaction avec 5 mM [32P] tRNAAspox. Le complexe obtenu est incubé dans 50mM de NaBH4 pendant 15 min. Après la fin de la réaction, les mélanges ont été appliqués sur un gel d'urée à 10%, les gels ont été séchés sous vide et soumis à une autoradiographie.C. The labeling reaction was initiated by the addition of 5 mM [32P] tRNAAspox and 5 mM sodium cyanoborohydride (NaBHSCN) and the incubation was continued for 1 h. In the control experiment, tRNAAspox [32P] was replaced by [32P] tRNAAsp (5 mM) at the P site in the reaction mixture. For protection of the formation of the 80S L36AL complex and labeled tRNAox, 15 mM tRNAAsp was preincubated for 5 min at 37 ° C before initiation of the reaction with 5 mM [32P] tRNAAspox. The complex obtained is incubated in 50 mM of NaBH4 for 15 min. After the reaction was completed, the mixtures were applied to a 10% urea gel, the gels were dried in vacuo and subjected to autoradiography.
1-3) tRNA oxydé en tRNAox1-3) tRNA oxidized to tRNAox
Le tRNAox est préparé à partir de l'ARNt (419μΜ) mis en incubation à 4 ° C pendant 1 heure avec NaIO4 (0,5 M) et du NH4OAc (5 M, pH 5). Après incubation, le NaIO4 est séparé de l'ARNt oxydé avec les colonnes Sephadex ™ G-25. Ensuite 0,2 du volume d'échantillon (tRNAox) de NaCl (5 M) a été ajouté pour stabiliser le tRNAox, et également 2,2 du volume de l'échantillon (tRNAox) d’éthanol froid à 96 ° C ajouté pour précipiter le tRNAox. Le tRNAox obtenu est de 2000 pmol et conserver à -20 0 C.TRNAox is prepared from tRNA (419μΜ) incubated at 4 ° C for 1 hour with NaIO4 (0.5M) and NH4OAc (5M, pH 5). After incubation, the NaIO4 is separated from the oxidized tRNA using Sephadex ™ G-25 columns. Then 0.2 of the sample volume (tRNAox) of NaCl (5 M) was added to stabilize the tRNAox, and also 2.2 of the sample volume (tRNAox) of cold 96 ° C ethanol added to precipitate the tRNAox. The tRNAox obtained is 2000 pmol and store at -20 ° C.
1-4) Technique et analyse de Western Blot1-4) Western blot technique and analysis
Le crosslink est réalisé avec la sous-unité ribosomale 60S (7μΜ), et le tRNAox (100 μΜ ), le tout dans le tampon de crosslink (10X) constitué du MgCL (2 M), du Tris-HCl (IM) à pH = 8,8. A ce mélange est ajouté du NaBH3CN (0,05 M) et de l'eau DEPC, le tout incubé dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 30 min. Ensuite, a été ajouté du NaBLU 0,4M au mélange, et 5 ul de leammli (3x). Le mélange résultant est chauffé à 90 ° C pendant 10min. Le lysat a été chargé sur 12% de gels SDS-polyacrylamide, suivi de la migration grâce à un générateur de courant à 4 Watt pendant 1 heure 20 minutes dans un tampon Tris-Glycine-SDS. Les protéines ont été après migration transférées des gels de polyacrylamide-SDS sur une membrane de nitrocellulose grâce au tampon de transfert contenant du Tris-glycine-SDS et 20% et d'éthanol (3 watts pendant 1 heure 30 minutes). Les membranes ont été bloquées ensuite avec 5% de lait dans du PBS IX pH 7,4 et 0,1% de Tween-20 (PBST) pendant 1 heure à température ambiante, ensuite lavées pendant 5 minutes et incubées dans l’anticorps primaire anti-RPL36AL dilués au 1/10000 préparé dans 1% de BSA / PBST pendant 2 heures à température ambiante sous agitation douce. La membrane a été lavée 3 fois après l’incubation dans du PBST pendant de 10 minutes, avant incubation dans l'anticorps secondaire de souris conjugué à HRP dans 1% de BSA / PBST pendant 1 heure à température ambiante sous agitation douce. La membrane est ensuite lavée à nouveau 4 fois après l’incubation dans du PBST pendant de 10 minutes avant d’être ensuite traiter dans le substraf~AVestêrrUEX3L__ pendant 3 minutes. Le film est mis en contact avec la membrane puis celui-ci est révélé grâce à la peroxydase greffée a l’anticorps secondaire précipite sur le film au contact de son substrat.The crosslink is carried out with the 60S ribosomal subunit (7μΜ), and the tRNAox (100 μΜ), all in the crosslink buffer (10X) consisting of MgCL (2 M), Tris-HCl (IM) at pH = 8.8. To this mixture are added NaBH3CN (0.05 M) and DEPC water, the whole incubated in a water bath at 37 ° C for 30 min. Then, 0.4M NaBLU was added to the mixture, and 5 µl of leammli (3x). The resulting mixture is heated at 90 ° C for 10min. The lysate was loaded onto 12% SDS-polyacrylamide gels, followed by migration using a current generator at 4 Watt for 1 hour 20 minutes in Tris-Glycine-SDS buffer. The proteins were, after migration, transferred from the polyacrylamide-SDS gels onto a nitrocellulose membrane using the transfer buffer containing Tris-glycine-SDS and 20% and ethanol (3 watts for 1 hour 30 minutes). The membranes were then blocked with 5% milk in PBS IX pH 7.4 and 0.1% Tween-20 (PBST) for 1 hour at room temperature, then washed for 5 minutes and incubated in the primary antibody. anti-RPL36AL diluted to 1/10000 prepared in 1% BSA / PBST for 2 hours at room temperature with gentle stirring. The membrane was washed 3 times after incubation in PBST for 10 minutes, before incubation in mouse secondary antibody conjugated to HRP in 1% BSA / PBST for 1 hour at room temperature with gentle agitation. The membrane is then washed again 4 times after incubation in PBST for 10 minutes before being then treated in the ~ AVestêrrUEX3L__ substance for 3 minutes. The film is brought into contact with the membrane and then it is revealed thanks to the peroxidase grafted to the secondary antibody precipitates on the film in contact with its substrate.
2) Résultats2) Results
2-1) Résultats des essais à chaud « radioactivité »2-1) Results of the “radioactivity” hot tests
Les résultats des premiers essais en radioactivité montrent l’effet des thiosemicarbazones sur l’interaction entre la protéine ribosomique L36AL et le tRNAox (figure2).The results of the first radioactivity tests show the effect of thiosemicarbazones on the interaction between the ribosomal protein L36AL and tRNAox (figure 2).
Dans le but de confirmer les résultats précédemment obtenus, il a été repris l’expérience avec les 4 molécules thiosemicarbazones qui ont montré un effet sur la formation du crosslink. La figure 2 montre l’action inhibitrice des molécules (1: UCK-159, 2: UCK-36, 3: UCK-37 et 4: UCK-160) sur le crosslink et 5: UCK-118 utilisé comme témoin négatif.In order to confirm the results previously obtained, the experiment was repeated with the 4 thiosemicarbazones molecules which showed an effect on the formation of the crosslink. Figure 2 shows the inhibitory action of molecules (1: UCK-159, 2: UCK-36, 3: UCK-37 and 4: UCK-160) on the crosslink and 5: UCK-118 used as a negative control.
2-2) Résultats des essais par la technique de western bloting2-2) Results of the tests using the western bloting technique
Il a été choisi de vérifier et de confirmer les résultats obtenus en radioactivité par une autre méthode de biologie moléculaire qui permet la détection de protéine spécifiques sur une membrane (figure 4). Il est question ici de 1’ analyse autoradiographique de l’interaction entre la protéine L36a et le tRNAox «crosslink» (puit 2) et l’effet inhibiteur de la molécule UCK-36 sur le crosslink (puit 3)·It was chosen to verify and confirm the results obtained in radioactivity by another method of molecular biology which allows the detection of specific proteins on a membrane (FIG. 4). This is an autoradiographic analysis of the interaction between the L36a protein and the "crosslink" tRNAox (well 2) and the inhibitory effect of the UCK-36 molecule on the crosslink (well 3) ·
3) Discussions3) Discussions
Après les différentes expériences réalisées les quatre thiosemicarbazones présentent un effet sur la formation du crosslink. Cette inhibition observée avec ces thiosemicarbazones à savoir : le Citral-4-phenylthiosemicarbazone (UCK-36) le pipéritone-4-phénylthiosemicarbazone (UCK-37), le Benzoine-4-phenylthiosemicarbazone (UCK-159) et le l-(4-chorophenyl)phenylmethanone-4phenylthiosemicarbazone (UCK-160) s’explique par le fait que celles-ci masquent l’extrémité NH2 de la lysine K53 qui entre dans la formation de la base de Schiff synonyme de crosslink entre le tRNAox et la protéine. Dans ce processus d’inhibition le groupement (C=S) des thiosemicarbazones qui peut être un centre électrophile (carbone sp2) comme nucléophile (souffre) est attaqué par l’azote (NH2) de K53 du motif GGQTK (motif retrouvé dans les facteurs de terminaison induisant l’hydrolyse du dernier tRNA de la chaîne peptidique, Soria et al., 2009), situé au site catalytique de la protéine L36AL, empêchant ainsi à la protéine de former un crosslink avec le tRNAox.After the various experiments carried out the four thiosemicarbazones show an effect on the formation of the crosslink. This inhibition observed with these thiosemicarbazones namely: Citral-4-phenylthiosemicarbazone (UCK-36) piperitone-4-phenylthiosemicarbazone (UCK-37), Benzoine-4-phenylthiosemicarbazone (UCK-159) and l- (4- chorophenyl) phenylmethanone-4phenylthiosemicarbazone (UCK-160) is explained by the fact that they mask the NH 2 end of lysine K53 which enters the formation of the Schiff base synonymous with a crosslink between tRNAox and the protein. In this process of inhibition the group (C = S) of thiosemicarbazones which can be an electrophilic center (sp2 carbon) as a nucleophile (sulfur) is attacked by the nitrogen (NH 2 ) of K53 of the GGQTK motif (motif found in termination factors inducing hydrolysis of the last tRNA in the peptide chain, Soria et al., 2009), located at the catalytic site of the L36AL protein, thus preventing the protein from forming a crosslink with tRNAox.
En effet la lysine K53 retrouvée au site catalytique et jouant un rôle essentiel dans la formation de la liaison peptidique (Hountondji et al., 2012} possède un pka (7,53) de 3 unités de moins que celui de la lysine habituelle (pka=10,53) ce qui rend la lysine K53 située au site..........In fact, lysine K53, found at the catalytic site and playing an essential role in the formation of the peptide bond (Hountondji et al., 2012} has a pka (7.53) of 3 units less than that of the usual lysine (pka = 10.53) which makes lysine K53 located at the site ..........
catalytique protoné à pH physiologique et donnant la possibilité d’une attaque nucléophile de l’azote sur tout groupement électrophile proche.catalytic protonated at physiological pH and giving the possibility of nucleophilic attack of nitrogen on any nearby electrophilic group.
Ainsi les résultats ces différentes expériences montrent que les molécules de la présente invention offrent chacune un agent capable de liaison avec la protéine L36AL provenant 5 d'humains, l'agent ayant une activité anticancéreuse. Avantageusement, ces molécules peuvent entrer dans les compositions pharmaceutiques entrant dans le traitement du cancer et autres maladies associées. L’agent de la présente invention permet donc de traiter, de prévenir la maladie du cancer dans toutes ses formes.Thus the results of these different experiments show that the molecules of the present invention each offer an agent capable of binding with the L36AL protein originating from humans, the agent having anti-cancer activity. Advantageously, these molecules can be used in pharmaceutical compositions used in the treatment of cancer and other associated diseases. The agent of the present invention therefore makes it possible to treat and prevent cancer disease in all its forms.
Claims (7)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| OA18055A true OA18055A (en) | 2018-04-06 |
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