NO882299L - Fremgangsmaate for magnetisk separering av merket reagens i en immunometrisk bindings-analyse. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører spesifikke Mndingsanalyser som krever separasjon av frie og bundede former av et merket reagens for bestemmelse av en analytt i et væsketestmedium. Foreliggende oppfinnelse vedrører spesielt homogene immunanalyser som benytter reagenspartikler for separasjon av de frie formene av et merket reagens av de bundede formene av et merket reagens.

Forskjellige heterogene spesifikke bindingsanalyser er blitt utviklet som generelt innbefatter spesifikk bindingsinterak-sjoner i en reaksjonsblanding mellom analytten som skal detekteres, en spesifikk bindingspartner for analytten og et merket reagens som kan være den samme eller forskjellig fra bindingspartneren for analytten. Når man utfører slike analyser, blir det merkede reagenset bundet til dets korresponderende bindingspartner for å danne en bundet form av de merkede reagenser, hvorpå det merkede reagenset som ikke er slik bundet utgjør de frie formene, hvori grad av binding er en funksjon av mengden av analytt som er tilstede. På grunn av at den detekterbare responsen til det merkede reagenset ikke kan skjelnes mellom de bundede og frie formene, er det dermed nødvendig å fysisk separere slike bundede og frie former fra hverandre for å effektivt bestemme mengden av analytt som er tilstede. Når de bundede og frie formene til det merkede reagenset er blitt separert fra hverandre, blir mengden av markør som er tilstede i begge fraksjonene bestemt ved måling av aktiviteten til den bestemte markøren til det merkede reagenset og korrelering av slik aktivitet til mengden av analytt som er tilstede.

Slik separasjon utføres vanligvis ved anvendelse av bestemte faste fasereagensstoffer som har evnen til å bindes til de frie formene for å kunne fysisk separere de frie formene fra de bundede formene, men som til tross for dette krever innviklede og ofte uhensiktsmessig manipulerende trinn for å utføre en slik separasjon. US-patent nr. 4.200.436 beskriver for eksempel en immunanalyse som anvender en immobilisert form av et antigen som skal bli målt og som blir satt til en immunanalysereaksjonsblanding for binding til de frie formene av det merkede reagens. For å separere de frie formene som er bundet til det immobiliserte antigenet fra de bundede formene, må reaksjonsblandingen derimot bli sentrifugert for å tilveiebringe en slik separasjon. Når -reaksjonsblandingen er blitt sentrifugert, må enten en aliquot bli tilveiebragt fra supernatanten, eller så må supernatanten bli fjernet, for å måle markøren til de bundede formene som er inne i supernatanten, eller markøren til de sedimenterte frie formene, respektivt.

Selv om forskjellige metoder som ikke krever et sentrifugeringstrinn er blitt beskrevet, krever slike metoder til tross for dette enda arbeidskrevende manipulerende trinn for å kunne måle markøren i enten de frie formene eller de bundede formene til det merkede reagens. For eksempel, beskriver US-patent nr. 4.628.036 væskebindingsanalyser utført f.eks. i et reagensrør, ved anvendelse av magnetiske partikler hvorpå et antigen eller antistoff er immobilisert til og har evnen til å bli bundet til de frie formene til et merket reagens som beskrevet ovenfor. De frie formene som er bundet til de magnetiske partiklene blir magnetisk separert med, for eksempel, en permanent magnet som blir holdt ved bunnen av reagensrøret, for å tiltrekke og dermed separere de bundede partiklene. Selv om et sentrifugeringstrinn ikke er nødvendig for å tilveiebringe separasjonen av de frie formene fra de bundede formene, er det til tross for dette nødvendig å tilveiebringe en aliquot av supernatanten eller å fjerne supernatanten for å måle markøren i en av formene som beskrevet ovenfor.

Forskjellige metoder er videre blitt beskrevet som anvender en kromatografisk testanordning, som, sammen med anvendelse av fast fasereagensmateriale, tilveiebringer separasjonen av de bundede og frie formene til et merket reagens uten et sentrifugeringstrinn. Europa-patentsøknad publikasjon nr.

120.602 beskriver for eksempel et analysesystem som anvender et merket reagens som delvis er tilstede 1 en form som er mobil på et valgt kromatografisk medium og som delvis er i en form som er immobil. Et antistoff til analytten blir festet eller immobilisert til et partikulat fast fasemateriale som er immobil på det valgte kromatografiske mediumet og som bindes til prøveanalytten. En merket form av antistoffet til analytten blir anvendt og som bindes til ledige bindingsseter til prøveanalytten bundet til det immobiliserte antistoff. Merket antistoff som ikke er bundet på denne måten, migrerer bort fra appliseringspunktet på det kromatografiske mediumet ved å anvende et oppløsningsmiddel dertil, hvorved mengden av markør til det immobile merkede antistoffet bundet til fast fasemateriale eller det frie merkede antistoffet blir målt og relatert til mengden av analytt i prøven.

Europa-patentsøknad publikasjon nr. 120.602, beskriver videre separasjonen av agglutinerte partikler fra ikke-agglutinerte partikler ved et analysesystem som anvender latekspartikler som det partikulate faste fasemateriale. Avhengig av hvilket spesielle immunanalyseformat som blir anvendt, f. eks. konkurrerende immunanalyse eller sandwich-immunanalyse agglutinerer latekspartiklene i fravær eller nærvær, respektivt, av analytt, hvorved de agglutinerte partiklene blir separert fra ikke-agglutinerte partikler på et valgt kromatografisk medium hvorpå den første er immobil og den siste er mobil, og mengden av markør til det merkede reagenset til den ene eller den andre blir målt.

Konsentrasjonen til de_ agglutinerte partiklene som skal bli målt på en sugende matrise er også beskrevet i Europa-patentsøknad publikasjon nr. 135.324, som tilveiebringer et observerbart signal i relasjon til konsentrasjonen til partiklene på matrisen. I nærvær av analytt, kan de anvendte partiklene bli forhindret fra migrering eller bli latt migrere, og tilstedeværelse av et detekterbart signal ved et bestemt eller konsentrert sted på matrisen, kan bli relatert til tilstedeværelse av analytten. Konsentrering av partiklene blir oppnådd ved tilveiebringing av spesifikke bindingsledd som broer mellom partiklene. For eksempel, i en analyse for et hapten, blir haptenet koblet til farvede kuler, som, individuelt, er mobile på matrisen, og immobile når de blir agglutinert. Prøvehaptenet blir reagert med antistoffer dertil, og deretter reagert med., kulene for binding til tilgjengelige bindingsseter til haptenet på kulene hvori, f.eks., i fravær av prøvehapten, oppstår det en vesentlig mengde bloddannelse mellom kulene på grunn av antistoffene, dvs. agglutinasjon. Ved kontakt med matrisen, blir en konsentrering av agglutinerte kuler, som blir indikert ved farven på kulen, observert i fravær av hapten som et resultat av immobiliteten derav på matrisen, mens i nærvær av hapten, er det ikke noe agglutinasjon og derfor ingen konsentrering av kuler og ikke noen observerbar farve. For bestemmelse av antigen, blir kuler merket med antistoffer til antigenet og med enzymer inkubert med prøveantigenet hvori broer blir dannet mellom kulene ved at antigen bindes til antistoffene til kulene. Tilstedeværelse av antigen resulterer i agglutinasjon av kulene som beskrevet ovenfor, og matrisen blir kontaktet med substrat for enzymet og en hensiktsmessig indikat forbindelse, for å indikere tilstedeværelse av enzym bundet til antigen-agglutinerte kuler tilbakeholdt av matrisen ved konsentreringsstedet.

En fremgangsmåte for deteksjon og bestemmelse av konsentrasjonen til prøveanalytt ved agglutinasjon eller agglutina-sjonsinhibering er beskrevet i tysk utleggsskrift nr. 3.511.012. Metoden anvender en partikkel som innbefatter minst en komponent av et bioaffinitetsbindingssystem, f.eks., antigen eller antistoff, og minst en komponent av et signalproduserende system, f.eks. et enzym, som blir anvendt i en agglutinasjon eller agglutinasjonsinhiberingsanalyse som nevnt ovenfor og som er kjent innenfor fagområdet. Separasjon av agglutinerte og ikke-agglutinerte partikler blir utført på en testanordning innbefattende en applikasjonssone, en reaksjonssone, en separasjonssone og en detekteringssone. Partiklene blir inkorporert inn i reakskjonssonen eller applisert dertil før eller samtidig med applisering av prøveantistoffer eller antigener til applikasjonssonen. Tilstedeværelse av prøveantistoff eller antigen produserer eller forhindrer agglutinasjon av partiklene, respektivt. Separasjonen blir tilveiebragt av separasjonssonen som er permeabel for de uagglutinerte partiklene men impermeabel for agglutinerte partikler. Deteksjonssonen er inkorporert med en annen komponent av det signaldannende systemet, f.eks. et substrat for enzymet, hvorved enzymmarkøren til de uagglutinerte partiklene som migrerer deri reagerer med substratet for å tilveiebringe et signal som er korrolert til mengden av prøveantigen eller antistoff.

En av ulempene ved å utføre slik konkurrerende og to-sted sandwich-analyser hvor det merkede reagens som er bundet til det faste fasestoffet blir målt, er nødvendigheten av å fjerne alt merket reagens som ikke er slik bundet, som hvis tilstede, ville resultere i et interfererende bakgrunnssignal og redusere analysefølsomheten. Når man utfører slike immunoanalyser som benytter en testanordning for separasjon av bundede og frie former av et merket reagens, er det nødvendig med et vasketrinn i tillegg, hvor man benytter en vaskeoppløsning for å forårsake at det mobile merkede reagenset reagerer bort fra det immobile merkede reagensste-det. Der hvor et enzym blir benyttet som markør for det merkede reagenset, vil et oppløselig enzymsubstrat inkorporert i anordningen være oppløst og bli vasket bort av vaskeoppløsningen, og dermed ville derfor kreve enten et tilleggstrinn Innbefattende benytting av en enzymsubstrat-oppløsning etter vaskeoppløsningen, eller inkorporering av enzymsubstratet inn i vaskeoppløsningen.

Der hvor de mobile formene av det merkede reagenset i stedet blir målt i henhold til slike konkurrerende og sandwich-immunoanalyseformater, krever den nøyaktige målingen at mengde merket reagens benyttet i immunanalysen blir nøye kontrollert. En slik mengde i overskudd er begrenset av nødvendigheten av å ha et signal i et målbart område. Slik måling vil også resultere i dose respons som har et høyt bakgrunnssignal i fravær av analytten.

I et konkurrerende immunanalyseformat er mengden av antistoff som er immobilisert til det faste fasestoffet også kritisk for utførelsen av immunanalysen, doserespons er ikke lineær over et vidt område av analyttkonsentrasjon, og vanskelig å lineærisere innenfor et mindre område og krever utvidede inkubasjonsperioder.

Slike fremgangsmåter som er avhengig av agglutinasjon av partikler for separasjon av bundede og frie former av et merket reagens, trenger aggregater av bare noen få partikler for å bli separert fra monodisperse partikler, hvor forskjel-len i størrelsen derav er av en størrelsesorden eller mindre. Valg av kromatografisk matrise må være nøye overveiet slik at den sjeldner mellom agglutinerte partikler fra ikke-agglutinerte partikler. Slike metoder krever også at partiklene forblir monodisperse før utførelsen av den bestemte analysen, og likeledes i løpet av utførelsen av en immunanalyse i fravær av analytt. Agglutinering av slike partikler kan derimot oppstå for eksempel i løpet av lagring eller i nærvær av biologiske fluider.

Selv om Europa-patent-søknad, publikasjon nr. 120.602 foreslår bruk av magnetisk anvendbare former av det merkede antistoffet som kan bli gjort immobilt i testanordningen, beskrevet deri med et magnetisk felt, de førnevnte ulempene vil til tross for dette oppstå, uansett på hvilken måte det bestemte faste fasematerialet blir forhindret fra migrering derigjennom.

Det er derfor en hensikt med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en hensiktsmessig metode for rask separering og detektering av den bundede formen til et merket reagens på en kromatografisk testanordning som ikke krevet et vasketrinn eller andre vanskelige manipulative trinn som er beskrevet ovenfor.

Det er videre en hensikt med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en effektiv metode for separering av de bundede formene av et merket reagens til destinkte, målbare former derav.

En annen hensikt med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en metode for spesifikk bindingsanalysebestemmelse av analytt på en kromatografisk testanordning som ikke krever andre reagenser eller fremkallingsoppløsninger for å tilveiebringe et detekterbart signal.

En annen hensiskt med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en metode for spesifikk bindingsanalysebestemmelse av analytt på en kromatografisk testanordning som tilveiebringer et detekterbart signal som resulterer i en lineær doserespons med lite eller ikke noe interfererende bakgrunnssignal.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for magnetisk separering av de bundede og frie formene av et merket reagens i en immunometrisk bindingsanalyse som anvender et magentisk mottagelig reagenspartlkkel innbefattende analytten eller en bindingsanalog derav immobilisert til en uoppløselig, paramagnetisk partikkel, og et merket reagens innbefattende en spesifikk bindingspartner for analytten merket med en detekterbar kjemisk gruppe. Væsketestmediumet inneholdende analytten, merket reagens, og magnetisk mottagelig reagenspartlkkel, blir samtidig eller sekvensielt kombinert, fortrinnsvis sekvensielt, for å danne en vannholdig væskereaksjonsblanding hvorpå det merkede reagens bundet til analytten for å danne den bundede formen, og magnetisk mottagelig reagenspartlkkel er tilstede i overskudd i forhold til det som kan bindes til vesentlig alle fire formene av det merkede reagenset som ikke bindes til analytten.

Den frie formen av det merkede reagens bundet til den magnetisk mottagelige reagenspartlkkel blir magnetisk separert fra den bundede formen på en kromatografisk separering og deteksjonstestanordning innbefattende en fast, porøs matrise som har evnen til transportering av vannholdige væsker ved den kapillære virkningen og som innbefatter en separeringssone og en detekteringssone som er beliggende i en forutbestemt avstand bort fra og i væsketransportkontakt med separeringssonen. Separeringen og detekteringssonene er fysisk distinkte deler som kan være beliggende langs lengden av en forlenget strimmel, bestående av et enkelt, kontinuerlig, fast, porøst matrisemateriale eller så kan de fysisk distinkte delene som innberfatter separering og detek-teringsonene være sammensatt av fysisk distinkt fast, porøs matrisematerialer beliggende langs lengden av den forlengede strimmelen.

Ved utføring av metoden ifølge foreliggende oppfinnelse, blir en aliquot av reaksjonsblandingen applisert på separeringssonen til testanordningen og et magnetisk felt blir påført, hvorved den magnetisk mottagelige reagenspartikkelen som har den frie formen av det merkede reagens immobilisert til seg blir magnetisk holdt tilbake og som dermed blir forhindret fra migrering ut av separeringssonen. Siden den faste porøse matrisen tilveiebringer et kromatografisk medium for uhindret migrering av den bundede formen derigjennom, blir den bundede formen av det merkede reagenset transportert av væsketestmediumet fra separeringssonen og inn i detekteringssonen. Den detekterbare kjemiske gruppen til den bundede formen i detekteringssonen, blir deretter målt og korrelert til mengden av analytt som er tilstede i testmediumet.

Siden fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse ikke krever et vasketrinn for å forårsake at den bundede formen migrerer fra separeringssonen og inn i detekteringssonen, er det ikke flere trinn nødvendig for å tilveiebringe separering derav når aliquoten i reaksjonsblandingen blir applisert i separeringssonen.

Separering av den bundede formen fra den immobiliserte frie formen til det merkede reagenset begynner vesentlig samtidig med den opprinnelige dannelsen av det detekterbare signalet i detekteringssonen uten flere manipulerende eller mekaniske trinn. Kontrollert separering og detektering av den bundede formen av det merkede reagens i løpet av en vesentlig tidsperiode er dermed tilveiebragt.

På grunn av at den immunometriske analysemetoden som blir benyttet i henhold til foreliggende oppfinnelse ikke krever et vasketrinn for å fjerne overskudd og/eller uspesifisert bundet merket reagens, kan en oppløselig form av en detek-ter ingsmiddelkomponent for markøren til det merkede reagens, slik som et substrat for en enzymmarkør, bli inkorporert inn i testanordningen. Fig. 1 er et perspektivt bilde av en magnet beliggende under en testanordning i henhold til foreliggende oppfinnelse innbefattende en separeringssone og detekteringssone som er beliggende ved fysisk bestemte deler langs lengden av en forlenget strimmel. Fig. 2 er et perspektivt bilde av en magnet beliggende under en testanordning i henhold til foreliggende oppfinnelse innbefattende en separeringssone og detekteringssone bestående av fysisk distinkte matrisematerialer i væsketransportkontakt beliggende langs lengden av en forlenget strimmel.

Magnetisk separerring av bundet og fri form av et merket reagens på en kromatografisk testanaordning i henhold til foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en hensiktsmessig metode for immunometrisk bestemmelse av analytt i et væsketestmedium uten at vanskelige manipulerende trinn er nødvendig, så som sentrifugering, sedimentering, dekantering o.l. Ved utførelse av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, blir den vannholdige væskereaksjonsblandingen først dannet innbefattende væsketestmediumet, det merkede reagens og den magnetisk mottagelige reagenspartikkelen. Reaksjonsblandingen ble deretter applisert i separeringssonen til separering og detekteringstestanordningen og et magnetisk felt blir påført. Dermed blir den magnetisk mottagelige reagenspartikkelen som har den frie formen av det merkede reagenset immobilisert til seg magnetisk holdt tilbake i separeringssonen og forhindret fra migrering inn i detekteringssonen mens, på samme tid, tillater kapillær transport av den bundede formen ut av separeringssonen og inn i detekteringssonen for å tilveiebringe slik separering.

Det magnetiske feltet kan bli tilført prepareringssonen i henhold til kjente metoder innenfor fagområdet, så som en permanent magnet eller elektrisk indusert med en elektromagnet beliggende under separeringssonen (se fig. 1 og 2). Det magnetiske feltet blir fortrinnsvis tilført før eller samtidig med applisering av reaksjonsblandingen til separeringssonen for å forhindre noen vesentlig migrering av magnetisk mottagelig reagensfortykker ved kontakt dertil. Selv om det magnetiske feltet kan bli påført etter applisering av reaksjonsblandingen til separeringssonen, må separer-ingssonematrisen da ha evnen til å forhindre vesentlig migrering av den magnetisk mottagelige reagenspartikkelen før påføring av det magnetiske feltet derpå.

I henhold til foreliggende oppfinnelse er den magnetisk mottagelige reagenspartikkelen tilstede i en mengde i overskudd av det som kan bindes til alle.frie formene av det merkede reagenset som ikke blir bundet til analytten fra testmediumet. Mengden av magnetisk mottagelig reagenspartlkkel som er i overskudd slik at en tilstrekkelig mengde er tilstede for å binde vesentlig alle frie former av det merkede reagenset for maksimal immobilisering og separering av vesentlig alle de frie former fra bundede former.

Merket reagens er fortrinnsvis også tilstede i overskudd relativt til den beregnede mengde eller konsentrasjon av antatt analytt i testmediumet. En slik overskuddsmengde tilveiebringer et tilstrekkelig antall spesifikke bind-ingspartnere for den antatte analytten i testmediumet slik at vesentlig alt antatt analytt blir bundet av merket reagens. Det er en fordel at siden overskudd merket reagens bindes og gjør at vesentlig all antatt analytt i testmediumet blir detekterbart, kan en nøyaktig og veldig sensitiv bestemmelse av analytten bli utført.

Anvendelse av reagenser i overskudd som er beskrevet ovenfor, resulterer i fordelaktige kinetiske og/eller likevektsfor-deler. Overskudd av reagenser aksellererer kinetikken til bindingsreaksjonene og skifter likevekten til reaksjonen for å begunstige dannelsen av bundet form, selv ved lave analyttkonsentrasjoner, hvorved det begrensende reagens i analysen blir selve analytten. Dermed, siden analysereagensene er i overskudd, er effekten av variasjoner i disse kon-sentrasjonene på analyseutførelsen mindre signifikant enn, for eksempel, det som oppstår i en konvensjonell konkurrerende immunoassay-format, og en feilmargin i reagenstilset-ningene er dermed tillatt når de i hvertfall gjøres i overskuddsmengder.

Ved å skifte likevekten som beskrevet ovenfor, blir det også mulig å maksimalisere mengden av analytt bundet av merket reagens og dermed optimalisere sensitiviteten til analysen. Når enkel antistoffimmunometrisk fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse blir benyttet, forårsaker tilstede værelse av uspesifikk binding ikke et bakgrunnssignal som ellers ville redusere sensitiviteten til analysen, slik som oppstår ved konvensjonell sandwich-immunanalyser hvor to antistoffbindingsreaksjoner er involvert og hvori markøren bundet til et fast fasemateriale eller reagensparikkel blir målt. Enkel antistoffimmunometrisk fremgangsmåte tillater også å bli anvendt for detektering av analytter som har en enkelt epitope, hvilket ikke er mulig i en sandwich immunoanalyse. Hvor monoklonale monovalente antistoffer blir anvendt i overskudd i en analyse, sammen med andre analyse-reagenser i overskudd, blir produksjonen av en lineær doseresponskurve som letter anvendelsen av et slikt analyse-format til en hensiktsmessig kalibreringsfremgangsmåte tilveiebragt.

Det bør være klart at selv om de førnevnte analysereagensene kan bli kombinert samtidig for å danne reaksjonsblandingen som beskrevet ovenfor, kombineres analysereagensene fortrinnsvis sekvensielt for å danne reaksjonsblandingen. En første reaksjonsblanding innbefattende testmediumet inneholdende analytten om merket reagens blir dannet og inkubert i en forutbestemt tidsperiode som er tilstrekkelige for å tillate binding av alt analytt fra testmediumet til merket reagens. Første reaksjonsblanding blir deretter kombinert med de magnetisk mottagelige reagenspartiklene for dannelsen av en andre reaksjonsblanding og inkubert i en forutbestemt tidsperiode for å tillate binding av alle frie formene til merket reagens til de magnetisk mottagelige reagenspartiklene.

Reagenspartlkkel

Magnetisk mottagelig responspartikkel som blir benyttet i metoden ifølge foreliggende oppfinnelse, innbefatter et vannuoppløselig magnetisk mottagelig partikkulatmaterlale som reagerer på et magnetisk felt uten resulterende permanent magnetisering, heretter referert til som "paramagnetisk" eller "paramagnetisme". Slik paramagnetisk adferd utvises vanligvis av Jernoksyder med en krystallstørrelse som er mindre enn omtrent 300 Å, mens jernoksyder som har en krystallstørrelse som er større enn omtrent 500 Å erkarakterisert veden reaksjon til et magnetisk felt som resulterer i permanent magnetisering. Fordelene ved anvending av magnetisk mottagelige reagenspartikler, innbefattende et paramagnetisk partikulatmateriale som tidligere beskrevet er at de kan bli utsatt for magnetiske felt, uten å bli permanent magnetiserte, som ville ha resultert i uønsket magnetisk aggregering derav ved utførelsen av en immunanalyse.

Slike magnetisk mottagelige reagenspartikler innbefatter hvilke som helst paramagnetiske materialer som har en krystallstørrelse mindre enn omtrent 300 Å og som analytten som skal bestemmes eller en bindingsanalog derav, har evnen til å bli bundet kovalent, ikke-kovalent bundet (f.eks. fysisk absorpsjon), eller på annen måte immobilisert dertil. Slike paramagnetiske materialer innbefatter, men er ikke ment å være begrensende til, overgangsmetaller så som jern, nik-kel, magnesium, mangan, kobolt, zink, kobber, titan o.l.; overgangsmetalloksyder og overgangsmetallsalter derav, så som Fe304og ferritt og FeCl2, FeCl3og CoCl2, respektivt; og overgangsmetallegeringene så som Ni-NiO, Ni-T104og Mn-Zn.

Selv om analytten eller bindingsanalogen derav kan bli immobilisert til slike paramagnetiske materialer, er den magnetisk mottagelige reagenspartikkelen fortrinnsvis en magnetisk mottagelig partikkel bestående av en kjerne av slikt paramagnetisk materiale omgitt av et absorberende eller kovalent bundet ytre skall eller belegg. Ytre skall eller belegg kan bli valgt fra mange forskjellige materialer som er kjent innenfor fagområdet, og som er egnede beleggsmaterialer for paramagnetiske materialkjerner og som har evnen til å bli bundet til analytten som skal bli bestemt eller bindings-analoger derav. Sil, for eksempel, som er en silikon- funksjonell silikonforbindelsekarakterisert vedat silikon-delen av molekylet har en affinitet for uorganiske materialer og organofunksjonalitetene derav, kan bli koblet til bio-affinitetsadsorberende midler, kan bli anvendt for slike formål. Andre ytre skall eller beleggsmaterlale innbefatter, men er ikke ment å være begrensende,- polystyren, poly-akrylater, polyakrylamid eller naturlig forekommende materialer slik som polysakkarider, spesielt kryss-bundede polysakkarider, så som agarose, dekstran, mirkokrystallinsk cellulose, stivelse, polyvinyltoluen eller styrenbutadien-aminkopolymerer, polyakroleinmikrosfærer, polyuretan, pollenpartikler, sporopollenin, polystyren eller polyvinyl-naftalenkjerner omgitt av skall av polyclycidyl metakrylat, mikrokrystallinsk cellulose eller kombinasjoner derav, polyvinylalkohol, kopolymerer av hydroksyetylmetakarylat og metylmetakrylat, silikoner og silisiumoksyd, glass, gummi, nylon, infusoriejord, silisiumoksyd o.l.

Slike magnetisk mottagelige partikler er kommersielt tilgjengelige, eller kan bli fremstilt i henhold til kjente fremgangsmåter, så som beskrevet i US-patent nr. 4.335.094 som anvender en polymer som har gitter eller porer hvor et magnetisk materiale er deponert i; US-patent nr. 4.339.337 og 4.358.388 som anvender en magnetisk kjerne omgitt av en vinylaromatisk polymer; US-patent nr. 4.452.773 benytter et kolloidalmagnetisk jernoksyd belagt med et polysakkarid med overhengende funksjonelle grupper for kovalent binding av biologiske molekyler dertil; og US-patent nr. 4.554.088 og 4.628.037 som benytter en metalloksydkjerne vanligvis omgitt av et silanbelegg.

Den største dimensjonen av de magnetisk mottagelige reagenspartiklene som blir anvendt ifølge foreliggende oppfinnelse, er mindre enn 50 mikron, fortrinnsvis fra mellom omtrent 0,1 mikron og 20 mikron, mest foretrukket fra mellom omtrent 0,5 mikron og 3,0 mikron. De magnetisk mottagelige reagenspartiklene er fortrinnsvis ensartede latekspartikler som er dis- pergerbare eller suspenderbare 1 vannholdlg media uten signifikant gravitasjonssetting og derfor har evnen til å forbli i suspensjon i reaksjonsblandingen uten konstant blanding, dvs. vannsuspenderbar. Dermed, gir sammen med Brownian-bevegelse og et høyt overflate til volumforhold, en effektiv og rask bindingskinetikk sikret.

Selv om de magnetisk mottagelige reagenspartiklene generelt er i form av en kule, kan andre konfigurasjoner bli benyttet som kan være kompatible med det som er beskrevet i foreliggende oppfinnelse. Slike konfigurasjoner innbefatter for eksempel staver, fibere, geometriske konfigurasjoner o.l., og uregelmessige konfigurasjoner derav. Der hvor det er ønskelig å kovalent binde analytten eller bindingsanalogen derav til den magnetisk mottagelige reagenspartikkelen, bør partikkelen være polyfunksjonell eller ha evnen til å bli polyfunksjona-lisert med funksjonelle grupper som, for eksempel, kan bli inkorporert i henhold til kovalent koblingsteknikker kjent innenfor fagområdet [se f.eks. Cuatrecasas, J. Biol. Chem. Vol. 245. s. 3059 (1970)]. Funksjonelle grupper innbefatter karboksylsyrer, aldehyder, aminer, amider, aktiverte etylener så som maleimid, hydroksyler, sulfonsyrer, merkaptaner o.l. Kobling av analytter og andre biologiske molekyler til agarose og polyakrylamider er for eksempel beskrevet av W.B. Jacoby og M. Wilchek, Methods in Enzymology, Vol. 34, Academic Press, New York (1974).

Analytten eller bindingsanalogen derav immobilisert til den magnetisk mottagelige reagense partikkel som beskrevet ovenfor, kan bli valgt for bestemmelse av en hvilken som helst analytt, for hvilket det er en bindingsmotpart tilgjengelig. Analytten er vanligvis et peptid, polypeptid, protein, karbohydrat, glykoprotein, steroid, nukleinsyre eller annet organisk molekyl som det eksisterer en bindingsmotpart for eller som kan produsere de biologiske systemer eller bli syntetisert. Analytten,' i funksjonelle betegnelser, blir vanligvis valgt fra gruppen bestående av antigener, haptener, komplementære polynukleotldsekvenser, hormoner, vitaminer, metaboliter og farmakologiske midler. Vanligvis er analytten et immunologisk aktivt polypeptid eller protein, som vanligvis har en molekyvekt på mellom omtrent 1.000 og omtrent 10.000.000, slik som et antigent polypeptid eller protein, eller et hapten som har en molekylvekt på mindre enn omtrent 100, og vanligvis omtrent mindre enn 1.500.

Representative polypeptidanalytter er angiotensin I og II, C-peptid, oksytoksin, vasopressin, neurofysin, gastrin, sektrin, bradykinin og glukagon.

Representative proteinanalytter innbefatter klassene protaminer, mukoproteiner, glykoproteiner, globuliner, albuminer,- skleroproteiner , f osf oproteiner , histoner, 1ipoproteiner, kromoproteiner og nukleoproteiner. Eksempler på spesifikke proteiner er prealbumin, a^-lipoproteiner, human serumalbumin, a^-syreglykoprotein, a^-antitrypsin, a^-glykoprotein, transkortin, tyroksinbindende globulin, haptoglobin, hemoglobin, glykosylerte peptidsekvenser så som glykosylert N-terminal peptidsekvens i beta-subenheten til humant hemoglobin, myoglobulin, ceruloplasmin, c<2-mak-roglobulin, e-1ipoprotein, erytropoietin, transferrin, hemopeksin, fibrinogen, immunoglobul iner så som IgG, IgM,, IgA, IgD og IgE og deres fragmenter, f. eks. Fc og Fat), komplimentfaktorer, prolaktin, blodkoagulerende faktorer så som fibrinogen, trombin osv., insulin, melanotropin, somatotropin, tyrotropin. follikkelstimulerende hormon, leutiniserende hormon,_ gonadotropin, human korinisk gonadotropin, tyroid stimulerende hormon.mplacental laktogen, instrinsisk faktor, transkobalamin, serumenzymer slik som alkalin fosfatase, laktisk dehydrogenase, amylase, lipase, fosfataser, kolinesterase, glumatisk oksaloketisk transaminase, glutamisk pyruvisk transaminase, og uropepsin, endorfiner, enkefaliner, protamin, vevsantigener, bak-terielle antigener, viralantigener så som hepatitt assosierte antigener (f.eks. HbsAg, HBcAg og HBeAg), og svulstmarkører (f.eks. CEA, alfa fetoprotein, prostatisk syrefosfatase, prostatisk spesifikk antigen, neuronspesif ikk enolase, estrogenreseptor, CA125, CA19-9 o.l.)

Representative haptenanalytter innbefatter de generelle klasser av medikamenter, metabolitter, h-ormoner, vitaminer, toksiner og lignende organiske forbindelser. Hapteniske hormoner innbefatter tyroksin og triiodotyronin. Vitaminer innbefatter vitaminene A, B, f.eks. tiamin, B-^g» c»D» E og K og folinsyre. Medikamenter innbefatter antibiotika slik som aminoglykosider, f.eks. gentamicin, tobramycin, amikacin, sisomicin, kanamycin og netilmicin, penicillin, tetracyklin, terramycin, kloromycetin og aktinomycetin; nukleosider og nukleotider så som adenosindifosfat (ADP) adenosin trifosfat (ATP), flavin mononukleotid (FMN), nikotinamid adenindinuk-leotid (NAD) og dets fosfatderivat (NADP), tymidin, guanosin og adenosin; prostaglandiner; steroider så som østrogener, f.eks. estriol og estrafiol, sterogener, androgener, digoksin, digitoksigenin, digitoksin, digoksigenin, 12-0-acetyldigoksigin, og adrenokortikalsteroider; og andre så som fenobarbital , fenytoin, primidon, etosuksimid, karbamazepin, valproat, teofyllin, kaffein, propranolol, prokainamid, guinidin, amitryptilin, kortisol, desipramin, disopyramid, doksepin, doksorubicin, nortryptilin, metotreksat, imipramin, lidokain, prokainamid, N-acetylprokainamid, amfetaminer, katekolaminer og antihistaminer. Toksiner innbefattende acetyl T-2 toksin, alfatoksin, koleratoksin, citrinin, cytokalasiner, stafylokokkal enterotoksin B, HT-2 toksin o.l.

Merket reagens

Merket reagens som blir anvendt i henhold til foreliggende oppfinnelse innbefatter en spesifikk bindingspartner for analytten som skal bestemmes, merket med en detekterbar kjemisk gruppe. Den spesifikke bindingspartner er en som har evnen til binding til enten analytten til vaesketestmediumet eller til analytten eller bindingsanalogen derav, immobilisert til det magnetisk mottagelige reagenspartiklet.

Den spesifikke bindingspartneren for analytten kan være et helt antistoff, så som en hvilken som helst av klassene og subklassene av kjente immunoglobuliner, f.eks. IgG, IgM o.l., eller monovalente og divalente antistoff-fragmenter fra IgG, konvensjonelt kjent som Fab og Fab', og F(ab')2>respektivt. Immunoglobulinkilden for antistoffkomponenten kan bli tilveiebragt på hvilken som helst tilgjengelig måte, så som konvensjonell antiserum og monoklonalteknikker. Antiserum kan bli tilveiebragt ved velkjente teknikker innbefattende immunisering av et dyr, så som en mus, kanin, marsvin eller geit, med et hensiktsmessig immunogen. Immunoglobulinet kan også bli tilveiebragt ved somatiske cellehybreringsteknikker, slike som resulterer i hva som vanligvis blir referert til som monoklonale antistoffer, som også innbefatter bruken av et hensiktsmessig immunogen.

Antistoffet er vanligvis divalent antistoff-fragment [F(ab')2]eller, fortrinnsvis et monovalent antistoff-fragment (Fab eller Fab'). Divalente og monovalente IgG antistoffragmenter kan bli tilveiebragt i henhold til kjente fremgangsmåter, som benytter standard proteolyttisk spal-tingsprosedyrer med pepsin eller papain,. For eksempel, kan divalente antistoff-fragmenter [F(ab')2]bli fremstilt ved spalting av hele IgG antistoffet med pepsin [Nisonoff,. Methods Med. Res., vol. 10, 132 (1964)], og deretter redusere F(ab')2fragmentet til det korresponderende Fab'-fragmentet med ditiotreitol. Alternativt, kan Fab-fragmentene bli tilveiebragt ved papainspalting av IgG [Porter, Biochem, J. , vol. 73, 119(1959)].

Den detekterbare kjemiske gruppen til det merkede reagenset kan være et hvilket som helst stoff som har en detekterbar fysisk eller kjemisk egenskap. Slike stoffer er godt utviklet innen immunanalyser og generelt kan en hvilken som helst markør som er anvendelige i slike metoder bli benyttet i foreliggende oppfinnelse.

Kjemiske grupper som har detekterbare fysiske egenskaper er de gruppene som blir detektert på basis av deres egne fysiske egenskaper og som ikke krever en kjemisk reaksjon eller interaksjon med annet kjemikal eller stoff for å tilveiebringe et detekterbart signal. Slike grupper innbefatter prinsipielt fluoriserende stoffer så - som umbelliferon, fluoreskein, resorufin, forskjellige rodaminer, dansylderiva-ter og aminonaftalensulfonsyre [se Clin. Chem., 25:353

(1979)]; fosforeserende molekyler så som pyren, 4-nitrobiofe-nyl, benzaldehyd, benzofenon eller trivalente metallchelater av dibenzoylmetan (f.eks. Al<+3>, T<+3>); kromoforerer så som para- eller ortonitrofenol, fenolftalein, naftol AS, paranitroanilid og tymolftalein; radioisotoper så som<3>H, 35S, 32P, l2<5>i og<14>C; spinnmarkører innbefattende nitrok-sydrester så som Doxyl, Proksyl og Tempo-derivater; eller elektroaktive bestanddeler så som protoner, fluorid, oksygen, ammoniakk og hydrogenperoksyd.

Kjemiske grupper som har detekterbare kjemiske egenskaper, er slike grupper som blir detektert på basis av deres egen kjemiske reaktivitet eller interaksjon med en detekterende middelkomponent til denne, for å tilveiebringe et detekterbart signal. Slike kjemiske grupper som har detekterbare kjemiske egenskaper danner ikke et detekterbart produkt eller på annen måte tilveiebringer et detekterbart signal før de reagerer med en slik detekteringsmiddelkomponent og innbefatter enzymatisk aktive grupper så som enzymer (se Clin. Chem., 22:1232(1976), US opptrykt pat. 31.006, og U.K. pat. 2.019.308), enzymsubstrater (se British Pat. Spee. 1.548.741 ), koenzymer_ (se US-pat. nr. 4.230.797 og 4.238.565), enzyminhibitorer og aktivatorer, kjemisk luminescensformer, kjemiske katalysatorer, metallkatalysa-torer, medlemmer i enzymveiene, kloroforslukker eller energioverføringspar (se US-pat. nr. 3.996.345; 4.174.384; 4.199,559 og 4.233.401) og spesifikt bindbare ligander så som biotin eller et hapten.

Hvor markøren til det merkede reagenset er en detekterbar kjemisk gruppe med en detekterbar kjemisk egenskap, blir detekteringskomponenten til denne inkorporert inn i detekteringssonen til separering og detektering testanordningen i foreliggende oppfinnelse. En slik detekterbar kjemisk gruppe er fortrinnsvis et enzym, hvorpå det bestemte substratet for den valgte enzymmarkøren blir inkorporert inn i detekteringssonen til testanordningen. Spesielle enzymer som kan bli anvendt innbefatter, men er ikke ment å være begrensende til, 3-D-galaktosidase, peroksydase, glukoseoksydase, alkalinfosfatase, glukose-6-fosfatdehydrogenase , luciferase, pyruvat kinase, laktase dehydrogenase, galaktose oksydase, tyrosinase, invertase, xantanin oksydase, urease, urikase, alkoholoksydase o.l. -Kromatografisk separering og detekteringstestanordning.

Den frie formen til det merkede reagenset immobilisert til den magnetisk mottagelige reagenspartikkelen blir separert magnetisk fra den bundede formen av det merkede reagenset på en kromatografisk separering og detekteringtestanordning innbefattende en fast, porøs matrise som har evnen til transportering av vannholdige væsker ved den kappilære virkningen. Testanordningen er sammensatt av en separeringssone, og en detekteringssone som er beliggende i en bestemt avstand fra og i væsketransportkontakt med separeringssonen. Det vil nedenfor bli beskrevet i større detalj at separeringssonen og detekteringssonen kan være sammensatt av og

i

beliggende langs lengd_en av en enkel, kontinuerlig matrise-material, eller kan være sammensatt av fysisk bestemte matrisematerialer i væskestrømkontakt.

Det faste porøse matrisemateriale er permeabelt til vannholdige væsker og i hvertfall noen komponenter i en væsketestprøve, f.eks. antigener, haptener, antistoffer o.l., og, der hvor det magnetiske feltet blir påført samtidig med applisering av reaksjonsblandingen til separeringssonen, kan den være gjennomtrengelig for den magnetisk mottagelige reagenspartikkelen også. En bør vite at væsketestmediumet inneholdende analytten som skal bestemmes, kan innbefatte en naturlig forekommende eller kunstig dannet væske som antas å inneholde analytt, og er vanligvis en biologisk væske eller en fortynning derav. Slike biologiske væsker innbefatter serum, helt blod, plasma, urin, spytt og amniotiske og cerebrospinale væsker. Seleksjon av et hensiktsmessig matrisemateriale vil dermed 1 de fleste tilfeller også innbefatte en som har evnen til å fjerne cellulære komponenter så som røde blodceller, hvite blodceller, blodplater o.l. fra slike biologiske væsker.

Det faste, porøse matrisematerialet er fortrinnsvis valgt blant forskjellige fiberformede materialer som er kjent innenfor fagområdet og som har evnen til å transportere vannholdige væsker ved kapillærvirkningen. Mest foretrukket er at matrisematerialet bør ha evnen til rask kappillæritet for å transportere den bundede formen av det merkede reagens fra separeringssonen og inn i detekteringssonen ved kontakt med væskereaksjonsblandingen. Slike matrisematerialer innbefatter, men er ikke ment å være begrensende, papir, glassfiber, porøs plast, scintret glass eller plast, cellulosepartikler, geler av agarose eller andre polymerer eller vevede stoffer så som kluter, nylon eller andre polymeriske meshstoffer eller andre fiberformede stoffer, enten de er dannet fra naturlige stoffer eller syntetiske stoffer. For eksempel, beskriver US-patent nr. 3.846.247 bruken av filt og vevet eller stoffglassfibere, og bruken av syntetisk harpiksull og glassfiberfilt er beskrevet i GB-patent nr. 1.369.139. Andre fiberformede matrisestoffer er også beskrevet i US-patent nr. 3.802.842, 3.809.605, 3.897.214 og 3.987.214.

De forskjellige matrisematerialene som blir benyttet i foreliggende oppfinnelse kan også bli behandlet med stoffer som er kjent for å lette gjennomtrengeligheten av den bundede formen av det merkede reagens. For eksempel, kan overflate-aktive midler så som Tween 20 , Triton X-100 eller natriumdodecylsulfat bli tilsatt til enten matrisematerialene eller til væsketestprøven eller reaksjonsblandingen. På lignende måte kan protein så som bovint seruma-lbumin, laktalbumin eller gammaglobulin bli satt til væsketestprøven, testanordningen eller til reaksjonsblandingen.

Som fagmannen vil forstå, tillater den magnetiske separeringen av den frie formen av merket reagens immobilisert til den magnetisk mottagelige reagenspartikkelseleksjon av et matrisemateriale som har optimal kapillæritet for væs-ketransporten av bundet form uten å måtte ta i betraktning, som en parameter for å gjøre slik seleksjon, den effektive porestørrelsen til matrisematerialet. For eksempel, i de tilfeller hvor et matrisemateriale er valgt som har optimal kapillæritet som beskrevet ovenfor, men som innbefatter en minimum effektiv porestørrelse eller form som er større enn størrelsen på den magnetisk mottagelige reagensparikkelen og derfor gj ennomtrengelig derigjennom, vil den magnetisk mottagelige reagenspartikkelen til tross for dette være forhindret fra å migrere ut av separeringssonen som et resultat av det magnetiske feltet som derav påført. I de tilfeller hvor et optimalt matrisemateriale er valgt som har en minimal porestørrelse som er vesentlig mindre enn størrel-sen på den magnetisk mottagelige reagenspartikkelen og som derfor er ugjennomtrengelig gjennom denne, vil den magnetisk mottagelige reagenspartikkelen til tross for dette være forhindret fra å migrere gjennom overflaten og ut av separeringssonén, og innpå overflaten av detekteringssonen, som et resultat av det magnetiske feltet som der er påført. Dermed kan valg av et hensiktsmessig matrisemateriale bli gjort av fagmannen og i forhold til de ovenfor angitte betraktningene.

Hvor separeringssonen og detekteringssonen er sammensatt av et enkelt, kontinuerlig matrisemateriale som beskrevet ovenfor, vil detekteringssonen selvfølgelig være sammensatt av det samme matrisematerialet og kan dermed ha den samme kapillæriteten som separeringssonematrisematerialet. Det er derimot klart, at der hvor det er ønskelig at separeringssonen og detekteringssonen er sammensatt av fysisk distinkte matrisematerialer, kan disse materialene være like eller forskjellige, hvorved detekteringssonematrisematerialet kan bli valgt fra ovenfornevnte matrisemateriale. Der hvor slike matrisematerialer er forskjellige, må detekterinssonematrise-materialet selvfølgelig, ihvertfall ha evnen til å transportere vannholdige væsker ved kapillærvirkningen.

Ifølge foreliggende oppfinnelse, mottar detekteringssonen den bundede formen til det merkede reagenset som migrerer ut av separeringssonen og inn i detekteringssonen ved kapillærvirkningen. Når den er i detekteringssonen, blir det detekterbare signalet tilveiebragt av markøren til den bundede formen av det merkede reagenset målt og korrelert til mengden av tilstedeværende analytt i væsketestprøven. Dannelsen av det detekterbare signalet vil selvfølgelig være avhengig av den bestemte markøren som blir anvendt, dvs. den som enten har en detekterbar fysisk egenskap eller en detekterbar kjemisk egenskap. For eksempel hvor markøren har en detekterbar fysisk egenskap, tilveiebringer markøren til den bundede formen et detekterbart signal som; når det er i detekteringssonen, lett kan bli målt uten å reagere med en detekterende komponent som hører til denne for å tilveiebringe det detekterbare signalet i detekteringssonen. På den annen side, hvor markøren har en detekterbar kjemisk egenskap. blir detekteringssonen inkorporert med den detekterende komponenten for markøren, slik som et enzymsubstrat i de tilfeller hvor markøren er et enzym, som reagerer med markøren for å tilveiebringe det detekterbare signalet i detekteringssonen. I begge tilfellene blir signalet som blir dannet av markøren til den bundede formen I detekteringssonen målt med et hensiktsmessig instrument, så som et spektrofotometer, spesielt et Seralyzer refletance fotometer (Miles Diagnostics, Elkhart, IN, USA) som lett kan tilpasses til testanordningen.

I henhold til en foretrukket fremstilling av foreliggende oppfinnelsen (fig. 1), er separeringssonen og detekteringssonen beliggende ved fysisk bestemte steder langs lengden av en forlenget strimmel bestående av et enkelt, kontinuerlig matrisemateriale. Separeringssonen og detekteringssonen er beliggende i en forutbestemt avstand bort fra og i væs-ketransport kontakt med hverandre langs lengden av strimmelen. En kilde som påfører et magnetisk felt til separeringssonen, så som en permanent magnet eller en elektromagnet, blir lagt under separeringssonen for magnetisk separering av den magnetisk mottagelige reagenspartikkelen i en ende av strimmelen, og detektering av den bundede formen av det merkede reagens i den andre enden av strimmelen, respektivt.

En aliquot av reaksjonsblandingen blir applisert på separeringssonen og et magnetisk felt blir påført, hvorved den magnetisk mottagelige reagenspartikkelen blir holdt tilbake i separeringssonen av det magnetiske feltet og dermed blir forhindret fra migrering inn i detekteringssonen, og den bundede formen av det merkede reagens blir ved kapillærvirkningen transportert inn i detekteringssonen. Avhengig av den effektive porestørrelsen til matrisematerialet som beskrevet ovenfor, kan det magnetiske feltet bli påført separeringssonen før samtidig med, eller like etter applisering av reaksjonsblandingen. Den magnetiske kilden blir fortrinnsvis først plassert under i hvertfall separeringssonen og reaksjonsblandingen blir applisert i separeringssonen. Når et instrument så som et Seralyzer reflektansfoto-meter blir benyttet for detektering og måling av det detekterbare signalet tilveiebragt av den bundede formen til det merkede reagens i detekteringssonen,' kan teststrim-melplaten eller holderen være Inkorporert med en permanent magnet eller en elektromagnet over hvilket i hvertfall separeringssonen kan bli plassert. Den magnetiske kilden bør tilveiebringe et magnetisk felt som har en tilstrekkelig styrke til å holde tilbake de paramagnetiske reagenspariklene ved appliseringsstedene på separeringssonen. En slik styrke vil, selvfølgelig, avhengig av slike parametere som størrelse og tetthet av det paramagnetiske materialet til reagenspartiklene og avstanden til den magnetiske kilden fra overflaten av testanordningen, og vil generelt være 400 Gauss. Selv om den magnetiske kilden bør bli plassert i hvertfall under appliseringsstedet til de paramagnetiske reagenspartiklene i separeringssonen, kan dimensjonene til den magnetiske kilden være større enn dimensjonene til separeringssonen, og kan også nå inn i området til detekteringssonen.

Siden separering av den magnetisk mottagelige reagenspartikkelen fra den bundede formen av det merkede reagenset fremkommer fra evnen som matrisematerialet har til å transportere vannholdige væsker ved kapillærvirkningen, blir slik separering best oppnådd ved transportering av et relativt stort volum av væsketestmedium gjennom et relativt smalt område. Dermed er vidden av den forlengede strimmelen generelt, men er ikke ment å være begrensende til, mindre enn 20 mm vidt, fortrinnsvis fra mellom omtrent 1,0 mm og 23 mm vidt, og fra mellom omtrent 4,0 mm til 8,0 mm vidde er mest foretrukket. Lengden av strimmelen er vanligvis, men er ikke begrenset til, fra mellom omtrent 2,0 cm og 40 cm lang, fortrinnsvis fra mellom omtrent 4,0 cm til 25 cm lang, mest foretrukket er lengder fra mellom 6,0 cm til 20 cm.

I henhold til en annen foretrukket fremstilling av foreliggende oppfinnelse (fig. 2), er separeringssonen og detekteringssonen sammensatt av individuelle, fysisk bestemte deler likt beliggende langs lengden av en forlenget strimmel og sammensatt av fysisk bestemte matrisematerialer. De individuelle matrisematerialene, som kan Være like eller forskjellige som beskrevet ovenfor, er beliggende i en ende- mot-ende-forhold hvorved disse endene er i væsketransportkontakt for å tillate migrering av den bundede formen av det merkede reagens inn i detekteringssonen. En kilde for å påføre et magnetisk felt er på lignende måte plassert under separeringssonen for å tilveiebringe den magnetiske separeringen av den magnetisk mottagelige reagenspartikkelen som beskrevet ovenfor. En bør merke seg at selv om de individuelle matrisematerialene fortrinnsvis danner en forlenget strimmel som har dimensjoner som er lik de som er beskrevet ovenfor, kan de individuelle matrisematerialene som danner separeringssonen og detekteringssonen variere i lengde, og hvor lengden av en kan være forskjellig fra, og ikke nødvendigvis lik, lengden til den andre.

Tykkelsen av separeringssonen og detekteringssonematrise-materialene er beskrevet ovenfor, og likeledes grad av gjennomtrengelighet derigjennom, vil variere, og avhengig av den aktuelle anvendelse. Generelt, er en tørr tykkelse fra mellom omtrent 0,1 mm og 2,0 mm foretrukket, selv om tykkelser som varierer enda mere kan bli valgt av fagmannen når det som er beskrevet foran blir tatt 1 betraktning og avhengig av de spesielle omstendighetene ved anvendelsen. Separeringssonen og detekteringssone-matrisematerialene blir fortrinnsvis lagt eller på annen måte plassert oppå en fast, ikke-porøst støtteanordning med et hensiktsmessig klebestoff. Forskjellige organiske og uorganiske stoffer, både naturlige og syntetiske, og kombinasjsoner derav, kan bli benyttet forutsatt at bare støtte ikke interfererer med den kapillære virkningen av strimmelen, eller de ikke-spesifikke bindings-analysekomponentene, eller interfere med det signaldannende systemet. Illustrative polymerer innbefatter polyetylen, polypropylen, poly ( 4-metylbuten), polystyren, polymet-akrylat, poly(etylenterftalat), nylon, poly(vinylbutyrat), glass, keramikk, metaller o.l.

Testkitt

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre et testkitt innbefattende alle essensielle elementer som er nødvendige for å utføre immunonalysemetoden ifølge foreliggende oppfinnelse. Testkittet er presentert i en -kommersiell pakket form, i en komposisjon eller sammenblanding hvor kompatibili-teten av reagensene vil tillate, i en testanordningskon-figurasjon, eller vanligvis som et testkitt, dvs., en pakket kombinasjon av en eller flere beholdere, anordninger eller lignende som Inneholder de nødvendige reagensene, og vanligvis innbefatter skrevne instruksjoner for utføringen av immunanalysen.

Testkittet vil i hvertfall inneholde (1) magnetisk mottagelige reagenspartikler som har analytten eller en bindingsanalog derav immobilisert dertil, fortrinnsvis en uniform latekssuspensjon derav, (2) et merket reagens, innbefattende en merket form av en spesifikk bindingspartner for analytten, fortrinnsvis et monovalent antistofffragment avledet fra et monoklonalt antistoff til analytten som skal bestemmes, merket med et enzym, og (3) en kromatografisk seprerings- og detekteringstestanordning for separering av de magnetisk mottagelige reagenspartlklene, fortrinnsvis Inkorporert med et substrat for enzymet, som danner et detekterbart signal som kan bli målt og korrelert til mengden av tilstedeværende analytt i en væsketestprøve.

Foreliggende oppfinnelse vil nå bli illustrert, men er ikke ment å være begrenset av følgende eksempler:

Eksempel 1

Separering av paramagnetiske latekspartikler

på et papirmatrisemateriale.

For å demonstrere den magnetiske separering av paramagnetiske latekspartikler på et papirmatrisemateriale, ble et Whatman 3 mm ark (Whatman, Ltd., Maidstone, England) skåret 1 0,7 cm x 2,0 cm forlengede teststrlmler, og en ende av hver av strimlene ble bestemt til å være separeringssone og den andre enden derav ble bestemt til å være detekteringssone. (i) En permanent magnet (Edmund Scientific, Barrington, N.J., USA, rektangulær 8500 Gauss magnet kat. nr. H30.964) ble omtrentlig plassert 1,6 cm under en teststrimmel (minst 400 Gauss på overflaten av teststrimmelen) og en 30 pl aliquot av en 1,0$ (vekt/volum) vannholdig suspensjon av paramagnetisk jernoksyd (95$) latekspartikler (Magic™partik-ler for TSH analyse, gjennomsnittlig diameter fra mellom omtrent 0,5 og 1,5 pm, Corning Medical, Medfield, MA, USA) i 10$ humant serum ble pipettert på et sentralt beliggende område av teststrimmelen omtrentlig 3,2 cm fra enden av separeringssonen. En 30 pl aliquot av den ovenfornevnte paramagnetiske latekspartikkelsuspensjonen ble på lignende måte pipettert på en annen teststrimmel uten at det ble plassert en permanent magnet under denne. I nærvær av det magnetiske feltet, ble partiklene visuelt observert (brun farge) bare ved applikeringsstedet på teststrimmelen, mens i fravær av et magnetisk felt, ble partiklene observert visuelt i både separeringssonen og detekteringssonen. (ii) En permanent magnet ble plassert under fire teststrimler som beskrevet ovenfor, og 30 pl aliquoter av 0,5$ og 1, 0% (vekt/volum) vannholdig suspensjoner av paramagnetisk jernoksyd ( 12%) latekspartikler (1,0 pm diameter, Seragen Diagnostics, Inc., Indiamapolis, IN, USA) i 120$ humant serum, og 0, 5% og 1,0$ (vekt/volum) suspensjoner av de paramagnetiske latekspartiklene i 100$ humant serum, ble på lignende måte pipettert på hver av teststrimlene, respektivt, som beskrevet ovenfor. 30 pl aliquoter av de ovenfor nevnte paramagnetiske latekspartikkelsuspensjonene ble på lignende måte pipettert på fire teststrimler, respektivt, uten å plassere en permanent magnet derunder. Ved' tilstedeværelse av det magnetiske feltet, ble partiklene visuelt observert (brun farve) bare ved applikasjonsstedet på hver av teststrimlene, mens i fravær av det magnetiske feltet, ble partiklene visuelt observert i både separeringssonene og detekteringssonene til teststrimlene.

Eksempel 2

Preparering av kromatografisk separerings-

og detekteringstestanordning og bruk derav

i en immunanalyse.

(a) Testanordning

Et 3,81 cm x 15,24 cm Whatman 54 ark (Whatman, Ltd., Maidstone, England) blir impregnert ved nedsenking inn i 5,0 mM MgCl2i 0,1 M bicin (pH 8,3) og tørket ved tilført luft ved 50° C i 10 minutter. Arket ble, deretter impregnert ved nedsenking i 10,0 mM resorufin-galaktosld (fremstilt i henhold til metoden beskrevet i EP-PS 156.347) i dimetylformamid, og tørket ved påført luft ved 50" C i 10 minutter. Dobbeltsidig limbånd blir påført på den ene siden av det impregnerte glassfiberarket, og deretter skåret i forlengede strimler med en vidde på 2,0 cm. De forlengede strimlene blir deretter laminert i den ene enden av 8,3 cm x 2,0 cm polystyrenarkene (0,4 cm tykk), og deretter skåret til 8,3 cm 0,5 cm med forlengede strimler. De forlengede strimlene blir lagret i brune glassflasker med et tørkemiddel ved romtemperatur .

(b) Reagenspartikler

3-hydroksy-(5-karboksypentyl)-karbamoyldigitoksygenin (0,132 mmol ) blir satt til 0,132 mmol isobutylklorformat og 0,132 mmol trietylamin i 5,0 mL dimetylformamid ved -10°C til -20°C under argon, og deretter dråpevis tilsatt til en oppløsning av bovinserumalbumin (110,0 mg/10,0 mL) i 0,1 L natrium-pyrofosfat (pH 8,5) med omfattende omrøring ved 0-4°C i en periode på 15 minutter. Reaksjonsblandingen ble deretter sonikert i en time. Etter henstand ved 4°C overnatt, ble reaksjonsblandingen justert til pH 7,0, applisert på en 45,0 cm x 2,5 cm Sephadex-kolonne (Sigma, St. Louis, MO, USA) ekvilibrert med 25,0 mM natriumfosfatbuffér (pH 7,0) og eluert med 25,0 mM natriumfosfatbuffer (pH 7,0).

Karboksylatmodifiserte polystyrenparamagnetiske latekspartikler (1,3 pm gjennomsnittlig diameter, 0,02-0,05 mequiv. av karboksylat/g partikler; Seragen, Inc., Indianapolis, IN, USA) blir skylt to ganger med vann og resuspendert ved 5,0$

(vekt/volum) i 0,1 M boratbuffer (pH 8,5) som inneholder 0,05 mg/mL BSA-digitoksygeninreagens beskrevet ovenfor. Suspen-sjonen blir inkubert i 20 timer og vasket tre ganger med 20,0 mM natr iumf osf at, 0,1$ Tween 20 (pH 7,0), to ganger i 1,0$ natriumdodecylsulfat i 30 minutter ved 60° C, én gang i 20,0 mM natrium fosfat, 0,1$ Tween 20 (pH 7,0), og to ganger i etanol. De paramagnetiske latekspartiklene blir lagret ved 5,0$ (vekt/volum) i etanol ved 4°C. Etanolen blir dekantert og de paramagnetiske latekspartiklene blir resuspendert til 1,0$ (vekt/volum) i reagensbuffer (0,05 M natriumfosfat, 0,05 M NaCl, 1,0 mM MgCl2, 0,02$ NaN3og 0,01$ bovint serumalbumin, pH 7,4) før bruk.

(c) Immunoanalyse og anvendelse av testanordningen

En immunoanalysereaksjonsblanding blir dannet inneholdende digoksin kalibratorserum (Optimate liquid analyzer, Miles Diagnostics, Elkhart, IN, USA) fortynnet fem ganger i reagensbufferen beskrevet ovenfor inneholdende et merket reagens (1,0 mM av et vesentlig rent anti-digoksin/<p->D-galaktosidasemonokonjugatpreparat inneholdende et enkelt monovalent antistofffragment avledet fra et anti-digoksin-monoklonal antistoff koblet til et enkelt P-D-galaktosidase-molekyl). Etter 5 minutter ved romtemperatur, blir et likt volum 2,0$ (vekt/volum) av paramagnetisk lateksreagens tilsatt og inkubert i 3 minutter ved romtemperatur.

En forlenget strimmel som beskrevet ovenfor blir plassert på strlmmelholderen til et Seralyzer refleksjonsfotometer (Miles Diagnostics, Elkhart, IN USA) som har en permanent magnet (Crumax, Colt Industries, Lextington, KY, USA) beliggende derunder, og 30,0 pl av reaksjonsblandingen beskrevet ovenfor blir applisert på separeringssonen av den forlengede strimmelen. Signalet som blir dannet av de merkede reagenser bundet til serumdigoksin som migreres inn i detekteringssonen blir målt

(1 - refleksjonskoffisient)2

[K/S hastighet signalrespons =

(2 x refleksjonskoeffisient) , bestemt mellom 70-90 sekunder etter plassering av aliquoten på den forlengede strimmelen].

K/S hastighetresponsen er lineært proporsjonal med den opprInnelige prøveanalyttkonsentrasjonen.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte for spesifikk bindingsanalysebestemmelse av en analytt i et vannholdig væsketestmedium anvendende (i) en magnetisk mottagelig reagensfortykker innbefattende analytten eller en bindingsanalog derav som er immobilisert dertil, (ii) et merket reagens innbefattende en spesifikk bindingspartner for analytten merket med en detekterbar kjemisk gruppe, og (lii) en kromatografisk separering og detekteringstestanordning innbefattende en fast, porøs matrise som har evnen til transportering av vannholdige væsker og som innbefatter en separeringssone og en detekteringssone som er beliggende i en forutbestemt avstand bort fra og i væsketransportkontakt med nevnte separeringssone, karakterisert ved at man: (a) danner en vannholdig væskereaksjonsblanding innbefattende nevnte testmedium, nevnte merkede reagens, og nevnte magnetisk mottaggelige reagenspartlkkel i en mengde i overskudd av det som har evnen til å bli bundet til alt merket reagens som ikke blir bundet til nevnte analytt; (b) appliserer nevnte reaksjonsblanding til nevnte separeringssone til nevnte testanordning og påfører et magnetisk felt til separeringssonen hvorved den magnetisk mottagelige reagenspartikkelen blir magnetisk tilbakeholdt i nevnte separeringssone og det merkede reagenset som ikke er bundet til den magnetisk mottagelige reagenspartikkelen, blir transportert inn i nevnte detekteringssone med væskemedium; og (c) måler nevnte detekterbare kjemiske gruppe til det merkede reagenset i detekteringssonen til testanordningen.

2 . Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man anvender magnetisk mottagelig reagenspartlkkel som er en paramagnetisk partikkel, fortrinnsvis en vannsuspenderbar, paramagnetisk latekspartikkel.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at nevnte vannholdige væske reaksjonsblanding blir dannet ved (i) at man danner en første reaksjonsblanding innbefattende nevnte testmedium og nevnte merkede reagens, hvor nevnte merkede reagens er tilstede i reaksjonsblandingen i en mengde som er i overskudd av det som kan bindes til alt av nevnte analytt som man antar er i nevnte testmedium; (ii) inkuberer nevnte første reaksjonsblanding i en forutbestemt tidsperiode; (ili) danner en andre reaksjonsblanding innbefattende nevnte første reaksjonsblanding og nevnte magnetisk mottagelige reagenspartlkkel; og (iv) inkuberer nevnte andre reaksjonsblanding i en forutbestemt tidsperiode.

4 . Fremgangmsåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at testanordningen som man anvender innbefatter en forlenget strimmel bestående av et fast, porøst matrisemateriale som har evnen til å transportere vannholdige væsker langs denne lengden ved den kapillære virkningen, og hvor nevnte separering og detekteringssoner er beliggende ved fysisk bestemte steder langs nevnte strimmel.

Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at den forlengede strimmelen man anvender, er sammensatt av et enkelt, kontinuerlig matrisemateriale, fortrinnsvis et fiberformet matrisemateriale valgt blant papir, fiberglass, cellulose eller et vevet stoff.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4 eller 5, karakterisert ved at de fysisk bestemte stedene til nevnte strimmel som anvendes innbefatter nevnte separerings- og detekteringssoner er sammensatt av fysisk distinkte matrisematerialer i væsketransportkontakt.

7. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6, karakterisert ved at nevnte anvendte detekterbare kjemiske gruppe har en detekterbar kjemisk egenskap og reagerer med en detekteringsmiddelkomponent for å tilveiebringe et detekterbart signal.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at detekteringssonen som anvendes er inkorporert med nevnte detekteringsmiddelkomponent.

9. Testsystem for spesifikk bindingsanalysebestemming av en analytt i et vannholdig væsketestmedium, karakterisert ved at den innbefatter: (i) en kromatografisk separerings- og detekteringstest7 anordning innbefattende en fast, porøs matrise som har evnen til transportering av vannholdig væsker og som innbefatter en separeringssone og en detekteringssone som er beliggende i en forutbestemt avstand fra og i væsketransportkontakt med nevnte separeringssone, og separeringssonen som er blitt tilført en reaksjonsblanding innbefattende nevnte væsketestmedium, et merket reagens innbefattende analytten eller en bindingsanalog derav, merket med en detekterbar kjemisk gruppe, og en magnetisk mottagelig reagenspartlkkel innbefattende analytten eller en bindingsanalog derav som er immobilisert dertil og i en mengde som er i overskudd av det som har evnen til å binde alt merket reagens som ikke blir bundet til analytten, og (li) metoder for påføring av et magnetisk felt for å holde nevnte magnetisk mottagelige reagenspartlkkel magnetisk til nevnte separeringssone, hvorved nevnte merkede reagens bundet til analytten blir transportert inn i nevnte detekteringssone ved nevnte væsketestmedium og er detekterbar deri som en funksjon av analyttmengden som er tilstede i nevnte væsketestmedium .

10. Testkitt for spesifikk bindingsanalysebestemming av en analytt i et væsketestmedium, karakterisert ved at nevnte testkitt innbefatter (a) en magnetisk mottagelig reagenspartlkkel innbefattende analytten eller en bindingsanalog derav som er immobilisert dertil; (b) et merket reagens innbefattende en spesifikk bindingspartner for analytten som er merket med en detekterbar kjemisk gruppe; og (c) en kromatografisk separerings- og detekteringstestanordning innbefattende en fast, porøs matrise som har evnen til transportering av vannholdige væsker og som innbefatter en separeringssone og en detekteringssone som er beliggende ved en forutbestemt avstand bort fra og i væsketransportkontakt med nevnte separeringssone.