NO885016L

NO885016L - Fremgangsmaate til fremstilling av antigenspesifikke t-cellelinjer og terapeutisk anvendelse av disse.

Info

Publication number: NO885016L
Application number: NO88885016A
Authority: NO
Inventors: Yung-Nan Liu; Richard C Gehrz
Original assignee: Childrens Hosp Medical Center
Priority date: 1987-03-11
Filing date: 1988-11-10
Publication date: 1989-01-11
Also published as: NO885016D0; DK628088A; DK628088D0

Description

Søknaden er en Continuation-in-Part av US-patentsøknad nr.

933.789 innlevert 24. november 1986.

Den oppfinnelse som her er beskrevet ble utført med assistanse

fra National Institutes of Health Grant No. 1-P01-HD19937-01A1. Den amerikanske stat har visse rettigheter i denne oppfinnelse.

Skjønt mekanismene og midlene som inngår i immunresponsreaksjonen hos pattedyr ikke er fullt ut forstått, har teknikker for å manipulere den immunologiske respons stort terapeutisk potensial. Dette er særlig tydelig i behandlingen av patologiske forhold som fører til undertrykkelse av de normale immunresponser og som ikke så lett lar seg behandle ved vanlige medikamentbaserte terapier. Slike betingelser omfatter visse virusinfeksjoner og immununder-trykkelsen forårsaket ved tilførsel av anticancer-medikamenter, medikamenter som anvendes til behandling av autoimmun-sykdommer

og de som anvendes til å hindre avstøtning av organer etter transplantasj on.

Evnen til å reagere på immunologiske stimuli ligger hovedsakelig

i cellene i lymfesystemet. I løpet av embryonisk liv utvikles en stamcelle som utvikler seg forskjellig langs flere forskjellige linjer. F.eks. kan en stamcelle omdannes til en lymfe-stamcelle som kan utvikle seg forskjellig for å danne minst to adskilte lymfocytt-populasjoner. Én populasjon som kalles T-lymfocytter er den fremkallende agent (effektor) i celleforårsaket immunitet, mens den andre (B-lymfocytter) er den viktigste fremkaller av antistoff-regulert eller humoral immunitet. Stimulansen for B-celle-antistoffproduksjon er festingen av et antigen (Ag) til B-celle-overflateimmunoglobulin. Således er B-celle-populasjoner hovedsakelig ansvarlig for spesifikk antistoffproduksjon, (Ab)-produksjon, hos verten. I blant, og for visse antigener (Ags), krever B-celler samvirke med T-celler for effektiv Ab-produksjon.

Av klassene av T-lymfocytter er T-hjelpeceller (T^-celler) antigenspesifikke celler som er involvert i primær immungjen-kj ennelse og vertsforsvarsreaksjoner mot bakterie-, virus-, sopp-antigener og andre antigener. De cytotoksiske celler, (Tc)-celler, er antigenspesifikke effektorceller som kan drepe målceller etter at de er infisert med patologiske agenser.

Skjønt T-hjelperceller (Tn-celler) er antigenspesifikke kan de ikke gjenkjenne fritt antigen. For at gjenkjennelse og etterføl-gende Tft-celleaktivering og -formering (proliferation) skal finne sted, må antigenet presenteres for mottakere eller et mottaker-kompleks på T^-cellen sammen med de viktigste (major) produkter av vevsforlikelighetskomplekset (histocompatibility complexMHC) klasse II, eller "leukocyttantigener". Således er T^-celle-gjenkjennelse av patogene antigener MHC klasse II-"begrenset", idet en gitt populasjon av T^-celler må enten være autologe eller dele én eller flere av det begrensende leukocyttantigens (LA) spesifisiteter som uttrykkes av MHC på verten. På samme måte gjenkjenner Tc-celler Ag i forbindelse med klasse I MHC LA'er.

Når det gjelder T^-celler blir denne funksjon utført av et begrenset antall spesialiserte celler kalt "antigenpresenterende celler" (APC). Det er nå alminnelig anerkjent at T-hjelpeceller (Tft-celler) gjenkjenner behandlet oppløselig antigen i forbindelse med klasse II MHC LA uttrykt på overflaten av makrofager.

I den senere tid er andre celletyper, såsom hvilende og aktiverte B-celler, dentrittiske celler, epiderme Langerhans-celler og humane dermale fibroblaster også vist å presentere antigen for T-celler. Epstein-Barr-virustransformerte humane lymfoblastoide B-celler (LCL) er vist å presentere tetanustoksoid, M. leprae og Candica albicans for autologe antigenspesifikke T-celler.

Dersom en gitt T^-celle har reseptorer eller et reseptorkompleks som gjør den istand til å gjenkjenne MHC-klasse II LA-antigenkom-plekset, blir den aktivert, formerer seg og danner lymfokiner såsom interleukin 2 (IL-2). Lymfokinene i sin tur bevirker formeringen av en rekke typer "dreperceller", innbefattet T-celler og makrofager, som kan oppvise antimikrobiell og tumorici-dal aktivitet. Etter at stimuleringen avtar, blir de som over-lever av de ekspanderte T^-celler tilbake som hukommelsesceller i legemet og kan ekspandere hurtig igjen når det samme antigen presenteres. Betydningen av T-celler ved helbredelse fra akutte virusinfeksjoner er vel anerkjent for visse viruser, særlig myxoviruset (influensa), kopperviruser (ectromelia og vaccinia)

og arenaviruset (lymfocytisk choriomeningittvirus).

Til tross for at betydningen av immunsystemets forsvarsmekanismer for vertens ve og vel er klart bragt på det rene, er det terapeutiske potensial av disse agenser ikke blitt realisert. I en forundersøkelse rapporterte S.A. Rosenberg et al., New England J. Med.. 313, 1485 (1985) at den systemiske tilførsel av autologe perifere blod-lymfocytter (PBL) som var blitt inkubert med IL-2 sammen med ytterligere IL-2 til pasienter med langt fremskreden cancer oppnådde cancerregresjon hos 11 av de 25 pasienter som ble behandlet. Rosenberg et al. kalte de inkuberte PBL-celler "lymfo-kinaktiverte dreperceller (LAK)" og rapporterte at de var medlemmer av et cytolytisk system som er forskjellig fra de naturlige dreperceller og cytotoksiske T-celler. Senere undersøkelser hvor denne terapi ble anvendt har imidlertid ikke bekreftet disse lovende tidlige resultater.

Uansett langtidsresultatene av denne metode av "adoptiv immunterapi" har Rosenberg et al. bemerket at "den største vanskelighet ved anvendelse av denne metode for behandling av human cancer har vært at man ikke har vært istand til å danne tilstrekkelig antall autologe humane celler med antitumor-reaktivitet som kan anvendes for systemisk terapi". Dette er spesielt problematisk hva angår pasienter som er immunundertrykket på grunn av infeksjoner, cancer, medikamenter i forbindelse med organtransplanta-sjon eller antineoplastiske medikamenter og liknende.

På samme måte er en rekke forsøk blitt gjort for å isolere og opprettholde homogene populasjoner av Tc- eller T^-celler og å karakterisere dem ved deres antigenspesifisitet og MHC-restrik-sjon. Disse forsøk innbefatter vanligvis stimulering av mononukleære celler fra en seropositiv menneske- eller musevert med bakterie- eller viruspreparater i kombinasjon med ikke-formerende (non-profilerative) APCer, såsom bestrålte autologe mononukleære celler (MNCer). Formerende polyklonale populasjoner av T^-celler eller Tc-celler klones ved begrensende fortynning for oppnåelse av homogene populasjoner og formeres deretter ytterligere og karakteriseres ved en rekke forskjellige teknikker. Som angitt av Rosenberg et al. når det gjelder klonede LAK-celler, er en av de største hindringer for kloning av T-lymfocytter den begrensede tilgjengelighet av autologe eller alternativt allogene MHC LA-matchede MNCer, særlig fra kliniske subjekter.

For å overvinne dette problem er APCer andre enn autologe MNCer blitt anvendt som APCer. F.eks. har T. Issekutz et al.,

J. Immunol., 129, 1446 (1982) først angitt at autologe Epstein-Barr-virustransformerte (EBV-transformerte) LCL-linjer kan presentere antigener assosiert med tetanustoksoid for tetanus-reaktive polyklonale T-celler og T-cellekloner. D.R. Kaplan et al. i Cellular Immunolo<g>y, 88., 193 (1984) rapporterte produksjonen av tre Tc-cellekloner ved formeringen av perifere blod-MNCer fra en type A-influensa immun donor. Én 'av klonene formerte seg i nærvær av bestrålte virusinfiserte autologe MNCer, eller i nærvær av bestrålte infiserte Epstein-Barr virustransformerte allogene lymfoblastoidceller (LCL).

B.G. Elferink et al., Scand J. Immunol., 22, 585 (1985) viste videre at autologe og allogene Epstein-Barr-virustransformerte-(EBV-transformerte) LCL-linjer kan presentere antigener assosiert med M. leprae basiller for M. leprae-reaktive klonede T-cellelinjer. Nok en artikkel fra denne gruppe beskrev isoleringen av en T-celleklone som kan gjenkjenne bare M. leprae-antigener. Kloningsmetoden benyttet autologe EBV-transformerte LCLer, som APCer. Fordelen ved å bruke EBV-transformerte LCLer er at de kan skaffe en kontinuerlig og ubegrenset kilde til APCer. [J.B.A.G. Haanen et al., Scand. J. Immunol., 23, 101 (1986)].

Human cytomegalovirus (HCMV) er et stort arts-spesifikt herpes-virus (DNA 1,5x10^ Da) som deler egenskapene av latens og reaktivering med andre medlemmer av denne gruppe. HCMV er ubikvitært (30-70% av voksne er seropositive), men det eller de viktigste seter for latens av HCMV er ikke bestemt, hvilket heller ikke de molekylære hendelser som inngår i dets reaktivering er. HCMV-infeksjon og -reaktivering kan være asymptomatiske, men er forbundet med betydelig sykelighet og dødelighet hos immunundertrykkede individer. F.eks. er HCMV den vanligste årsak til

opportunistisk, infeksjon i benmargtransplanterte pasienter.

Mer enn 80% av de som utvikler HCMV-lungebetennelse dør, til tross for de seneste behandlingsmetoder.

Skjønt monoklonal antistoff-terapi kan være nyttig som en forebyggende behandling, er det blitt foreslått at overlevelse av immunundertrykkede pasienter med alvorlige HCMV-infeksjoner kan avhenge av nærværet av HCMV-spesifikke cytotoksiske T-celler. Quinnan et al., i New England J. Med., 307, 7 (1982) har antydet at HCMV-spesifikke cytotoksiske T-celleresponser i disse pasienter er forbundet med klinisk helbredelse og opphør av virusekskresjon, mens de som hadde aktive infeksjoner som ikke utviklet cytotoksiske responser alle som én døde.

R.C. Gehrz et al., Lancet, 2, 844 (1977) meddelte at spedbarn med medfødt HCMV-infeksjon har en antigenspesifikk defekt med hensyn til T-hjelpercelle-formering, som er forbundet med persistens av replikerende virusinfeksjon i måneder og år, til tross for nærværet av HCMV-spesifikke antistoffer. Tilegnelse av HCMV-spesifikke lymfocytt-formerende responser synes å være forbundet med en svekkelse i virusekskresjon. Således er det sannsynlig at HCMV-spesifikke T-hjelperceller spiller en betydelig rolle i immunforsvaret mot dette virus hos immunkompetente verter.

I pasienter med reaktivert HCMV-infeksjon er antistoffer rettet mot HCMV-antigener ikke beskyttende eller er bare nyttige i samband med riktige T-celleresponser. Perifere blod-lymfocytter (PBL) vil sannsynligvis heller ikke være nyttige som terapeutiske agenser, selv om de kunne oppnås i tilstrekkelige mengder. Antallet T-hjelperceller eller cytotoksiske T-celler som er reaktive med et spesielt antigen, er ekstremt lavt og således vil den selektive ekspansjon av antigenspesifikke T-celler in vitro være nødvendig for oppnåelse av tilstrekkelige antall for terapeutiske formål. Videre vil den terapeutiske tilførsel av allogene PBLer aktivere T-celler som kjenner igjen "fremmede" leukocyttantigener, hvilket fører til en blandet leukocyttkultur-reaksjon. Denne blandede leukocyttkultur-reaksjon kan aktivere uønskede ikke-spesifikke immunresponser, eller alternativt indusere supressorceller som kan inhibere ønskede antigenspesifikke

immunresponser.

Autologe eller allogene antigenspesifikke T-cellelinjer vil sannsynligvis uttrykke en ønsket terapeutisk aktivitet uten ledsagende komplikasjoner som er forbundet med den blandede leukocyttkultur-reaksjon. L.K. Borysiewicz et al., Eur. J. Immunology, 13, 804 (1983) rapporterte dannelsen av kortvarige polyklonale T^-cellelinjer ved ekspansjonen av MNCer fra seropositive individer (subjects) med oppløselig HCMV-antigen i nærvær av IL-2. Når MNCene ble samdyrket på autologe HCMV-infiserte fibroblaster, ble polyklonale Tc-celler dannet, hvilke lyserte HCMV-infiserte celler.

Der eksisterer imidlertid et behov for forbedrede fremgangsmåter for å danne og opprettholde populasjoner av T^-celler og Tc-celler som er spesifikke for antigener assosiert med vira såsom HCMV og andre patogene agenser. Et ytterligere behov eksisterer for immunterapeutiske metoder basert på tilførselen av antigenspesifikke T-lymfocytt-populasjoner av kjent biologisk aktivitet til pattedyrindivider.

Kort beskrivelse av oppfinnelsen

I. Produksjon av T- cellelinier

A. T- hielperceller

Den foreliggende oppfinnelse er rettet på fremgangsmåter for effektiv produksjon av en homogen populasjon av T-hjelperceller (Tft-celler) som er spesifikke for et virusantigen såsom et HCMV-antigen. Det antas at de foreliggende fremgangsmåter skaffer grunnlaget for den effektive produksjon av klonede T^-celler, idet der anvendes et minimum av antigen- og lymfokinunderstøt-telse med opprettholdelse av både antigenspesifisiteten og den funksjonelle aktivitet av klonene. I sin videste form omfatter den foreliggende fremgangsmåte: (a) å isolere en populasjon av mononukleære celler (MNC) fra blodet av en giver-pattedyr, hvor MNC-populasjonen omfatter T-hjelperceller som er spesifikke for et virusantigen, og autologe, ikke-formerende antigenpresenterende celler (APC) ;

(b) å kombinere den nevnte isolerte populasjon av de nevnte MNCer med en mengde av virusantigenet som er virksomt

for å bevirke formeringen av en T-hjelpercelle som er spesifikk for antigenet; (c) å tillate den nevnte T-hjelpercelle å formere seg i et tidsrom som er virksomt for å tillate ikke-formerende MNCer å tape levedyktighet, og

(d) å ekspandere klonalt den antigenspesifikke T-hjelpercelle

i nærvær av en mengde av ikke-formerende antigenpresenterende celler som omfatter en blanding av (i) autologe MNCer, allogene MNCer eller blandinger derav, og (ii) autologe lymfoblastoid-celler (LCLer), allogene LCLer eller blandinger derav, og en mengde av den nevnte virusantigen som er virksom for formering av den nevnte klonede antigenspesifikke T-hjelpercelle for å gi den nevnte homogene populasjon, og hvor de nevnte LCLer foreligger i en mengde som er virksom for å øke formeringshastigheten av T-hjelpercellen i forhold til den som bevirkes av MMCene.

I løpet av det selektive formeringstrinn (c), som kan kreve 1-2 uker, kan det også være effektivt å tilsette en ytterligere mengde av det nevnte virusantigen og de autologe ikke-formerende APCer for å bevirke den ytterligere formering av T-hjelpercellen for å forbedre produksjonen av en levedyktig polyklonal populasjon av de virusantigenspesifikke T^-celler før trinn (d). I trinn (d) kan antigenspesifikke monoklonale T^-celler fås ved begrensende fortynning eller ved enkeltcelleisolering ved mikro-manipulering eller strømningscytometri.

Antigenspesifikke polyklonale T-cellelinjer, såvel som monoklonale antigenspesifikke T-celler, har potensiell terapeutisk nytte. Således kan uttrykket "T-celleline", slik det her benyttes, henvise til en ekspandert populasjon av polyklonale T-celler som er unikt reaktive med et gitt antigen, eller til en homogen populasjon av monoklonale T-celler som er blitt oppnådd ved

ekspansjonen fra en enkelt forløper-T-celle.

Da den foreliggende oppfinnelse omfatter formeringen av antigenspesifikke T^-celler, skaffer den også en fremgangsmåte til formering av en homogen populasjon av T-hjelperceller som er spesifikk for virusantigen omfattende å kombinere den nevnte homogene populasjon av T-hjelperceller med en mengde av antigenet og en mengde av en blanding av ikke-formerende antigenpresenterende celler (APC) som er virksomme for å bevirke formeringen av populasjonen av T-hjelperceller, idet den nevnte blanding av APCer omfatter (i) autologe eller allogene lymfoblastoid-celler (LCL) og (ii) autologe eller allogene mononukleære celler (MNC), idet LCLene foreligger i en mengde som er virksom for å øke formeringshastigheten av T-hjelpercellene i forhold til det som bevirkes av MNCene. Fortrinnsvis fås LCLene fra en kontinuerlig lymfoblastoid-cellelinje, således som den som kan produseres ved virustransformasjon, hybridomateknologi og liknende. APCene gjøres ikke-formerende ved teknikker som er kjent i faget, f.eks. ved røntgenbestråling, behandling med kjemiske midler såsom mitomycin C og liknende.

Både de ikke-formerende MNCer og LCLer er funnet å bevirke formeringen av T^-celler når de fås fra den samme vert som T-cellene eller er allogene MNCer eller LCLer som deler ett eller flere klasse II begrensende antigener (forkortelse: "MHC LA-matchet"). Det ble overraskende funnet at en blanding av LCLer og MNCer kan synergistisk presentere antigen for T^-celler, for således i betydelig grad å øke deres formeringshastighet i forhold til det som bevirkes av et ekvivalent antall av den ene eller den annen type APC når den anvendes alene.

F.eks., denne virkning observeres når det gjelder et virusantigen såsom et HCMV-antigen, når en blanding av EBV-transformerte autologe LCLer og autologe MNCer anvendes som APCene i et forhold på minst 1:10. Fortrinnsvis er forholdet mellom T^-celler og LCL-celler som tilsettes fra 1:1 til 1:3, og forholdet mellom T-celler og MNCer er fra 1:3 til 1:10.

Videre kreves bare en begrenset tetthet av LCL for i betydelig grad å øke ekspansjonen av av T^-kloner. Denne side ved den foreliggende fremgangsmåte er viktig fra et praktisk synspunkt, fordi humant antigenspesifikke T^-kloner kan ekspanderes i store mengder i et forholdsvis kort tidsrom ved bruk av begrensede antall MNCer. F.eks. i henhold til den foreliggende fremgangsmåte kan HCMV-spesifikke T^-kloner ekspanderes fra l-2xl0<6>celler til 10^ celler i løpet av 2 uker ved anvendelse av l-2xl0<7>MNCog lxlO<6>LCL som APC.

Det er også funnet at det er langt å foretrekke å utføre forme-ringstrinnene (c) og/eller (d) ifølge fremgangsmåten i nærvær av en virksom mengde interleukin-2 ("IL-2" eller "TCGF").

En videre hensikt med den foreliggende oppfinnelse omfatter å øke formeringshastigheten av de virusantigenspesifikke T^-celler ved utførelse av det opprinnelige formeringstrinn (trinn a-c som angitt ovenfor), eller det etterfølgende ekspansjonstrinn (trinn (d), som angitt ovenfor) i nærvær av en mengde av monoklonalt antistoff som er spesifikt for det nevnte virusantigen. I én utførelsesform av denne side ved oppfinnelsen blir formeringshastigheten av en T^-celle spesifikk for et HCMV-virusantigen, øket ved å kombinere MNCer som er isolert fra blodet av en HCMV-seropositiv giver-pattedyr med et monoklonalt antistoff som er spesifikt for et antigen som foreligger på et HCMV-genprodukt, såsom et strukturelt protein. Det monoklonale antistoff anvendes i kombinasjon med (a) en virksom formeringsstimulerende mengde av det nevnte antigen og (b) en mengde av autologe APCer valgt fra gruppen bestående av (i) ikke-formerende MNCer, (ii) et ikke-formerende LCL som fås fra et kontinuerlig LCL og (iii) blandinger derav, f.eks. blandinger som kan sammen virke for ytterligere økning av formeringshastigheten av T^-cellene. Fortrinnsvis blir de autologe, ikke-formerende antigenpresenterende celler valgt fra gruppen bestående av røntgenbestrålte autologe MNCer, en røntgenbestrålt Epstein-Barr-virustransformert (EBV-transformert) lymfoblastoid cellelinje (LCL) og blandinger derav. Disse er de foretrukne APCer for bruk i trinn (b) ifølge fremgangsmåten, uansett om der anvendes eller ikke anvendes monoklonalt antistoff og/eller IL-2 for å øke formeringshastigheten.

B. C<y>totoksiske T- celler

Den foreliggende fremgangsmåte kan også anvendes til å produsere en homogen populasjon av cytotoksiske T-celler (Tc-celler) som er spesifikke for et HCMV-antigen. Denne side ved den foreliggende oppfinnelse omfatter de følgende trinn: (a<1>) å isolere en populasjon av mononukleære celler (MNC) fra blodet av en giver-pattedyr, fortrinnsvis et menneske,

hvor MNC-populasjonen omfatter Tc-celler som er spesifikke for det nevnte virusantigen,

(b<1>) å kombinere den nevnte isolerte populasjon av de nevnte MNCer med (i) en mengde av en autologe, ikke-formerende, antigenpresenterende celler (APC), f.eks. bestrålte MNCer, (ii) en mengde av det nevnte HCMV-antigen og (iii) en mengde av interleukin-2 (IL-2) som er virksomt for å bevirke formeringen av en Tc-celle som er spesifikk for det nevnte antigen;

(c<1>) å tillate den nevnte Tc-celle å formere seg i et tidsrom som er virksom for å tillate ikke-formerende MNCer å tape levedyktighet; og

(d<1>) å ekspandere klonalt den nevnte antigenspesifikke Tc-celle

i nærvær av (i) en mengde av ikke-formerende, autologe, antigenpresenterende celler; ikke-formerende, allogene, antigenpresenterende celler eller blandinger derav, (ii)

en mengde av IL-2 og (iii) en mengde av det nevnte HCMV-antigen som er virksomt for å formere den nevnte klonede antigenspesifikke Tc-celle for å gi den nevnte homogene populasj on.

Trinn (b<1>), (c<1>) eller (d<1>) utføres fortrinnsvis i nærvær av et monoklonalt antistoff som er spesifikt for et HCMV-antigen og som tjener til å øke formeringshastigheten av den nevnte Tc-celle.

Som tidligere beskrevet for antigenspesifikke T-hjelpercellelinjer kan polyklonale Tc-linjer som er reaktive med en spesielt virusantigen ekspanderes ved kontinuerlig stimulering av Tc- blåster som oppviser cytotoksisk aktivitet overfor målceller som uttrykker det ønskede antigen. Homogene populasjoner av virusspesifikke Tc-kloner som fås fra en enkelt opphavs-T-celle kan fås ved begrensende fortynning eller ved enkeltcelleisolasjon ved mikromanipulasjon eller strømningscytometri, fulgt av ekspansjon i henhold til trinn (d<1>).

Andre foretrukne utførelsesformer av denne Tc-celleformerings-metode omfatter (1) bruken av helt HCMV-virusantigen eller bruken av HCMV-infiserte autologe eller allogene fibroblaster som en kilde til celleassosiert virusantigen, f.eks. et HCMV mellomliggende-tidlig protein, (2) tilsetningen av ytterligere mengder av virusantigenet IL-2 og de autologe ikke-formerende APCer i løpet av trinn (c<1>) for å bevirke ytterligere formering av den nevnte Tc-celle og (3) bruken, i trinn (b<1>) eller trinn (d<1>) av antigenpresenentereride celler som ytterligere omfatter ikke-formerende MNCer som fås fra en kontinuerlig autolog MNC-linje i en mengde som er virksom for å øke formeringshastigheten av Tc-cellene i forhold til den som bevirkes av de autologe mononukleære antigenpresenterende celler. Denne kontinuerlige autologe MNC-linje omfatter fortrinnsvis en virustransformert LCL, dvs.

en EBV-transformert LCL.

Den foreliggende oppfinnelse er også rettet på en fremgangsmåte til formering av en homogen populasjon av Tc-celler som er spesifikk for et antigen, såsom et virusantigen, dvs. et HCMV-antigen. Fremgangsmåten omfatter å kombinere den nevnte homogene populasjon av cytotoksiske T-celler med en mengde av det nevnte antigen, en mengde av interleukin-2 (IL-2) og en mengde av en blanding av ikke-formerende antigenpresenterende celler (APC) som er virksom for å bevirke formeringen av den nevnte populasjon av Tc-celler, idet den nevnte blanding av APCer omfatter allogene virustransformerte lymfoblastoide celler (LCL) og allogene mononukleære celler (MNC). Fremgangsmåten omfatter ytterligere å kombinere den nevnte populasjon av Tc-celler med en mengde av monoklonalt antistoff som er spesifikt for det nevnte antigen, hvilket monoklonalt antistoff tjener til å øke formeringshastigheten av den nevnte populasjon av celler.

Uttrykket "antigen" slik det her benyttes med hensyn til et patologisk mål, såsom et virus eller en infisert celle, henviser til en forbindelse såsom et polypeptid, polypeptidkompleks, glykoprotein, nukleinsyre eller liknende som frembringer en immunrespons. Et patologisk målantigen kan være en porsjon av det patologiske mål i seg selv, f.eks. et virus-kappeglykoprotein, eller det kan være et antigen som uttrykkes av et sykt vev, såsom et neoplastisk vev eller en virusinfisert celle. En "antigenspesifikk" T-lymfocytt blir aktivert i nærvær av et enkelt antigen når det presenteres for en antigenpresenterende celle (APC) i forbindelse med et spesifikt leukocyttantigen (LA) som uttrykkes av den antigenpresenterende celle. En antigenspesifikk T^-celle vil formere seg i et egnet medium i nærvær av det antigen for hvilket det har spesifisitet når det nevnte antigen presenteres for T^-cellen ved en APC som også uttrykker leukocyttantigenet for hvilket T^-cellen har spesifisitet. Som antydet ovenfor når det gjelder humane T-hjelperceller, vil det spesifikke leukocyttantigen være et humant MHC klasse II-antigen, mens humane cytotoksiske T-celler er spesifikke for MHC klasse I-antigener.

C. HCMV- antiaenspesifikke T- cellelinier

Foretrukne utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse omfatter homogene populasjoner av Tc- eller T^-celler og fremgangsmåter for fremstilling av disse, hvor en gitt cellepopulasjon er spesifikk for et HCMV-antigen.

Når en T-celle eller en T-celleklon sies å være antigenspesifikk, er epitopen eller det spesifikke antigensetet på antigenblandin-gen ikke nødvendigvis kjent, skjønt blandingen som omfatter antigenet kan være spesifisert. F.eks. kan tre forskjellige homogene populasjoner av T-hjelperlymfocytter være spesifikke for ett spesielt HCMV strukturelt protein eller glykoprotein. Skjønt de alle reagerer på det samme antigen og således har den samme antigenspesifisitet, kan de ha forskjellige spesifisiteter på submolekylært nivå, hvilket betyr at de kan reagere på forskjellige regioner av antigenet eller epitopene. Innenfor denne sammenheng kan forskjellige HCMV-spesifikke T-lymfocytter ha samme submolekylære spesifisitet bare når de gjenkjenner den samme epitop på det samme HCMV-assosierte antigen. De kan imidler tid likevel være spesifikke for det same antigen dersom antigenet har en rekke forskjellige epitoper som presenteres ved APCer i forskjellige tilfeller.

F.eks. blir HCMV-DNA-genomet transkribert i fortløpende rekke-følge, idet man begynner med den restrikerte transkripsjon av mellomliggende-tidlige gener som koder for regulatoriske proteiner som er nødvendige for den etterfølgende ekspresjon av tidlige gener. Det viktigste mellomliggende-tidlige gen (I-El) koder for et 68 kD regulatorisk protein som uttrykkes på membranen av infiserte celler 6-24 timer etter at infeksjonen er begynt. HCMV-spesif ikke cytotoksiske T-celler antas hovedsakelig å gjenkjenne dette mellomliggende-tidlige protein som en del av deres rolle i immunovervåking for å hindre reaktivering av latent HCMV.

Transkripsjon av tidlige gener går forut for begynnelsen av DNA-syntese. Innbefattet blant de tidlige genprodukter er virusspesifikke polymeraser og kinaser som er nødvendige for DNA-replika-sjon. Disse enzymer synes ikke å spille noen viktig rolle i immunresponser.

De sene HCMV-gener koder imidlertid for en rekke immunogeniske strukturelle proteiner og glykoproteiner. Innbefattet blant disse proteiner er kappeglykopeptid-komplekser med disulfidbroer, ikke-glykosylerte kappeproteiner, tegument-glykoproteiner som danner bro mellom virusnukleocapsidet med den ytre kappe, og matriks-proteiner som danner den indre capsidstruktur av viruset.

Rensingen og karakteriseringen av en rekke immunogeniske strukturelle glykopeptidkomplekser og reduserte glykopeptider fra HCMV-kappefraksjonen sammen med monoklonale antistoffer (MoAber) som er spesifikke for dette er fullt beskrevet i US-patentsøknad nr. 933.789 innlevert 24. november 1986, som herved innlemmes som referanse. De primære glykopeptider, glykopeptidkomplekser og MoAber som er beskrevet er angitt i tabell 1.

De immunogene glykopeptidkomplekser og glykopeptider som er angitt i tabell 1 er nyttige for selektiv stimulering av formeringen av T^-celler som fås fra blodet av en HCMV-seropositiv giver. På samme måte kan monoklonale antistoffer med kjent bindingsspesifisitet, såsom 9E10, 41C2 og 9B7 benyttes til å rense virusantigener. Disse monoklonale antistoffer kan også benyttes til å forsterke antigengjenkjennelse ved Tn-cellekloner, hvilket letter deres ekspansjon i nærvær av begrensede mengder virusantigen.

II. Immunterapi med T- cellelinier

T-celle-gjenkjennelse av forskjellige HCMV-proteiner er viktig for planlegging av det riktige forløp av immunterapi med T-cellelinjene. T^-cellene som her er eksemplifisert, gjenkjenner primært strukturelle proteiner av HCMV. Det er derfor sannsynlig at de vil være viktige i gjenkjennelsen av cellefri virus (dvs.

i tilfeller av akutt viremi). Data fra mus og mennesker viser at visse cytotoksiske T-celler gjenkjenner mellomliggende-tidlige proteiner som uttrykkes på overflaten av infiserte celler. Da disse proteiner bare produseres etter at virusgenene er uttrykt av vertscellene, er slike Tc-celler viktige for å hindre reaktivering av latent HCMV, og deres tilførsel er antydet for både forebyggende og spesifikk HCMV-behandling.

De foretrukne T-cellelinjer gjenkjenner virusantigener i assosiasjon med humane LA-produkter. Derfor må terapeutiske T-celler være enten autologe eller dele én eller flere av de restriksjons-spesifisiteter som uttrykkes av pasienten. I den sammenheng hvor isolerte T-celler overføres til et individ som en måte til behandling, er allogene celler celler fra et giverindivid av den samme art som mottakeren som er matchet for det viktigste (major) histokompatibilitetskompleks for en passende human leukocyttantigen-klasse (HLA-klasse) av antigener uttrykt av resipienten (forkortelse "MHC LA-matchet"). Følgelig, når man har med en pasient å gjøre som har en patologisk infeksjon, såsom kronisk HCMV-sykdom, kan man ekspandere autologe antigenspesifikke T-cellelinjer in vitro for senere T-celleterapi via ny tilførsel. Alternativt, når hurtig tilgang til T-celleklone-reagenser er viktig for å behandle akutt, livstruende infeksjon, kan pre-ekspansjon og tilførsel av en rekke ekspanderte allogene terapeutiske T-celler av kjent virusantigen-spesifisitet og/eller HLA-type anvendes. Denne teknikk er spesielt viktig for pasienter som

er immunundertrykket.

En videre side ved den foreliggende oppfinnelse er derfor rettet på en fremgangsmåte til anvendelse av T-lymfocytter (T-celler) for terapeutisk behandling av et pattedyr, såsom en human pasient, som har en virusinfeksjon, f.eks. HCMV-infeksjon. Fremgangsmåten omfatter å behandle det nevnte infiserte pattedyr med en mengde av en homogen, klonalt ekspandert, virusantigenspesifikk T-celle-populasjon som er virksom for å frembringe en øket immunreaksjon overfor virusinfeksjonen, idet den nevnte T-cellepopulasjon er spesifikk (a) for minst ett leukocyttantigen (LA) som foreligger på overflaten av en antigenpresenterende celle (APC) av det nevnte pattedyr, og (b) overfor et antigen av det nevnte virus.

Fortrinnsvis består de.n klonalt ekspanderte T-celle-populasjon hovedsakelig av Tn-celler eller Tc-celler. Som angitt ovenfor foretrekkes det ofte å tilføre en rekke forskjellige (eller en "bank") homogene klonalt ekspanderte virusantigenspesifikke T-celle-populasjoner for (a) å fremme immunsystemgjenkjennelse av antigener som er uttrykt i løpet av forskjellige stadier infeksjon og/eller (b) å garantere at et virksomt antall av de samlede T-celle-populasjoner vil være MHC-matchet med mottakeren.

Den foreliggende fremgangsmåte for T-celle-immunterapi omfatter derfor tilførselen av en rekke forskjellige T-celle-populasjoner som omfatter T-celler med spesifisitet (a) for en rekke forskjellige antigener av det nevnte virus, og (b) for minst ett LA som foreligger på overflaten av en APC av det nevnte pattedyr. Videre kan fremgangsmåten også omfatte tilførselen av en rekke forskjellige T-celle-populasjoner som hver omfatter T-celler med en spesifisitet (a) for minst ett antigen av det nevnte virus, og (b) for en rekke forskjellige LAer som foreligger på overflatene av APCer av en rekke forskjellige allotyper av en enkelt art av det nevnte pattedyr, idet minst ett LA er LA-restriksjonsmatchet med det nevnte pattedyr.

Polyklonale linjer, samt T-cellekloner, kan ha betydelig terapeutisk potensial. En spesiell fordel med antigenspesifikke polyklonale T-cellelinjer er at de innbefatter T^- og/eller Tc-celler som kan gjenkjenne mål-virusantigenet i assosiasjon med alle restrikerende MHC LAer som uttrykkes av T-cellegiveren. Fordelen med virusspesifike Tn- og Tc-kloner som fås fra en enkelt opphavs-T-celle er at de representerer en homogen populasjon av celler med kjent antigenspesifisitet, funksjonell aktivitet og MHC LA-restriksjonsspesifisitet. Det er derfor sannsynlig at de vil oppvise maksimal terapeutisk virkning, da alle celler i populasjonen oppviser den samme funksjonelle aktivitet. Fra et praktisk synspunkt vil imidlertid en langt større "bank" som fås fra adskilte (discrete) T-celle-populasjoner være nødvendig dersom monoklonale T-celler skal anvendes.

Da fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tillater tilførselen av en terapeutisk virksom mengde av T^-celler og/eller Tc-celler, kan det sykdomsrammede pattedyr behandles, skjønt ikke nødvendigvis, samtidig med eksogene lymfokiner, såsom IL-2 (TCGF). Da tilførse-len av store doser IL-2 er blitt assosiert med uheldige reaksjo-ner hos noen pasienter, kan evnen til å fremme immunresponsen i fravær av IL-2 skaffe en betydelig forbedring i virkningsfull-heten av T-celle-terapi.

Representative antigenspesifikke T-cellelinjer som er blitt dannet i henhold til de foreliggende fremgangsmåter og som er representative for de populasjoner som kan benyttes til å danne T-celle-"banker" som angitt ovenfor, er angitt i tabell 2.

Den foreliggende oppfinnelse er blitt beskrevet hovedsakelig ut fra produksjonen av Tn- og Tc-celler som er spesifikke for virusantigener og behandlingen av virusinfeksjoner med homogene populasjoner av disse T-celler. Det antas imidlertid at homogene populasjoner av T^- og Tc-celler som er spesifikke for antigener på en rekke forskjellige patologiske mål kan fremstilles ved bruk av den foreliggende fremgangsmåte og at disse populasjoner vil være virksomme for å forsterke eller stimulere immunresponsen for en rekke forskjellige patogener eller patologiske mål.

Vidt definert er et patologisk mål en enhet innenfor legemet av et pattedyr som er årsaken til, eller resultatet av, en sykdom som truer pattedyrvertens helse og ve og vel. Målet kan være en enhet som er fremmed for verten, såsom et virus, bakterie, sopp eller liknende, eller ået kan være et produkt av en sykdom eller patologisk tilstand, såsom en virusinfisert celle, en neoplastisk celle og liknende. I spesifikke utførelsesformer av den terapeutiske behandling ifølge oppfinnelsen er det patologiske mål for behandlingen undertiden en sekundærinfeksjon som er mer truende for den påtenkte resipient, fordi en primærsykdom har svekket resipientens evne til å reagere immunologisk på den sekundære infeksjon. Mange sider ved primærsykdommer kan svekke den påtenkte resipients immunrespons overfor den sekundære infeksjon, innbefattet terapeutiske behandlinger som virker til å undertrykke sider av resipientens immunsystem. Slike behandlinger omfatter, men er ikke begrenset til, strålebehandling, kjemiterapi og liknende.

Som en oppsummering kan den foreliggende terapeutiske fremgangsmåte anvende allogene T-celler fra individer av samme art som er MHC LA-matchet. Dette vil tillate leger og farmasøyter å forenkle bruken av på forhånd dannede doseformer av allogene T-celler for behandling av en pasient. Da T-celler som ikke er matchet ganske enkelt er uten virkning for å hjelpe pasienten, kan dosen inneholde mange celler, noen som er matchet og som vil hjelpe pasienten og noen som ikke er matchet og som ikke vil hjelpe pasienten.

På denne måte kan en enkelt doseform anvendes for å behandle en rekke pasienter som deler ett eller flere LAer som uttrykkes ved de allogene terapeutiske celler. Dessuten kan dosen inneholde både Tc- og T^-celler som har forskjellige MHC-klasserestriksjo-ner. Det tør være åpenbart at en slik terapeutisk behandling ikke krever fremstillingen av doser på en fra gang-til-gang-basis. Dette betyr at T-cellene kan ekspanderes i store dyrkningsmedia, hvilket tillater den effektivitet som oppnås ved stor målestokk. Dessuten kan cellene fremstilles slik at de er øyeblikkelig tilgjengelige uten at de krever individualisert oppsamlet, leukaferese og dyrking.

Uansett de ovenfor angitte fordeler er imidlertid det mest lovende trekk ved den nye immunterapi utsiktene til at hver dose vil inneholde antigenspesifikke T-celler. Dette representerer et betydelig fremskritt over fremgangsmåten i henhold til Rosenberg et al. som bare skaffer ikke-spesifikk forbedring av cytotoksiske celler. I den foreliggende fremgangsmåte kan en doseform skaffes som inneholder allogene T^- og Tc-celler som er spesifikke for en rekke forskjellige antigener som alle er assosiert med et spesielt patogen. F.eks. kan en enhetsdose inneholde en rekke

Tn- og Tc-cellekloner som er blitt individuelt dyrket og deretter blandet. Doseformen kan inneholde Tn- og Tc-celler med et på forhånd valgt antall LA-restriksjoner og også et på forhånd valgt antall antigenspesifisiteter. Dersom et spesielt patogen er kjent for å uttrykke 10 eller 20 kjente epitoper på en rekke forskjellige antigener, strukturelle eller andre, kan dosen inneholde passende T-celler som har spesifisitet for hver av dem. Behandlingsmetodologier vil normalt involvere den parenterale tilførsel av en terapeutisk virksom mengde av autologe eller allogene T-celler i en egnet flytende bærer såsom en fysiologisk saltoppløsning. Én slik fremgangsmåte er den som er skaffet avS.A. Rosenberg et al., New England J . ' Med. , 313, 1485 (1985), men antall celler som leveres pr. dose og antall doser som tilføres vil variere innen vide grenser, avhengig av faktorer som bestem-mes av klinikeren, innbefattet den patologi som behandles, pasientens fysikk og hans fysiske tilstand og andre faktorer. På grunn av den forbedrede virkningsgrad av formeringsmetoden ifølge oppfinnelsen, kan det imidlertid være mulig å fjerne stort sett færre MNCer fra pasienten og tilbakeføre stort sett flere autologe antigenspesifikke T-celler til pasienten enn det som er nødven-dig ved metodologien i henhold til Rosenberg et al.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Oppfinnelsen skal beskrives ytterligere i overensstemmelse med

de følgende detaljerte eksempler.

EKSEMPEL I

1. Fremstilling av virusantigener

Humane primære fibroblastkulturer dyrket i Dulbeccos modifisert Eagle<1>s Medium (DMEM) pluss 10% kvegfosterserum ble infisert

med Towne-stamme HCMV ved en infeksjonsmultiplisitet (MOI) på 1-5. Ved 3-4 dagers postinfeksjon ble [^H]glukosamin (5 uCi/ml, 22 Ci/mM, Amersham, Arlington Heigths, IL) eller [-^5S]metionin

(5 uCi/ml, 109 Ci/mM, DuPont/NEN, Boston, MA) tilsatt som en markør i løpet av etterfølgende rensing for visse av de eksperimenter som er beskrevet nedenfor.

Celler og celleavfall ble fjernet fra mediet ved lavhastig-hetssentrifugering ved 7500 x g i 20 min. Virus ble samlet opp fra supernatanten ved sentrifugering ved 48 200 x g i 1 time. Viruspelleten ble resuspendert i Tris NaCl-buffer (50

mM trishydroksymetylaminometan-HCl, pH 7,4, og 150 mM NaCl)

og lagt lagvis på 20-60% sakkarosegradienter fremstilt med den samme buffer. Hastighetssedimentering ble utført ved 131.300 x g i 1 time. Gradienter ble samlet opp og målt for optisk densitet ved 280 nm. En hovedtopp for optisk densitet som dannet

bånd ved 43% sakkarose ble samlet opp. Disse fraksjoner ble fortynnet medTris/NaCl-buffer og virus samlet opp ved sentrifugering ved 131.300 x g i 2 timer. Dette rensede hele virus-preparat ble betegnet "helt HCMV-antigen".

For å oppløseliggjøre membranbestanddeler, ble hele HCMV-anti-genpreparatet suspendert på nytt i 2-4 ml TN-buffer (Tris/NaCl-buf f er (50 mM Tris hydroklorid, pH 7,5, 10 mM NaCl, 2 mM fenyl-metylsulfonylfluorid)) inneholdende 1% Triton-X 100 (TX-100). Etter inkubasjon ved omgivelsetemperatur i 60 minutter ble

denne oppløsning lagt lagvis på en lineær 20-60% sakkarose-gradient for hastighetssone-sentrifugering (rate zonal centri-fugation) ved 120.000 g i 60 minutter. Det TX-100 oppløselig-gjorte materiale ble tilbake ved toppen av gradienten, mens HCMV-nukleocapsidene ble samlet i bånd ved hastighetssedimentering. Alternativt ble detergentekstrakter av Towne-stamme HCMV fremstilt ved bruk av 1,0% Nonidet P-40 (NP-40, Sigma Chemical Company). I denne fremgangsmåte ble 10-15 mg av det rensede hele HCMV-antigen suspendert i 3-5 ml TN-buffer inneholdende 1% NP-40. Detergent/virus-suspensjoner ble omrørt i 1 time ved værelsetemperatur. De ekstraherte proteiner ble separert fra uoppløselige proteiner ved høyhastighetssentrifugering i 1 time. Det ekstrakt som ble oppnådd ved den ene eller den annen av disse fremgangsmåter ble betegnet "HCMV-detergentekstrakt".

Skjønt HCMV-spesifikke T-hjelperceller synes å gjenkjenne HCMV-proteiner og glykoproteiner som inneholdes inne i de hele HCMV-antigenpreparater, gjenkjenner HCMV-spesifikke cytotoksiske T-celler hovedsakelig HCMV-kodede proteiner uttrykt på overflaten av de infiserte celler. Nærmere bestemt synes det viktigste mellomliggende-tidlige protein (I-El-protein) som uttrykkes på cellemembranen innen 6-24 timers infeksjon å være viktig for ekspansjonen av HCMV-spesifikke cytotoksiske T-celler.

Autologe fibroblaster eller allogene fibroblaster som deler

et eller flere klasse-I-leukocyttantigener som gjenkjennes av T-celledonoren ble derfor infisert med Towne-stamme HCMV ved

en infeksjonsmangfoldighet på 5-10 i 3 timer. I noen tilfeller ble cellene infisert i nærvær av cykloheksamid (50 ug/ml).

Etter fjerning av cykloheksamid ble Actinomycin D (5 ug/ml) tilsatt for å hindre ytterligere DNA-transkripsjon, hvilket tillot selektiv ekspresjon av I-E-gener av HCMV. Infiserte fibroblaster som ikke var behandlet med cykloheksamid og Actinomycin D uttrykte både I-E og sene geneprodukter av HCMV. Disse preparater ble betegnet "celleassosiert virusantigen".

Herpes simplex-virus type I (HSV-I) ble delvis renset som beskrevet av R.C. Gehrz et al., Lancet, 2, 844 (1977) og varmeinaktivert ved 56°C i 1 time for å gi "HSV-Antigen".

EKSEMPEL II

1.Dannelse av HCMV- spesifikk T- hieloercelle oa cytotoksiske T- cellelinier

HCMV-spesifikke T-celleblaster ble fremstilt i 25 cm<2>opprett-stående vevdyrkningskolber ved stimulering av 10 x 10<6>mononukleære celler (MNC) ved en konsentrasjon på 1 x 10^ MNC pr.

ml med 10 ug varmeinaktivert helt HCMV-antigen (56°C, 1 time) suspendert i RPMI 1640-medium supplert med 15% varmeinaktivert HCMV-seronegativt humant serum (PHS). Etter 7-10 dager ved

37°C i 5% C02-atmosfære ble de HCMV-spesifikke blåster enten ekspandert ytterligere i samlekultur (bulk culture), eller klonet ved begrensende fortynning i 9 6-brønners U-bunnede vevskulturplater med 0,3 celler pr. brønn i nærvær av røntgen-bestrålt (5.000 R) autologt MNC (MNC<IRR>) som mateceller, helt HCMV-antigen ved en konsentrasjon på 1 ug/ml (for Tn-celler) eller celleassosiert antigen med et forhold mellom fibroblast og MNC på 1:20 (for Tc-celler), og 10-20% interleukin-2 (IL-2)

(TCGF, Biotest, Frankfurt, Vest-Tyskland). Deretter ble cellene matet på nytt hver 3-4 dag med nytt IL-2-holdig medium. Helt HCMV-antigen og autologe røntgenbestrålte mateceller ble satt til mediet hver 7.-14. dag.

Voksende celler ble matet og overført til 96-brønners flatbunnede vevskulturplater. Voksende kloner ble deretter overført til 24-brønners plater for ytterligere ekspansjon og deretter sådd på nytt i 25 cm<2>vevskulturkolber for produksjon i stor skala. Ekspanderte kloner ble subklonet ved en annen begrensende fortynning for å sikre klonalitet. Kloner ble utviklet fra 4 forskjellige HCMV-seropositive givere, hvilket ga mer enn 100 individuelle T-cellelinjer. 2. Karakteriserin<g>av HCMV- Tn- oa TG- cellelinier og - kloner Alle de Tft- og Tc-linjer og -kloner som anvendes i eksemplene nedenfor blekarakterisertmed hensyn til fenotype, formeringsresponser, IL-2-produksjon og cytotoksisk aktivitet som følger:

A. Fenotvpeanalvse

T-cellelinjer ble analysert for ekspresjon av CD-fenotypiske determinanter ved bruk av de monoklonale antistoffer 0KT3 (samlede T-celler), 0KT4 (hjelper/induserer-T-celler) og 0KT8 (cytotoksiske/suppressor-T-celler) (Ortho Pharmaceuticals Inc., Raritan, NJ) ved bruk av en indirekte immunofluorescens-målemetode. Fluorescens ble påvist enten ved fluorescensmikroskopi ved bruk av et Zeiss fluorescerende mikroskop eller strømningscytometri ved bruk av EPICS sp celle 541 (Coulter Corp., Hialeah, FL). Polyclonale T^-linjer var hovedsakelig CD3+4+8-; alle T^-kloner uttrykte CD3+4+8-fenotypen. Tc-linjene var hovedsakelig CD3+4-8+; Tc-klonene var CD3+4-8+.

B. Lvmfocvttformering

T-cellelinjer og -kloner ble tillatt å hvile i vevskultur-medium i fravær av TCGF over natten, og deretter restimulert i 72 timer med enten helt HCMV-antigen eller HSV-antigen for å bestemme spesifisiteten av formeringsresponsen hos T^-kloner. Alle T^-linjer og -kloner viste positive formeringsresponser overfor HCMV, mens responser overfor HSV var de samme som for vevskulturmediumsbakgrunns-sammenlikningsprøve. Således var alle T^-linjer og -kloner HCMV-spesifikke. Tc-cellekloner formerte seg dårlig overfor HCMV-antigen i frævær av IL-2.

C. Produksjon av interleukin- 2 ( IL- 2)

Tn-kloner ble stimulert med helt HCMV-antigen og supernatanten høstet ved 24 timer og analysert for IL-2-aktivitet ved bruk av musecellelinjen CTLL-20 (IL-2-avhengig). Alle Tn-kloner ble vist å produsere IL-2, som oppvist ved overlevelsen og veksten av CTLL-20. Tc-klonene ble ikke testet for IL-2-produksjon.

D. Cvtotoksisk aktivitet

Alle T^-kloner ble testet for cytotoksisk aktivitet mot NK-målcellelinjen, K562, autologt uinfiserte og CMV- og HSV-infiserte fibroblaster som målceller. Ikke noen NK-eller virusspesifikk cytotoksisk aktivitet ble observert ved noen av T^-klonene.

Alle Tc-kloner ble testet for cytotoksisk aktivitet mot NK-målcellelinjene K5 62, autologe og umatchede eller delvis matchede allogene uinfiserte og HCMV-, HSV- og influensa-infiserte fibroblaster som målceller. Ikke noen anti-NK-aktivitet ble observert med noen av Tc-klonene. Alle HCMV-spesifikke Tc-kloner oppviste cytotoksisk aktivitet overfor autologe og MHC LA-matchede HCMV-infiserte fibroblaster, men ikke overfor allogene umatchede HCMV-inf iserte fibroblaster. Ingen cytotoksisk aktivitet ble observert for noen av målcellene infisert med HSV eller influensavirus. Således oppviser de Tc-kloner som her er beskrevet HSMV-spesifikk cytotoksisk aktivitet begrenset ved MHC klasse-I-antigener og oppviser derfor karakteri-stikkene for virusspesifikke cytotoksiske T-celler.

EKSEMPEL III

Formeringsrespons av HCMV- spesifikke T^- kloner overfor HCMV-antigener

Sytten HCMV-T^-kloner oppnådd fra giver-WRC blekarakteriserti utstrakt grad med hensyn til fenotype, formeringsresponser, IL-2-produksjon og cytotoksisk aktivitet. Alle kloner var CD3+4+8-

, formerende overfor HCMV, men ikke HSV (som beskrevet i eksempel II (2) ovenfor), alle produserte IL-2 når de ble stimulert med HCMV, men ikke HSV, og ingen oppviste cytotoksisk aktivitet.

Således ble alle kloner ansett å være T-hjelperceller. Alle kloner oppviste også klasse II MHC-restriksjonsspesifisitet, som bestemt ved blokkering med anti-klasse-II monoklonale antistoffer og reaktivitet overfor helt HCMV-antigen presentert ved autologe eller allogene antigenpresenterende celler som deler den riktige Dw-restriksjonsdeterminant uttrykt i assosiasjon med DR, DQ eller

DP.

For undersøkelser av Tc-cellereaktivitet overfor rensede HCMV-antigener ble røntgenbestrålte autologe mononukleære celler tilsatt som en kilde til antigenpresenterende celler i en 3 dagers restimuleringskultur. Én uCi pr. brønn av tritiumbehandlet (tritiated) tymidin ble tilsatt i løpet av kulturens siste 16 timer. Kulturene ble høstet på glassfiberfiltre og tellet på et væske-scintillasjonsspektrofometer. Resultatene av disse analyser er angitt i tabell 3.

De data som er angitt i tabell 3 viser at alle 17 kloner var reaktive for helt Towne-HCMV-antigen og oppviste fra 4108 tellinger pr. minutt til 121.030 tellinger pr. minutt. Disse resultater antyder at den eller de immunodominerende determinanter som gjenkjennes av disse HCMV-T^-kloner uttrykkes ved strukturelle proteiner og/eller glykoproteiner fra virionet.

Alle kloner reagerte også i betydelig grad på Triton X-100 ekstrakter av Towne-HCMV, skjønt i mindre grad enn overfor hele Towne-viruspartikler. Således virker det som om mesteparten av Tft-klonene enten gjenkjenner primært proteiner eller glykoproteiner som er inkludert inne i viruskappen eller proteiner som assosierer i tilstrekkelig grad med viruskappen til at de gjenkjennes i detergentekstraktet. De lavere responser sammenliknet med helt Towne-antigen kan gjenspeile inhibitoriske virkninger av resterende detergent eller et tap av immunogenisitet som skyldes strukturelle forandringer som et resultat av ekstraksjonsfrem-gangsmåten.

Det er også interessant at alle T^-kloner også oppviste en lav, men signifikant formeringsrespons overfor utfellinger av virusantigen etter detergentekstråksjon. Skjønt det er sannsynlig at noen resterende kappeglykoproteiner og tegumentproteiner er inkludert inne i bunnfallet, er det også mulig at nukleocapsidproteiner,

som øyensynlig omfatter det dominerende protein i bunnfallet,

også kan uttrykke antigeniske determinanter som gjenkjennes av T-hj elperceller.

T-celleklonene ble deretter stimulert med rensede glykoproteinkomplekser som ble oppnådd ved anionveksling-HPLC-fraksjonering av uredusert detergentekstrakt av helt HCMV-antigen (se eksempel I (1) ) •

Som angitt hos B. Kari et al., J. Viroloav. 60, 345 (1986) og i tabell 1 ovenfor, inkluderer glykoproteinkomplekser som inneholdes inne i topper 2UR og 4UR et glykoproteinkompleks som gjenkjennes av et monoklonalt antistoff (9E10)\Dette antistoff er kryssreaktivt med forskjellige andre vira og er istand til å nøytralisere HCMV i fravær av komplement. I motsetning til dette isoleres en separat og avgrenset gruppe glykoproteinkomplekser med en høy renhetsgrad i topp 3UR og gjenkjennes av en separat klasse monoklonale antistoffer som reagerer unikt med HCMV og nøytraliserer HCMV effektivt bare i nærvær av komplement.

Etter reduksjonen har de viktigste glykoproteiner som fås fra 3UR-komplekset molekylvekter på 130.000, 90.000 og 50.000-52.000 kD, de to glykoproteiner som fås fra 2UR/4UR-komplekset gjenkjent av det 9E10 monoklonale antistoff har molekylvekter på 93.000 og 50.000-52.000 kD. Et tredje glykoprotein er blitt påvist i topp 2UR, som er forskjellig fra de glykoproteiner som gjenkjennes av det 9E10 monoklonale antistoff. Derfor er der minst tre viktige glykoproteinkomplekser som inneholdes i HCMV-kappen som er blitt identifisert som utgjørende mer enn 9 5% av de samlede glykoproteine inne i HCMV-viruskappen. Da disse HPLC-metoder synes å gi glykoproteinkomplekser med >9 5% renhet, var det av interesse å vise mønsteret for Tn-reaktivitet overfor disse individuelle glykoproteinkomplekser.

Som vist i tabell 3, av de 17 T^-kloner som ble testet for reaktivitet med HPLC-rensede glykoproteinkomplekser, reagerte to på topper 3UR og 4UR, men ikke på topp 2UR. En tredje T^-klon reagerte på alle tre HPLC-topper. Det er sannsynlig at disse kloner primært reagerer på det viktigste glykoproteinkompleks som også gjenkjennes av monoklonale antistoffer.som påviser glykoproteinkomplekset hovedsakelig isolert i topp 3UR. Det er sannsynlig at den avtagende del av topp 3UR, idet den overgår til topp 4UR, svarer for den tilsynelatende kryssreaktivitet. Denne spesifisitet ble bekreftet for Th-klon WRC-T3#3, WRC-T2#41 og WRC-L10, som formerte seg spesifikt overfor glykopeptid gpA produsert ved m-RNA-translasjon av pgA-genet in vitro (data ikke angitt).

Av særlig interesse er det at mesteparten av klonene (14/17) ikke synes å gjenkjenne determinanter uttrykt ved noen av de viktigste kappeglykoprotein-komplekser som representert ved materialer 2UR, 3UR og 4UR. Således kan den immunodominante HCMV-antigeniske determinant som gjenkjennes av disse klonede T-hjelperceller ligge enten i et ikke-glykosylert membranprotein eller i et internt protein. Hvis dette er tilfelle kan det være det samme som for influensaviruset, hvor antistoffgjenkjennelse omfatter primært overflateglykoproteinene (dvs. hemagglutinin), mens cytotoksiske T-lymfocytter er kjent for å gjenkjenne primært interne nukleocapsidproteiner.

Tabell 4 angir data med hensyn til spesifisiteten av HCMV-spesifikk Tft-kloner som er reaktive med individuelle HCMV-(glyko)proteiner. Kloner ble dannet ved opprinnelig stimulering av MNCer fra seropositiv giver-WRC med helt HCMV-antigen for å velge for Th-reaktive med strukturelle proteiner og glykoproteiner av HCMV.

18% av de Tn-kloner som ble testet var spesifikke for gpA som beskrevet i detalj i eksempel 1.1. Representative eksempler omfatte WRCT3#3 og WRCT2#41. 33% av de HCMV-spesifikke Tn-kloner funnet å være reaktive med helt virus såvel som et delvis renset matriksprotein med molekylvekt på 64.000 dalton. Dette protein ble oppnådd ved revers fase HPLC og gelfiltrering i henhold til en modifikasjon av fremgangsmåten ifølge B.R. Clark, J. Virol., 49, 279 (1984). Helt Towne-HCMV oppnådd ved sentrifugering av supernatanten av de HCMV-infiserte fibroblaster ble oppløseliggjort i 6 M guanidinium-klorid og kjørt på revers fase HPLC med en C-18 kolonne. Proteiner som adsorberte til kolonnen ble eluert med acetonitril og påvist ved måling av kolonneutløpsstrømmen ved 214 nm. Topper som ble samlet opp ble slått sammen, og 64 kD-proteinet ble identifisert ved SDS-PAGE.

64 kD-proteinet ble ytterligere renset fra sameluerte proteiner ved størrelseeksklusjonskromatografi ved anvendelse av TSK 4000

og TSK 3000 SEC-kolonner koblet i serie. En aggregert form av 64 kD-proteinet ble isolert som bestemt ved SDS-PAGE ved bruk av denne fremgangsmåte.

Kloner WRC-T2/88 og WRC-T2/131 er representative for HCMV-spesifikk T^-kloner som formerte seg som respons på 64 kD-matriksproteinet. Det er interessant at mange av klonene (dvs. WRC-L33 og WRC-L42) var ikke-reaktive med enten det viktige kappeglykoprotein gpA eller det rikelig forekommende 64 kD interne matriksprotein. Sålede er det tydelig at HCMV-spesifikke T-hjelperceller eksisterer for en rekke forskjellige strukturelle HCMV-proteiner.

EKSEMPEL IV

Cytotoksiske responser av HCMV- spesifikke Tc- linier og - kloner overfor HCMV- antigener

Polyklonale og monoklonale Tc-celler ble analysert for cytotoksi-sitet overfor NK-målcellen, K562; og autologe eller allogene fibroblaster infisert med HCMV, HSV eller influensavirus. De følgende spesifikke metodologier ble anvendt:

A. Preparering av målceller

1. HCMV- inf iserte menneskehud- fibroblaster ( SF)

Humane diploide hudfibroblaster (SF) ble oppnådd fra husbiopsier hos voksne givere og forhuden fra nyfødte. Celler ble ført i passasje minst 6 ganger og frosset ved en hastighet på 1°C pr. minutt i Dulbeccos modifi-serte Eagle Medium (DMEM) inneholdende 10% serum fra kalvefoster (FCS) og 10% dimetylsulfoksid (DMSO) og lagret i flytende nitrogen. Før anvendelse ble cellene tint i et 37°C vannbad, vasket med medium og podet på 25 cm<2>'s vevskulturkolber. SF ble dyrket til konfluens, infisert med HCMV ved en infeksjonsmangfoldighet på 0,2 og inkubert inntil 70-90% av monolaget oppviste cytopatis virkning. Celler ble deretter merket med Na2CrC>4 (375 uCi i 2 ml medium) over natten ved 37°C i en atmosfære på 5% CO2. Cellene ble vasket tre ganger og resuspendert iRPMI i 10% FCS. Uinfiserte<51>CR-merkedeSFer ble brukt som sammenligningsprøver.

2. HSV- og influensainfiserte hudfibroblaster

Et SF-monolag i en 25 cm<2>'s kolbe ble infisert med HSV eller influensa med en infeksjonsmangfoldighet på 5-10 og inkubert over natten. Cellene ble merket på samme måte som HCMV-infisert SF.

3. K562

Erytroleukemicellelinje K562 ble benyttet som en kilde for målceller for å måle NK-aktivitet. K562-celler (1 x 10^) ble suspendert i 1 ml medium og 375 uCi av Na2CrC>4 i en 25 cm<21>s kolbe over natten ved 37°C i et atmosfære av 5% CC>2. Cellene ble resuspendert i RPMI supplert med 10% FCS etter tre vaskinger.

4. SF som selektivt uttrykker I- E HCMV- proteiner

SFer ble infisert med HCMV ved en infeksjonsmangfoldighet på 5-10 i tre timer i nærvær av cykloheksamid (15 ug/ml). Etter fjerning av cykloheksamid ble Actinomycin-D (5 ug/ml) og Na2Cr04(375 uCi) satt til kulturen. Cellene ble deretter vasket tre ganger og resuspendert i RPMI i 10% FCS som målceller. Den cytotoksiske måling ble utført under Actinomycin-D for å hindre DNA-transkrip sjon. Uinfiserte SFer behandlet med cykloheksamid og Actinomycin-D i parallell ble brukt som sammenlignings-prøver.

B. Cvtotoksisitetsmåling

Tre tusen målceller i 100 ul ble satt til hver brønn av V-bunnede mikrotiterplater. Fortynninger i serier av effektorceller i 100 ul ble deretter satt til målcellene for å gi et forhold mellom effektorceller og målceller på 50:1, 25:1 og 12:1. Platene ble sentrifugert ved 50 g i 5 minutter ved 37°C i et atmosfære av 5% CO2i 10 timer. 100 ul supernatanter ble høstet og tellet i en gammateller (Beckmann Gamma 9000). Sammenligningsprøvene besto av maksimal lyse og spontan frigjøring som ble oppnådd ved tilset-ning av 100 pl Triton-X-100 i medium resp. målceller. Beregninger er utført i henhold til følgende formel:

Eksperimentelle tellinger pr. minutt representerte celler fra brønner med effektorceller.

Resultatene ble uttrykt som den midlere verdi av brønner i triplika eller kvadruplikat. Spontan frigjøring fra både infiserte og uinfiserte SF-målceller var mindre enn 40%.

1. Cytotoksisk aktivitet av HCMV- spesifikke pol<y>klonale Tc-cellelinier stimulert med Towne- HCMV- infiserte autologe

hudfibroblaster ( SF)

Mononukleære celler fra seropositiv giver SP-CN ble stimulert i 7-10 dager i massekultur med autologe hudfibroblaster (SF) infisert i 20 timer med Towne HCMV. T-celleblaster ble restimulert ukentlig med HCMV-infiserte fibroblaster, autologe bestrålte MNC som mateceller og IL-2. Resulterende polyklonale CD8+ T-cellelinjer ble evaluert for cytotoksisk aktivitet overfor uinfiserte og HCMV- infiserte autologe fibroblaster og NK-målcellelinjen K562. Resultatene i denne undersøkelsen er angitt i tabell 5.

Som det kan ses fra dataene angitt i tabell 5 oppviste begge cellelinjer cytolytisk aktivitet overfor autologe fibroblaster infisert i 20 timer med HCMV, idet de uttrykte mellomliggende-tidlig og sene virusproteiner og overfor CMV-infiserte autologe fibroblaster som var blitt behandlet med cykloheksamid (CH) og Actinomycin-D (act. D) for selektiv uttrykkelse av de mellomliggende-tidlige proteiner av HCMV. Begge linjer uttrykker også signifikante nivåer av NK-lignende cytotoksisk aktivitet.

2. Cytotoksisk aktivitet av HCMV- spesifikke Tc- cellelinier oa kloner stimulert med sakkarosearadient/ rensede Towne- HCMV-viruspartikler

CD8+ Tc-cellelinjer og -kloner ble oppnådd fra seropositiv giver SP-RK ved opprinnelig stimulering av MNC med sakkarosegradient-rensede Towne-HCMV-viruspartikler, fulgt av gjentatt stimulering med HCMV-viruspartikler, autologt bestrålt MNC som mateceller og IL-2. Tre CD8+-linjer og klonen CD8+ SP-RK #3 lyserte HCMV-infisert autologe fibroblaster, men ikke allogene umatchete HCMV-infiserte fibroblaster eller autologe fibroblaster infisert med enten HSV eller influensavirus som vist i tabell 6.

Disse linjer uttrykte liten cytotoksisk aktivitet overfor K562-NK-målceller. Således er disse T-cellelinjer og -klon karakteris-tiske for HCMV-spesifikke MNC-klasse-I LA-restrikerte T-cytotoksiske celler som gjenkjenner ett eller flere antigener som uttrykke av helt virusantigen (dvs. strukturelle proteiner.

EKSEMPEL V

Forsterkning av antigenindusert formering av HCMV- spesifikke Tn-kloner ved bruk av polvklonalt antiserum fra seropositive givere og HCMV- spesifikke monoklonale antistoffer

1. Monoklonalt antistoff

HCMV-Th-klon WRC-T3#3 ble benyttet ved en konsentrasjon på 1,5 x IO<4>celler pr. brønn som en kilde til responderceller. Autologt røntgenbestrålt MNC (10^) ble tilsatt som en kilde til antigenpresenterende celler. En optimal fortynning av hele HCMV-antigen eller 0,1 ug/ml av HPLC-renset 3UR ble tilsatt som en kilde til HCMV-spesifikk antigenstimulering. Fortynninger i rekkefølge av monoklonale antistoffer 41C2, som gjenkjenner det immundominerende glykoprotein A (gpA) eller et sammenlignings-monoklonalt antistoff 35F10, som gjenkjenner et ikke-glykosylert protein betegnet protein D ble tilsatt ved konsentrasjoner i området fra 10 ned til 0,01 ug/ml protein pr. brønn. Resultatene av dette forsøk er angitt i tabell 7.

Dataene angitt i tabell 7 viser at monoklonalt antistoff 41C2 i betydelig grad forsterket den formerende respons av Tn-klonen når 3UR eller helt HCMV-antigen ble benyttet for antigenisk stimulering. I motsetning til dette ble ingen betydelig forsterkning observert med det monoklonale antistoff rettet mot protein D ved bruk av enten 3UR eller helt HCMV-antigen.

Således virker det som om monoklonale antistoffer rettet mot et immunogenisk glykoproteinkompleks som spesielt stimulerer en bestem Tft-klon er virksom når det gjelder å forbedre den formerende respons.

Seks HCMV-T^-kloner som har vist seg å reagere på helt HCMV-antigen ble deretter stimulert med helt HCMV-antigen pluss fortynninger i rekkefølge av enten monoklonalt antistoff 41C2 (til gpA) eller monoklonalt antistoff 35F10 (til protein D). Seropositive og seronegative hele sera ble også testet under de samme betingelser. Resultatene av disse eksperimenter er angitt i tabell 8.

Det var overraskende at monoklonalt antistoff 41C2, rettet mot gpA, forsterket den formerende respons av alle seks T^-kloner overfor helt HCMV-antigen til tross for det faktum at bare 3 av de 6 kloner reagerte på HPLC-renset gpA i fravær av antistoff (se tabell 7). Det monoklonale antistoff rettet mot protein D forsterke ikke responsen av noen av de kloner som ble testet. Helt serum fra den seropositive giver forsterket responsen av alle kloner, mens det fra den seronegative giver ikke gjorde det. Disse data antyder at forsterkningsmekanismen ikke nødvendigvis involverer en direkte interaksjon mellom antistoffet og det spesifikke virus-protein eller glykoprotein som gjenkjennes at T^-klonen.

EKSEMPEL VI

Presentasjon av HCMV- antigen for T- hielpercellekloner ved MNC,

LCL eller blandinger derav

1.Epstein- Barr virus- transformert ( EBV- transformert) lvmfo-blastoidcellelinier ( LCL)

En autolog LCL fra seropositiv giver SP-CN (SP-CN LCL) ble opprettet ved fremgangsmåten ifølge Sugden og Mark, J. Virology, 23, 503 (1977) og dyrket i RPMI 1640-medium (GIBCO, Grand Island, NY), supplert med 10% varmeinaktivert kalve-fosterserum (FCS). AMG LCL (DR 2,2/D2 2,2) og NHS LCL (DR 3,8) var gaver fra Dr. F. Bach {IRC, University of Minnesota, Minneapolis, MN).

2. Dannelse av HCMV- spesifikke T- cellekloner

HCMV-spesifikke T-cellekloner ble dannet fra en seropositiv giver (SP-CN). Kort sagt ble mononukleære celler (MNC) dyrket ved 10^ celler pr. ml i■RPMI 1640-medium supplert med 15% varmeinaktivert HCMV-seronegativt humant serum (PHS) og 1 ug/ml helt HCMV-antigen. Etter 7-10 dager ble T-celleblaster isolert og klonet ved begrensende fortynning ved 0,3 celler pr. brønn i rund-bunnede brønner inneholdende 0,2 ml RPMI/15% PHS-medium med 10.000 autologe røntgenbestrålte (5000 R) MNC, 1 ug/ml helt HCMV-antigen (Towne-stamme) og 15% IL-2 (TCGF, Biotest, Frankfurt, Vest-Tyskland). Platings-virkningsgrader på 2-12% ble observert. Klonene ble ekspandert i dyrkingsmedium inneholdende 10-20% IL-2 og restimulert med autolog røntgenbestrålt MNC/LCL-blanding og 1 ug/ml helt HCMV-antigen hver 1-2 uker.

3. Formerinasanalvse

HCMV-spesifikke klonede Tn-celler ble analysert 7-14 dager etter restimulering. Mikrokulturene ble anordnet i rund-bunned plater (Flow Lab., Inc., VA) med et samlet volum på 0,2 ml pr. brønn inneholdende 10<4>HCMV-spesifikke T^-celler, forskjellige konsentrasjoner av røntgenbestrålt analogt MNC og/eller LCL og helt HCMV-antigen (Towne-stamme) eller HSV-antigen. Kulturene ble inkubert i 3 dager, og 1 uCi pr. brønn<3>H-tymidin (New England Nuclear, Boston, MA) ble satt til hver brønn for de siste 16-24 timer av dyrkingen. Brønnene ble høstet med en automatisk cellehøster, cellene oppsamlet på glassfiber-filterpapir og radioaktivitet målt i et Beckman 5 801 væske-scintillasj onsspektrometer.

4.LCL presenterer HCMV- antigen for HCMV- spesifikke T^- kloner Et panel av HCMV-spesifikke T^-kloner dannet fra en seropositiv giver (SP-CN) ble testet for HCMV-spesifikk formerende aktivitet ved bruk av enten røntgenbestrålt autologtMNC(IO<5>pr. brønn) eller røntgenbestrålt autologt LCL (10<4>- 3 x 10<4>pr. brønn) som APC. HSV-antigen var inkludert som en antigenspesifikk kontrollprøve. Tabell 9 viser resultatene som ble oppnådd ved bruk av syv kloner.

Alle de T^-kloner som er angitt i tabell 9 formerte seg godt som respons på HCMV-antigen, men ikke HSV-antigen når MNC ble satt til kulturene som APC. Graden av formering varierte fra 8.114 til 68.307 cmp. De fleste av disse kloner oppviste også HCMV-angiten spesifikk formerende responser når LCL ble benyttet som APC med et område fra 1.020 til 21.370. Kloner SP-CN/T2-131 og SP-CN/T5-43 formerte seg godt overfor HCMV i nærvær av bestrålt autologt MNC, men dårlig i nærvær av

autologt LCL.

På den annen side formerte kloner SP-CN/T3-16 og SP-CN/T3-9 seg godt overfor HCMV i nærvær av bestrålt autologt LCL, skjønt deres formering overfor HCMV i nærvær av bestålt MNC var ikke noe bedre enn for de andre fem kloner. Således er der ingen tilsynelatende korrelasjon mellom formeringsrespons overfor HCMV ved bruk av MNC som APC og den som oppnås ved bruk av LCL som APC. Det er velkjent at antigenspesifikke T-hjelperceller (T--celler) gjenkjenner antigen assosiert med klasse II-MHC-produkter på overflaten av APC-(P. Erb et al., J. Exper.

Med., 142, 460 (1975)). Oppfinnerne undersøkte MHC-restrik-sjonen av noen av disse T^-kloner ved bruk av LCL som APC og fant at alle klonene testet er klasse II-restrikert. LCL fra andre MHC klasse II-matchete givere presenterte også HCMV-antigen godt overfor de to høytreagerende kloner (SP-CN/T3-16 og SP-CN/T3-9), men dårlig overfor de fem lavtreagerende kloner. F.eks. presenterte CP-CN LCL (autologt, DR2, 4/DW/2,4) samt AMG LCL (DR2,2/DW2,2) HCMV-antigen overfor klonen SP-CN/T3-9, mens NHB LCL (DR3,8) ikke presenterte HCMV for den samme klon.

5. Forsterkende virkning av LCL på formerende responser av T-celler overfor MNC og HCMV

På grunn av begrensede forsyninger av autologt MNC som APC for å stimulere HCMV-spesifikke T^-celler og ineffektiv antigenpresentasjon ved autologt LCL når det anvendes alene, ble kombinasjoner av MNC og LCL anvendt som APC og mateceller i løpet av reaktivering av T^-klonene. Kombinasjonen av LCL og MNC oppviste overraskende en synergistisk effekt på formerende respons, som vist i tabell 10.

LCL alene som APC i et-,område på 10<4->10<5>LCL pr. brønn stimulerte ikke noen betydelig T-celleformerende respons overfor helt HCMV-antigen over bakgrunnen. Tilsetningen av LCL ved 10<4>LCL pr. brønn og 3 x 10<4>LCLpr. brønn forsterket imidlertid 3 dagers formeringsresponsen av T^-celler overfor MNC pluss helt HCMV i betydelig grad, skjønt IO<5>LCL pr. brønn syntes å undertrykke formerings-responsene, sannsynligvis på grunn av for stor celletetthet i kulturen.

De samme kulturer ble ekspandert i nærvær av 15% IL-2 i 12 dager, og celletellinger ble utført på dag 7 og dag 12 etter begynnelse av dyrkingen. Resultatene av disse forsøk er angitt i tabell 11. Som vist i tabell 11, når ikke noe MNC forelå, ble ikke Tn-celler ekspandert selv når både LCL og helt HCMV-antigen ble satt til kulturen. En kombinasjon av MNC og helt HCMV-antigen førte til en økning på 3-43 ganger i T-celle-antall i løpet av 12 dagers dyrking avhengig av mengden MNC som var involvert. Når LCL ble tilsatt sammen med MNC og HCMV-antigen, ble en økning i celleantall på 29-620 ganger observert over det samme tidsrom under de samme vevskulturbetingelser, hvilket klart indikerer at LCL forsterket ekspansjonen av aktiverte Tn-celler.

Porsjoner av disse kulturer ble platet i 96-brønners flatbunnede mikrotiterplater på dag 7 ved 0,2 ml pr. brønn i triplikat. Etter pulsing over natten med [^Hj-tymidin ble en lignende virkning av LCL på celleformering observert som målt ved inkorporert [%]-tymidin som angitt i tabell 12.

Disse resultater bekreftet gjennomførbarheten av å benytte både MNC og LCL som mateceller sammen med antigen i aktivering og ekspansjon av T^-kloner. Utstrekningen av T^-celleekspansjon er proporsjonal med konsentrasjonen av MNC<IRR>i området fra 10<4->10<5>MNC pr. brønn, men ikke proporsjonal med konsentrasjonen av LCL<IRR>. De optimale forhold mellom LCL og klonede T^-celler ligger i område fra 1:1 til 3:1.

Prøver av antigenpresenterende LCL-cellelinjer SP-CN/T3-43 (aksesjonskode: IVI-10122), og SP-CN/T5-43 (aksesjonskode: IVI-10123)

er også blitt deponert hos In Vitro International, Linthicum, MD,

i henhold til the Draft PTO Deposit Policy for biologiske materialer, BNA PTCJ, 32, 90 (1986) .

Kulturer av disse deponerte cellelinjer vil gjøres tilgjengelige for offentligheten ved utstedelse av et patent basert på den foreliggende søknad. Det skal forstås at tilgjengeligheten av deponeringen ikke utgjør en lisens til å utøve oppfinnelsens gjenstand som opphevelse av de patentrettigheter som meddeles av forente staters regjering. Skjønt visse representasjoner av utførelsesformer som her er beskrevet med det formål å illustrere oppfinnelsen, skal det forstå av fagfolk at modifikasjoner kan utføres uten å avvike fra oppfinnelsens omfang og ånd.

En takk rettes mot Children's Hospital, St. Paul, Minnesota, for generøs støtte og bistand i dette arbeid.

Claims

1.F remgangsmåte til fremstilling av en homogen populasjon av T-hjelperceller som er spesifikke for et virusantigen, karakterisert ved at den omfatter de følgende trinn: (a) å isolere en populasjon av mononukleære celler (MNC) fra blodet av et giver-pattedyr, hvor MNC-populasjonen omfatter T-hjelperceller som er spesifikke for det nevnte virusantigen, og autologe, ikke-formerende (non-proliferative) antigenpresenterende celler (APC); (b) å kombinere den nevnte isolerte populasjon av de nevnte MNCer med en mengde av det nevnte virusantigen som er virksomt for å bevirke formeringen av en T-hjelpercelle som er spesifikk for det nevnte antigen; (c) å tillate den nevnte T-hjelpercelle å formere seg i et tidsrom som er virksomt for å tillate ikke-formerende MNCer å tape levedyktighet; og (d) å ekspandere klonalt den nevnte antigenspesifikke T-hjelpercelle i nærvær av en mengde av ikke-formerende antigenpresenterende celler som omfatter en blanding av (i) autologe MNCer, allogene MNCer eller blandinger derav, og (ii) autologe lymfoblastoid-celler (LCLer), allogene LCLer eller blandinger derav og en mengde av det nevnte virusantigen som er virksom for formering av den nevnte klonede antigenspesifikke T-hjelpercelle, for å gi den nevnte homgene populasjon, og hvor de nevnte LCLer foreligger i en mengde som er virksom for å samvirke med MNCene for å øke formeringshastigheten av T-hj elpercellen.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at ytterligere mengder av det nevnte virusantigen og de nevnte autologe, ikke-formerende APCer som er virksomme for å forårsake formeringen av en T-hjelpercelle tilsettes i løpet av trinn (c) for å forårsake ytterligere formering av den nevnte T-hjelpercelle.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at i trinn (d) omfatter de ikke-formerende APCer en blanding av (i) autologe MNCer, og (ii) autologe LCLer, som er virksomme for å formere den nevnte antigenspesifikke T-hjelpercelle, idet de nevnte LCLer foreligger i en mengde som er virksom for å samvirke med MNCene for å øke formeringshastigheten av T-hjelpercellen.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at LCLene fås fra en virus-transf ormert lymfoblastoid-cellelinj e.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at den virustransformerte lymfoblastoid-cellelinje er Epstein-Barr virustransformert (EBV-transf ormert ) lymfoblastoid-cellelinj e.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det nevnte virusantigen er et humant cytomegalovirus-antigen (HCMV-antigen).

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at det nevnte HCMV-antigen er et viralt strukturelt protein.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at HCMV-antigenet foreligger i en viruskappe-fraksjon.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at HCMV-antigenet omfatter et glykopeptidkompleks som foreligger på virusoverflaten eller et virusglykopeptid som fås derfra.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 9, karakterisert ved at HCMV-antigenet er et immunogent glykopeptid på tilnærmet 9 3 kD eller et immunogent glykopeptid på 50-52 kD, hvilke glykopeptider foreligger på virusoverflaten.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at HCMV-antigenet er et tilnærmet 64 kD-matriksprotein.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at trinn (b), (c) eller (d) utføres i nærvær av en mengde av monoklonalt antistoff som er virksomt for å øke formeringshastigheten av den nevnte T-hjelpercelle, idet det monoklonale antistoff er spesifikt for det nevnte virusantigen.

13. Fremgangsmåte som angitt i krav 12, karakterisert ved at det monoklonale antistoff er spesifikt for humant cytomegalovirus-antigen (HCMV-antigen).

14. Fremgangsmåte som angitt i krav 13, karakterisert ved at det monoklonale antistoff er spesifikt for et immunogent glykopeptid med en molekylvekt på 50-52 kD eller et immunogent glykopeptid med en molekylvekt på tilnærmet 93 kD som foreligger på virusoverflaten.

15. Fremgangsmåte som angitt i krav 14, karakterisert ved at det monoklonale antistoff fremstilles ved hybridoma IVI-10117, ivi-10118 eller IVI-10119.

16. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at trinn (b), (c) eller (d) utføres i nærvær av en virksom mengde av interleukin-2 (IL-2).

17. Fremgangsmåte til fremstilling av en homogen populasjon av T-hjelperceller som er spesifikke for et virusantigen, karakterisert ved at den omfatter de følgende trinn: (a) å isolere en populasjon av mononukleære celler (MNC) fra blodet til et giver-pattedyr, hvor MNC-populasjonen omfatter T-hjelperceller som er spesifikke for det nevnte virusantigen, og autologe, ikke-formerende antigenpresenterende celler ( APC) ; (b) å kombinere den nevnte isolerte populasjon av de nevnte MNCer med en mengde av det nevnte virusantigen og en mengde av et monoklonalt antistoff som er spesifikt for det nevnte virusantigen som er virksomt for å forårsake formeringen av en T-hjelpercelle som er spesifikk for det nevnte antigen; (c) å tillate den nevnte T-hjelpercelle å formere seg i et tidsrom som er virksomt for å tillate ikke-formerende MNCer å tape levedyktighet; og (d) å ekspandere klonalt den nevnte antigenspesifikke T-hjelpercelle i nærvær av en mengde av ikke-autologe antigenpresenterende celler eller blandinger derav; en mengde av det nevnte virusantigen, og en mengde av det monoklonale antistoff som er spesifikt for det nevnte antigen, hvilke mengder er virksomme for formering av den nevnte klonede antigenspesifikke T-hjelpercelle, for å gi den nevnte homogene populasjon.

18. Fremgangsmåte som angitt i krav 17, karakterisert ved at virusantigenet er et HCMV-antigen.

19. Fremgangsmåte som angitt i krav 17, karakterisert ved at i trinn (d) omfatter de autologe ikke-formerende APCer ikke-formerende MNCer.

20. Fremgangsmåte som angitt i krav 19, karakterisert ved at i trinn (d) omfatter de autologe APCer eller de allogene APCer ytterligere ikke-formerende LCLer i en mengde som er virksom for å øke formeringshastigheten av T-hjelpercellen ytterligere i forhold til den økning som forårsakes av de ikke-formerende MNCer.

21.F remgangsmåte til fremstilling av en homogen populasjon av T-hjelperceller som er spesifikke for et antigen som foreligger på et humant cytomegalovirus (HCMV) strukturelt protein, karakterisert ved at den omfatter de følgende trinn: (a) å isolere en populasjon av mononukleære celler (MNC) fra blodet av et giver-pattedyr, hvor MNC-populasjonen omfatter T-hjelperceller som har spesifisitet for det nevnte humant cytomegalovirus-antigen (HCMV-antigen), og .ikke-formerende antigenpresenterende celler (APC); (b) å kombinere den nevnte isolerte MNC-populasjon med en mengde av det nevnte humant cytomegalovirus-antigen (HCMV-antigen) som er virksomt for å forårsake formeringen av en T-hjelpecelle som er spesifikk for det nevnte humant cytomegalovirus-antigen (HCMV-antigen); (c) å tillate den nevnte T-hjelpercelle å formere seg i et tidsrom som er virksomt for å tillate ikke-formerende MNCer å tape levedyktighet; og (d) å ekspandere klonalt den nevnte antigenspesifike T-hjelpercelle i nærvær av en virksom mengde av det nevnte HCMV-antigen, et monoklonalt antistoff som er spesifikt for det nevnte humant cytomegalovirus-antigen (HCMV-antigen), og en autolog, antigenpresenterende celle valgt fra gruppen røntgen-bestrålte autologe MNCer, en røntgenbestrålt Epstein-Barr-virustransf ormert (EBV) lymfoblastoid cellelinje (LCL) og blandinger derav, for å gi den nevnte homogene populasjon.

22. Fremgangsmåte som angitt i krav 21, karakterisert ved at ytterligere mengder av det nevnte virusantigen, det nevnte monoklonale antistoff som er spesifikt for det nevnte virusantigen og de nevnte autologe, ikke-formerende APCer, som er virksomme for å forårsake formeringen av den nevnte T-hjelpercelle, tilsettes i løpet av trinn (c) for å forårsake ytterligere formering av den nevnte T-hj elpercelle.

23. Fremgangsmåte som angitt i krav 21, karakterisert ved at trinn (b), (c) eller (d) utføres i nærvær av en virksom mengde av interleukin-2 (IL-2).

24. Fremgangsmåte til formering av en homogen populasjon av T-hjelperceller som er spesifikke for et virusantigen, omfattende å kombinere den nevnte homogene populasjon av T-hjelperceller med en mengde av det nevnte virusantigen og en mengde av en blanding av ikke-formerende, antigenpresenterende celler (APC) som er virksom for å forårsake formeringen av den nevnte populasjon av T-hjelperceller, idet den nevnte blanding av APCer omfatter (i) autologe eller allogene virustransformerte lymfoblastoid-celler (LCL) og (ii) autologe eller allogene mononukleære celler (MNC), idet LCLene foreligger i en mengde som er virksom for å samvirke med MNCene for økning av formeringshastigheten av T-hjelpercellene.

25. Fremgangsmåte som angitt i krav 24, karakterisert ved at forholdet mellom LCLer og MNCer er minst 1:1-1:10.

26. Fremgangsmåte som angitt i krav 25, karakterisert ved at det nevnte virusantigen er et humant cytomegalovirus-antigen (HCMV-antigen).

27. Fremgangsmåte som angitt i krav 24, karakterisert ved at den ytterligere omfatter å kombinere den nevnte populasjon av T-hjelperceller med en mengde av et monoklonalt antistoff som er spesifikt for det nevnte antigen, hvilket er virksomt for å øke formeringshastigheten av den nevnte populasjon av T-hjelperceller.

28. Fremgangsmåte som angitt i krav 24,: karakterisert ved at den ytterligere omfatter å kombinere den nevnte populasjon av T-hjelperceller med en mengde av interleukin-2 (IL-2) som er virksom for å øke formeringshastigheten av den nevnte populasjon av T-hjelperceller.

29. Fremgangsmåte som angitt i krav 24, karakterisert ved at forholdet mellom T-hjelperceller og LCLer er 1:1-3:1.

30. Fremgangsmåte til fremstilling av en homogen populasjon av cytotoksiske T-celler som er spesifikke for et humant cytomegalovirus-antigen (HCMV-antigen), karakterisert ved at den omfatter de følgende trinn: (a) å isolere en populasjon av mononukleære celler (MNC) fra blodet av et giverdyr, hvor MNC-populasjonen omfatter cytotoksiske T-celler som er spesifikke for HCMV-virusantigener; (b) å kombinere den nevnte isolerte populasjon av de nevnte MNCer med (i) en mengde av autologe, ikke-formerende, antigenpresenterende celler (APCer), (ii) en mengde av HCMV-infiserte autologe fibroblaster eller helt HCMV-antigen, og (iii) en mengde av interleukin-2 (IL-2), som er virksomt for å forårsake formeringen av en cytotoksisk T-celle som er spesifikk for et HCMV-antigen som er uttrykt ved de nevnte APCer; (c) å tillate den nevnte T-hjelpercelle å formere seg i et tidsrom som er virksomt for å tillate ikke-formerende MNCer å tape levedyktighet; og (d) å ekspandere klonalt den nevnte antigenspesifikke cytotoksiske T-celle i nærvær av (i) en mengde av HCMV-infiserte, ikke-formerende, autologe, antigenpresenterende celler, HCMV-infiserte ikke-formerende, allogene antigenpresenterende celler eller blandinger derav, (ii) en mengde av IL-2 og (iii) en mengde av autologe HCMV-infiserte fibroblaster eller helt HCMV-antigen som er virksomt for formering av den nevnte klonede antigenspesifikke cytotoksiske T-celle, for å gi den nevnte homogene populasjon.

31. Fremgangsmåte som angitt i krav 30, karakterisert ved at det nevnte giver-pattedyr er et menneske.

32. Fremgangsmåte som angitt i krav 30, karakterisert ved at ytterligere mengder av det nevnte virusantigen, det nevnte IL-2 og de nevnte autologe, ikke-formerende APCer som er virksomme for å forårsake formeringen av den nevnte cytotoksiske T-celle tilsettes i løpet av trinn (c) for å forårake ytterligere formering av den nevnte cytotoksiske T-celle.

33. Fremgangsmåte som angitt i krav 31, karakterisert ved at i trinn (b) blir populasjonen av MNCer kombinert med HCMV-infiserte autologe fibroblaster .

34. Fremgangsmåte som angitt i krav 33, karakterisert ved at i trinn (d) omfatter de nevnte antigenpresenterende celler ytterligere ikke-formerende MNCer som fås fra en kontinuerlig autolog MNC-linje i en mengde som er virksom for å øke formeringshastigheten av de cytotoksiske T-celler i samvirke med de autologe mononukleære antigenpresenterende celler.

35. Fremgangsmåte som angitt i krav 34, karakterisert ved at MNC-linjen omfatter en virustransformert lymfoblastoid cellelinje.

36. Fremgangsmåte som angitt i krav 35, karakterisert ved at den virustransformerte lymfyblastoide cellelinje omfatter en Epstein-Barr-virustransformert (EBV-transformert cellelinje).

37. Fremgangsmåte som angitt i krav 30, karakterisert ved at trinn (b), (c) eller (d) utføres i nærvær av en mengde av et monoklonalt antistoff som er virksomt for å øke formeringshastigheten av den nevnte cytotoksiske T-celle, idet det monoklonale antistoff er spesifikt for et HCMV-antigen.

38. Fremgangsmåte til formering av en homogen populasjon av cytotoksiske T-celler som er spesifikke for et antigen som er assosiert med et patogen, karakterisert ved at den omfatter å kombinere den nevnte homogene populasjon av cytotoksiske T-celler med en mengde av interleukin-2 (IL-2) og en mengde av en blanding av ikke-formerende, antigenpresenterende celler (APC) som er virksomme for å forårsake formeringen av den nevnte populasjon av cytotoksiske T-celler, idet den nevnte blanding av APCer omfatter allogene virustransformerte lymfoblastoid-celler (LCL) og allogene mononukleære celler (MNC) som uttrykker det nevnte antigen.

39. Fremgangsmåte som angitt i krav 38, karakterisert ved at det nevnte antigen er et virusantigen.

40. Fremgangsmåte som angitt i krav 39, karakterisert ved at det nevnte virusantigen er et humant cytomegalovirus-antigen (HCMV-antigen).

41. Fremgangsmåte som angitt i krav 38, karakterisert ved at den ytterligere omfatter å kombinere den nevnte populasjon av cytotoksiske T-celler med en mengde av monoklonalt antistoff som er spesifikt for det nevnte antigen, hvilket er virksomt for å øke formeringshastigheten av den nevnte cellepopulasjon.

42. Farmasøytisk enhetsdoseform, karakterisert ved at den omfatter en mengde av en homogen populasjon av antigenspesifikke T-lymfocytter som omfatter Tn -celler eller Tc -celler som er virksomme for å øke en immunrespons hos et mottager-pattedyr for et patologisk målantigen ved parenteral tilførsel av den nevnte doseform, idet den nevnte populasjon av T-lymfocytter er MHC LA-matchet med hensyn til mottaker-pattedyret, og hvor de nevnte T-lymfocytter er antigenspesifikke for det nevnte patologiske målantigen.

43. Farmasøytisk enhetsdoseform, karakterisert ved at den omfatter en blanding av en rekke homogene populasjoner av antigenspesifikke T-lymfocytter, hvor den nevnte blanding omfatter T^ -celler, Tc -celler eller blandinger derav, idet hver av de nevnte populasjoner er spesifikk for et patologisk målantigen, hvor minst én av den nevnte en rekke T-lymfocyttpopulasjoner er MHC LA-matchet med hensyn til et mottager-pattedyr, og hvor den nevnte blanding er virksom for å øke en immunrespons hos mottager-pattedyret overfor minst ett patologisk målantigen ved parenteral tilførsel av den nevnte doseform.

44. Farmasøytisk enhetsdoseform, karakterisert ved at den omfatter en rekke separat pakkede homogene populasjoner av antigenspesifikke T-lymfocytter omfattende Tn -celler eller Tc -celler, idet hver populasjon omfatter T-lymfocytter som er spesifikke for et patologisk målantigen, hvor hver populasjon er virksom for å øke en immunrespons hos et MHC-matchet mottager-pattedyr for det nevnte patologiske målantigen ved parenteral tilførsel av den nevnte populasjon av T-lymfocyter, og hvor minst én av de nevnte populasjoner er MHC LA-matchet med hensyn til mottager-pattedyret.

45. Farmasøytisk enhetsdoseform, karakterisert ved at den omfatter en mengde av en heterogen populasjon av antigenspesifikke T-lymfocytter omfattende Th-celler, Tc -celler eller blandinger derav for effektiv økning av en immunrespons hos et mottager-pattedyr overfor minst ett patologisk målantigen ved parenteral tilførsel av den nevnte populasjon av T-lymfocytter, og hvor minst en porsjon av den nevnte populasjon av T-lymfocytter er MHC LA-matchet med hensyn til mottager-pattedyret.

46. Farmasøytisk enhetsdoseform, karakterisert ved at den er fremstilt ved en fremgangsmåte som omfatter å kombinere en rekke homogene populasjoner av antigenspesifikke T-lymfocytter omfattende T^ -celler eller Tc -celler med en farmasøytisk akseptabel flytende bærer, hvor hver T-lymfocytt-populasjon er antigenspesifikk for et patologisk målantigen, og hvor minst én T-lymfocytt-populasjon er MHC LA-matchet med hensyn til pattedyrmottageren.

47. Farmasøytisk enhetsdoseform som angitt i et av kravene 44-46, karakterisert ved at den nevnte en rekke T-lymfocytt-populasjoner omfatter antigenspesifisiteter for en rekke antigener som er assosiert med et spesielt patologisk mål.

48. Farmasøytisk enhetsdoseform som angitt i et av kravene 44-46, karakterisert ved at den nevnte en rekke T-lymfocytt-populasjoner omfatter antigenspesifisteter for en rekke HCMV-assosierte antigener.