NO885016L - PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF ANTIGEN-SPECIFIC T-CELL LINES AND THERAPEUTIC APPLICATION OF THESE. - Google Patents
PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF ANTIGEN-SPECIFIC T-CELL LINES AND THERAPEUTIC APPLICATION OF THESE.Info
- Publication number
- NO885016L NO885016L NO88885016A NO885016A NO885016L NO 885016 L NO885016 L NO 885016L NO 88885016 A NO88885016 A NO 88885016A NO 885016 A NO885016 A NO 885016A NO 885016 L NO885016 L NO 885016L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- antigen
- cells
- specific
- hcmv
- population
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 86
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 271
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 270
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 270
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 196
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 claims description 176
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 110
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 97
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 63
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 62
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 49
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 49
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 43
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 41
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 39
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 35
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 34
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 33
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 27
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 24
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 23
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 20
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 14
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 13
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 claims description 11
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 claims description 11
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 claims description 11
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 9
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 claims description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 8
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims description 6
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 claims description 5
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 claims description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 claims description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims 1
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 27
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 25
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 21
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 19
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 16
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 15
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 14
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 13
- 230000004044 response Effects 0.000 description 13
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 8
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 7
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 6
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 6
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 6
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 6
- 206010011831 Cytomegalovirus infection Diseases 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 5
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 5
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 108700016947 Bos taurus structural-GP Proteins 0.000 description 4
- 102100037840 Dehydrogenase/reductase SDR family member 2, mitochondrial Human genes 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000186362 Mycobacterium leprae Species 0.000 description 4
- 101710188053 Protein D Proteins 0.000 description 4
- 101710132893 Resolvase Proteins 0.000 description 4
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 3
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 2
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 2
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 2
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007402 cytotoxic response Effects 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 208000037920 primary disease Diseases 0.000 description 2
- 210000001978 pro-t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 2
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036642 wellbeing Effects 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000712891 Arenavirus Species 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 102000019260 B-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010012919 B-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 208000006586 Ectromelia Diseases 0.000 description 1
- 101710088235 Envelope glycoprotein C homolog Proteins 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000031637 Erythroblastic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000036566 Erythroleukaemia Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102100036242 HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Human genes 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 1
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000930801 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Proteins 0.000 description 1
- 101000972485 Homo sapiens Lupus La protein Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 206010024503 Limb reduction defect Diseases 0.000 description 1
- 241000712899 Lymphocytic choriomeningitis mammarenavirus Species 0.000 description 1
- 101710141347 Major envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000001388 Opportunistic Infections Diseases 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 101710186352 Probable membrane antigen 3 Proteins 0.000 description 1
- 101710181078 Probable membrane antigen 75 Proteins 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 108010004487 SS-B antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 101710178472 Tegument protein Proteins 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 208000021841 acute erythroid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 239000005712 elicitor Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003426 epidermal langerhans cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 102000052972 human La Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008073 immune recognition Effects 0.000 description 1
- 230000037451 immune surveillance Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 210000003738 lymphoid progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003810 lymphokine-activated killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000002625 monoclonal antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000065 noncytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002020 noncytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000000472 rate-zonal centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- ILXAOQAXSHVHTM-UHFFFAOYSA-M sodium;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;chloride Chemical compound [Na+].[Cl-].OCC(N)(CO)CO ILXAOQAXSHVHTM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 238000009121 systemic therapy Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000014723 transformation of host cell by virus Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000002476 tumorcidal effect Effects 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Søknaden er en Continuation-in-Part av US-patentsøknad nr.The application is a Continuation-in-Part of US patent application no.
933.789 innlevert 24. november 1986.933,789 filed November 24, 1986.
Den oppfinnelse som her er beskrevet ble utført med assistanseThe invention described here was carried out with assistance
fra National Institutes of Health Grant No. 1-P01-HD19937-01A1. Den amerikanske stat har visse rettigheter i denne oppfinnelse. from National Institutes of Health Grant No. 1-P01-HD19937-01A1. The United States has certain rights in this invention.
Skjønt mekanismene og midlene som inngår i immunresponsreaksjonen hos pattedyr ikke er fullt ut forstått, har teknikker for å manipulere den immunologiske respons stort terapeutisk potensial. Dette er særlig tydelig i behandlingen av patologiske forhold som fører til undertrykkelse av de normale immunresponser og som ikke så lett lar seg behandle ved vanlige medikamentbaserte terapier. Slike betingelser omfatter visse virusinfeksjoner og immununder-trykkelsen forårsaket ved tilførsel av anticancer-medikamenter, medikamenter som anvendes til behandling av autoimmun-sykdommer Although the mechanisms and agents involved in the immune response in mammals are not fully understood, techniques for manipulating the immunological response have great therapeutic potential. This is particularly evident in the treatment of pathological conditions which lead to suppression of the normal immune responses and which cannot be so easily treated by usual drug-based therapies. Such conditions include certain viral infections and the immunosuppression caused by the administration of anticancer drugs, drugs used to treat autoimmune diseases
og de som anvendes til å hindre avstøtning av organer etter transplantasj on. and those used to prevent rejection of organs after transplantation.
Evnen til å reagere på immunologiske stimuli ligger hovedsakeligThe ability to respond to immunological stimuli lies mainly
i cellene i lymfesystemet. I løpet av embryonisk liv utvikles en stamcelle som utvikler seg forskjellig langs flere forskjellige linjer. F.eks. kan en stamcelle omdannes til en lymfe-stamcelle som kan utvikle seg forskjellig for å danne minst to adskilte lymfocytt-populasjoner. Én populasjon som kalles T-lymfocytter er den fremkallende agent (effektor) i celleforårsaket immunitet, mens den andre (B-lymfocytter) er den viktigste fremkaller av antistoff-regulert eller humoral immunitet. Stimulansen for B-celle-antistoffproduksjon er festingen av et antigen (Ag) til B-celle-overflateimmunoglobulin. Således er B-celle-populasjoner hovedsakelig ansvarlig for spesifikk antistoffproduksjon, (Ab)-produksjon, hos verten. I blant, og for visse antigener (Ags), krever B-celler samvirke med T-celler for effektiv Ab-produksjon. in the cells of the lymphatic system. During embryonic life, a stem cell develops that develops differently along several different lines. E.g. a stem cell can be transformed into a lymphoid stem cell that can develop differently to form at least two distinct lymphocyte populations. One population called T-lymphocytes is the eliciting agent (effector) in cell-mediated immunity, while the other (B-lymphocytes) is the main elicitor of antibody-regulated or humoral immunity. The stimulus for B-cell antibody production is the attachment of an antigen (Ag) to B-cell surface immunoglobulin. Thus, B cell populations are mainly responsible for specific antibody production, (Ab) production, in the host. Sometimes, and for certain antigens (Ags), B cells require cooperation with T cells for effective Ab production.
Av klassene av T-lymfocytter er T-hjelpeceller (T^-celler) antigenspesifikke celler som er involvert i primær immungjen-kj ennelse og vertsforsvarsreaksjoner mot bakterie-, virus-, sopp-antigener og andre antigener. De cytotoksiske celler, (Tc)-celler, er antigenspesifikke effektorceller som kan drepe målceller etter at de er infisert med patologiske agenser. Of the classes of T lymphocytes, T helper cells (T^ cells) are antigen-specific cells involved in primary immune recognition and host defense reactions against bacterial, viral, fungal and other antigens. The cytotoxic cells, (Tc) cells, are antigen-specific effector cells that can kill target cells after they are infected with pathological agents.
Skjønt T-hjelperceller (Tn-celler) er antigenspesifikke kan de ikke gjenkjenne fritt antigen. For at gjenkjennelse og etterføl-gende Tft-celleaktivering og -formering (proliferation) skal finne sted, må antigenet presenteres for mottakere eller et mottaker-kompleks på T^-cellen sammen med de viktigste (major) produkter av vevsforlikelighetskomplekset (histocompatibility complexMHC) klasse II, eller "leukocyttantigener". Således er T^-celle-gjenkjennelse av patogene antigener MHC klasse II-"begrenset", idet en gitt populasjon av T^-celler må enten være autologe eller dele én eller flere av det begrensende leukocyttantigens (LA) spesifisiteter som uttrykkes av MHC på verten. På samme måte gjenkjenner Tc-celler Ag i forbindelse med klasse I MHC LA'er. Although T helper cells (Tn cells) are antigen specific, they cannot recognize free antigen. In order for recognition and subsequent Tft cell activation and proliferation to take place, the antigen must be presented to recipients or a recipient complex on the T^ cell together with the most important (major) products of the histocompatibility complex (histocompatibility complexMHC) class II, or "leukocyte antigens". Thus, T^ cell recognition of pathogenic antigens is MHC class II "restricted", in that a given population of T^ cells must either be autologous or share one or more of the limiting leukocyte antigen (LA) specificities expressed by the MHC on the host. Similarly, Tc cells recognize Ag in association with class I MHC LAs.
Når det gjelder T^-celler blir denne funksjon utført av et begrenset antall spesialiserte celler kalt "antigenpresenterende celler" (APC). Det er nå alminnelig anerkjent at T-hjelpeceller (Tft-celler) gjenkjenner behandlet oppløselig antigen i forbindelse med klasse II MHC LA uttrykt på overflaten av makrofager. In the case of T^ cells, this function is performed by a limited number of specialized cells called "antigen presenting cells" (APC). It is now generally recognized that T helper cells (Tft cells) recognize processed soluble antigen in association with class II MHC LA expressed on the surface of macrophages.
I den senere tid er andre celletyper, såsom hvilende og aktiverte B-celler, dentrittiske celler, epiderme Langerhans-celler og humane dermale fibroblaster også vist å presentere antigen for T-celler. Epstein-Barr-virustransformerte humane lymfoblastoide B-celler (LCL) er vist å presentere tetanustoksoid, M. leprae og Candica albicans for autologe antigenspesifikke T-celler. More recently, other cell types, such as resting and activated B cells, dendritic cells, epidermal Langerhans cells and human dermal fibroblasts have also been shown to present antigen to T cells. Epstein-Barr virus-transformed human lymphoblastoid B cells (LCL) have been shown to present tetanus toxoid, M. leprae, and Candica albicans to autologous antigen-specific T cells.
Dersom en gitt T^-celle har reseptorer eller et reseptorkompleks som gjør den istand til å gjenkjenne MHC-klasse II LA-antigenkom-plekset, blir den aktivert, formerer seg og danner lymfokiner såsom interleukin 2 (IL-2). Lymfokinene i sin tur bevirker formeringen av en rekke typer "dreperceller", innbefattet T-celler og makrofager, som kan oppvise antimikrobiell og tumorici-dal aktivitet. Etter at stimuleringen avtar, blir de som over-lever av de ekspanderte T^-celler tilbake som hukommelsesceller i legemet og kan ekspandere hurtig igjen når det samme antigen presenteres. Betydningen av T-celler ved helbredelse fra akutte virusinfeksjoner er vel anerkjent for visse viruser, særlig myxoviruset (influensa), kopperviruser (ectromelia og vaccinia) If a given T^ cell has receptors or a receptor complex that enables it to recognize the MHC class II LA antigen complex, it is activated, multiplies and produces lymphokines such as interleukin 2 (IL-2). The lymphokines in turn cause the proliferation of a number of types of "killer cells", including T cells and macrophages, which can exhibit antimicrobial and tumoricidal activity. After the stimulation subsides, those that survive the expanded T^ cells remain as memory cells in the body and can rapidly expand again when the same antigen is presented. The importance of T cells in healing from acute viral infections is well recognized for certain viruses, in particular the myxovirus (influenza), smallpox viruses (ectromelia and vaccinia)
og arenaviruset (lymfocytisk choriomeningittvirus).and the arenavirus (lymphocytic choriomeningitis virus).
Til tross for at betydningen av immunsystemets forsvarsmekanismer for vertens ve og vel er klart bragt på det rene, er det terapeutiske potensial av disse agenser ikke blitt realisert. I en forundersøkelse rapporterte S.A. Rosenberg et al., New England J. Med.. 313, 1485 (1985) at den systemiske tilførsel av autologe perifere blod-lymfocytter (PBL) som var blitt inkubert med IL-2 sammen med ytterligere IL-2 til pasienter med langt fremskreden cancer oppnådde cancerregresjon hos 11 av de 25 pasienter som ble behandlet. Rosenberg et al. kalte de inkuberte PBL-celler "lymfo-kinaktiverte dreperceller (LAK)" og rapporterte at de var medlemmer av et cytolytisk system som er forskjellig fra de naturlige dreperceller og cytotoksiske T-celler. Senere undersøkelser hvor denne terapi ble anvendt har imidlertid ikke bekreftet disse lovende tidlige resultater. Despite the fact that the importance of the immune system's defense mechanisms for the well-being of the host has been clearly demonstrated, the therapeutic potential of these agents has not been realized. In a preliminary investigation, S.A. reported Rosenberg et al., New England J. Med.. 313, 1485 (1985) that the systemic administration of autologous peripheral blood lymphocytes (PBL) that had been incubated with IL-2 together with additional IL-2 to patients with advanced cancer achieved cancer regression in 11 of the 25 patients treated. Rosenberg et al. termed the incubated PBL cells "lymphokine-activated killer (LAK) cells" and reported that they were members of a cytolytic system distinct from natural killer cells and cytotoxic T cells. However, later studies where this therapy was used have not confirmed these promising early results.
Uansett langtidsresultatene av denne metode av "adoptiv immunterapi" har Rosenberg et al. bemerket at "den største vanskelighet ved anvendelse av denne metode for behandling av human cancer har vært at man ikke har vært istand til å danne tilstrekkelig antall autologe humane celler med antitumor-reaktivitet som kan anvendes for systemisk terapi". Dette er spesielt problematisk hva angår pasienter som er immunundertrykket på grunn av infeksjoner, cancer, medikamenter i forbindelse med organtransplanta-sjon eller antineoplastiske medikamenter og liknende. Regardless of the long-term results of this method of "adoptive immunotherapy", Rosenberg et al. noted that "the major difficulty in applying this method to the treatment of human cancer has been the inability to generate sufficient numbers of autologous human cells with antitumor reactivity that can be used for systemic therapy". This is particularly problematic regarding patients who are immunosuppressed due to infections, cancer, drugs in connection with organ transplantation or antineoplastic drugs and the like.
På samme måte er en rekke forsøk blitt gjort for å isolere og opprettholde homogene populasjoner av Tc- eller T^-celler og å karakterisere dem ved deres antigenspesifisitet og MHC-restrik-sjon. Disse forsøk innbefatter vanligvis stimulering av mononukleære celler fra en seropositiv menneske- eller musevert med bakterie- eller viruspreparater i kombinasjon med ikke-formerende (non-profilerative) APCer, såsom bestrålte autologe mononukleære celler (MNCer). Formerende polyklonale populasjoner av T^-celler eller Tc-celler klones ved begrensende fortynning for oppnåelse av homogene populasjoner og formeres deretter ytterligere og karakteriseres ved en rekke forskjellige teknikker. Som angitt av Rosenberg et al. når det gjelder klonede LAK-celler, er en av de største hindringer for kloning av T-lymfocytter den begrensede tilgjengelighet av autologe eller alternativt allogene MHC LA-matchede MNCer, særlig fra kliniske subjekter. Likewise, a number of attempts have been made to isolate and maintain homogenous populations of Tc or T₂ cells and to characterize them by their antigen specificity and MHC restriction. These experiments usually involve stimulation of mononuclear cells from a seropositive human or mouse host with bacterial or viral preparations in combination with non-proliferative (non-profilerative) APCs, such as irradiated autologous mononuclear cells (MNCs). Proliferating polyclonal populations of T₂ cells or Tc cells are cloned by limiting dilution to obtain homogeneous populations and then further propagated and characterized by a variety of techniques. As stated by Rosenberg et al. in the case of cloned LAK cells, one of the major obstacles to T-lymphocyte cloning is the limited availability of autologous or alternatively allogeneic MHC LA-matched MNCs, particularly from clinical subjects.
For å overvinne dette problem er APCer andre enn autologe MNCer blitt anvendt som APCer. F.eks. har T. Issekutz et al., To overcome this problem, APCs other than autologous MNCs have been used as APCs. E.g. have T. Issekutz et al.,
J. Immunol., 129, 1446 (1982) først angitt at autologe Epstein-Barr-virustransformerte (EBV-transformerte) LCL-linjer kan presentere antigener assosiert med tetanustoksoid for tetanus-reaktive polyklonale T-celler og T-cellekloner. D.R. Kaplan et al. i Cellular Immunolo<g>y, 88., 193 (1984) rapporterte produksjonen av tre Tc-cellekloner ved formeringen av perifere blod-MNCer fra en type A-influensa immun donor. Én 'av klonene formerte seg i nærvær av bestrålte virusinfiserte autologe MNCer, eller i nærvær av bestrålte infiserte Epstein-Barr virustransformerte allogene lymfoblastoidceller (LCL). J. Immunol., 129, 1446 (1982) first indicated that autologous Epstein-Barr virus-transformed (EBV-transformed) LCL lines can present antigens associated with tetanus toxoid to tetanus-reactive polyclonal T cells and T cell clones. D.R. Kaplan et al. in Cellular Immunolo<g>y , 88., 193 (1984) reported the production of three Tc cell clones by the propagation of peripheral blood MNCs from a type A influenza immune donor. One of the clones proliferated in the presence of irradiated virus-infected autologous MNCs, or in the presence of irradiated infected Epstein-Barr virus-transformed allogeneic lymphoblastoid cells (LCL).
B.G. Elferink et al., Scand J. Immunol., 22, 585 (1985) viste videre at autologe og allogene Epstein-Barr-virustransformerte-(EBV-transformerte) LCL-linjer kan presentere antigener assosiert med M. leprae basiller for M. leprae-reaktive klonede T-cellelinjer. Nok en artikkel fra denne gruppe beskrev isoleringen av en T-celleklone som kan gjenkjenne bare M. leprae-antigener. Kloningsmetoden benyttet autologe EBV-transformerte LCLer, som APCer. Fordelen ved å bruke EBV-transformerte LCLer er at de kan skaffe en kontinuerlig og ubegrenset kilde til APCer. [J.B.A.G. Haanen et al., Scand. J. Immunol., 23, 101 (1986)]. B. G. Elferink et al., Scand J. Immunol., 22, 585 (1985) further demonstrated that autologous and allogeneic Epstein-Barr virus-transformed (EBV-transformed) LCL lines can present antigens associated with M. leprae bacilli to M. leprae -reactive cloned T cell lines. Another paper from this group described the isolation of a T-cell clone that can recognize only M. leprae antigens. The cloning method used autologous EBV-transformed LCLs, as APCs. The advantage of using EBV-transformed LCLs is that they can provide a continuous and unlimited source of APCs. [J.B.A.G. Haanen et al., Scand. J. Immunol., 23, 101 (1986)].
Human cytomegalovirus (HCMV) er et stort arts-spesifikt herpes-virus (DNA 1,5x10^ Da) som deler egenskapene av latens og reaktivering med andre medlemmer av denne gruppe. HCMV er ubikvitært (30-70% av voksne er seropositive), men det eller de viktigste seter for latens av HCMV er ikke bestemt, hvilket heller ikke de molekylære hendelser som inngår i dets reaktivering er. HCMV-infeksjon og -reaktivering kan være asymptomatiske, men er forbundet med betydelig sykelighet og dødelighet hos immunundertrykkede individer. F.eks. er HCMV den vanligste årsak til Human cytomegalovirus (HCMV) is a large species-specific herpesvirus (DNA 1.5x10^ Da) that shares the characteristics of latency and reactivation with other members of this group. HCMV is ubiquitous (30-70% of adults are seropositive), but the main site or sites of latency of HCMV have not been determined, nor are the molecular events involved in its reactivation. HCMV infection and reactivation can be asymptomatic but are associated with significant morbidity and mortality in immunocompromised individuals. E.g. HCMV is the most common cause
opportunistisk, infeksjon i benmargtransplanterte pasienter.opportunistic infection in bone marrow transplant patients.
Mer enn 80% av de som utvikler HCMV-lungebetennelse dør, til tross for de seneste behandlingsmetoder. More than 80% of those who develop HCMV pneumonia die, despite the latest treatment methods.
Skjønt monoklonal antistoff-terapi kan være nyttig som en forebyggende behandling, er det blitt foreslått at overlevelse av immunundertrykkede pasienter med alvorlige HCMV-infeksjoner kan avhenge av nærværet av HCMV-spesifikke cytotoksiske T-celler. Quinnan et al., i New England J. Med., 307, 7 (1982) har antydet at HCMV-spesifikke cytotoksiske T-celleresponser i disse pasienter er forbundet med klinisk helbredelse og opphør av virusekskresjon, mens de som hadde aktive infeksjoner som ikke utviklet cytotoksiske responser alle som én døde. Although monoclonal antibody therapy may be useful as a preventive treatment, it has been suggested that survival of immunosuppressed patients with severe HCMV infections may depend on the presence of HCMV-specific cytotoxic T cells. Quinnan et al., in New England J. Med., 307, 7 (1982) have suggested that HCMV-specific cytotoxic T-cell responses in these patients are associated with clinical cure and cessation of virus excretion, whereas those who had active infections that did not developed cytotoxic responses all of whom died.
R.C. Gehrz et al., Lancet, 2, 844 (1977) meddelte at spedbarn med medfødt HCMV-infeksjon har en antigenspesifikk defekt med hensyn til T-hjelpercelle-formering, som er forbundet med persistens av replikerende virusinfeksjon i måneder og år, til tross for nærværet av HCMV-spesifikke antistoffer. Tilegnelse av HCMV-spesifikke lymfocytt-formerende responser synes å være forbundet med en svekkelse i virusekskresjon. Således er det sannsynlig at HCMV-spesifikke T-hjelperceller spiller en betydelig rolle i immunforsvaret mot dette virus hos immunkompetente verter. R. C. Gehrz et al., Lancet, 2, 844 (1977) reported that infants with congenital HCMV infection have an antigen-specific defect in T helper cell proliferation, which is associated with persistence of replicating viral infection for months and years, despite the presence of HCMV-specific antibodies. Acquisition of HCMV-specific lymphocyte proliferative responses appears to be associated with an impairment in virus excretion. Thus, it is likely that HCMV-specific T helper cells play a significant role in the immune defense against this virus in immunocompetent hosts.
I pasienter med reaktivert HCMV-infeksjon er antistoffer rettet mot HCMV-antigener ikke beskyttende eller er bare nyttige i samband med riktige T-celleresponser. Perifere blod-lymfocytter (PBL) vil sannsynligvis heller ikke være nyttige som terapeutiske agenser, selv om de kunne oppnås i tilstrekkelige mengder. Antallet T-hjelperceller eller cytotoksiske T-celler som er reaktive med et spesielt antigen, er ekstremt lavt og således vil den selektive ekspansjon av antigenspesifikke T-celler in vitro være nødvendig for oppnåelse av tilstrekkelige antall for terapeutiske formål. Videre vil den terapeutiske tilførsel av allogene PBLer aktivere T-celler som kjenner igjen "fremmede" leukocyttantigener, hvilket fører til en blandet leukocyttkultur-reaksjon. Denne blandede leukocyttkultur-reaksjon kan aktivere uønskede ikke-spesifikke immunresponser, eller alternativt indusere supressorceller som kan inhibere ønskede antigenspesifikke In patients with reactivated HCMV infection, antibodies directed against HCMV antigens are not protective or are only useful in the context of appropriate T-cell responses. Peripheral blood lymphocytes (PBL) are also unlikely to be useful as therapeutic agents, even if they could be obtained in sufficient quantities. The number of T helper cells or cytotoxic T cells reactive with a particular antigen is extremely low and thus the selective expansion of antigen-specific T cells in vitro will be necessary to obtain sufficient numbers for therapeutic purposes. Furthermore, the therapeutic administration of allogeneic PBLs will activate T cells that recognize "foreign" leukocyte antigens, leading to a mixed leukocyte culture reaction. This mixed leukocyte culture reaction can activate unwanted non-specific immune responses, or alternatively induce suppressor cells that can inhibit desired antigen-specific
immunresponser.immune responses.
Autologe eller allogene antigenspesifikke T-cellelinjer vil sannsynligvis uttrykke en ønsket terapeutisk aktivitet uten ledsagende komplikasjoner som er forbundet med den blandede leukocyttkultur-reaksjon. L.K. Borysiewicz et al., Eur. J. Immunology, 13, 804 (1983) rapporterte dannelsen av kortvarige polyklonale T^-cellelinjer ved ekspansjonen av MNCer fra seropositive individer (subjects) med oppløselig HCMV-antigen i nærvær av IL-2. Når MNCene ble samdyrket på autologe HCMV-infiserte fibroblaster, ble polyklonale Tc-celler dannet, hvilke lyserte HCMV-infiserte celler. Autologous or allogeneic antigen-specific T cell lines are likely to express a desired therapeutic activity without attendant complications associated with the mixed leukocyte culture reaction. L. K. Borysiewicz et al., Eur. J. Immunology, 13, 804 (1983) reported the generation of short-lived polyclonal T₂ cell lines by the expansion of MNCs from seropositive subjects with soluble HCMV antigen in the presence of IL-2. When the MNCs were co-cultured on autologous HCMV-infected fibroblasts, polyclonal Tc cells were generated, which lysed HCMV-infected cells.
Der eksisterer imidlertid et behov for forbedrede fremgangsmåter for å danne og opprettholde populasjoner av T^-celler og Tc-celler som er spesifikke for antigener assosiert med vira såsom HCMV og andre patogene agenser. Et ytterligere behov eksisterer for immunterapeutiske metoder basert på tilførselen av antigenspesifikke T-lymfocytt-populasjoner av kjent biologisk aktivitet til pattedyrindivider. However, a need exists for improved methods of generating and maintaining populations of T₂ cells and Tc cells specific for antigens associated with viruses such as HCMV and other pathogenic agents. A further need exists for immunotherapeutic methods based on the delivery of antigen-specific T-lymphocyte populations of known biological activity to mammalian subjects.
Kort beskrivelse av oppfinnelsenBrief description of the invention
I. Produksjon av T- cellelinierI. Production of T-cell lines
A. T- hielpercellerA. T helper cells
Den foreliggende oppfinnelse er rettet på fremgangsmåter for effektiv produksjon av en homogen populasjon av T-hjelperceller (Tft-celler) som er spesifikke for et virusantigen såsom et HCMV-antigen. Det antas at de foreliggende fremgangsmåter skaffer grunnlaget for den effektive produksjon av klonede T^-celler, idet der anvendes et minimum av antigen- og lymfokinunderstøt-telse med opprettholdelse av både antigenspesifisiteten og den funksjonelle aktivitet av klonene. I sin videste form omfatter den foreliggende fremgangsmåte: (a) å isolere en populasjon av mononukleære celler (MNC) fra blodet av en giver-pattedyr, hvor MNC-populasjonen omfatter T-hjelperceller som er spesifikke for et virusantigen, og autologe, ikke-formerende antigenpresenterende celler (APC) ; The present invention is directed to methods for the efficient production of a homogeneous population of T helper cells (Tft cells) which are specific for a viral antigen such as an HCMV antigen. It is believed that the present methods provide the basis for the efficient production of cloned T cells, using a minimum of antigen and lymphokine support while maintaining both the antigen specificity and the functional activity of the clones. In its broadest form, the present method comprises: (a) isolating a population of mononuclear cells (MNC) from the blood of a donor mammal, wherein the MNC population comprises T helper cells specific for a viral antigen, and autologous, non- proliferating antigen-presenting cells (APC);
(b) å kombinere den nevnte isolerte populasjon av de nevnte MNCer med en mengde av virusantigenet som er virksomt (b) combining said isolated population of said MNCs with an amount of the viral antigen that is effective
for å bevirke formeringen av en T-hjelpercelle som er spesifikk for antigenet; (c) å tillate den nevnte T-hjelpercelle å formere seg i et tidsrom som er virksomt for å tillate ikke-formerende MNCer å tape levedyktighet, og to effect the proliferation of a T helper cell specific for the antigen; (c) allowing said T helper cell to proliferate for a period of time effective to allow non-proliferating MNCs to lose viability, and
(d) å ekspandere klonalt den antigenspesifikke T-hjelpercelle(d) clonally expanding the antigen-specific T helper cell
i nærvær av en mengde av ikke-formerende antigenpresenterende celler som omfatter en blanding av (i) autologe MNCer, allogene MNCer eller blandinger derav, og (ii) autologe lymfoblastoid-celler (LCLer), allogene LCLer eller blandinger derav, og en mengde av den nevnte virusantigen som er virksom for formering av den nevnte klonede antigenspesifikke T-hjelpercelle for å gi den nevnte homogene populasjon, og hvor de nevnte LCLer foreligger i en mengde som er virksom for å øke formeringshastigheten av T-hjelpercellen i forhold til den som bevirkes av MMCene. in the presence of a plurality of non-proliferating antigen-presenting cells comprising a mixture of (i) autologous MNCs, allogeneic MNCs or mixtures thereof, and (ii) autologous lymphoblastoid cells (LCLs), allogeneic LCLs or mixtures thereof, and a quantity of the said viral antigen which is effective for the propagation of the said cloned antigen-specific T-helper cell to give the said homogeneous population, and wherein the said LCLs are present in an amount which is effective for increasing the rate of propagation of the T-helper cell in relation to that effected of the MMCs.
I løpet av det selektive formeringstrinn (c), som kan kreve 1-2 uker, kan det også være effektivt å tilsette en ytterligere mengde av det nevnte virusantigen og de autologe ikke-formerende APCer for å bevirke den ytterligere formering av T-hjelpercellen for å forbedre produksjonen av en levedyktig polyklonal populasjon av de virusantigenspesifikke T^-celler før trinn (d). I trinn (d) kan antigenspesifikke monoklonale T^-celler fås ved begrensende fortynning eller ved enkeltcelleisolering ved mikro-manipulering eller strømningscytometri. During the selective propagation step (c), which may require 1-2 weeks, it may also be effective to add a further amount of said viral antigen and the autologous non-proliferating APCs to effect the further propagation of the T helper cell for to enhance the production of a viable polyclonal population of the virus antigen-specific T^ cells prior to step (d). In step (d), antigen-specific monoclonal T₂ cells can be obtained by limiting dilution or by single cell isolation by micro-manipulation or flow cytometry.
Antigenspesifikke polyklonale T-cellelinjer, såvel som monoklonale antigenspesifikke T-celler, har potensiell terapeutisk nytte. Således kan uttrykket "T-celleline", slik det her benyttes, henvise til en ekspandert populasjon av polyklonale T-celler som er unikt reaktive med et gitt antigen, eller til en homogen populasjon av monoklonale T-celler som er blitt oppnådd ved Antigen-specific polyclonal T cell lines, as well as monoclonal antigen-specific T cells, have potential therapeutic utility. Thus, the term "T cell line", as used herein, can refer to an expanded population of polyclonal T cells that are uniquely reactive with a given antigen, or to a homogeneous population of monoclonal T cells that has been obtained by
ekspansjonen fra en enkelt forløper-T-celle.the expansion from a single precursor T cell.
Da den foreliggende oppfinnelse omfatter formeringen av antigenspesifikke T^-celler, skaffer den også en fremgangsmåte til formering av en homogen populasjon av T-hjelperceller som er spesifikk for virusantigen omfattende å kombinere den nevnte homogene populasjon av T-hjelperceller med en mengde av antigenet og en mengde av en blanding av ikke-formerende antigenpresenterende celler (APC) som er virksomme for å bevirke formeringen av populasjonen av T-hjelperceller, idet den nevnte blanding av APCer omfatter (i) autologe eller allogene lymfoblastoid-celler (LCL) og (ii) autologe eller allogene mononukleære celler (MNC), idet LCLene foreligger i en mengde som er virksom for å øke formeringshastigheten av T-hjelpercellene i forhold til det som bevirkes av MNCene. Fortrinnsvis fås LCLene fra en kontinuerlig lymfoblastoid-cellelinje, således som den som kan produseres ved virustransformasjon, hybridomateknologi og liknende. APCene gjøres ikke-formerende ved teknikker som er kjent i faget, f.eks. ved røntgenbestråling, behandling med kjemiske midler såsom mitomycin C og liknende. As the present invention includes the propagation of antigen-specific T-cells, it also provides a method for the propagation of a homogeneous population of T-helper cells specific for viral antigen comprising combining said homogeneous population of T-helper cells with an amount of the antigen and an amount of a mixture of non-proliferating antigen-presenting cells (APCs) effective to effect the proliferation of the population of T-helper cells, said mixture of APCs comprising (i) autologous or allogeneic lymphoblastoid cells (LCL) and (ii ) autologous or allogeneic mononuclear cells (MNC), in that the LCLs are present in an amount that is effective for increasing the multiplication rate of the T-helper cells in relation to what is effected by the MNCs. Preferably, the LCLs are obtained from a continuous lymphoblastoid cell line, such as that which can be produced by viral transformation, hybridoma technology and the like. The APCs are made non-propagating by techniques known in the art, e.g. by X-ray irradiation, treatment with chemical agents such as mitomycin C and the like.
Både de ikke-formerende MNCer og LCLer er funnet å bevirke formeringen av T^-celler når de fås fra den samme vert som T-cellene eller er allogene MNCer eller LCLer som deler ett eller flere klasse II begrensende antigener (forkortelse: "MHC LA-matchet"). Det ble overraskende funnet at en blanding av LCLer og MNCer kan synergistisk presentere antigen for T^-celler, for således i betydelig grad å øke deres formeringshastighet i forhold til det som bevirkes av et ekvivalent antall av den ene eller den annen type APC når den anvendes alene. Both the nonproliferating MNCs and LCLs have been found to induce the proliferation of T^ cells when obtained from the same host as the T cells or are allogeneic MNCs or LCLs that share one or more class II restriction antigens (abbreviation: "MHC LA -matched"). It was surprisingly found that a mixture of LCLs and MNCs can synergistically present antigen to T^ cells, thus significantly increasing their proliferation rate compared to that effected by an equivalent number of one or the other type of APC when the used alone.
F.eks., denne virkning observeres når det gjelder et virusantigen såsom et HCMV-antigen, når en blanding av EBV-transformerte autologe LCLer og autologe MNCer anvendes som APCene i et forhold på minst 1:10. Fortrinnsvis er forholdet mellom T^-celler og LCL-celler som tilsettes fra 1:1 til 1:3, og forholdet mellom T-celler og MNCer er fra 1:3 til 1:10. For example, this effect is observed in the case of a viral antigen such as an HCMV antigen, when a mixture of EBV-transformed autologous LCLs and autologous MNCs is used as the APCs in a ratio of at least 1:10. Preferably, the ratio of T cells to LCL cells added is from 1:1 to 1:3, and the ratio of T cells to MNCs is from 1:3 to 1:10.
Videre kreves bare en begrenset tetthet av LCL for i betydelig grad å øke ekspansjonen av av T^-kloner. Denne side ved den foreliggende fremgangsmåte er viktig fra et praktisk synspunkt, fordi humant antigenspesifikke T^-kloner kan ekspanderes i store mengder i et forholdsvis kort tidsrom ved bruk av begrensede antall MNCer. F.eks. i henhold til den foreliggende fremgangsmåte kan HCMV-spesifikke T^-kloner ekspanderes fra l-2xl0<6>celler til 10^ celler i løpet av 2 uker ved anvendelse av l-2xl0<7>MNCog lxlO<6>LCL som APC. Furthermore, only a limited density of LCL is required to significantly increase the expansion of T^ clones. This aspect of the present method is important from a practical point of view, because human antigen-specific T₂ clones can be expanded in large quantities in a relatively short period of time using limited numbers of MNCs. E.g. according to the present method, HCMV-specific T^ clones can be expanded from 1-2xl0<6> cells to 10^ cells within 2 weeks using 1-2xl0<7>MNC and lxl0<6>LCL as APC.
Det er også funnet at det er langt å foretrekke å utføre forme-ringstrinnene (c) og/eller (d) ifølge fremgangsmåten i nærvær av en virksom mengde interleukin-2 ("IL-2" eller "TCGF"). It has also been found that it is far preferable to carry out propagation steps (c) and/or (d) of the method in the presence of an effective amount of interleukin-2 ("IL-2" or "TCGF").
En videre hensikt med den foreliggende oppfinnelse omfatter å øke formeringshastigheten av de virusantigenspesifikke T^-celler ved utførelse av det opprinnelige formeringstrinn (trinn a-c som angitt ovenfor), eller det etterfølgende ekspansjonstrinn (trinn (d), som angitt ovenfor) i nærvær av en mengde av monoklonalt antistoff som er spesifikt for det nevnte virusantigen. I én utførelsesform av denne side ved oppfinnelsen blir formeringshastigheten av en T^-celle spesifikk for et HCMV-virusantigen, øket ved å kombinere MNCer som er isolert fra blodet av en HCMV-seropositiv giver-pattedyr med et monoklonalt antistoff som er spesifikt for et antigen som foreligger på et HCMV-genprodukt, såsom et strukturelt protein. Det monoklonale antistoff anvendes i kombinasjon med (a) en virksom formeringsstimulerende mengde av det nevnte antigen og (b) en mengde av autologe APCer valgt fra gruppen bestående av (i) ikke-formerende MNCer, (ii) et ikke-formerende LCL som fås fra et kontinuerlig LCL og (iii) blandinger derav, f.eks. blandinger som kan sammen virke for ytterligere økning av formeringshastigheten av T^-cellene. Fortrinnsvis blir de autologe, ikke-formerende antigenpresenterende celler valgt fra gruppen bestående av røntgenbestrålte autologe MNCer, en røntgenbestrålt Epstein-Barr-virustransformert (EBV-transformert) lymfoblastoid cellelinje (LCL) og blandinger derav. Disse er de foretrukne APCer for bruk i trinn (b) ifølge fremgangsmåten, uansett om der anvendes eller ikke anvendes monoklonalt antistoff og/eller IL-2 for å øke formeringshastigheten. A further purpose of the present invention comprises increasing the multiplication rate of the virus antigen-specific T^ cells by carrying out the original propagation step (steps a-c as indicated above), or the subsequent expansion step (step (d), as indicated above) in the presence of a amount of monoclonal antibody specific for said virus antigen. In one embodiment of this aspect of the invention, the rate of proliferation of a T^ cell specific for an HCMV viral antigen is increased by combining MNCs isolated from the blood of an HCMV-seropositive donor mammal with a monoclonal antibody specific for a antigen present on an HCMV gene product, such as a structural protein. The monoclonal antibody is used in combination with (a) an effective proliferation-stimulating amount of said antigen and (b) an amount of autologous APCs selected from the group consisting of (i) non-proliferating MNCs, (ii) a non-proliferating LCL obtained from a continuous LCL and (iii) mixtures thereof, e.g. mixtures which together may act to further increase the proliferation rate of the T^ cells. Preferably, the autologous, non-proliferating antigen-presenting cells are selected from the group consisting of X-rayed autologous MNCs, a X-rayed Epstein-Barr virus-transformed (EBV-transformed) lymphoblastoid cell line (LCL), and mixtures thereof. These are the preferred APCs for use in step (b) of the method, regardless of whether or not monoclonal antibody and/or IL-2 is used to increase the proliferation rate.
B. C<y>totoksiske T- cellerB. C<y>totoxic T cells
Den foreliggende fremgangsmåte kan også anvendes til å produsere en homogen populasjon av cytotoksiske T-celler (Tc-celler) som er spesifikke for et HCMV-antigen. Denne side ved den foreliggende oppfinnelse omfatter de følgende trinn: (a<1>) å isolere en populasjon av mononukleære celler (MNC) fra blodet av en giver-pattedyr, fortrinnsvis et menneske, The present method can also be used to produce a homogeneous population of cytotoxic T cells (Tc cells) specific for an HCMV antigen. This aspect of the present invention comprises the following steps: (a<1>) isolating a population of mononuclear cells (MNC) from the blood of a mammalian donor, preferably a human,
hvor MNC-populasjonen omfatter Tc-celler som er spesifikke for det nevnte virusantigen, wherein the MNC population comprises Tc cells specific for said viral antigen,
(b<1>) å kombinere den nevnte isolerte populasjon av de nevnte MNCer med (i) en mengde av en autologe, ikke-formerende, antigenpresenterende celler (APC), f.eks. bestrålte MNCer, (ii) en mengde av det nevnte HCMV-antigen og (iii) en mengde av interleukin-2 (IL-2) som er virksomt for å bevirke formeringen av en Tc-celle som er spesifikk for det nevnte antigen; (b<1>) combining said isolated population of said MNCs with (i) a quantity of an autologous, non-proliferating, antigen-presenting cells (APC), e.g. irradiated MNCs, (ii) an amount of said HCMV antigen and (iii) an amount of interleukin-2 (IL-2) effective to cause the proliferation of a Tc cell specific for said antigen;
(c<1>) å tillate den nevnte Tc-celle å formere seg i et tidsrom som er virksom for å tillate ikke-formerende MNCer å tape levedyktighet; og (c<1>) allowing said Tc cell to proliferate for a period of time effective to allow non-proliferating MNCs to lose viability; and
(d<1>) å ekspandere klonalt den nevnte antigenspesifikke Tc-celle(d<1>) to clonally expand said antigen-specific Tc cell
i nærvær av (i) en mengde av ikke-formerende, autologe, antigenpresenterende celler; ikke-formerende, allogene, antigenpresenterende celler eller blandinger derav, (ii) in the presence of (i) a plurality of non-proliferating, autologous, antigen-presenting cells; non-proliferating, allogeneic, antigen-presenting cells or mixtures thereof, (ii)
en mengde av IL-2 og (iii) en mengde av det nevnte HCMV-antigen som er virksomt for å formere den nevnte klonede antigenspesifikke Tc-celle for å gi den nevnte homogene populasj on. an amount of IL-2 and (iii) an amount of said HCMV antigen effective to propagate said cloned antigen-specific Tc cell to yield said homogeneous population.
Trinn (b<1>), (c<1>) eller (d<1>) utføres fortrinnsvis i nærvær av et monoklonalt antistoff som er spesifikt for et HCMV-antigen og som tjener til å øke formeringshastigheten av den nevnte Tc-celle. Step (b<1>), (c<1>) or (d<1>) is preferably carried out in the presence of a monoclonal antibody which is specific for an HCMV antigen and which serves to increase the proliferation rate of said Tc cell .
Som tidligere beskrevet for antigenspesifikke T-hjelpercellelinjer kan polyklonale Tc-linjer som er reaktive med en spesielt virusantigen ekspanderes ved kontinuerlig stimulering av Tc- blåster som oppviser cytotoksisk aktivitet overfor målceller som uttrykker det ønskede antigen. Homogene populasjoner av virusspesifikke Tc-kloner som fås fra en enkelt opphavs-T-celle kan fås ved begrensende fortynning eller ved enkeltcelleisolasjon ved mikromanipulasjon eller strømningscytometri, fulgt av ekspansjon i henhold til trinn (d<1>). As previously described for antigen-specific T helper cell lines, polyclonal Tc lines reactive with a particular viral antigen can be expanded by continuous stimulation of Tc blasts that exhibit cytotoxic activity against target cells expressing the desired antigen. Homogeneous populations of virus-specific Tc clones obtained from a single progenitor T cell can be obtained by limiting dilution or by single cell isolation by micromanipulation or flow cytometry, followed by expansion according to step (d<1>).
Andre foretrukne utførelsesformer av denne Tc-celleformerings-metode omfatter (1) bruken av helt HCMV-virusantigen eller bruken av HCMV-infiserte autologe eller allogene fibroblaster som en kilde til celleassosiert virusantigen, f.eks. et HCMV mellomliggende-tidlig protein, (2) tilsetningen av ytterligere mengder av virusantigenet IL-2 og de autologe ikke-formerende APCer i løpet av trinn (c<1>) for å bevirke ytterligere formering av den nevnte Tc-celle og (3) bruken, i trinn (b<1>) eller trinn (d<1>) av antigenpresenentereride celler som ytterligere omfatter ikke-formerende MNCer som fås fra en kontinuerlig autolog MNC-linje i en mengde som er virksom for å øke formeringshastigheten av Tc-cellene i forhold til den som bevirkes av de autologe mononukleære antigenpresenterende celler. Denne kontinuerlige autologe MNC-linje omfatter fortrinnsvis en virustransformert LCL, dvs. Other preferred embodiments of this Tc cell propagation method include (1) the use of whole HCMV virus antigen or the use of HCMV-infected autologous or allogeneic fibroblasts as a source of cell-associated virus antigen, e.g. an HCMV intermediate-early protein, (2) the addition of additional amounts of the viral antigen IL-2 and the autologous non-proliferating APCs during step (c<1>) to effect further proliferation of said Tc cell and (3 ) the use, in step (b<1>) or step (d<1>) of antigen-presenting cells further comprising non-proliferating MNCs obtained from a continuous autologous MNC line in an amount effective to increase the proliferation rate of Tc -cells compared to that effected by the autologous mononuclear antigen-presenting cells. This continuous autologous MNC line preferably comprises a virus-transformed LCL, i.e.
en EBV-transformert LCL.an EBV-transformed LCL.
Den foreliggende oppfinnelse er også rettet på en fremgangsmåte til formering av en homogen populasjon av Tc-celler som er spesifikk for et antigen, såsom et virusantigen, dvs. et HCMV-antigen. Fremgangsmåten omfatter å kombinere den nevnte homogene populasjon av cytotoksiske T-celler med en mengde av det nevnte antigen, en mengde av interleukin-2 (IL-2) og en mengde av en blanding av ikke-formerende antigenpresenterende celler (APC) som er virksom for å bevirke formeringen av den nevnte populasjon av Tc-celler, idet den nevnte blanding av APCer omfatter allogene virustransformerte lymfoblastoide celler (LCL) og allogene mononukleære celler (MNC). Fremgangsmåten omfatter ytterligere å kombinere den nevnte populasjon av Tc-celler med en mengde av monoklonalt antistoff som er spesifikt for det nevnte antigen, hvilket monoklonalt antistoff tjener til å øke formeringshastigheten av den nevnte populasjon av celler. The present invention is also directed to a method for propagating a homogeneous population of Tc cells which is specific for an antigen, such as a viral antigen, i.e. an HCMV antigen. The method comprises combining said homogeneous population of cytotoxic T cells with an amount of said antigen, an amount of interleukin-2 (IL-2) and an amount of a mixture of non-proliferating antigen-presenting cells (APC) which are effective to effect the propagation of said population of Tc cells, said mixture of APCs comprising allogeneic virus-transformed lymphoblastoid cells (LCL) and allogeneic mononuclear cells (MNC). The method further comprises combining said population of Tc cells with an amount of monoclonal antibody specific for said antigen, which monoclonal antibody serves to increase the proliferation rate of said population of cells.
Uttrykket "antigen" slik det her benyttes med hensyn til et patologisk mål, såsom et virus eller en infisert celle, henviser til en forbindelse såsom et polypeptid, polypeptidkompleks, glykoprotein, nukleinsyre eller liknende som frembringer en immunrespons. Et patologisk målantigen kan være en porsjon av det patologiske mål i seg selv, f.eks. et virus-kappeglykoprotein, eller det kan være et antigen som uttrykkes av et sykt vev, såsom et neoplastisk vev eller en virusinfisert celle. En "antigenspesifikk" T-lymfocytt blir aktivert i nærvær av et enkelt antigen når det presenteres for en antigenpresenterende celle (APC) i forbindelse med et spesifikt leukocyttantigen (LA) som uttrykkes av den antigenpresenterende celle. En antigenspesifikk T^-celle vil formere seg i et egnet medium i nærvær av det antigen for hvilket det har spesifisitet når det nevnte antigen presenteres for T^-cellen ved en APC som også uttrykker leukocyttantigenet for hvilket T^-cellen har spesifisitet. Som antydet ovenfor når det gjelder humane T-hjelperceller, vil det spesifikke leukocyttantigen være et humant MHC klasse II-antigen, mens humane cytotoksiske T-celler er spesifikke for MHC klasse I-antigener. The term "antigen" as used herein with respect to a pathological target, such as a virus or an infected cell, refers to a compound such as a polypeptide, polypeptide complex, glycoprotein, nucleic acid or the like that produces an immune response. A pathological target antigen can be a portion of the pathological target itself, e.g. a viral envelope glycoprotein, or it may be an antigen expressed by a diseased tissue, such as a neoplastic tissue or a virus-infected cell. An "antigen-specific" T-lymphocyte is activated in the presence of a single antigen when presented to an antigen-presenting cell (APC) in conjunction with a specific leukocyte antigen (LA) expressed by the antigen-presenting cell. An antigen-specific T^ cell will proliferate in a suitable medium in the presence of the antigen for which it has specificity when said antigen is presented to the T^ cell by an APC which also expresses the leukocyte antigen for which the T^ cell has specificity. As indicated above in the case of human T helper cells, the specific leukocyte antigen will be a human MHC class II antigen, whereas human cytotoxic T cells are specific for MHC class I antigens.
C. HCMV- antiaenspesifikke T- cellelinierC. HCMV antigen-specific T cell lines
Foretrukne utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse omfatter homogene populasjoner av Tc- eller T^-celler og fremgangsmåter for fremstilling av disse, hvor en gitt cellepopulasjon er spesifikk for et HCMV-antigen. Preferred embodiments of the present invention comprise homogeneous populations of Tc or T^ cells and methods for their production, where a given cell population is specific for an HCMV antigen.
Når en T-celle eller en T-celleklon sies å være antigenspesifikk, er epitopen eller det spesifikke antigensetet på antigenblandin-gen ikke nødvendigvis kjent, skjønt blandingen som omfatter antigenet kan være spesifisert. F.eks. kan tre forskjellige homogene populasjoner av T-hjelperlymfocytter være spesifikke for ett spesielt HCMV strukturelt protein eller glykoprotein. Skjønt de alle reagerer på det samme antigen og således har den samme antigenspesifisitet, kan de ha forskjellige spesifisiteter på submolekylært nivå, hvilket betyr at de kan reagere på forskjellige regioner av antigenet eller epitopene. Innenfor denne sammenheng kan forskjellige HCMV-spesifikke T-lymfocytter ha samme submolekylære spesifisitet bare når de gjenkjenner den samme epitop på det samme HCMV-assosierte antigen. De kan imidler tid likevel være spesifikke for det same antigen dersom antigenet har en rekke forskjellige epitoper som presenteres ved APCer i forskjellige tilfeller. When a T cell or a T cell clone is said to be antigen specific, the epitope or the specific antigen site on the antigen mixture gene is not necessarily known, although the mixture comprising the antigen may be specified. E.g. three different homogeneous populations of T helper lymphocytes can be specific for one particular HCMV structural protein or glycoprotein. Although they all respond to the same antigen and thus have the same antigen specificity, they may have different specificities at the submolecular level, meaning that they may respond to different regions of the antigen or epitopes. Within this context, different HCMV-specific T lymphocytes may have the same submolecular specificity only when they recognize the same epitope on the same HCMV-associated antigen. However, they can still be specific for the same antigen if the antigen has a number of different epitopes that are presented by APCs in different cases.
F.eks. blir HCMV-DNA-genomet transkribert i fortløpende rekke-følge, idet man begynner med den restrikerte transkripsjon av mellomliggende-tidlige gener som koder for regulatoriske proteiner som er nødvendige for den etterfølgende ekspresjon av tidlige gener. Det viktigste mellomliggende-tidlige gen (I-El) koder for et 68 kD regulatorisk protein som uttrykkes på membranen av infiserte celler 6-24 timer etter at infeksjonen er begynt. HCMV-spesif ikke cytotoksiske T-celler antas hovedsakelig å gjenkjenne dette mellomliggende-tidlige protein som en del av deres rolle i immunovervåking for å hindre reaktivering av latent HCMV. E.g. the HCMV DNA genome is transcribed in sequential order, beginning with the restricted transcription of intermediate-early genes that encode regulatory proteins necessary for the subsequent expression of early genes. The major intermediate-early gene (I-El) encodes a 68 kD regulatory protein that is expressed on the membrane of infected cells 6-24 hours after infection has begun. HCMV-specific non-cytotoxic T cells are thought to mainly recognize this intermediate-early protein as part of their role in immune surveillance to prevent reactivation of latent HCMV.
Transkripsjon av tidlige gener går forut for begynnelsen av DNA-syntese. Innbefattet blant de tidlige genprodukter er virusspesifikke polymeraser og kinaser som er nødvendige for DNA-replika-sjon. Disse enzymer synes ikke å spille noen viktig rolle i immunresponser. Transcription of early genes precedes the beginning of DNA synthesis. Included among the early gene products are virus-specific polymerases and kinases that are necessary for DNA replication. These enzymes do not seem to play an important role in immune responses.
De sene HCMV-gener koder imidlertid for en rekke immunogeniske strukturelle proteiner og glykoproteiner. Innbefattet blant disse proteiner er kappeglykopeptid-komplekser med disulfidbroer, ikke-glykosylerte kappeproteiner, tegument-glykoproteiner som danner bro mellom virusnukleocapsidet med den ytre kappe, og matriks-proteiner som danner den indre capsidstruktur av viruset. However, the late HCMV genes encode a number of immunogenic structural proteins and glycoproteins. Included among these proteins are envelope glycopeptide complexes with disulfide bridges, non-glycosylated envelope proteins, tegument glycoproteins that form a bridge between the viral nucleocapsid and the outer envelope, and matrix proteins that form the internal capsid structure of the virus.
Rensingen og karakteriseringen av en rekke immunogeniske strukturelle glykopeptidkomplekser og reduserte glykopeptider fra HCMV-kappefraksjonen sammen med monoklonale antistoffer (MoAber) som er spesifikke for dette er fullt beskrevet i US-patentsøknad nr. 933.789 innlevert 24. november 1986, som herved innlemmes som referanse. De primære glykopeptider, glykopeptidkomplekser og MoAber som er beskrevet er angitt i tabell 1. The purification and characterization of a variety of immunogenic structural glycopeptide complexes and reduced glycopeptides from the HCMV envelope fraction along with monoclonal antibodies (MoAber) specific thereto is fully described in US Patent Application No. 933,789 filed November 24, 1986, which is hereby incorporated by reference. The primary glycopeptides, glycopeptide complexes and MoAbers described are listed in Table 1.
De immunogene glykopeptidkomplekser og glykopeptider som er angitt i tabell 1 er nyttige for selektiv stimulering av formeringen av T^-celler som fås fra blodet av en HCMV-seropositiv giver. På samme måte kan monoklonale antistoffer med kjent bindingsspesifisitet, såsom 9E10, 41C2 og 9B7 benyttes til å rense virusantigener. Disse monoklonale antistoffer kan også benyttes til å forsterke antigengjenkjennelse ved Tn-cellekloner, hvilket letter deres ekspansjon i nærvær av begrensede mengder virusantigen. The immunogenic glycopeptide complexes and glycopeptides listed in Table 1 are useful for selectively stimulating the proliferation of T₂ cells obtained from the blood of an HCMV seropositive donor. In the same way, monoclonal antibodies with known binding specificity, such as 9E10, 41C2 and 9B7 can be used to purify viral antigens. These monoclonal antibodies can also be used to enhance antigen recognition by Tn cell clones, facilitating their expansion in the presence of limited amounts of viral antigen.
II. Immunterapi med T- cellelinierII. Immunotherapy with T-cell lines
T-celle-gjenkjennelse av forskjellige HCMV-proteiner er viktig for planlegging av det riktige forløp av immunterapi med T-cellelinjene. T^-cellene som her er eksemplifisert, gjenkjenner primært strukturelle proteiner av HCMV. Det er derfor sannsynlig at de vil være viktige i gjenkjennelsen av cellefri virus (dvs. T-cell recognition of different HCMV proteins is important for planning the correct course of immunotherapy with the T-cell lines. The T₂ cells exemplified here primarily recognize structural proteins of HCMV. It is therefore likely that they will be important in the recognition of cell-free viruses (i.e.
i tilfeller av akutt viremi). Data fra mus og mennesker viser at visse cytotoksiske T-celler gjenkjenner mellomliggende-tidlige proteiner som uttrykkes på overflaten av infiserte celler. Da disse proteiner bare produseres etter at virusgenene er uttrykt av vertscellene, er slike Tc-celler viktige for å hindre reaktivering av latent HCMV, og deres tilførsel er antydet for både forebyggende og spesifikk HCMV-behandling. in cases of acute viraemia). Data from mice and humans show that certain cytotoxic T cells recognize intermediate-early proteins expressed on the surface of infected cells. As these proteins are only produced after the viral genes are expressed by the host cells, such Tc cells are important to prevent reactivation of latent HCMV, and their delivery is suggested for both preventive and specific HCMV treatment.
De foretrukne T-cellelinjer gjenkjenner virusantigener i assosiasjon med humane LA-produkter. Derfor må terapeutiske T-celler være enten autologe eller dele én eller flere av de restriksjons-spesifisiteter som uttrykkes av pasienten. I den sammenheng hvor isolerte T-celler overføres til et individ som en måte til behandling, er allogene celler celler fra et giverindivid av den samme art som mottakeren som er matchet for det viktigste (major) histokompatibilitetskompleks for en passende human leukocyttantigen-klasse (HLA-klasse) av antigener uttrykt av resipienten (forkortelse "MHC LA-matchet"). Følgelig, når man har med en pasient å gjøre som har en patologisk infeksjon, såsom kronisk HCMV-sykdom, kan man ekspandere autologe antigenspesifikke T-cellelinjer in vitro for senere T-celleterapi via ny tilførsel. Alternativt, når hurtig tilgang til T-celleklone-reagenser er viktig for å behandle akutt, livstruende infeksjon, kan pre-ekspansjon og tilførsel av en rekke ekspanderte allogene terapeutiske T-celler av kjent virusantigen-spesifisitet og/eller HLA-type anvendes. Denne teknikk er spesielt viktig for pasienter som The preferred T cell lines recognize viral antigens in association with human LA products. Therefore, therapeutic T cells must be either autologous or share one or more of the restriction specificities expressed by the patient. In the context where isolated T cells are transferred to an individual as a means of treatment, allogeneic cells are cells from a donor individual of the same species as the recipient that are major histocompatibility complex matched for an appropriate human leukocyte antigen class (HLA -class) of antigens expressed by the recipient (abbreviation "MHC LA-matched"). Accordingly, when dealing with a patient who has a pathological infection, such as chronic HCMV disease, one can expand autologous antigen-specific T-cell lines in vitro for subsequent T-cell therapy via re-infusion. Alternatively, when rapid access to T cell clone reagents is important to treat acute, life-threatening infection, pre-expansion and infusion of a number of expanded allogeneic therapeutic T cells of known viral antigen specificity and/or HLA type can be used. This technique is particularly important for patients who
er immunundertrykket.is immunosuppressed.
En videre side ved den foreliggende oppfinnelse er derfor rettet på en fremgangsmåte til anvendelse av T-lymfocytter (T-celler) for terapeutisk behandling av et pattedyr, såsom en human pasient, som har en virusinfeksjon, f.eks. HCMV-infeksjon. Fremgangsmåten omfatter å behandle det nevnte infiserte pattedyr med en mengde av en homogen, klonalt ekspandert, virusantigenspesifikk T-celle-populasjon som er virksom for å frembringe en øket immunreaksjon overfor virusinfeksjonen, idet den nevnte T-cellepopulasjon er spesifikk (a) for minst ett leukocyttantigen (LA) som foreligger på overflaten av en antigenpresenterende celle (APC) av det nevnte pattedyr, og (b) overfor et antigen av det nevnte virus. A further aspect of the present invention is therefore directed to a method for using T-lymphocytes (T-cells) for the therapeutic treatment of a mammal, such as a human patient, who has a viral infection, e.g. HCMV infection. The method comprises treating said infected mammal with an amount of a homogeneous, clonally expanded, viral antigen-specific T-cell population which is effective to produce an increased immune response to the viral infection, said T-cell population being specific (a) for at least one leukocyte antigen (LA) present on the surface of an antigen-presenting cell (APC) of said mammal, and (b) against an antigen of said virus.
Fortrinnsvis består de.n klonalt ekspanderte T-celle-populasjon hovedsakelig av Tn-celler eller Tc-celler. Som angitt ovenfor foretrekkes det ofte å tilføre en rekke forskjellige (eller en "bank") homogene klonalt ekspanderte virusantigenspesifikke T-celle-populasjoner for (a) å fremme immunsystemgjenkjennelse av antigener som er uttrykt i løpet av forskjellige stadier infeksjon og/eller (b) å garantere at et virksomt antall av de samlede T-celle-populasjoner vil være MHC-matchet med mottakeren. Preferably, the clonally expanded T cell population consists mainly of Tn cells or Tc cells. As noted above, it is often preferred to add a number of different (or a "bank") homogeneous clonally expanded virus antigen-specific T cell populations to (a) promote immune system recognition of antigens expressed during different stages of infection and/or (b ) to guarantee that an effective number of the pooled T-cell population will be MHC-matched to the recipient.
Den foreliggende fremgangsmåte for T-celle-immunterapi omfatter derfor tilførselen av en rekke forskjellige T-celle-populasjoner som omfatter T-celler med spesifisitet (a) for en rekke forskjellige antigener av det nevnte virus, og (b) for minst ett LA som foreligger på overflaten av en APC av det nevnte pattedyr. Videre kan fremgangsmåten også omfatte tilførselen av en rekke forskjellige T-celle-populasjoner som hver omfatter T-celler med en spesifisitet (a) for minst ett antigen av det nevnte virus, og (b) for en rekke forskjellige LAer som foreligger på overflatene av APCer av en rekke forskjellige allotyper av en enkelt art av det nevnte pattedyr, idet minst ett LA er LA-restriksjonsmatchet med det nevnte pattedyr. The present method for T-cell immunotherapy therefore comprises the supply of a number of different T-cell populations comprising T-cells with specificity (a) for a number of different antigens of said virus, and (b) for at least one LA which present on the surface of an APC of said mammal. Furthermore, the method can also comprise the supply of a number of different T-cell populations, each comprising T-cells with a specificity (a) for at least one antigen of the said virus, and (b) for a number of different LAs present on the surfaces of APCs of a variety of different allotypes of a single species of said mammal, wherein at least one LA is the LA restriction match to said mammal.
Polyklonale linjer, samt T-cellekloner, kan ha betydelig terapeutisk potensial. En spesiell fordel med antigenspesifikke polyklonale T-cellelinjer er at de innbefatter T^- og/eller Tc-celler som kan gjenkjenne mål-virusantigenet i assosiasjon med alle restrikerende MHC LAer som uttrykkes av T-cellegiveren. Fordelen med virusspesifike Tn- og Tc-kloner som fås fra en enkelt opphavs-T-celle er at de representerer en homogen populasjon av celler med kjent antigenspesifisitet, funksjonell aktivitet og MHC LA-restriksjonsspesifisitet. Det er derfor sannsynlig at de vil oppvise maksimal terapeutisk virkning, da alle celler i populasjonen oppviser den samme funksjonelle aktivitet. Fra et praktisk synspunkt vil imidlertid en langt større "bank" som fås fra adskilte (discrete) T-celle-populasjoner være nødvendig dersom monoklonale T-celler skal anvendes. Polyclonal lines, as well as T-cell clones, may have significant therapeutic potential. A particular advantage of antigen-specific polyclonal T cell lines is that they include T^ and/or Tc cells that can recognize the target viral antigen in association with all restrictive MHC LAs expressed by the T cell donor. The advantage of virus-specific Tn and Tc clones obtained from a single progenitor T cell is that they represent a homogeneous population of cells with known antigen specificity, functional activity and MHC LA restriction specificity. It is therefore likely that they will show maximum therapeutic effect, as all cells in the population show the same functional activity. From a practical point of view, however, a much larger "bank" obtained from separate (discrete) T-cell populations will be necessary if monoclonal T-cells are to be used.
Da fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tillater tilførselen av en terapeutisk virksom mengde av T^-celler og/eller Tc-celler, kan det sykdomsrammede pattedyr behandles, skjønt ikke nødvendigvis, samtidig med eksogene lymfokiner, såsom IL-2 (TCGF). Da tilførse-len av store doser IL-2 er blitt assosiert med uheldige reaksjo-ner hos noen pasienter, kan evnen til å fremme immunresponsen i fravær av IL-2 skaffe en betydelig forbedring i virkningsfull-heten av T-celle-terapi. As the method according to the invention allows the delivery of a therapeutically effective amount of T cells and/or Tc cells, the diseased mammal can be treated, although not necessarily, at the same time with exogenous lymphokines, such as IL-2 (TCGF). As the administration of large doses of IL-2 has been associated with adverse reactions in some patients, the ability to promote the immune response in the absence of IL-2 may provide a significant improvement in the efficacy of T-cell therapy.
Representative antigenspesifikke T-cellelinjer som er blitt dannet i henhold til de foreliggende fremgangsmåter og som er representative for de populasjoner som kan benyttes til å danne T-celle-"banker" som angitt ovenfor, er angitt i tabell 2. Representative antigen-specific T-cell lines which have been generated according to the present methods and which are representative of the populations that can be used to form T-cell "banks" as indicated above, are set forth in Table 2.
Den foreliggende oppfinnelse er blitt beskrevet hovedsakelig ut fra produksjonen av Tn- og Tc-celler som er spesifikke for virusantigener og behandlingen av virusinfeksjoner med homogene populasjoner av disse T-celler. Det antas imidlertid at homogene populasjoner av T^- og Tc-celler som er spesifikke for antigener på en rekke forskjellige patologiske mål kan fremstilles ved bruk av den foreliggende fremgangsmåte og at disse populasjoner vil være virksomme for å forsterke eller stimulere immunresponsen for en rekke forskjellige patogener eller patologiske mål. The present invention has been described mainly on the basis of the production of Tn and Tc cells which are specific for viral antigens and the treatment of viral infections with homogeneous populations of these T cells. However, it is believed that homogeneous populations of T^ and Tc cells specific for antigens on a variety of different pathological targets can be produced using the present method and that these populations will be effective in enhancing or stimulating the immune response for a variety of different pathogens or pathological targets.
Vidt definert er et patologisk mål en enhet innenfor legemet av et pattedyr som er årsaken til, eller resultatet av, en sykdom som truer pattedyrvertens helse og ve og vel. Målet kan være en enhet som er fremmed for verten, såsom et virus, bakterie, sopp eller liknende, eller ået kan være et produkt av en sykdom eller patologisk tilstand, såsom en virusinfisert celle, en neoplastisk celle og liknende. I spesifikke utførelsesformer av den terapeutiske behandling ifølge oppfinnelsen er det patologiske mål for behandlingen undertiden en sekundærinfeksjon som er mer truende for den påtenkte resipient, fordi en primærsykdom har svekket resipientens evne til å reagere immunologisk på den sekundære infeksjon. Mange sider ved primærsykdommer kan svekke den påtenkte resipients immunrespons overfor den sekundære infeksjon, innbefattet terapeutiske behandlinger som virker til å undertrykke sider av resipientens immunsystem. Slike behandlinger omfatter, men er ikke begrenset til, strålebehandling, kjemiterapi og liknende. Broadly defined, a pathological target is an entity within the body of a mammal that is the cause of, or the result of, a disease that threatens the health and well-being of the mammalian host. The target may be an entity foreign to the host, such as a virus, bacterium, fungus or the like, or the target may be a product of a disease or pathological condition, such as a virus-infected cell, a neoplastic cell, and the like. In specific embodiments of the therapeutic treatment according to the invention, the pathological target of the treatment is sometimes a secondary infection that is more threatening to the intended recipient, because a primary disease has impaired the recipient's ability to respond immunologically to the secondary infection. Many aspects of primary disease can impair the intended recipient's immune response to the secondary infection, including therapeutic treatments that act to suppress aspects of the recipient's immune system. Such treatments include, but are not limited to, radiotherapy, chemotherapy and the like.
Som en oppsummering kan den foreliggende terapeutiske fremgangsmåte anvende allogene T-celler fra individer av samme art som er MHC LA-matchet. Dette vil tillate leger og farmasøyter å forenkle bruken av på forhånd dannede doseformer av allogene T-celler for behandling av en pasient. Da T-celler som ikke er matchet ganske enkelt er uten virkning for å hjelpe pasienten, kan dosen inneholde mange celler, noen som er matchet og som vil hjelpe pasienten og noen som ikke er matchet og som ikke vil hjelpe pasienten. In summary, the present therapeutic method can use allogeneic T cells from individuals of the same species that are MHC LA-matched. This will allow physicians and pharmacists to facilitate the use of preformed dosage forms of allogeneic T cells for the treatment of a patient. Since T cells that are not matched are simply ineffective in helping the patient, the dose may contain many cells, some that are matched and will help the patient and some that are not matched and will not help the patient.
På denne måte kan en enkelt doseform anvendes for å behandle en rekke pasienter som deler ett eller flere LAer som uttrykkes ved de allogene terapeutiske celler. Dessuten kan dosen inneholde både Tc- og T^-celler som har forskjellige MHC-klasserestriksjo-ner. Det tør være åpenbart at en slik terapeutisk behandling ikke krever fremstillingen av doser på en fra gang-til-gang-basis. Dette betyr at T-cellene kan ekspanderes i store dyrkningsmedia, hvilket tillater den effektivitet som oppnås ved stor målestokk. Dessuten kan cellene fremstilles slik at de er øyeblikkelig tilgjengelige uten at de krever individualisert oppsamlet, leukaferese og dyrking. In this way, a single dosage form can be used to treat a number of patients who share one or more LAs expressed by the allogeneic therapeutic cells. Moreover, the dose can contain both Tc and T^ cells which have different MHC class restrictions. It should be obvious that such therapeutic treatment does not require the preparation of doses on a time-to-time basis. This means that the T cells can be expanded in large culture media, allowing the efficiency achieved on a large scale. Moreover, the cells can be prepared so that they are immediately available without requiring individualized collection, leukapheresis and culture.
Uansett de ovenfor angitte fordeler er imidlertid det mest lovende trekk ved den nye immunterapi utsiktene til at hver dose vil inneholde antigenspesifikke T-celler. Dette representerer et betydelig fremskritt over fremgangsmåten i henhold til Rosenberg et al. som bare skaffer ikke-spesifikk forbedring av cytotoksiske celler. I den foreliggende fremgangsmåte kan en doseform skaffes som inneholder allogene T^- og Tc-celler som er spesifikke for en rekke forskjellige antigener som alle er assosiert med et spesielt patogen. F.eks. kan en enhetsdose inneholde en rekke Regardless of the above advantages, however, the most promising feature of the new immunotherapy is the prospect that each dose will contain antigen-specific T cells. This represents a significant advance over the method according to Rosenberg et al. which only provides non-specific enhancement of cytotoxic cells. In the present method, a dosage form can be provided containing allogeneic T₂ and Tc cells specific for a variety of different antigens all associated with a particular pathogen. E.g. A unit dose can contain a number of
Tn- og Tc-cellekloner som er blitt individuelt dyrket og deretter blandet. Doseformen kan inneholde Tn- og Tc-celler med et på forhånd valgt antall LA-restriksjoner og også et på forhånd valgt antall antigenspesifisiteter. Dersom et spesielt patogen er kjent for å uttrykke 10 eller 20 kjente epitoper på en rekke forskjellige antigener, strukturelle eller andre, kan dosen inneholde passende T-celler som har spesifisitet for hver av dem. Behandlingsmetodologier vil normalt involvere den parenterale tilførsel av en terapeutisk virksom mengde av autologe eller allogene T-celler i en egnet flytende bærer såsom en fysiologisk saltoppløsning. Én slik fremgangsmåte er den som er skaffet avS.A. Rosenberg et al., New England J . ' Med. , 313, 1485 (1985), men antall celler som leveres pr. dose og antall doser som tilføres vil variere innen vide grenser, avhengig av faktorer som bestem-mes av klinikeren, innbefattet den patologi som behandles, pasientens fysikk og hans fysiske tilstand og andre faktorer. På grunn av den forbedrede virkningsgrad av formeringsmetoden ifølge oppfinnelsen, kan det imidlertid være mulig å fjerne stort sett færre MNCer fra pasienten og tilbakeføre stort sett flere autologe antigenspesifikke T-celler til pasienten enn det som er nødven-dig ved metodologien i henhold til Rosenberg et al. Tn and Tc cell clones that have been individually cultured and then mixed. The dosage form may contain Tn and Tc cells with a preselected number of LA restrictions and also a preselected number of antigen specificities. If a particular pathogen is known to express 10 or 20 known epitopes on a variety of different antigens, structural or otherwise, the dose may contain appropriate T cells that have specificity for each of them. Treatment methodologies will normally involve the parenteral administration of a therapeutically effective amount of autologous or allogeneic T cells in a suitable liquid carrier such as a physiological saline solution. One such method is that provided by S.A. Rosenberg et al., New England J . ' With. , 313, 1485 (1985), but the number of cells delivered per dose and number of doses administered will vary widely, depending on factors determined by the clinician, including the pathology being treated, the patient's physique and physical condition, and other factors. However, due to the improved efficiency of the propagation method according to the invention, it may be possible to remove substantially fewer MNCs from the patient and return substantially more autologous antigen-specific T cells to the patient than is necessary with the methodology according to Rosenberg et al. eel.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsenDetailed description of the invention
Oppfinnelsen skal beskrives ytterligere i overensstemmelse medThe invention shall be further described in accordance with
de følgende detaljerte eksempler.the following detailed examples.
EKSEMPEL IEXAMPLE I
1. Fremstilling av virusantigener1. Production of viral antigens
Humane primære fibroblastkulturer dyrket i Dulbeccos modifisert Eagle<1>s Medium (DMEM) pluss 10% kvegfosterserum ble infisert Human primary fibroblast cultures grown in Dulbecco's modified Eagle<1>s Medium (DMEM) plus 10% fetal bovine serum were infected
med Towne-stamme HCMV ved en infeksjonsmultiplisitet (MOI) på 1-5. Ved 3-4 dagers postinfeksjon ble [^H]glukosamin (5 uCi/ml, 22 Ci/mM, Amersham, Arlington Heigths, IL) eller [-^5S]metionin with Towne strain HCMV at a multiplicity of infection (MOI) of 1-5. At 3-4 days postinfection, [^H]glucosamine (5 uCi/ml, 22 Ci/mM, Amersham, Arlington Heights, IL) or [-^5S]methionine
(5 uCi/ml, 109 Ci/mM, DuPont/NEN, Boston, MA) tilsatt som en markør i løpet av etterfølgende rensing for visse av de eksperimenter som er beskrevet nedenfor. (5 uCi/ml, 109 Ci/mM, DuPont/NEN, Boston, MA) added as a marker during subsequent purification for certain of the experiments described below.
Celler og celleavfall ble fjernet fra mediet ved lavhastig-hetssentrifugering ved 7500 x g i 20 min. Virus ble samlet opp fra supernatanten ved sentrifugering ved 48 200 x g i 1 time. Viruspelleten ble resuspendert i Tris NaCl-buffer (50 Cells and cell debris were removed from the medium by low-speed centrifugation at 7500 x g for 20 min. Viruses were collected from the supernatant by centrifugation at 48,200 x g for 1 hour. The virus pellet was resuspended in Tris NaCl buffer (50
mM trishydroksymetylaminometan-HCl, pH 7,4, og 150 mM NaCl)mM trishydroxymethylaminomethane-HCl, pH 7.4, and 150 mM NaCl)
og lagt lagvis på 20-60% sakkarosegradienter fremstilt med den samme buffer. Hastighetssedimentering ble utført ved 131.300 x g i 1 time. Gradienter ble samlet opp og målt for optisk densitet ved 280 nm. En hovedtopp for optisk densitet som dannet and layered on 20-60% sucrose gradients prepared with the same buffer. Velocity sedimentation was performed at 131,300 x g for 1 hour. Gradients were collected and measured for optical density at 280 nm. A main optical density peak that formed
bånd ved 43% sakkarose ble samlet opp. Disse fraksjoner ble fortynnet medTris/NaCl-buffer og virus samlet opp ved sentrifugering ved 131.300 x g i 2 timer. Dette rensede hele virus-preparat ble betegnet "helt HCMV-antigen". bands at 43% sucrose were collected. These fractions were diluted with Tris/NaCl buffer and virus collected by centrifugation at 131,300 x g for 2 hours. This purified whole virus preparation was termed "whole HCMV antigen".
For å oppløseliggjøre membranbestanddeler, ble hele HCMV-anti-genpreparatet suspendert på nytt i 2-4 ml TN-buffer (Tris/NaCl-buf f er (50 mM Tris hydroklorid, pH 7,5, 10 mM NaCl, 2 mM fenyl-metylsulfonylfluorid)) inneholdende 1% Triton-X 100 (TX-100). Etter inkubasjon ved omgivelsetemperatur i 60 minutter ble To solubilize membrane components, the whole HCMV antigen preparation was resuspended in 2-4 ml of TN buffer (Tris/NaCl buffer (50 mM Tris hydrochloride, pH 7.5, 10 mM NaCl, 2 mM phenyl- methylsulfonyl fluoride)) containing 1% Triton-X 100 (TX-100). After incubation at ambient temperature for 60 minutes,
denne oppløsning lagt lagvis på en lineær 20-60% sakkarose-gradient for hastighetssone-sentrifugering (rate zonal centri-fugation) ved 120.000 g i 60 minutter. Det TX-100 oppløselig-gjorte materiale ble tilbake ved toppen av gradienten, mens HCMV-nukleocapsidene ble samlet i bånd ved hastighetssedimentering. Alternativt ble detergentekstrakter av Towne-stamme HCMV fremstilt ved bruk av 1,0% Nonidet P-40 (NP-40, Sigma Chemical Company). I denne fremgangsmåte ble 10-15 mg av det rensede hele HCMV-antigen suspendert i 3-5 ml TN-buffer inneholdende 1% NP-40. Detergent/virus-suspensjoner ble omrørt i 1 time ved værelsetemperatur. De ekstraherte proteiner ble separert fra uoppløselige proteiner ved høyhastighetssentrifugering i 1 time. Det ekstrakt som ble oppnådd ved den ene eller den annen av disse fremgangsmåter ble betegnet "HCMV-detergentekstrakt". this solution layered on a linear 20-60% sucrose gradient for rate zonal centrifugation at 120,000 g for 60 minutes. The TX-100 solubilized material remained at the top of the gradient, while the HCMV nucleocapsids were collected in bands by velocity sedimentation. Alternatively, detergent extracts of Towne strain HCMV were prepared using 1.0% Nonidet P-40 (NP-40, Sigma Chemical Company). In this procedure, 10-15 mg of the purified whole HCMV antigen was suspended in 3-5 ml of TN buffer containing 1% NP-40. Detergent/virus suspensions were stirred for 1 hour at room temperature. The extracted proteins were separated from insoluble proteins by high-speed centrifugation for 1 hour. The extract obtained by one or the other of these methods was termed "HCMV detergent extract".
Skjønt HCMV-spesifikke T-hjelperceller synes å gjenkjenne HCMV-proteiner og glykoproteiner som inneholdes inne i de hele HCMV-antigenpreparater, gjenkjenner HCMV-spesifikke cytotoksiske T-celler hovedsakelig HCMV-kodede proteiner uttrykt på overflaten av de infiserte celler. Nærmere bestemt synes det viktigste mellomliggende-tidlige protein (I-El-protein) som uttrykkes på cellemembranen innen 6-24 timers infeksjon å være viktig for ekspansjonen av HCMV-spesifikke cytotoksiske T-celler. Although HCMV-specific T helper cells appear to recognize HCMV proteins and glycoproteins contained within the whole HCMV antigen preparations, HCMV-specific cytotoxic T cells mainly recognize HCMV-encoded proteins expressed on the surface of the infected cells. Specifically, the major intermediate-early protein (I-E1 protein) expressed on the cell membrane within 6-24 hours of infection appears to be important for the expansion of HCMV-specific cytotoxic T cells.
Autologe fibroblaster eller allogene fibroblaster som delerAutologous fibroblasts or dividing allogeneic fibroblasts
et eller flere klasse-I-leukocyttantigener som gjenkjennes av T-celledonoren ble derfor infisert med Towne-stamme HCMV ved one or more class I leukocyte antigens recognized by the T cell donor were therefore infected with Towne strain HCMV at
en infeksjonsmangfoldighet på 5-10 i 3 timer. I noen tilfeller ble cellene infisert i nærvær av cykloheksamid (50 ug/ml). a multiplicity of infection of 5-10 for 3 hours. In some cases, the cells were infected in the presence of cyclohexamide (50 µg/ml).
Etter fjerning av cykloheksamid ble Actinomycin D (5 ug/ml) tilsatt for å hindre ytterligere DNA-transkripsjon, hvilket tillot selektiv ekspresjon av I-E-gener av HCMV. Infiserte fibroblaster som ikke var behandlet med cykloheksamid og Actinomycin D uttrykte både I-E og sene geneprodukter av HCMV. Disse preparater ble betegnet "celleassosiert virusantigen". After removal of cyclohexamide, Actinomycin D (5 µg/ml) was added to prevent further DNA transcription, allowing selective expression of I-E genes of HCMV. Infected fibroblasts not treated with cyclohexamide and Actinomycin D expressed both I-E and late gene products of HCMV. These preparations were termed "cell-associated virus antigen".
Herpes simplex-virus type I (HSV-I) ble delvis renset som beskrevet av R.C. Gehrz et al., Lancet, 2, 844 (1977) og varmeinaktivert ved 56°C i 1 time for å gi "HSV-Antigen". Herpes simplex virus type I (HSV-I) was partially purified as described by R.C. Gehrz et al., Lancet, 2, 844 (1977) and heat inactivated at 56°C for 1 hour to give "HSV Antigen".
EKSEMPEL IIEXAMPLE II
1.Dannelse av HCMV- spesifikk T- hieloercelle oa cytotoksiske T- cellelinier 1. Formation of HCMV-specific T-cells and other cytotoxic T-cell lines
HCMV-spesifikke T-celleblaster ble fremstilt i 25 cm<2>opprett-stående vevdyrkningskolber ved stimulering av 10 x 10<6>mononukleære celler (MNC) ved en konsentrasjon på 1 x 10^ MNC pr. HCMV-specific T cell blasts were produced in 25 cm<2> upright tissue culture flasks by stimulation of 10 x 10<6> mononuclear cells (MNC) at a concentration of 1 x 10^ MNC per
ml med 10 ug varmeinaktivert helt HCMV-antigen (56°C, 1 time) suspendert i RPMI 1640-medium supplert med 15% varmeinaktivert HCMV-seronegativt humant serum (PHS). Etter 7-10 dager ved ml with 10 µg of heat-inactivated whole HCMV antigen (56°C, 1 hour) suspended in RPMI 1640 medium supplemented with 15% heat-inactivated HCMV-seronegative human serum (PHS). After 7-10 days at
37°C i 5% C02-atmosfære ble de HCMV-spesifikke blåster enten ekspandert ytterligere i samlekultur (bulk culture), eller klonet ved begrensende fortynning i 9 6-brønners U-bunnede vevskulturplater med 0,3 celler pr. brønn i nærvær av røntgen-bestrålt (5.000 R) autologt MNC (MNC<IRR>) som mateceller, helt HCMV-antigen ved en konsentrasjon på 1 ug/ml (for Tn-celler) eller celleassosiert antigen med et forhold mellom fibroblast og MNC på 1:20 (for Tc-celler), og 10-20% interleukin-2 (IL-2) At 37°C in a 5% C02 atmosphere, the HCMV-specific blasts were either expanded further in bulk culture, or cloned by limiting dilution in 9 6-well U-bottomed tissue culture plates with 0.3 cells per well. well in the presence of X-irradiated (5,000 R) autologous MNC (MNC<IRR>) as feeder cells, whole HCMV antigen at a concentration of 1 ug/ml (for Tn cells) or cell-associated antigen with a ratio of fibroblast to MNC of 1:20 (for Tc cells), and 10-20% interleukin-2 (IL-2)
(TCGF, Biotest, Frankfurt, Vest-Tyskland). Deretter ble cellene matet på nytt hver 3-4 dag med nytt IL-2-holdig medium. Helt HCMV-antigen og autologe røntgenbestrålte mateceller ble satt til mediet hver 7.-14. dag. (TCGF, Biotest, Frankfurt, West Germany). The cells were then re-fed every 3-4 days with new IL-2-containing medium. Whole HCMV antigen and autologous x-ray irradiated feeder cells were added to the medium every 7-14 days. day.
Voksende celler ble matet og overført til 96-brønners flatbunnede vevskulturplater. Voksende kloner ble deretter overført til 24-brønners plater for ytterligere ekspansjon og deretter sådd på nytt i 25 cm<2>vevskulturkolber for produksjon i stor skala. Ekspanderte kloner ble subklonet ved en annen begrensende fortynning for å sikre klonalitet. Kloner ble utviklet fra 4 forskjellige HCMV-seropositive givere, hvilket ga mer enn 100 individuelle T-cellelinjer. 2. Karakteriserin<g>av HCMV- Tn- oa TG- cellelinier og - kloner Alle de Tft- og Tc-linjer og -kloner som anvendes i eksemplene nedenfor blekarakterisertmed hensyn til fenotype, formeringsresponser, IL-2-produksjon og cytotoksisk aktivitet som følger: Growing cells were fed and transferred to 96-well flat-bottomed tissue culture plates. Growing clones were then transferred to 24-well plates for further expansion and then reseeded in 25 cm<2>tissue culture flasks for large-scale production. Expanded clones were subcloned at another limiting dilution to ensure clonality. Clones were developed from 4 different HCMV-seropositive donors, yielding more than 100 individual T-cell lines. 2. Characterization<g>of HCMV- Tn and TG cell lines and clones All the Tft and Tc lines and clones used in the examples below were characterized with regard to phenotype, proliferation responses, IL-2 production and cytotoxic activity as following:
A. FenotvpeanalvseA. Phenotypic analysis
T-cellelinjer ble analysert for ekspresjon av CD-fenotypiske determinanter ved bruk av de monoklonale antistoffer 0KT3 (samlede T-celler), 0KT4 (hjelper/induserer-T-celler) og 0KT8 (cytotoksiske/suppressor-T-celler) (Ortho Pharmaceuticals Inc., Raritan, NJ) ved bruk av en indirekte immunofluorescens-målemetode. Fluorescens ble påvist enten ved fluorescensmikroskopi ved bruk av et Zeiss fluorescerende mikroskop eller strømningscytometri ved bruk av EPICS sp celle 541 (Coulter Corp., Hialeah, FL). Polyclonale T^-linjer var hovedsakelig CD3+4+8-; alle T^-kloner uttrykte CD3+4+8-fenotypen. Tc-linjene var hovedsakelig CD3+4-8+; Tc-klonene var CD3+4-8+. T cell lines were analyzed for expression of CD phenotypic determinants using the monoclonal antibodies 0KT3 (total T cells), 0KT4 (helper/inducer T cells) and 0KT8 (cytotoxic/suppressor T cells) (Ortho Pharmaceuticals Inc., Raritan, NJ) using an indirect immunofluorescence assay method. Fluorescence was detected either by fluorescence microscopy using a Zeiss fluorescent microscope or flow cytometry using EPICS sp cell 541 (Coulter Corp., Hialeah, FL). Polyclonal T^ lines were predominantly CD3+4+8-; all T^ clones expressed the CD3+4+8 phenotype. The Tc lines were predominantly CD3+4-8+; The Tc clones were CD3+4-8+.
B. LvmfocvttformeringB. Lvmfocvtt propagation
T-cellelinjer og -kloner ble tillatt å hvile i vevskultur-medium i fravær av TCGF over natten, og deretter restimulert i 72 timer med enten helt HCMV-antigen eller HSV-antigen for å bestemme spesifisiteten av formeringsresponsen hos T^-kloner. Alle T^-linjer og -kloner viste positive formeringsresponser overfor HCMV, mens responser overfor HSV var de samme som for vevskulturmediumsbakgrunns-sammenlikningsprøve. Således var alle T^-linjer og -kloner HCMV-spesifikke. Tc-cellekloner formerte seg dårlig overfor HCMV-antigen i frævær av IL-2. T cell lines and clones were allowed to rest in tissue culture medium in the absence of TCGF overnight and then restimulated for 72 hours with either whole HCMV antigen or HSV antigen to determine the specificity of the proliferative response of T^ clones. All T^ lines and clones showed positive proliferation responses to HCMV, while responses to HSV were the same as for the tissue culture medium background control sample. Thus, all T^ lines and clones were HCMV specific. Tc cell clones proliferated poorly against HCMV antigen in the presence of IL-2.
C. Produksjon av interleukin- 2 ( IL- 2)C. Production of interleukin-2 (IL-2)
Tn-kloner ble stimulert med helt HCMV-antigen og supernatanten høstet ved 24 timer og analysert for IL-2-aktivitet ved bruk av musecellelinjen CTLL-20 (IL-2-avhengig). Alle Tn-kloner ble vist å produsere IL-2, som oppvist ved overlevelsen og veksten av CTLL-20. Tc-klonene ble ikke testet for IL-2-produksjon. Tn clones were stimulated with whole HCMV antigen and the supernatant harvested at 24 h and assayed for IL-2 activity using the mouse cell line CTLL-20 (IL-2 dependent). All Tn clones were shown to produce IL-2, as demonstrated by the survival and growth of CTLL-20. The Tc clones were not tested for IL-2 production.
D. Cvtotoksisk aktivitetD. Cvtotoxic activity
Alle T^-kloner ble testet for cytotoksisk aktivitet mot NK-målcellelinjen, K562, autologt uinfiserte og CMV- og HSV-infiserte fibroblaster som målceller. Ikke noen NK-eller virusspesifikk cytotoksisk aktivitet ble observert ved noen av T^-klonene. All T^ clones were tested for cytotoxic activity against the NK target cell line, K562, autologously uninfected and CMV- and HSV-infected fibroblasts as target cells. No NK or virus-specific cytotoxic activity was observed in any of the T₂ clones.
Alle Tc-kloner ble testet for cytotoksisk aktivitet mot NK-målcellelinjene K5 62, autologe og umatchede eller delvis matchede allogene uinfiserte og HCMV-, HSV- og influensa-infiserte fibroblaster som målceller. Ikke noen anti-NK-aktivitet ble observert med noen av Tc-klonene. Alle HCMV-spesifikke Tc-kloner oppviste cytotoksisk aktivitet overfor autologe og MHC LA-matchede HCMV-infiserte fibroblaster, men ikke overfor allogene umatchede HCMV-inf iserte fibroblaster. Ingen cytotoksisk aktivitet ble observert for noen av målcellene infisert med HSV eller influensavirus. Således oppviser de Tc-kloner som her er beskrevet HSMV-spesifikk cytotoksisk aktivitet begrenset ved MHC klasse-I-antigener og oppviser derfor karakteri-stikkene for virusspesifikke cytotoksiske T-celler. All Tc clones were tested for cytotoxic activity against the NK target cell lines K5 62, autologous and unmatched or partially matched allogeneic uninfected and HCMV-, HSV- and influenza-infected fibroblasts as target cells. No anti-NK activity was observed with any of the Tc clones. All HCMV-specific Tc clones exhibited cytotoxic activity against autologous and MHC LA-matched HCMV-infected fibroblasts, but not against allogeneic mismatched HCMV-infected fibroblasts. No cytotoxic activity was observed for any of the target cells infected with HSV or influenza virus. Thus, the Tc clones described here exhibit HSMV-specific cytotoxic activity limited by MHC class I antigens and therefore exhibit the characteristics of virus-specific cytotoxic T cells.
EKSEMPEL IIIEXAMPLE III
Formeringsrespons av HCMV- spesifikke T^- kloner overfor HCMV-antigener Proliferation response of HCMV-specific T^ clones to HCMV antigens
Sytten HCMV-T^-kloner oppnådd fra giver-WRC blekarakteriserti utstrakt grad med hensyn til fenotype, formeringsresponser, IL-2-produksjon og cytotoksisk aktivitet. Alle kloner var CD3+4+8- Seventeen HCMV-T^ clones obtained from donor WRC were extensively characterized for phenotype, proliferative responses, IL-2 production and cytotoxic activity. All clones were CD3+4+8-
, formerende overfor HCMV, men ikke HSV (som beskrevet i eksempel II (2) ovenfor), alle produserte IL-2 når de ble stimulert med HCMV, men ikke HSV, og ingen oppviste cytotoksisk aktivitet. , proliferative against HCMV but not HSV (as described in Example II (2) above), all produced IL-2 when stimulated with HCMV but not HSV, and none exhibited cytotoxic activity.
Således ble alle kloner ansett å være T-hjelperceller. Alle kloner oppviste også klasse II MHC-restriksjonsspesifisitet, som bestemt ved blokkering med anti-klasse-II monoklonale antistoffer og reaktivitet overfor helt HCMV-antigen presentert ved autologe eller allogene antigenpresenterende celler som deler den riktige Dw-restriksjonsdeterminant uttrykt i assosiasjon med DR, DQ eller Thus, all clones were considered to be T helper cells. All clones also exhibited class II MHC restriction specificity, as determined by blocking with anti-class II monoclonal antibodies and reactivity to whole HCMV antigen presented by autologous or allogeneic antigen-presenting cells sharing the correct Dw restriction determinant expressed in association with DR, DQ or
DP. DP.
For undersøkelser av Tc-cellereaktivitet overfor rensede HCMV-antigener ble røntgenbestrålte autologe mononukleære celler tilsatt som en kilde til antigenpresenterende celler i en 3 dagers restimuleringskultur. Én uCi pr. brønn av tritiumbehandlet (tritiated) tymidin ble tilsatt i løpet av kulturens siste 16 timer. Kulturene ble høstet på glassfiberfiltre og tellet på et væske-scintillasjonsspektrofometer. Resultatene av disse analyser er angitt i tabell 3. For studies of Tc cell reactivity to purified HCMV antigens, X-irradiated autologous mononuclear cells were added as a source of antigen-presenting cells in a 3-day restimulation culture. One uCi per well of tritiated thymidine was added during the last 16 hours of the culture. The cultures were harvested on glass fiber filters and counted on a liquid scintillation spectrophotometer. The results of these analyzes are shown in table 3.
De data som er angitt i tabell 3 viser at alle 17 kloner var reaktive for helt Towne-HCMV-antigen og oppviste fra 4108 tellinger pr. minutt til 121.030 tellinger pr. minutt. Disse resultater antyder at den eller de immunodominerende determinanter som gjenkjennes av disse HCMV-T^-kloner uttrykkes ved strukturelle proteiner og/eller glykoproteiner fra virionet. The data set out in Table 3 show that all 17 clones were reactive for the entire Towne-HCMV antigen and showed from 4108 counts per minute to 121,030 counts per minute. These results suggest that the immunodominant determinant(s) recognized by these HCMV-T^ clones are expressed by structural proteins and/or glycoproteins of the virion.
Alle kloner reagerte også i betydelig grad på Triton X-100 ekstrakter av Towne-HCMV, skjønt i mindre grad enn overfor hele Towne-viruspartikler. Således virker det som om mesteparten av Tft-klonene enten gjenkjenner primært proteiner eller glykoproteiner som er inkludert inne i viruskappen eller proteiner som assosierer i tilstrekkelig grad med viruskappen til at de gjenkjennes i detergentekstraktet. De lavere responser sammenliknet med helt Towne-antigen kan gjenspeile inhibitoriske virkninger av resterende detergent eller et tap av immunogenisitet som skyldes strukturelle forandringer som et resultat av ekstraksjonsfrem-gangsmåten. All clones also reacted significantly to Triton X-100 extracts of Towne-HCMV, although to a lesser extent than to whole Towne virus particles. Thus, it seems that most of the Tft clones either primarily recognize proteins or glycoproteins that are included inside the virus envelope or proteins that associate sufficiently with the virus envelope to be recognized in the detergent extract. The lower responses compared to whole Towne antigen may reflect inhibitory effects of residual detergent or a loss of immunogenicity due to structural changes as a result of the extraction procedure.
Det er også interessant at alle T^-kloner også oppviste en lav, men signifikant formeringsrespons overfor utfellinger av virusantigen etter detergentekstråksjon. Skjønt det er sannsynlig at noen resterende kappeglykoproteiner og tegumentproteiner er inkludert inne i bunnfallet, er det også mulig at nukleocapsidproteiner, It is also interesting that all T^ clones also showed a low but significant proliferation response to precipitation of viral antigen after detergent extraction. Although it is likely that some residual envelope glycoproteins and tegument proteins are included within the precipitate, it is also possible that nucleocapsid proteins,
som øyensynlig omfatter det dominerende protein i bunnfallet,which apparently comprises the dominant protein in the precipitate,
også kan uttrykke antigeniske determinanter som gjenkjennes av T-hj elperceller. can also express antigenic determinants that are recognized by T-helper cells.
T-celleklonene ble deretter stimulert med rensede glykoproteinkomplekser som ble oppnådd ved anionveksling-HPLC-fraksjonering av uredusert detergentekstrakt av helt HCMV-antigen (se eksempel I (1) ) • The T cell clones were then stimulated with purified glycoprotein complexes obtained by anion exchange HPLC fractionation of unreduced detergent extract of whole HCMV antigen (see Example I (1) ) •
Som angitt hos B. Kari et al., J. Viroloav. 60, 345 (1986) og i tabell 1 ovenfor, inkluderer glykoproteinkomplekser som inneholdes inne i topper 2UR og 4UR et glykoproteinkompleks som gjenkjennes av et monoklonalt antistoff (9E10)\Dette antistoff er kryssreaktivt med forskjellige andre vira og er istand til å nøytralisere HCMV i fravær av komplement. I motsetning til dette isoleres en separat og avgrenset gruppe glykoproteinkomplekser med en høy renhetsgrad i topp 3UR og gjenkjennes av en separat klasse monoklonale antistoffer som reagerer unikt med HCMV og nøytraliserer HCMV effektivt bare i nærvær av komplement. As stated in B. Kari et al., J. Viroloav. 60, 345 (1986) and in Table 1 above, glycoprotein complexes contained within peaks 2UR and 4UR include a glycoprotein complex recognized by a monoclonal antibody (9E10) This antibody is cross-reactive with various other viruses and is capable of neutralizing HCMV in absence of complement. In contrast, a separate and defined group of glycoprotein complexes is isolated with a high degree of purity in peak 3UR and recognized by a separate class of monoclonal antibodies that react uniquely with HCMV and effectively neutralize HCMV only in the presence of complement.
Etter reduksjonen har de viktigste glykoproteiner som fås fra 3UR-komplekset molekylvekter på 130.000, 90.000 og 50.000-52.000 kD, de to glykoproteiner som fås fra 2UR/4UR-komplekset gjenkjent av det 9E10 monoklonale antistoff har molekylvekter på 93.000 og 50.000-52.000 kD. Et tredje glykoprotein er blitt påvist i topp 2UR, som er forskjellig fra de glykoproteiner som gjenkjennes av det 9E10 monoklonale antistoff. Derfor er der minst tre viktige glykoproteinkomplekser som inneholdes i HCMV-kappen som er blitt identifisert som utgjørende mer enn 9 5% av de samlede glykoproteine inne i HCMV-viruskappen. Da disse HPLC-metoder synes å gi glykoproteinkomplekser med >9 5% renhet, var det av interesse å vise mønsteret for Tn-reaktivitet overfor disse individuelle glykoproteinkomplekser. After the reduction, the most important glycoproteins obtained from the 3UR complex have molecular weights of 130,000, 90,000 and 50,000-52,000 kD, the two glycoproteins obtained from the 2UR/4UR complex recognized by the 9E10 monoclonal antibody have molecular weights of 93,000 and 50,000-52,000 kD. A third glycoprotein has been detected in peak 2UR, which is different from the glycoproteins recognized by the 9E10 monoclonal antibody. Therefore, there are at least three important glycoprotein complexes contained in the HCMV envelope that have been identified as constituting more than 95% of the total glycoproteins within the HCMV viral envelope. As these HPLC methods appear to yield glycoprotein complexes of >95% purity, it was of interest to show the pattern of Tn reactivity towards these individual glycoprotein complexes.
Som vist i tabell 3, av de 17 T^-kloner som ble testet for reaktivitet med HPLC-rensede glykoproteinkomplekser, reagerte to på topper 3UR og 4UR, men ikke på topp 2UR. En tredje T^-klon reagerte på alle tre HPLC-topper. Det er sannsynlig at disse kloner primært reagerer på det viktigste glykoproteinkompleks som også gjenkjennes av monoklonale antistoffer.som påviser glykoproteinkomplekset hovedsakelig isolert i topp 3UR. Det er sannsynlig at den avtagende del av topp 3UR, idet den overgår til topp 4UR, svarer for den tilsynelatende kryssreaktivitet. Denne spesifisitet ble bekreftet for Th-klon WRC-T3#3, WRC-T2#41 og WRC-L10, som formerte seg spesifikt overfor glykopeptid gpA produsert ved m-RNA-translasjon av pgA-genet in vitro (data ikke angitt). As shown in Table 3, of the 17 T₂ clones tested for reactivity with HPLC-purified glycoprotein complexes, two reacted to peaks 3UR and 4UR, but not to peak 2UR. A third T^ clone reacted to all three HPLC peaks. It is likely that these clones primarily react to the main glycoprotein complex which is also recognized by monoclonal antibodies, which detect the glycoprotein complex mainly isolated in peak 3UR. It is likely that the decreasing part of peak 3UR, as it transitions to peak 4UR, accounts for the apparent cross-reactivity. This specificity was confirmed for Th clones WRC-T3#3, WRC-T2#41 and WRC-L10, which propagated specifically against glycopeptide gpA produced by m-RNA translation of the pgA gene in vitro (data not shown).
Av særlig interesse er det at mesteparten av klonene (14/17) ikke synes å gjenkjenne determinanter uttrykt ved noen av de viktigste kappeglykoprotein-komplekser som representert ved materialer 2UR, 3UR og 4UR. Således kan den immunodominante HCMV-antigeniske determinant som gjenkjennes av disse klonede T-hjelperceller ligge enten i et ikke-glykosylert membranprotein eller i et internt protein. Hvis dette er tilfelle kan det være det samme som for influensaviruset, hvor antistoffgjenkjennelse omfatter primært overflateglykoproteinene (dvs. hemagglutinin), mens cytotoksiske T-lymfocytter er kjent for å gjenkjenne primært interne nukleocapsidproteiner. Of particular interest is that the majority of clones (14/17) do not appear to recognize determinants expressed by any of the major envelope glycoprotein complexes as represented by materials 2UR, 3UR and 4UR. Thus, the immunodominant HCMV antigenic determinant recognized by these cloned T helper cells may reside either in a non-glycosylated membrane protein or in an internal protein. If this is the case, it may be the same as for the influenza virus, where antibody recognition involves primarily the surface glycoproteins (ie, hemagglutinin), while cytotoxic T lymphocytes are known to recognize primarily internal nucleocapsid proteins.
Tabell 4 angir data med hensyn til spesifisiteten av HCMV-spesifikk Tft-kloner som er reaktive med individuelle HCMV-(glyko)proteiner. Kloner ble dannet ved opprinnelig stimulering av MNCer fra seropositiv giver-WRC med helt HCMV-antigen for å velge for Th-reaktive med strukturelle proteiner og glykoproteiner av HCMV. Table 4 provides data regarding the specificity of HCMV-specific Tft clones reactive with individual HCMV (glyco)proteins. Clones were generated by initial stimulation of MNCs from seropositive donor WRC with whole HCMV antigen to select for Th-reactive with structural proteins and glycoproteins of HCMV.
18% av de Tn-kloner som ble testet var spesifikke for gpA som beskrevet i detalj i eksempel 1.1. Representative eksempler omfatte WRCT3#3 og WRCT2#41. 33% av de HCMV-spesifikke Tn-kloner funnet å være reaktive med helt virus såvel som et delvis renset matriksprotein med molekylvekt på 64.000 dalton. Dette protein ble oppnådd ved revers fase HPLC og gelfiltrering i henhold til en modifikasjon av fremgangsmåten ifølge B.R. Clark, J. Virol., 49, 279 (1984). Helt Towne-HCMV oppnådd ved sentrifugering av supernatanten av de HCMV-infiserte fibroblaster ble oppløseliggjort i 6 M guanidinium-klorid og kjørt på revers fase HPLC med en C-18 kolonne. Proteiner som adsorberte til kolonnen ble eluert med acetonitril og påvist ved måling av kolonneutløpsstrømmen ved 214 nm. Topper som ble samlet opp ble slått sammen, og 64 kD-proteinet ble identifisert ved SDS-PAGE. 18% of the Tn clones tested were specific for gpA as detailed in Example 1.1. Representative examples include WRCT3#3 and WRCT2#41. 33% of the HCMV-specific Tn clones were found to be reactive with whole virus as well as a partially purified matrix protein with a molecular weight of 64,000 daltons. This protein was obtained by reverse phase HPLC and gel filtration according to a modification of the method according to B.R. Clark, J. Virol., 49, 279 (1984). Whole Towne-HCMV obtained by centrifugation of the supernatant of the HCMV-infected fibroblasts was solubilized in 6 M guanidinium chloride and run on reverse phase HPLC with a C-18 column. Proteins adsorbed to the column were eluted with acetonitrile and detected by measuring the column outlet current at 214 nm. Peaks collected were pooled, and the 64 kD protein was identified by SDS-PAGE.
64 kD-proteinet ble ytterligere renset fra sameluerte proteiner ved størrelseeksklusjonskromatografi ved anvendelse av TSK 4000 The 64 kD protein was further purified from co-eluted proteins by size exclusion chromatography using TSK 4000
og TSK 3000 SEC-kolonner koblet i serie. En aggregert form av 64 kD-proteinet ble isolert som bestemt ved SDS-PAGE ved bruk av denne fremgangsmåte. and TSK 3000 SEC columns connected in series. An aggregated form of the 64 kD protein was isolated as determined by SDS-PAGE using this method.
Kloner WRC-T2/88 og WRC-T2/131 er representative for HCMV-spesifikk T^-kloner som formerte seg som respons på 64 kD-matriksproteinet. Det er interessant at mange av klonene (dvs. WRC-L33 og WRC-L42) var ikke-reaktive med enten det viktige kappeglykoprotein gpA eller det rikelig forekommende 64 kD interne matriksprotein. Sålede er det tydelig at HCMV-spesifikke T-hjelperceller eksisterer for en rekke forskjellige strukturelle HCMV-proteiner. Clones WRC-T2/88 and WRC-T2/131 are representative of HCMV-specific T^ clones that proliferated in response to the 64 kD matrix protein. Interestingly, many of the clones (ie, WRC-L33 and WRC-L42) were non-reactive with either the important envelope glycoprotein gpA or the abundant 64 kD internal matrix protein. Thus, it is clear that HCMV-specific T helper cells exist for a number of different structural HCMV proteins.
EKSEMPEL IVEXAMPLE IV
Cytotoksiske responser av HCMV- spesifikke Tc- linier og - kloner overfor HCMV- antigener Cytotoxic responses of HCMV-specific Tc lines and clones to HCMV antigens
Polyklonale og monoklonale Tc-celler ble analysert for cytotoksi-sitet overfor NK-målcellen, K562; og autologe eller allogene fibroblaster infisert med HCMV, HSV eller influensavirus. De følgende spesifikke metodologier ble anvendt: Polyclonal and monoclonal Tc cells were assayed for cytotoxicity against the NK target cell, K562; and autologous or allogeneic fibroblasts infected with HCMV, HSV, or influenza virus. The following specific methodologies were used:
A. Preparering av målcellerA. Preparation of target cells
1. HCMV- inf iserte menneskehud- fibroblaster ( SF)1. HCMV-infected human skin fibroblasts (SF)
Humane diploide hudfibroblaster (SF) ble oppnådd fra husbiopsier hos voksne givere og forhuden fra nyfødte. Celler ble ført i passasje minst 6 ganger og frosset ved en hastighet på 1°C pr. minutt i Dulbeccos modifi-serte Eagle Medium (DMEM) inneholdende 10% serum fra kalvefoster (FCS) og 10% dimetylsulfoksid (DMSO) og lagret i flytende nitrogen. Før anvendelse ble cellene tint i et 37°C vannbad, vasket med medium og podet på 25 cm<2>'s vevskulturkolber. SF ble dyrket til konfluens, infisert med HCMV ved en infeksjonsmangfoldighet på 0,2 og inkubert inntil 70-90% av monolaget oppviste cytopatis virkning. Celler ble deretter merket med Na2CrC>4 (375 uCi i 2 ml medium) over natten ved 37°C i en atmosfære på 5% CO2. Cellene ble vasket tre ganger og resuspendert iRPMI i 10% FCS. Uinfiserte<51>CR-merkedeSFer ble brukt som sammenligningsprøver. Human diploid skin fibroblasts (SF) were obtained from core biopsies of adult donors and the foreskin of newborns. Cells were passaged at least 6 times and frozen at a rate of 1°C per minute in Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) containing 10% fetal calf serum (FCS) and 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) and stored in liquid nitrogen. Before use, the cells were thawed in a 37°C water bath, washed with medium and seeded onto 25 cm<2>'s tissue culture flasks. SF were grown to confluence, infected with HCMV at a multiplicity of infection of 0.2 and incubated until 70-90% of the monolayer exhibited cytopathic effect. Cells were then labeled with Na 2 CrC> 4 (375 uCi in 2 ml medium) overnight at 37°C in an atmosphere of 5% CO 2 . The cells were washed three times and resuspended in RPMI in 10% FCS. Uninfected<51>CR-labeled SFs were used as control samples.
2. HSV- og influensainfiserte hudfibroblaster2. HSV- and influenza-infected skin fibroblasts
Et SF-monolag i en 25 cm<2>'s kolbe ble infisert med HSV eller influensa med en infeksjonsmangfoldighet på 5-10 og inkubert over natten. Cellene ble merket på samme måte som HCMV-infisert SF. A SF monolayer in a 25 cm<2> flask was infected with HSV or influenza at a multiplicity of infection of 5-10 and incubated overnight. The cells were labeled in the same way as HCMV-infected SF.
3. K562 3. K562
Erytroleukemicellelinje K562 ble benyttet som en kilde for målceller for å måle NK-aktivitet. K562-celler (1 x 10^) ble suspendert i 1 ml medium og 375 uCi av Na2CrC>4 i en 25 cm<21>s kolbe over natten ved 37°C i et atmosfære av 5% CC>2. Cellene ble resuspendert i RPMI supplert med 10% FCS etter tre vaskinger. Erythroleukemia cell line K562 was used as a source of target cells to measure NK activity. K562 cells (1 x 10^) were suspended in 1 ml of medium and 375 uCi of Na2CrC>4 in a 25 cm<21>s flask overnight at 37°C in an atmosphere of 5% CC>2. The cells were resuspended in RPMI supplemented with 10% FCS after three washes.
4. SF som selektivt uttrykker I- E HCMV- proteiner4. SF that selectively express I-E HCMV proteins
SFer ble infisert med HCMV ved en infeksjonsmangfoldighet på 5-10 i tre timer i nærvær av cykloheksamid (15 ug/ml). Etter fjerning av cykloheksamid ble Actinomycin-D (5 ug/ml) og Na2Cr04(375 uCi) satt til kulturen. Cellene ble deretter vasket tre ganger og resuspendert i RPMI i 10% FCS som målceller. Den cytotoksiske måling ble utført under Actinomycin-D for å hindre DNA-transkrip sjon. Uinfiserte SFer behandlet med cykloheksamid og Actinomycin-D i parallell ble brukt som sammenlignings-prøver. SFer were infected with HCMV at a multiplicity of infection of 5-10 for three hours in the presence of cyclohexamide (15 µg/ml). After removal of cyclohexamide, Actinomycin-D (5 µg/ml) and Na 2 CrO 4 (375 µCi) were added to the culture. The cells were then washed three times and resuspended in RPMI in 10% FCS as target cells. The cytotoxic measurement was performed under Actinomycin-D to prevent DNA transcription. Uninfected SFs treated with cyclohexamide and Actinomycin-D in parallel were used as comparison samples.
B. CvtotoksisitetsmålingB. Cvtotoxicity measurement
Tre tusen målceller i 100 ul ble satt til hver brønn av V-bunnede mikrotiterplater. Fortynninger i serier av effektorceller i 100 ul ble deretter satt til målcellene for å gi et forhold mellom effektorceller og målceller på 50:1, 25:1 og 12:1. Platene ble sentrifugert ved 50 g i 5 minutter ved 37°C i et atmosfære av 5% CO2i 10 timer. 100 ul supernatanter ble høstet og tellet i en gammateller (Beckmann Gamma 9000). Sammenligningsprøvene besto av maksimal lyse og spontan frigjøring som ble oppnådd ved tilset-ning av 100 pl Triton-X-100 i medium resp. målceller. Beregninger er utført i henhold til følgende formel: Three thousand target cells in 100 µl were added to each well of V-bottomed microtiter plates. Serial dilutions of effector cells in 100 µl were then added to the target cells to give a ratio of effector cells to target cells of 50:1, 25:1 and 12:1. The plates were centrifuged at 50 g for 5 minutes at 37°C in an atmosphere of 5% CO 2 for 10 hours. 100 µl supernatants were harvested and counted in a gamma counter (Beckmann Gamma 9000). The comparison samples consisted of maximum lysis and spontaneous release which was achieved by adding 100 µl of Triton-X-100 in medium or target cells. Calculations are carried out according to the following formula:
Eksperimentelle tellinger pr. minutt representerte celler fra brønner med effektorceller. Experimental counts per minute represented cells from wells with effector cells.
Resultatene ble uttrykt som den midlere verdi av brønner i triplika eller kvadruplikat. Spontan frigjøring fra både infiserte og uinfiserte SF-målceller var mindre enn 40%. The results were expressed as the mean value of wells in triplicate or quadruplicate. Spontaneous release from both infected and uninfected SF target cells was less than 40%.
1. Cytotoksisk aktivitet av HCMV- spesifikke pol<y>klonale Tc-cellelinier stimulert med Towne- HCMV- infiserte autologe 1. Cytotoxic activity of HCMV-specific pol<y>clonal Tc cell lines stimulated with Towne HCMV-infected autologous
hudfibroblaster ( SF)skin fibroblasts (SF)
Mononukleære celler fra seropositiv giver SP-CN ble stimulert i 7-10 dager i massekultur med autologe hudfibroblaster (SF) infisert i 20 timer med Towne HCMV. T-celleblaster ble restimulert ukentlig med HCMV-infiserte fibroblaster, autologe bestrålte MNC som mateceller og IL-2. Resulterende polyklonale CD8+ T-cellelinjer ble evaluert for cytotoksisk aktivitet overfor uinfiserte og HCMV- infiserte autologe fibroblaster og NK-målcellelinjen K562. Resultatene i denne undersøkelsen er angitt i tabell 5. Mononuclear cells from seropositive donor SP-CN were stimulated for 7-10 days in mass culture with autologous skin fibroblasts (SF) infected for 20 hours with Towne HCMV. T-cell blasts were restimulated weekly with HCMV-infected fibroblasts, autologous irradiated MNC as feeder cells, and IL-2. Resulting polyclonal CD8+ T cell lines were evaluated for cytotoxic activity against uninfected and HCMV-infected autologous fibroblasts and the NK target cell line K562. The results of this survey are shown in table 5.
Som det kan ses fra dataene angitt i tabell 5 oppviste begge cellelinjer cytolytisk aktivitet overfor autologe fibroblaster infisert i 20 timer med HCMV, idet de uttrykte mellomliggende-tidlig og sene virusproteiner og overfor CMV-infiserte autologe fibroblaster som var blitt behandlet med cykloheksamid (CH) og Actinomycin-D (act. D) for selektiv uttrykkelse av de mellomliggende-tidlige proteiner av HCMV. Begge linjer uttrykker også signifikante nivåer av NK-lignende cytotoksisk aktivitet. As can be seen from the data presented in Table 5, both cell lines exhibited cytolytic activity against autologous fibroblasts infected for 20 hours with HCMV, expressing intermediate-early and late viral proteins and against CMV-infected autologous fibroblasts that had been treated with cyclohexamide (CH) and Actinomycin-D (act. D) for selective expression of the intermediate-early proteins of HCMV. Both lines also express significant levels of NK-like cytotoxic activity.
2. Cytotoksisk aktivitet av HCMV- spesifikke Tc- cellelinier oa kloner stimulert med sakkarosearadient/ rensede Towne- HCMV-viruspartikler 2. Cytotoxic activity of HCMV-specific Tc cell lines, including clones stimulated with sucrose radient/purified Towne HCMV virus particles
CD8+ Tc-cellelinjer og -kloner ble oppnådd fra seropositiv giver SP-RK ved opprinnelig stimulering av MNC med sakkarosegradient-rensede Towne-HCMV-viruspartikler, fulgt av gjentatt stimulering med HCMV-viruspartikler, autologt bestrålt MNC som mateceller og IL-2. Tre CD8+-linjer og klonen CD8+ SP-RK #3 lyserte HCMV-infisert autologe fibroblaster, men ikke allogene umatchete HCMV-infiserte fibroblaster eller autologe fibroblaster infisert med enten HSV eller influensavirus som vist i tabell 6. CD8+ Tc cell lines and clones were obtained from seropositive donor SP-RK by initial stimulation of MNC with sucrose gradient-purified Towne-HCMV virus particles, followed by repeated stimulation with HCMV virus particles, autologously irradiated MNC as feeder cells and IL-2. Three CD8+ lines and clone CD8+ SP-RK #3 lysed HCMV-infected autologous fibroblasts, but not allogeneic mismatched HCMV-infected fibroblasts or autologous fibroblasts infected with either HSV or influenza virus as shown in Table 6.
Disse linjer uttrykte liten cytotoksisk aktivitet overfor K562-NK-målceller. Således er disse T-cellelinjer og -klon karakteris-tiske for HCMV-spesifikke MNC-klasse-I LA-restrikerte T-cytotoksiske celler som gjenkjenner ett eller flere antigener som uttrykke av helt virusantigen (dvs. strukturelle proteiner. These lines expressed little cytotoxic activity against K562-NK target cells. Thus, these T-cell lines and clones are characteristic of HCMV-specific MNC class-I LA-restricted T-cytotoxic cells that recognize one or more antigens that express whole virus antigens (ie, structural proteins.
EKSEMPEL V EXAMPLE V
Forsterkning av antigenindusert formering av HCMV- spesifikke Tn-kloner ved bruk av polvklonalt antiserum fra seropositive givere og HCMV- spesifikke monoklonale antistoffer Enhancement of antigen-induced proliferation of HCMV-specific Tn clones using polyclonal antiserum from seropositive donors and HCMV-specific monoclonal antibodies
1. Monoklonalt antistoff1. Monoclonal antibody
HCMV-Th-klon WRC-T3#3 ble benyttet ved en konsentrasjon på 1,5 x IO<4>celler pr. brønn som en kilde til responderceller. Autologt røntgenbestrålt MNC (10^) ble tilsatt som en kilde til antigenpresenterende celler. En optimal fortynning av hele HCMV-antigen eller 0,1 ug/ml av HPLC-renset 3UR ble tilsatt som en kilde til HCMV-spesifikk antigenstimulering. Fortynninger i rekkefølge av monoklonale antistoffer 41C2, som gjenkjenner det immundominerende glykoprotein A (gpA) eller et sammenlignings-monoklonalt antistoff 35F10, som gjenkjenner et ikke-glykosylert protein betegnet protein D ble tilsatt ved konsentrasjoner i området fra 10 ned til 0,01 ug/ml protein pr. brønn. Resultatene av dette forsøk er angitt i tabell 7. HCMV-Th clone WRC-T3#3 was used at a concentration of 1.5 x 10<4> cells per well as a source of responder cells. Autologous X-irradiated MNC (10^) were added as a source of antigen presenting cells. An optimal dilution of whole HCMV antigen or 0.1 µg/ml of HPLC-purified 3UR was added as a source of HCMV-specific antigen stimulation. Serial dilutions of monoclonal antibody 41C2, which recognizes the immunodominant glycoprotein A (gpA) or a control monoclonal antibody 35F10, which recognizes a non-glycosylated protein designated protein D were added at concentrations ranging from 10 down to 0.01 µg/ ml of protein per well. The results of this experiment are set out in Table 7.
Dataene angitt i tabell 7 viser at monoklonalt antistoff 41C2 i betydelig grad forsterket den formerende respons av Tn-klonen når 3UR eller helt HCMV-antigen ble benyttet for antigenisk stimulering. I motsetning til dette ble ingen betydelig forsterkning observert med det monoklonale antistoff rettet mot protein D ved bruk av enten 3UR eller helt HCMV-antigen. The data presented in Table 7 show that monoclonal antibody 41C2 significantly enhanced the proliferative response of the Tn clone when 3UR or whole HCMV antigen was used for antigenic stimulation. In contrast, no significant enhancement was observed with the monoclonal antibody directed against protein D using either 3UR or whole HCMV antigen.
Således virker det som om monoklonale antistoffer rettet mot et immunogenisk glykoproteinkompleks som spesielt stimulerer en bestem Tft-klon er virksom når det gjelder å forbedre den formerende respons. Thus, it appears that monoclonal antibodies directed against an immunogenic glycoprotein complex that specifically stimulates a particular Tft clone are effective in enhancing the proliferative response.
Seks HCMV-T^-kloner som har vist seg å reagere på helt HCMV-antigen ble deretter stimulert med helt HCMV-antigen pluss fortynninger i rekkefølge av enten monoklonalt antistoff 41C2 (til gpA) eller monoklonalt antistoff 35F10 (til protein D). Seropositive og seronegative hele sera ble også testet under de samme betingelser. Resultatene av disse eksperimenter er angitt i tabell 8. Six HCMV-T^ clones shown to respond to whole HCMV antigen were then stimulated with whole HCMV antigen plus serial dilutions of either monoclonal antibody 41C2 (to gpA) or monoclonal antibody 35F10 (to protein D). Seropositive and seronegative whole sera were also tested under the same conditions. The results of these experiments are shown in Table 8.
Det var overraskende at monoklonalt antistoff 41C2, rettet mot gpA, forsterket den formerende respons av alle seks T^-kloner overfor helt HCMV-antigen til tross for det faktum at bare 3 av de 6 kloner reagerte på HPLC-renset gpA i fravær av antistoff (se tabell 7). Det monoklonale antistoff rettet mot protein D forsterke ikke responsen av noen av de kloner som ble testet. Helt serum fra den seropositive giver forsterket responsen av alle kloner, mens det fra den seronegative giver ikke gjorde det. Disse data antyder at forsterkningsmekanismen ikke nødvendigvis involverer en direkte interaksjon mellom antistoffet og det spesifikke virus-protein eller glykoprotein som gjenkjennes at T^-klonen. It was surprising that monoclonal antibody 41C2, directed against gpA, enhanced the proliferative response of all six T^ clones to whole HCMV antigen despite the fact that only 3 of the 6 clones reacted to HPLC-purified gpA in the absence of antibody (see table 7). The monoclonal antibody directed against protein D did not enhance the response of any of the clones tested. Whole serum from the seropositive donor enhanced the response of all clones, whereas that from the seronegative donor did not. These data suggest that the enhancement mechanism does not necessarily involve a direct interaction between the antibody and the specific viral protein or glycoprotein recognized by the T₂ clone.
EKSEMPEL VIEXAMPLE VI
Presentasjon av HCMV- antigen for T- hielpercellekloner ved MNC,Presentation of HCMV antigen to T helper cell clones by MNC,
LCL eller blandinger deravLCL or mixtures thereof
1.Epstein- Barr virus- transformert ( EBV- transformert) lvmfo-blastoidcellelinier ( LCL) 1.Epstein-Barr virus-transformed (EBV-transformed) lvmfo-blastoid cell lines (LCL)
En autolog LCL fra seropositiv giver SP-CN (SP-CN LCL) ble opprettet ved fremgangsmåten ifølge Sugden og Mark, J. Virology, 23, 503 (1977) og dyrket i RPMI 1640-medium (GIBCO, Grand Island, NY), supplert med 10% varmeinaktivert kalve-fosterserum (FCS). AMG LCL (DR 2,2/D2 2,2) og NHS LCL (DR 3,8) var gaver fra Dr. F. Bach {IRC, University of Minnesota, Minneapolis, MN). An autologous LCL from seropositive donor SP-CN (SP-CN LCL) was created by the method of Sugden and Mark, J. Virology, 23, 503 (1977) and cultured in RPMI 1640 medium (GIBCO, Grand Island, NY), supplemented with 10% heat-inactivated fetal calf serum (FCS). AMG LCL (DR 2.2/D2 2.2) and NHS LCL (DR 3.8) were gifts from Dr. F. Bach {IRC, University of Minnesota, Minneapolis, MN).
2. Dannelse av HCMV- spesifikke T- cellekloner2. Generation of HCMV-specific T cell clones
HCMV-spesifikke T-cellekloner ble dannet fra en seropositiv giver (SP-CN). Kort sagt ble mononukleære celler (MNC) dyrket ved 10^ celler pr. ml i■RPMI 1640-medium supplert med 15% varmeinaktivert HCMV-seronegativt humant serum (PHS) og 1 ug/ml helt HCMV-antigen. Etter 7-10 dager ble T-celleblaster isolert og klonet ved begrensende fortynning ved 0,3 celler pr. brønn i rund-bunnede brønner inneholdende 0,2 ml RPMI/15% PHS-medium med 10.000 autologe røntgenbestrålte (5000 R) MNC, 1 ug/ml helt HCMV-antigen (Towne-stamme) og 15% IL-2 (TCGF, Biotest, Frankfurt, Vest-Tyskland). Platings-virkningsgrader på 2-12% ble observert. Klonene ble ekspandert i dyrkingsmedium inneholdende 10-20% IL-2 og restimulert med autolog røntgenbestrålt MNC/LCL-blanding og 1 ug/ml helt HCMV-antigen hver 1-2 uker. HCMV-specific T-cell clones were generated from a seropositive donor (SP-CN). Briefly, mononuclear cells (MNC) were cultured at 10^ cells per ml in RPMI 1640 medium supplemented with 15% heat-inactivated HCMV seronegative human serum (PHS) and 1 µg/ml whole HCMV antigen. After 7-10 days, T-cell blasts were isolated and cloned by limiting dilution at 0.3 cells per well in round-bottomed wells containing 0.2 ml RPMI/15% PHS medium with 10,000 autologous X-irradiated (5000 R) MNC, 1 µg/ml whole HCMV antigen (Towne strain) and 15% IL-2 (TCGF, Biotest, Frankfurt, West Germany). Plating efficiencies of 2-12% were observed. The clones were expanded in culture medium containing 10-20% IL-2 and restimulated with autologous X-rayed MNC/LCL mixture and 1 µg/ml whole HCMV antigen every 1-2 weeks.
3. Formerinasanalvse3. Formerinasanalvse
HCMV-spesifikke klonede Tn-celler ble analysert 7-14 dager etter restimulering. Mikrokulturene ble anordnet i rund-bunned plater (Flow Lab., Inc., VA) med et samlet volum på 0,2 ml pr. brønn inneholdende 10<4>HCMV-spesifikke T^-celler, forskjellige konsentrasjoner av røntgenbestrålt analogt MNC og/eller LCL og helt HCMV-antigen (Towne-stamme) eller HSV-antigen. Kulturene ble inkubert i 3 dager, og 1 uCi pr. brønn<3>H-tymidin (New England Nuclear, Boston, MA) ble satt til hver brønn for de siste 16-24 timer av dyrkingen. Brønnene ble høstet med en automatisk cellehøster, cellene oppsamlet på glassfiber-filterpapir og radioaktivitet målt i et Beckman 5 801 væske-scintillasj onsspektrometer. HCMV-specific cloned Tn cells were analyzed 7-14 days after restimulation. The microcultures were arranged in round-bottom plates (Flow Lab., Inc., VA) with a total volume of 0.2 ml per well containing 10<4>HCMV-specific T^ cells, various concentrations of X-irradiated analog MNC and/or LCL and whole HCMV antigen (Towne strain) or HSV antigen. The cultures were incubated for 3 days, and 1 uCi per well<3>H-thymidine (New England Nuclear, Boston, MA) was added to each well for the last 16-24 hours of cultivation. The wells were harvested with an automatic cell harvester, the cells collected on glass fiber filter paper and radioactivity measured in a Beckman 5801 liquid scintillation spectrometer.
4.LCL presenterer HCMV- antigen for HCMV- spesifikke T^- kloner Et panel av HCMV-spesifikke T^-kloner dannet fra en seropositiv giver (SP-CN) ble testet for HCMV-spesifikk formerende aktivitet ved bruk av enten røntgenbestrålt autologtMNC(IO<5>pr. brønn) eller røntgenbestrålt autologt LCL (10<4>- 3 x 10<4>pr. brønn) som APC. HSV-antigen var inkludert som en antigenspesifikk kontrollprøve. Tabell 9 viser resultatene som ble oppnådd ved bruk av syv kloner. 4.LCL presents HCMV antigen to HCMV-specific T^ clones A panel of HCMV-specific T^ clones generated from a seropositive donor (SP-CN) was tested for HCMV-specific proliferative activity using either X-irradiated autologous MNC( IO<5>per well) or x-rayed autologous LCL (10<4>- 3 x 10<4>per well) as APC. HSV antigen was included as an antigen-specific control sample. Table 9 shows the results obtained using seven clones.
Alle de T^-kloner som er angitt i tabell 9 formerte seg godt som respons på HCMV-antigen, men ikke HSV-antigen når MNC ble satt til kulturene som APC. Graden av formering varierte fra 8.114 til 68.307 cmp. De fleste av disse kloner oppviste også HCMV-angiten spesifikk formerende responser når LCL ble benyttet som APC med et område fra 1.020 til 21.370. Kloner SP-CN/T2-131 og SP-CN/T5-43 formerte seg godt overfor HCMV i nærvær av bestrålt autologt MNC, men dårlig i nærvær av All of the T₂ clones listed in Table 9 proliferated well in response to HCMV antigen but not HSV antigen when MNC were added to the cultures as APC. The degree of multiplication varied from 8,114 to 68,307 cmp. Most of these clones also showed HCMV antigen-specific proliferative responses when LCL was used as APC with a range from 1,020 to 21,370. Clones SP-CN/T2-131 and SP-CN/T5-43 proliferated well against HCMV in the presence of irradiated autologous MNC, but poorly in the presence of
autologt LCL.autologous LCL.
På den annen side formerte kloner SP-CN/T3-16 og SP-CN/T3-9 seg godt overfor HCMV i nærvær av bestrålt autologt LCL, skjønt deres formering overfor HCMV i nærvær av bestålt MNC var ikke noe bedre enn for de andre fem kloner. Således er der ingen tilsynelatende korrelasjon mellom formeringsrespons overfor HCMV ved bruk av MNC som APC og den som oppnås ved bruk av LCL som APC. Det er velkjent at antigenspesifikke T-hjelperceller (T--celler) gjenkjenner antigen assosiert med klasse II-MHC-produkter på overflaten av APC-(P. Erb et al., J. Exper. On the other hand, clones SP-CN/T3-16 and SP-CN/T3-9 proliferated well against HCMV in the presence of irradiated autologous LCL, although their proliferation against HCMV in the presence of cultured MNC was no better than that of the others five clones. Thus, there is no apparent correlation between the proliferation response to HCMV using MNC as APC and that obtained using LCL as APC. It is well known that antigen-specific T helper cells (T- cells) recognize antigen associated with class II MHC products on the surface of APC-(P. Erb et al., J. Exper.
Med., 142, 460 (1975)). Oppfinnerne undersøkte MHC-restrik-sjonen av noen av disse T^-kloner ved bruk av LCL som APC og fant at alle klonene testet er klasse II-restrikert. LCL fra andre MHC klasse II-matchete givere presenterte også HCMV-antigen godt overfor de to høytreagerende kloner (SP-CN/T3-16 og SP-CN/T3-9), men dårlig overfor de fem lavtreagerende kloner. F.eks. presenterte CP-CN LCL (autologt, DR2, 4/DW/2,4) samt AMG LCL (DR2,2/DW2,2) HCMV-antigen overfor klonen SP-CN/T3-9, mens NHB LCL (DR3,8) ikke presenterte HCMV for den samme klon. Med., 142, 460 (1975)). The inventors examined the MHC restriction of some of these T₂ clones using LCL as APC and found that all clones tested are class II restricted. LCLs from other MHC class II-matched donors also presented HCMV antigen well to the two high-reacting clones (SP-CN/T3-16 and SP-CN/T3-9), but poorly to the five low-reacting clones. E.g. presented CP-CN LCL (autologous, DR2, 4/DW/2,4) as well as AMG LCL (DR2,2/DW2,2) HCMV antigen against clone SP-CN/T3-9, while NHB LCL (DR3,8 ) did not present HCMV for the same clone.
5. Forsterkende virkning av LCL på formerende responser av T-celler overfor MNC og HCMV 5. Enhancing effect of LCL on proliferative responses of T cells to MNC and HCMV
På grunn av begrensede forsyninger av autologt MNC som APC for å stimulere HCMV-spesifikke T^-celler og ineffektiv antigenpresentasjon ved autologt LCL når det anvendes alene, ble kombinasjoner av MNC og LCL anvendt som APC og mateceller i løpet av reaktivering av T^-klonene. Kombinasjonen av LCL og MNC oppviste overraskende en synergistisk effekt på formerende respons, som vist i tabell 10. Due to limited supplies of autologous MNC as APC to stimulate HCMV-specific T^ cells and ineffective antigen presentation by autologous LCL when used alone, combinations of MNC and LCL were used as APC and feeder cells during reactivation of T^- the clones. The combination of LCL and MNC surprisingly showed a synergistic effect on proliferative response, as shown in Table 10.
LCL alene som APC i et-,område på 10<4->10<5>LCL pr. brønn stimulerte ikke noen betydelig T-celleformerende respons overfor helt HCMV-antigen over bakgrunnen. Tilsetningen av LCL ved 10<4>LCL pr. brønn og 3 x 10<4>LCLpr. brønn forsterket imidlertid 3 dagers formeringsresponsen av T^-celler overfor MNC pluss helt HCMV i betydelig grad, skjønt IO<5>LCL pr. brønn syntes å undertrykke formerings-responsene, sannsynligvis på grunn av for stor celletetthet i kulturen. LCL alone as APC in an area of 10<4->10<5>LCL per well did not stimulate any significant T-cell proliferative response to whole HCMV antigen above background. The addition of LCL at 10<4>LCL per well and 3 x 10<4>LCLpr. well, however, significantly enhanced the 3-day proliferation response of T^ cells to MNC plus whole HCMV, although IO<5>LCL per well appeared to suppress the proliferation responses, probably due to excessive cell density in the culture.
De samme kulturer ble ekspandert i nærvær av 15% IL-2 i 12 dager, og celletellinger ble utført på dag 7 og dag 12 etter begynnelse av dyrkingen. Resultatene av disse forsøk er angitt i tabell 11. Som vist i tabell 11, når ikke noe MNC forelå, ble ikke Tn-celler ekspandert selv når både LCL og helt HCMV-antigen ble satt til kulturen. En kombinasjon av MNC og helt HCMV-antigen førte til en økning på 3-43 ganger i T-celle-antall i løpet av 12 dagers dyrking avhengig av mengden MNC som var involvert. Når LCL ble tilsatt sammen med MNC og HCMV-antigen, ble en økning i celleantall på 29-620 ganger observert over det samme tidsrom under de samme vevskulturbetingelser, hvilket klart indikerer at LCL forsterket ekspansjonen av aktiverte Tn-celler. The same cultures were expanded in the presence of 15% IL-2 for 12 days, and cell counts were performed on day 7 and day 12 after initiation of culture. The results of these experiments are set forth in Table 11. As shown in Table 11, when no MNC was present, Tn cells were not expanded even when both LCL and whole HCMV antigen were added to the culture. A combination of MNC and whole HCMV antigen led to a 3-43 fold increase in T-cell numbers over 12 days of culture depending on the amount of MNC involved. When LCL was added together with MNC and HCMV antigen, a 29-620-fold increase in cell number was observed over the same time period under the same tissue culture conditions, clearly indicating that LCL enhanced the expansion of activated Tn cells.
Porsjoner av disse kulturer ble platet i 96-brønners flatbunnede mikrotiterplater på dag 7 ved 0,2 ml pr. brønn i triplikat. Etter pulsing over natten med [^Hj-tymidin ble en lignende virkning av LCL på celleformering observert som målt ved inkorporert [%]-tymidin som angitt i tabell 12. Portions of these cultures were plated in 96-well flat-bottomed microtiter plates on day 7 at 0.2 ml per well. well in triplicate. After overnight pulsing with [^Hj-thymidine, a similar effect of LCL on cell proliferation was observed as measured by incorporated [%]-thymidine as indicated in Table 12.
Disse resultater bekreftet gjennomførbarheten av å benytte både MNC og LCL som mateceller sammen med antigen i aktivering og ekspansjon av T^-kloner. Utstrekningen av T^-celleekspansjon er proporsjonal med konsentrasjonen av MNC<IRR>i området fra 10<4->10<5>MNC pr. brønn, men ikke proporsjonal med konsentrasjonen av LCL<IRR>. De optimale forhold mellom LCL og klonede T^-celler ligger i område fra 1:1 til 3:1. These results confirmed the feasibility of using both MNC and LCL as feeder cells together with antigen in the activation and expansion of T^ clones. The extent of T^ cell expansion is proportional to the concentration of MNC<IRR> in the range from 10<4->10<5>MNC per well, but not proportional to the concentration of LCL<IRR>. The optimal ratios between LCL and cloned T₂ cells range from 1:1 to 3:1.
Prøver av antigenpresenterende LCL-cellelinjer SP-CN/T3-43 (aksesjonskode: IVI-10122), og SP-CN/T5-43 (aksesjonskode: IVI-10123) Samples of antigen-presenting LCL cell lines SP-CN/T3-43 (accession code: IVI-10122), and SP-CN/T5-43 (accession code: IVI-10123)
er også blitt deponert hos In Vitro International, Linthicum, MD,has also been deposited with In Vitro International, Linthicum, MD,
i henhold til the Draft PTO Deposit Policy for biologiske materialer, BNA PTCJ, 32, 90 (1986) . according to the Draft PTO Deposit Policy for Biological Materials, BNA PTCJ, 32, 90 (1986).
Kulturer av disse deponerte cellelinjer vil gjøres tilgjengelige for offentligheten ved utstedelse av et patent basert på den foreliggende søknad. Det skal forstås at tilgjengeligheten av deponeringen ikke utgjør en lisens til å utøve oppfinnelsens gjenstand som opphevelse av de patentrettigheter som meddeles av forente staters regjering. Skjønt visse representasjoner av utførelsesformer som her er beskrevet med det formål å illustrere oppfinnelsen, skal det forstå av fagfolk at modifikasjoner kan utføres uten å avvike fra oppfinnelsens omfang og ånd. Cultures of these deposited cell lines will be made available to the public by issuing a patent based on the present application. It is to be understood that the availability of the deposit does not constitute a license to practice the subject invention as a waiver of the patent rights granted by the United States Government. Although certain representations of embodiments are described herein for the purpose of illustrating the invention, it should be understood by those skilled in the art that modifications may be made without departing from the scope and spirit of the invention.
En takk rettes mot Children's Hospital, St. Paul, Minnesota, for generøs støtte og bistand i dette arbeid. Thanks are extended to Children's Hospital, St. Paul, Minnesota, for generous support and assistance in this work.
Claims (48)
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US2457187A | 1987-03-11 | 1987-03-11 | |
PCT/US1988/000383 WO1988007077A1 (en) | 1987-03-11 | 1988-02-09 | Method for the generation of antigen-specific t cell lines and therapeutic use thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO885016D0 NO885016D0 (en) | 1988-11-10 |
NO885016L true NO885016L (en) | 1989-01-11 |
Family
ID=26698602
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO88885016A NO885016L (en) | 1987-03-11 | 1988-11-10 | PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF ANTIGEN-SPECIFIC T-CELL LINES AND THERAPEUTIC APPLICATION OF THESE. |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
DK (1) | DK628088A (en) |
NO (1) | NO885016L (en) |
-
1988
- 1988-11-10 DK DK628088A patent/DK628088A/en not_active Application Discontinuation
- 1988-11-10 NO NO88885016A patent/NO885016L/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK628088A (en) | 1989-01-11 |
NO885016D0 (en) | 1988-11-10 |
DK628088D0 (en) | 1988-11-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20220251509A1 (en) | Platform for activation and expansion of virus-specific t-cells | |
KR100235849B1 (en) | Peptide capable of inducing immune response against hiv and aids preventive or remedy containing the peptide | |
Amrolia et al. | Selective depletion of donor alloreactive T cells without loss of antiviral or antileukemic responses | |
Gottschalk et al. | Adoptive T-cell immunotherapy | |
Nikiforow et al. | Cytolytic CD4+-T-cell clones reactive to EBNA1 inhibit Epstein-Barr virus-induced B-cell proliferation | |
CN110997903B (en) | Method of activating T cells for cancer treatment | |
AU2015343239B2 (en) | Methods of selecting T cell line and donor thereof for adoptive cellular therapy | |
Engers et al. | Inhibition of T cell-mediated functions by MVM (i), a parvovirus closely related to minute virus of mice. | |
Riddell et al. | Cytotoxic T cells specific for cytomegalovirus: a potential therapy for immunocompromised patients | |
Regn et al. | Ex vivo generation of cytotoxic T lymphocytes specific for one or two distinct viruses for the prophylaxis of patients receiving an allogeneic bone marrow transplant | |
WO1988007077A1 (en) | Method for the generation of antigen-specific t cell lines and therapeutic use thereof | |
JP2004512039A (en) | Immunoreactive peptide CTL epitope of human cytomegalovirus PP150 | |
Kurane et al. | Characterization with monoclonal antibodies of human lymphocytes active in natural killing and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity of dengue virus-infected cells. | |
Yasukawa et al. | Rotavirus induces proliferative response and augments non‐specific cytotoxic activity of lymphocytes in humans | |
KR20230104844A (en) | A Method for activating T cells to treat cancer | |
Jalili et al. | Virus-specific T cells: promising adoptive T cell therapy against infectious diseases following hematopoietic stem cell transplantation | |
Kishimoto et al. | Protection against murine coxsackievirus B3 myocarditis by T cell vaccination | |
NO885016L (en) | PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF ANTIGEN-SPECIFIC T-CELL LINES AND THERAPEUTIC APPLICATION OF THESE. | |
Foster et al. | Rapid, large-scale generation of highly pure cytomegalovirus-specific cytotoxic T cells for adoptive immunotherapy | |
CA2562892A1 (en) | Bob-1 specific t cells and methods to use | |
Rutella et al. | Strategies to harness immunity against infectious pathogens after haploidentical stem cell transplantation | |
Einsele | Immunotherapy for CMV infection | |
Yasukawa et al. | HLA-restricted T lymphocyte-mediated cytotoxicity against herpes simplex virus-infected cells in humans | |
Vaz-Santiago et al. | IE1-pp65 recombinant protein from human CMV combined with a nanoparticulate carrier, SMBV, as a potential source for the development of anti-human CMV adoptive immunotherapy | |
Golub et al. | Stimulation of lymphocytes in vitro to reactions against cultured Burkitt’s lymphoma cells |