NO880831L - Rekombinant human vevsplasminogen-aktivatorblanding. - Google Patents

Abstract

Sammendrag Fremgangsmåte ved fremstilling og rensing av en ny human vevsplasminogen-aktivatorblanding. tPA-blandingen fremstilles i nyelomaceller, fortrinnsvis i nerver av epsilon-aninokapron-syre. Den kan renses fra dyrkningsmediet ved sekvensfraksjoner-ing pi kontrollert porestørrelseglass og pi affinitetskromato-grafimedier. Den omfatter en blanding av proteiner son er ner homogen enn tPA-blandingen son fremstilles i CHO-celler. Oet er overveiende enke1tkjedet materiale. Den omfatter en blanding av to kjeder, en hovedmengde av en sekvens som begynner med ser + 1 (ferdigform), og en liten mengde av en sekvens son begynner med gly-3. Beskrivelsen muliggjør produksjon i stor skala av en aktiv human tPA-blanding som er meget lik naturlig endogent humant tPA.

Description

Bakgrunnen for oppfinnelsen

Denne oppfinnelsen vedrører en human vevsplasminogen-aktivatorblanding fremstilt ved bruk av rekombinant DNA-teknologi i myelomaceller. Nærmere bestemt vedrører den en fremgangsmåte for fremstilling av en vevsplasminogen-aktivatorblanding med forbedret homogenitet i forhold til andre aktivatorpreparater fremstilt i dyreceller.

Human vevsplasminogen-aktivator (tPA) utskilles av celler

og sirkulerer gjennom det vaskulære systemet. Den består av en komponent fra det fibrinolytiske system som er i dynamisk likevekt med koaguleringssystemet. Den fibrinolytiske prosess innbefatter det proteolytiske enzymet plasmin, som dannes fra sitt zymogenplasminogen. Plasminogen overføres i plasmin, eller "aktiveres", av forskjellige forbindelser innbefattende vevsplasminogen-aktivator, urokinase og streptokinase.

EPA-publikasjonsnummer 41766 beskriver en human melanoma-cellelinje som utskiller et tPA som hevdes å ikke kunne skilles verken immunologisk eller i aminosyresammensetning fra human plasminogen-aktivator isolert fra normale vev. Cellelinjen, kjent som Bowe's melanoma, har gitt fagmannen en dyrkbar kilde for mRNA som koder for humant tPA og en kilde for selve proteinet. Disse oppdagelser sammen med utviklingen av en måling for pålitelig påvisning av nærvær av tPA har gjort det mulig for fagmannen å utlede med etablerte metoder DNA-sekvensen til det humane tPA-genet. Fremgangsmåtene innbefatter konstruksjonen av radioaktivt merkede oligonukleotidprober som brukes i hybridiser-ingseksperimenter mot et cDNA-bibliotek konstruert med revers transkriptase fra størrelsesfraksjonert mRNA som stammer fra melanomacellelinjen. Se f.eks. Pennica et al, Infra. Firmaer som utnytter rekombinant DNA-teknologi, har oppnådd ekspresjon av protein med aminosyresekvensen til humant tPA i celler som ikke normalt produserer det. Se f.eks. GB 2 119 804A, publisert 23. november 1983, som beskriver ekspresjon av tPA-genet i kinesisk hamster-eggstokk-(CHO)-celler.

Skjønt ekspresjonen av aminosyresekvensen til humant tPAi forskjellige dyrkbare cellelinjer ofte er et fagmessig spørsmål, er det velkjent at betydelige post-translasjonelle modifikasjoner av proteinet kreves for å gi molekylet de sekundære og tertiære strukturelle trekk som er ansvarlige for dets fibrinaffinitet og enzymatiske aktivitet. Et protein som omfatter aminosyresekvensen til det naturlige protein, men mangler den tilsvarende konformasjon, kan være enzymatisk inaktivt eller ha redusert eller ingen affinitet til fibrin. Således er det den vanlige oppfatning at tPA ikke kan fremstilles i prokaryotiske celler eller gjær uten etterfølgende in vitro-modifikasjon, da disse ekspresjonssystemer ikke inneholder det nødvendige molekylære maskineri for å glykosylere molekylet korrekt eller å skape de riktige disulfid-bindinger.

Et humant tPA-produkt fremstilt i CHO-celler gjennomgår for tiden klinisk utprøvning. Generelt er dette tPA-produkt funnet å noen ganger indusere betydelig perifer blødning, hvilket tyder på at dets affinitet til fibrin er mindre enn optimalt,

og å vise et skuffende aktivitetsnivå ved bruk in vivo som et intravaskulært fibrinolytisk middel. Disse observasjoner tyder på at de for tiden tilgjengelige humane rekombinante tPA-produkter kan være forskjellige fra det naturlige protein på

det tertiære strukturelle nivå. Følgelig kan disse handels-produkter i aminosyresekvens tilsvare naturlig fremstilt humant tPA, men likevel i dette viktige aspekt ikke være samme substans som endogent humant tPA.

Med mindre noen midler kan finnes for å forbedre den post-translasjonelle modifikasjon av tPA fremstilt i rekombinante vertsceller, vil den forventede anvendelighet av dette potens-ielle nye legemidlet for behandling av myokardiale infarkt, dype venetromboser, slag, emboli og andre vaskulære sykdommer kanskje ikke kunne realiseres..

Før publikum i tillegg kan nyte godt av tPA, må industrien

i tillegg oppskalere produksjons- og renseteknikker. Utviklingen av teknologien for det tekniske produksjonstrinn byr på mange utfordrende tekniske problemer. Disse innbefatter f.eks. at dyreceller normalt bare vokser til høy densitet i medier tilsatt serum, samtidig som serum inneholder proteiner som hydrolyserer, bindes til eller på annen måte reduserer aktiviteten og/eller utbyttet av tPA-høsten. Ved ønsket høy konsentrasjon utfelles også tPA.

Det er et mål for denne oppfinnelsen å tilveiebringe en human vevsplasminogen-aktivatorblanding med homogenitet i forhold til nåværende tilgjengelige tPA-produkter. Et annet mål er å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av humant tPA ved å bruke rekombinante DNA-teknikker til å produsere et tPA-produkt som ligner mer på det naturlige materialet. Enda et annet mål er å tilveiebringe en effektiv fremgangsmåte for å rense tPA fra dyrkningsmedier.

Disse og andre mål for oppfinnelsen vil fremgå klart for fagmannen fra beskrivelsen og kravene som følger.

Sammenfatning av oppfinnelsen

Det er nå oppdaget at myelomaceller utgjør en ideell celletype for ekspresjonen og den post-translasjonelle modifikasjonen av human vevsplasminogen-aktivator. Myelomaceller transformert med vektorer som er konstruert for å gi evnen til å uttrykke tPA-genet, kan gi en blanding av strukturelt beslektede proteiner med tPA-aktivitet og med forbedret homogenitet sammenlignet med tPA-produkter fremstilt i andre kjente typer av transformanter eller i Bowe's melanomaceller. Videre er myelomaceller som en klasse generelt relativt lette å dyrke og kan induseres til å utskille tPA i det ekstracellulære medium uten serumtilsetninger. Dette forenkler meget sterkt rensingen av produktet. Det har også blitt oppdaget at epsilon-aminokapronsyre (EACA) fortrinnsvis i citratbuffer kan brukes til å holde løseligheten av humant tPA på nøytralt pH-nivå, og at EACA er effektivt for å inhibere proteolytisk spaltning av den uttrykte enkeltkjedede form.

I ett aspekt omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av en human vevsplasminogen-aktivatorblanding. Fremgangsmåten omfatter trinnene ekspresjon av et DNA omfattende kodesekvensen for humant tPA (se fig. 2) eller alleliske varianter derav, et forskjellig DNA som koder for den samme aminosyresekvensen eller allelisk variant, eller en DNA-sekvens som koder for en analog sekvens av aminosyrer i en dyrkbar myelomacellelinje, og deretter høsting av tPA-produktet. Transformanter som uttrykker tPA fremstilt ved å transfektere J558L-celler (deponert hos American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, under tilgjengelighetsnummeret ATCC CRL 9132) foretrekkes. J558L-cellelinjen er et muse-myeloma som utskiller lambda-lett-kjede av immunoglobulin A, men ikke utskiller intakt immunoglobulin.

I foretrukne aspekter holdes myeloma-cellelinjen som

utskiller tPA'et i medium fritt for tilsatt serum før høsting av tPA'et, og cellene dyrkes i porøse mikrokapsler. EACA kan brukes i vevsdyrkningsmedium for å inhibere proteolytisk nedbrytning av enkeltkjedet tPA-protein. Rensing kan oppnås ved å bruke en forskrift som omfatter trinnene fraksjonering av proteiner i mediet på glass med stort overflateområde og på en affinitets-matrise omfattende bundet antistoff, fortrinnsvis monoklonalt antistoff mot en epitop på aktivatoren. For å opprettholde løselighet og høy aktivitet, elueres aktivatoren fortrinnsvis fra den immobiliserte antistoffmatrise ved å bruke en citration-løshing inneholdende EACA. Ettersom proteinløsningens pH økes, forblir EACA løselig. Denne fremgangsmåten gjør det mulig å produsere et tPA-produkt med høy aktivitet oppløst i fysiologisk forenelig buffer omfattende citrat og EACA.

Det resulterende rensede produkt karakteriseres som følger: a. Nitti prosent av det totale aktive protein som pre-paratet inneholder, er et enkeltkjedet, meget aktivt humant tPA. b. tPA-blandingen skilles, når den gjennomgår polyakrylamidgel-elektroforese som er beskrevet, i to bånd som skiller seg ved sine respektive glykosyleringsnivåer, idet det største lavmolekylvektsbåndet utgjør minst ca. 70 % av det totale aktive protein, og typisk mer enn ca. 90 %. c. Blandingen omfatter også minst ca. 70 % og fortrinnsvis mer enn ca. 90 % av et protein bestående av den kjente aminosyresekvens med full lengde humant tPA-protein minus dets første 3 5 aminoterminale rester ("ferdigform"). Typisk har hovedsakelig alt det gjenværende aktive protein den samme sekvens pluss et gly ala arg-tripeptid på sin aminoende.

Denne blandingen kan oppløses ved høy konsentrasjon i en fysiologisk fordragelig løsning inneholdende citrat og EACA og gi en terapeutisk effektiv fibrinolytisk aktiv injiserbar blanding. Dyreforsøk viser at det tPA som er fremstilt som her beskrevet, er minst så aktivt som det tidligere kjente materialet fremstilt i CHO og Bowes's melanoma. In vitro-forsøk ved bruk av det kromogene substrat S-2288-forsøkssystemet viser at det tPA som her er beskrevet, viser en økning i Vmaks (og ingen økning i Km) ved aktivering med monomert fibrin, og således i det minste ved høyere konsentrasjoner av substratet, kan det være et katalytisk mer effektivt preparat enn de tidligere kjente tPA'er. Forsøk på primater som er utviklet for å bestemme videre det nye tPA's farmakokinetiske egenskaper, skulle bestemme om denne forskjellen har praktiske terapeutiske konsekvenser.

Oppfinnelsen vil bli mer forståelig ved lesning av beskrivelsen, kravene og tegningene som følger.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 er en to-dimensjonal fremstilling av humant tPA-protein i full lengde som viser hva som antas å være dets disulfidbindinger, dets glykosyleringsseter og dets aminosyresekvens (aminosyrer identifisert i standardkode). Restene -1 til

-35 utgjør et signalpeptid og en variabel prosekvens som spaltes fra det ferdige protein; Fig. 2 er DNA-sekvensen til det humane tPA-genet inneholdende dets signalpeptidområde og dets start- og stoppsignaler, men utelukker dets 3'-ikke-translaterte område; Fig. 3A-3D er den fulle DNA-sekvensen til plasmid pEMpl - tPA, den foretrukne ekspresjonsvektor for bruk i fremstillingen av tPA ifølge oppfinnelsen; Fig. 4 er et diagram av plasmid pEMpl - tPAK; Fig. 5 er en kurve av optisk densitet mot fraksjonsnummer som illustrerer affinitetskromatografi-elueringsmønsteret til den meget aktive human tPA-blanding ifølge oppfinnelsen; Fig. 6 er en fotografisk produksjon av et eksempel på polyakrylamidgel, elektroforeseseparasjon av tPA-blandingen i oppfinnelsen; og Fig. 7 er en kurve for den resiproke verdi av plasminogen-aktiveringsgraden (optiske densitetsenheter per minutt) mot den

resiproke plasminogen-konsentrasjonen (målt ved konsentrasjonen av S-2288) i nærvær eller uten (åpne sirkler) av fibrinmonomer.

Beskrivelse

Oppfinnelsen gir en nyhuman vevsplasminogen-aktivatorblanding omfattende en aminosyresekvens som er den samme som eller analog med den kjente publiserte sekvens, men som adskiller seg fra vanlig tilgjengelige tPA-produkter i sitt glykosylerings-mønster og protein-undergruppefordeling. Oppfinnelsen bygger på den oppdagelse at myelomaceller gir et intracellulært miljø som er i stand til å modifisere tPA-proteinet etter translasjon og før utskillelse og fører til et forbedret, relativt homogent produkt. Dyre- og in vitro-forsøk viste at ut fra et effektiv-itetssynspunkt og terapeutisk effekt er tPA-sammensetningen i oppfinnelsen lignende Bowe's melanoma-tPA, bortsett fra at det nye tPA viser en økning i Vmaks i nærvær av fibrin, mens Bowe's eller CHO-produserte tPA'er ikke gjør det.

Under henvisning til tegningene viser Fig. 1 en to-dimensjonal modell av det enkeltkjedede tPA-protein. Den standardiserte 1-bokstav-kode for hver av aminosyrene er angitt i de åpne sirkler. Linjene viser den utledede plassering av disulfidbroer. Trekanten viser spaltningssetet mellom de tunge og lette kjeder. Markørene Ser, Asp, His utgjør tilsammen det som antas å være det proteaseaktive setet (se Ny et al, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, V. 81, 1984, s. 5358). I den viste modellen er fire asparaginrester 10, 12, 14 og 16 illustrert som glykosylerte. De første 35 restene spaltes fra proteinet under modningen, og er per konvensjon nummerert -35 til -1, med -1-resten inntil den første resten på det ferdige protein (ser + 1).

Modellen som er vist i Fig. 1, behøver ikke være den korrekte modell for endogent humant tPA. Det som er klart, er at tPA fremstilt ved ekspresjon i myelomaceller er strukturelt forskjellig fra tPA uttrykt i melanoma- eller CHO-celler. Selv om sammenhengen mellom strukturen til det nye tPA og tidligere kjente materialer ennå ikke er blitt fullstendig avklart, er det fastslått at tPA produsert fra Bowe's melanoma omfatter to nær beslektede grupper: en (ca. 70 vekt%) hvor sukkerrester er knyttet til glykosyleringssetene 10 og 16; og en (ca. 3 0 vekt%) hvor sukkerrester er knyttet til setene 10, 12 og 16. Det vises ingen sukkerrester ved glykosyleringssetet 14 i Bowe's melanoma-tPA. Glykosyleringsmønsteret til tPA fremstilt i myelomaceller er ennå ikke kjent. Imidlertid fremstilles to typer i et forhold som typisk overskrider 70:30 forholdet av tPA-typer fra Bowe's melanomaceller. I produksjonssatser som anvender fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, oppnås ofte mer enn et 90:10 forhold, idet hovedfraksjonen er lett glykosylert og har en lavere molekylvekt enn den mindre fraksjon. Polyakrylamidgel-elektroforese-separasjoner av blandingen fører ofte til et tydelig enkeltbånd med den lavere molekylvektform.

Glutamin-glutaminsyrebindingen merket B i tegningen på Fig. 1 antas å begrense signalpeptidet fra resten av det uspaltede tPA-molekylet. Ytterligere spaltning må foregå når tPA'er isolert fra Bowe's cellekultur og andre naturlige kilder har flere ytterligere rester avspaltet som forsekvenser. Enzymer i myelomacellene spalter N-enden av proteinet forskjellig, hvilket fører til dannelse av en overvekt av en proteinundergruppe som begynner med serin (aminosyre 3 6 på Fig. 1, + 1 i det ferdige protein). Små mengder av et lengre protein som begynner med glycin ved aminosyre 3 3 på tegningen (-3), dannes også ofte. Typisk er ca. 70 % og fortrinnsvis mer enn 90 % av det totale aktive protein den korte undergruppe.

Pilen mellom arg-ile (aminosyrene 275-276) viser et spalt-ningssete åpent for angrep med endoprotease, som fører til en disulfid-bundet to-kjede-form av proteinet. Anvendelsen av protease-inhibitorer såsom epsilon-aminokapronsyre i dyrkningsmediet og det høstede produkt hindrer spaltning av enkeltkjeden, slik at typisk er mer enn 90 % av det aktive proteinet i blandingene i oppfinnelsen i den enkeltkjedede form.

De rekombinante DNA-teknikker for fremstilling av ekspresjonsvektorer og myelomatransformanter som er anvendelig i denne oppfinnelsen, er velkjente og utviklet. De medfører bruk av forskjellige restriksjonsenzymer som foretar sekvens-spesifikke avskjæringer i DNA og gir stumpe ender eller heftende ender, DNA-ligaser, teknikker som muliggjør enzymatisk addisjon av heftende ender til stump-endede DNA-molekyler, cDNA-syntese-teknikker, syntetiske prober for isolering av gener med en spesiell funksjon, vanlige transfeksjonsteknikker og likeledes vanlige teknikker for kloning og subkloning av DNA. Forskjellige typer vektorer kan brukes såsom plasmider og virus innbefattende animalske virus og fager. Vektorene vil normalt benytte forskjellige markørgener som vil gi en riktig transfektert celle en påviselig fenotypisk egenskap som kan brukes til å identifisere hvilke individer i en cellepopulasjon som har fått det rekombinante DNA fra vektoren riktig innsatt. Foretrukne markører for bruk i myelomacellelinjer omfatter DNA'er som koder for et enzym som normalt ikke uttrykkes (eller bare uttrykkes i lav grav) av cellene som gjør det mulig for cellene å overleve i et medium som inneholder et toksin. Eksempler på slike enzymer innbefatter tymidinkinase (TK), adenosinfosforibosyltransferase (APRT) og hypoksantinfosforiboksyltransferase (HPRT), som gjør det mulig for TK-, APRT- eller HPRT-manglende celler henholdsvis å vokse i hypoksantin/aminopterin/tymidin-medium; dihydrofolat-reduktase (DHFR), hvilket gjør det mulig for DHFR-manglende celler å vokse i nærvær av metotreksat; E. Coli-xantin-guanosin-fosforibosyltransferase (XGPRT, produktet fra qpt-genet), hvilket gjør det mulig for normale celler å vokse i nærvær av mykofenolsyre; og det prokaryotiske enzymet Tn5 fosfotransferase, hvilket gjør det mulig for normale celler å vokse i nærvær av neomycin. Andre passende markørgener vil være anvendelig i vektorene som brukes til å transformere myelomaceller ifølge oppfinnelsen. Følgelig bør eksempelet som følger bare oppfattes som et eksempel i alle henseende, som gir en detaljert beskrivelse av en tPA-fremstillingsforskrifts-utførelsesform av oppfinnelsen, og en beskrivelse av den beste utførelsesform man for tiden kjenner for utøvelse av oppfinnelsen.

Fig. 2 beskriver det som antas å være den fullstendige kodesekvens for naturlig humant tPA tatt fra den publiserte litteratur og starter med ATG-begynnelseskodonet og ender med TGA-translasjons-stoppsignalet. Genet inneholder basene som koder for signalpeptidområdet, men utelukker et 3'-ikke-translatert område og polyadenyleringssetet som normalt befinner seg forbi stoppsignalet. Basebetegnelsene er nummerert fra 20 til 1710. Denne kodesekvensen er den som har vært brukt for å konstruere ekspresjonsvektorer, som har blitt transfektert til myelomacellelinjer for å gi det her krevede tPA. Imidlertid vil en fagmann på området forstå at på grunn av den genetiske kodens utbredelse, kan et forskjellig DNA fra det som er beskrevet i Fig. 2, konstrueres, som koder for den samme proteinsekvensen. Naturlige alleliske variasjoner av genet kan forekomme fra individ til individ. Det er også mulig at forskjellige innskudd eller delesjoner, basesubstitusjoner eller addisjoner i kodesekvensen ville gi en human tPA-aminosyresekvens som er modifisert etter translasjon i myelomaceller liksom proteinet kodet for av det naturlige gen. Alle slike proteiner fremstilt fra gener som spesifiserer en forskjellig, men funksjonelt virkende aminosyresekvens, refereres her til som en analog sekvens. Alle slike analoge sekvenser anses å ligge innenfor omfanget av oppfinnelsen som ekvivalente materialer.

Figurene 3a - 3d og 4 beskriver henholdsvis nukleotid-sekvensen til den foretrukne plasmidvektor som brukes i tPA-fremstillingsprosessen ifølge denne oppfinnelsen, og et restriksjonskart av plasmidet. Denne foretrukne vektoren er kalt pEMpl-tPA og omfatter 7533 basepar. Den innbefatter et for-sterkerelement som forsterker transkripsjon av mRNA fra cDNA'et som koder for tPA (se Gillies et al, Cell, 1983, infra og U.S. 4,663,281), og benytter vektorkonstruksjonsprinsipper som regulerer selektivt forsterkerfunksjonen ifølge det som er beskrevet i den samtidige US-patentsøknad nr. 837,595, innsendt 7. mars, 1986. Det naturlige 3' ikke-translaterte området av tPA-DNA med full lengde ble avskåret for å gi mRNA-stabilitet.

Vektoren som er beskrevet på Fig. 3 og 4, og andre passende ekspresjonsvektorer brukes ifølge oppfinnelsen til å transfektere myelomaceller, fortrinnsvis av musedyrsopprinnelse, såsom cellelinjen J558 (ATCC-TIB 6), Sp2/0-Agl4 (ATCC CRL 1581), og P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Den foretrukne myelomacellelinje er J558L (ATCC CRL 9132, se Oi et al, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, V. 80, s. 825 1983). Disse celler omfatter maligne transformanter av B-celler fra kretsløpsystemet til Balb/C-musen, og stammer fra myeloidvev. Bruken av myelomaceller fra mus- eller rotteopprinnelse foretrekkes fremfor human-myelomaceller, ettersom muligheten for kontaminasjon av det rekombinante tPA med humanvirus reduseres sterkt.

Det er blitt oppdaget at myelomaceller av den ovenfor beskrevne typen kan dyrkes i suspensjon eller fortrinnsvis i mikrokapsler ifølge fremgangsmåten som er beskrevet i US-patent nr. 4,409,331 til F. Lim. For å gjøre rensingen lettere og gi etter-sekresjonsstabilitet til tPA-produktet, foretrekkes det at cellene dyrkes i serumfritt medium og i nærvær av epsilon-aminokapronsyre. Det ekstracellulære proteinet kan høstes daglig ettersom mediet erstattes. Denne formen har fordelen ved å fremstille produktet hovedsakelig fritt for virkningen av kontaminerende proteolytiske enzymer, tPA-komplekseringsmidler og andre inaktiverende faktorer som ofte er tilstede i storfe-eller hestesera. Den foretrukne J558L-cellen utskiller lambda-lett-kjede av immunoglobulin A i betydelige mengder. Dette og andre kontaminerende proteiner kan lett adskilles fra tPA-produktet ved å bruke den enkle rensemetode som er beskrevet nedenunder. tPA-produktet renset ifølge denne fremgangmåten beholder aktiviteten til molekylet når det utskilles.

Det ble observert at tPA hefter til mange overflater innbefattet glass, og av denne grunn unngås normalt glass-apparatur- og andre glassflater under hele tPA-fremstillings-forskriften. Imidlertid er glass med stort overflateområde såsom materialet solgt i kuleform av forskjellige fabrikanter og kjent som "kontrollert poreglass" anvendelig i et første rensetrinn. tPA binder til glasset under passende pH-betingelser, mens immunoglobuliner f.eks. bare har lav ikke-spesifikk affinitet og vil gå gjennom eller kan elueres selektivt fra en kontrollert poreglasskolonne. Fraksjoner med mye tPA kan elueres fra glasset ved behandling med et passende elueringsreagens såsom tris-bufret saltvann. Den kontrollerte poreglassfraksjonering kan føre til en 40-50 gangers økning i konsentrasjon og en 30-40 gangers rensing av tPA-produktet fra det høstede medium.

Et ytterligere trinn i rensingen innbefatter vanlig affinitetskromatografi ved bruk av immobiliserte antistoffer, fortrinnsvis et monoklonalt antistoff mot en epitop på aktivatoren. tPA'et kan elueres fra antistoffmatrisen ved pH 3 ved bruk av citrationløsning. Deretter kan de tPA-holdige fraksjoner nøytraliseres til fysiologisk pH (EACA forhindrer tPA-utfelling ved denne pH). Denne løsningen har ofte et proteininnhold omfattende mer enn 90 % enkeltkjedet, aktivt, humant tPA, som typisk bare inneholder små mengder av to-kjedede materialer. Det kan være egnet for terapeutisk bruk som der, ettersom citratbuffer og EACA har blitt godkjent for intravenøs injeksjon.

Oppfinnelsen vil bli videre forståelig fra det følgende ikke-begrensende eksempel.

Fremstilling av tPA- produserende myelomatransformanter

En ekspresjonsvektor, pEMpl, ble konstruert fra de

følgende fragmenter: (a) et 2,25 kB PvuII-BamHI-fragment fra pSV2-gp_t (Mulligan and Berg, Science; V. 209, 1422-1427, 1980) inneholdende SV40-forsterkeren og tidlig regionspromotor,

E. coli qpt-genet, den SV40 lille tumor-antigen-mellomliggende sekvens og SV40-transkripsjonsavslutningen og polyadenylerings-signalene; (b) et 2,3 kB PvuII-EcoRI-fragment fra pBR322 inneholdende ampicillinase-genet og den bakterielle replikasjons-opprinnelse (Sutcliffe, Proe. Nati. Acad. Sei, USA, V. 75,

3737, 1978); (c) et 0,3 kB PvuII-EcoRI-fragment inneholdende en immunoglobulin-tungkjedeforsterker (Gillies et al, Cell, V. 33, s. 717-728, 1983); (d) et 0,25 kB SacI-BglII-fragment inneholdende metallotionein I-promotoren (Brinster et al, Nature, V.

296, 39-42, 1982); og (e) et 0,4 kB AvaII-HaeIII-fragment fra det 3' ikke-translaterte området (UT) av immunoglobulin-kappa-lettkjedegenet, som inneholder polyadenyleringssignalet (Max et al, J. Biol. Chem., V. 256, 5116-5120, 1981). Et 0,26 kB Xbal-BstNI-fragment inneholdende immunoglobulin-lettkjedepromotoren, TATAA-sekvensen, transkripsjonsbegynnelsessetet og de første 2 2 nukleotidene deretter, ble stump-ende-ligert til Sall-setet på en ende av IgH-forsterkersegmentet. Denne promotor-sekvensen ble satt til blokkforsterkning av transkripsjon av E. Coli qpt-genet med immunoglobulin-tungkjedeforsterkeren. Disse fragmenter ble ligert sammen i en rekke reaksjoner ifølge velkjente metodikker (se f.eks. Maniatis et al, Molecular Cloning:

A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982).

cDNA'et for tPA erholdtes ved standardteknikker (Maniatis, supra). PolyA+ RNA isolert fra dyrkede Bowe's celler ble primet med oligo (dT) for syntese av første kjede med revers transkriptase, nikk-translatert med RNase H og DNA-polymerase I for syntese av annenkjede (Gubler & Hoffman, Gene, V. 25, 263, 1983), metylert med EcoRI-metylase, ligert til EcoRI-linkere og innsatt i EcoRI-setet til lambda fagvektoren gtlO. Fag-plaquer ble undersøkt med radioaktivt merkede oligonukleotid-tPA-spesifikke prober, hvis sekvenser ble bestemt fra den publiserte DNA-sekvensen for tPA cDNA (Pennica et al, Nature, V. 3 01, s. 214-231, Januar, 1983). tPA-kloner som inneholder hele kodeområdet og ca. 800 basepar av 3' UT-område, ble identifisert og bekreftet ved nukleotid-sekvensbestemmelse.

De ekstremt lange 3' UT av tPA cDNA ble oppdaget å bevirke budbringer-RNA-ustabilitet. Hoveddelen av det 3' UT-området ble derfor fjernet ved spaltning ved Sau3A-setet som befinner seg 34 nukleotider nedstrøms for translasjonsstoppsetet. Et 1,7 kB-fragment inneholdende tPA cDNA med det avskårede 3' UT ble ligert til Xhol-linkere.

tPA cDNA-fragmentet ble så innsatt i det eneste Xhol-setet som foreligger i pEMpl-vektor og gav rekombinant plasmid pEMpl-tPA. Et diagram av vektoren pEMpl-tPA er vist på Fig. 4; vektorens fullstendige nukleotidsekvens er beskrevet i Fig. 3A-3D.

De tPA-holdige plasmidene ble transfektert i J558L myelomaceller ved protoplastfusjonsmetoden (Gillies et al, supra) . Celler inneholdende plasmidet og derfor gp_t-genet ble selektert ved dyrking i medier som inneholdt mykofenolsyre. Resistente kolonier inneholdende pEMpl-tPA ble underklonet og undersøkt med hensyn til tPA-ekspresjon. Syntesen og utskil-lelsen av tPA i mediet ble bestemt ved hjelp av en måling hvori tPA overfører plasminogen til plasmin, som deretter spalter det kromogene tripeptidet S2251 (Pennica et al, supra). Fordi det er kjent at serum inneholder inhibitorer for både tPA og plasmin (Coilen and Lijnen, CRC Critical Rewievs in Oncology/ Hematology, V. 4, 249-301, 1986), ble transformanter dyrket i 48 timer i serumfritt medium før måling. Aktiviteten ble målt i internasjonale enheter (IU) basert på en standard levert av World Health Organization og bekreftet ved en tPA-standard fra American Diagnostics, Inc.

Seksten av transformantene man fikk med pEMpl-tPA ble undersøkt etter tPA-aktivitet i mediet. Syv av de 16 var positive, idet aktivitetene varierte mellom 1000 og 6000 IU/ml.

Cellekultur

Et klon av de transformerte J558L-celler som var utplukket, ble selektert for videre eksperimenter medførende laboratorie-skalaproduksjon av tPA. En inokulum-kultur av klonet ble dyrket i Dulbecco's modifiserte Eagle Medium (Gibco, Catalogue #320-1965) tilsatt 10 % kalvefosterserum (Hazelton), penicillin, streptomycin og 2 mM glutamin.

Ca. 6xl0<9>levedyktige celler med en densitet på ca. lxlO<6>celler/ml (90 % levedyktighet målt ved trypan-blå-ekskludering) ble sentrifugert ved 1,25 K opm i 15 minutter. Supernatanten ble helt fra, og cellene ble gjenoppslemmet i det ovenfor beskrevne modifiserte Dulbecco's Medium (men serumfritt) ytterligere tilsatt 25 TI enheter/ml aprotinin (protease-inhibitor). 1500 ml alikvoter av cellesuspensjonen med en levedyktig celledensitet på ca. lxlO<6>celler/ml ble fordelt i Belco Microcarrier spinner Flasks. Kulturene ble inkubert ved 37°C i tre dager, sentrifugert, slått sammen og brakt til en konsentrasjon på 0,01 % overflateaktivt middel (Tween 80) og 5 mM EDTA.

At disse kulturer produserte tPA, ble bekreftet ved å ekstrahere 1 ml-prøver med en plastpipette. Semi-kvantitativ analyse med ELISA med hensyn på nærvær av tPA og en måling av tPA-aktivitet bekrefter at kulturene produserer et tPA, overveiende (mer enn 95 %) med en enkeltkjedet struktur.

For produksjon i stor skala ble cellemedium innkapslet ifølge fremgangsmåten til Lim (se US-patent 4,409,331), og dyrket i medium som inneholdt det dobbelte av den normale mengde aminosyrer og redusert CaCl2-konsentrasjon (EMA).

Et subklon som grodde godt i kapslene, ble isolert, dyrket i spinnerflasker som angitt ovenfor, og deretter brukt som en inokulum-kultur for en laboratorieskala-tPA-produksjonssats. Cellekulturen ble blandet med 1,6 % natriumalginat som ble formet til kuler og satt til en CaCl2-løsning og gav gelkuler inneholdende celler. Disse ble oppslemmet i en natriumklorid-løsning inneholdende 2 5 TI enheter/ml aprotinin. Kalsiumalginat-gelkulene ble vasket i saltvann tre ganger, oppslemmet seks minutter i en vandig løsning av poly-L-lysin (750 mg/l i 0,9 % natriumklorid) for å avsette en hydrogel-membran rundt gelkulene. Kapslene fikk sette seg, supernatanten ble suget av, og kapslene ble vasket i 60 ml 2 % CHES-buffer, pH 8,4, i en vandig løsning omfattende 0,6 % NaCl og 0,2 % CaCl2. Etter tre minutter ble kapslene vasket i 0,3 % CaCl2i tre minutter, fysiologisk saltvann i tre minutter, og deretter belagt en gang til med poly L lysin (ca. 62.000 dalton gjennomsnittlig molekylvekt) ved bruk av en 400 mg/l løsning av PLL i 0,9 % NaCl-vask i 5 minutter. Kapslene fikk så sette seg, ble suget av, vasket i saltvann og behandlet i 4 minutter i en 0,15 % natriumalginatløsning med lav viskositet. Kapslene ble deretter vasket en gang til med saltvann og to ganger (10 minutter, 6 minutter) i 55 mM natriumcitrat (i 0,9 % NaCl) for å få innmaten av kapslene tilbake i væskeform. Disse celle-holdige kapslene ble deretter vasket i saltvann, EMA-medium, EMA-medium tilsatt 5 % serum og epsilon-aminokapronsyre, og igjen med et medium inneholdende serum, epsilon-aminokapronsyre, 2 mM L-glutamin og 10 mM HEPES-buffer.

Kapslene inneholdt ca. 2,25xl0<6>celler per ml. 100 ml av kapslene ble dyrket i 1,5 1 medium i en 3 liters spinnerflaske. Den innkapslede kultur ble oppslemmet i EMA-medium tilsatt 5 % serum, 2 mM L-glutamin, 5 mM EACA og 10 mM HEPES i 13 dager.

Når den intrakapsulære celledensiteten var større enn ca. IO<7>celler/ml, ble kapslene vasket i serumfrie sterile medier

og deretter oppslemmet i et serumfritt medium omfattende EMA-mediet tilsatt 1 mg/ml storfeserumalbumin, 2 0 mikromolar jern-(III)fruktose, 1 mikrogram per ml av hver av linolensyre og oleinsyre, 5 mM EACA og 1,2 mikrogram per ml etanolamin. Den innkapslede kulturen holdes i dette medium i ytterligere 12 til 3 0 dager. Ca. 2/3 av mediumvolumet kan forandres daglig og oppbevares. Før forandring til serumfritt medium hadde celledensiteten nådd 2,8xl0<7>celler/ml kapsler. 39,7 % av

cellene var levedyktige, hvilket viste en levedyktig celledensitet på ca. I,llxl0<7>celler/ml. Etter forandring til det serumfrie medium var veksten langsom i to dager og begynte så å øke i 6 dager til, og nådde en høyde på 6,75xl0<7>totale celler/ml med en 48,3 % levedyktighet, og en samlet levedyktig celledensitet på 3,26xl0<7>celler/ml. Det tok ca. tre dager til for kulturen å dø av etter dens levedyktige celletelling hadde nådd toppen. Under de siste tre dagers dyrking falt den levedyktige celletelling, men likevel var det tilstrekkelig levedyktige celler til å la det totale antall celler/ml i kapslene nå nesten lxlO<8>.

Prøver av mediet ble tatt fra 15. dag til og med 25. dag og målt ved å bruke en aktivitetsmåling og en ELISA for å påvise tPA-produksjonen.

Rensing

tPA'et i mediet ble renset, først ved å utsette det for en glassmatrise med høyt overflateområde (kontrollert poreglass, Sigma PG-1,000-200) pakket i en kolonne. Kolonnen ble vasket med 4 liter 100 mM NaOH, etterfulgt av4liter 100 mM HC1 og 4 liter ionefritt vann. Kolonnen ble så påsatt serumfritt medium fra kulturen. Serumholdige medium kan brukes, men det reduserer kolonnens kapasitet sterkt. Mediet ble filtrert gjennom et 6 mikrometer Sealclean-filter og satt på CPG-kolonnen med en strømningshastighet på 255 cm/time. Kolonnen ble vasket med 4 liter buffer inneholdende 200 mM Tris HCl, pH 8,3, 5 mM EDTA, 0,01 % overflateaktivt middel (Tween 80), 5 mM EACA og 500 mM NaCl. Dette trinn eluerer svakt bundet protein, for eksempel alt aprotinin og den lette IgA-kjeden utskilt av de tPA-produserende kloner.

tPA-et elueres med 4 liter buffer inneholdende 500 mM tris HCl, pH 8,3, 5 mM EDTA, 0,01 % Tween 80, 5 mM EACA og 1,5 mM natriumklorid. Dette trinnet eluerer det bundne tPA, og gir en fraksjon som inneholder ca. 50 % tPA blandet med andre proteiner.

Kolonnen kan deretter vaskes med 4 liter 100 mM NaOH etterfulgt av 4 liter 100 mM HCl for å eluere alt gjenværende protein for resirkulering.

Den foregående fremgangsmåte fører til en 4 0-50 gangers økning i konsentrasjonen av tPA'et og 30-40 gangers rensing. Virkningsgraden av rensingen avhenger av mengden storfeserumalbumin og andre proteiner i utgangsmediet. tPA-utvinninger større enn 70 % oppnås rutinemessig ved denne separasjonen.

Dette råmateriale ble deretter renset videre med affinitetskromatografi. I dette trinnet ble fremgangsmåten til Kohler og Milstein brukt for å fremstille et hybridoma som utskiller et monoklonalt antistoff spesifikt for en epitop av det humane tPA-produkt. En Balb/C-mus ble immunisert med humant tPA fra American Diagnostics Inc. På dag 0 ble 10 mikrogram materiale

i fullstendig Freunds adjuvans injisert intraperitonealt (IP). Fjorten til femten dager senere ble ytterligere 10 mikrogram av tPA'et i ufullstendig Freunds adjuvans injisert IP som et skudd, og den 21. dag ble muse-sera undersøkt etter anti-tPA-aktivitet med ELISA. En 50 % styrke målt ved en større fortynning enn 1/1.000 ble tatt som en positiv avlesning.

De positive dyrene fikk 10 mikrogram tPA i fosfat-bufret saltvann innført IP og ble avlivet tre dager senere. Miltene deres ble presset gjennom en sikt for å gi en enkeltcelle-suspensjon. B-cellene og SP2/0 myeloma ble oppslemmet sammen ved et forhold på 4:1 B-celler til myeloma. Fusjonen ble utført ved 45 % polyetylenglykol (1000 dalton). Seleksjon av kloner ble utført i HAT-medium i 7 dager, og overlevende kloner ble dyrket i HT Dulbecco's minimums-essensielle medium tilsatt 10 % kalvefosterserum. Fusjonsfrekvensen var l-3xl0~<7>. De tPA-antistoff-utskillende kloner ble videre undersøkt etter et hybridoma som utskilte et antistoff som reagerte med både de dobbelt- og enkeltkjedede tPA-typene, men ikke reagerte med urokinase eller med tPA kompleksert med serum-tPA-inhibitor.

Det utplukkede hybridoma produserte følgelig monoklonalt antistoff mot en epitop av tPA'et som ikke inngitt i dets enzymatiske aktivitet.

En antistoff-gelkolonne ble fremstilt ved å immobilisere det tPA-monoklonale antistoff på cyanogenbromid-aktivert sepharose (Pharmacia) ifølge fremgangsmåten til Kohn og Wilchek (Biochem. Biophys. Res. Comm., V. 107, s. 878-884, (1982).

Gelen aktiveres i 60 % aceton ved -15 til -20°C med cyanogen bromid ved bruk av trietylamin som et "cyano-overførings"-reagens. Den aktiverte gelen overføres så til vann (4°C), og

antistoffet tilsettes oppslemmet i natriumkarbonatbuffer,

pH 8,3, inneholdende natriumklorid. Etter blanding i to timer ved romtemperatur, blokkeres de usubstituerte gruppene med etanolamin i karbonatbufferen. Normalt immobiliseres mellom 5 og 10 milligram antistoff per ml gel.

Anti-tPA-sepharosen pakkes i en 2,6 cm diameter kolonne, 4 cm høy, og ekvilibreres med 0,1 M natriumcitrat, pH 7,0, IM NaCl, 20 mM epsilon-aminokapronsyre og 0,01 % Tween 80. Kapronsyren kreves ettersom antistoffet er forurenset med protease, som kunne redusere utbyttet av tPA i mangel av en protease-inhibitor. Det delvis rensede tPA-produkt fra det kontrollerte poreglass-trinn inneholder 500 ml tris, 1,5 M NaCl, EDTA og overflateaktivt middel. Dets pH justeres til 7, og det settes på kolonnen. Etter prøve-påsetting vaskes kolonnen i citratbufferen for to kolonnevolumer, og deretter elueres tPA med 0,15 M sitronsyre, pH 3,0, tilsatt 2 0 mM epsilon-aminokapronsyre og 0,01 % Tween 80. Et eksempel på elueringsprofil er angitt i Fig. 5. tPA samles, og løsningens pH justeres til 7. Av det totale proteininnhold i disse elueringsvolumer er mer enn 95 % humant tPA.

Karakteriseringsdata

Typisk omfatter mer enn 90 % av den rensede tPA-blanding enkeltkjedede tPA-typer som vist ved adskillelse på reduserende geler.

Det rensede produkt ble underkastet natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel-elektroforese. Resultatene av eksperimentet er vist på Fig. 6. Fremgangsmåten ble utført på 10 % gel under reduserende betingelser ifølge metoden til Laemmli, NATURE, 227, 680-685 (1970). Sporene 1, 2 og 9 ble påsatt lavmolekyl-vektstandarder fra Pharmacia. Hvert av sporene 3-8 ble påsatt 5,0 mikrogram av forskjellige tPA-blandinger. Sporene 3 og 8 inneholdt tPA-blandingen fra oppfinnelsen. Sporene 4 og 7 inneholdt tPA fra separate kilder fremstilt ved ekspresjon i CHO-celler. Sporene 5 og 6 inneholdt duplikatprøver av en tPA-blanding fra Bowe's melanoma.

CHO-tPA vandrer langsommere enn både melanoma- og myeloma-tPA. Både CHO og Bowe's materiale vandrer som to adskilte bånd, og viser en molekylvektsheterogenitet som skyldes forskjeller i glykosylering. Det øvre båndet antas å skyldes formen av tPA med 3 N-bundne glykosyleringsseter, og det nedre båndet antas å skyldes formen med 2 N-bundne glykosyleringsseter. Myeloma-tPA</>et i denne oppfinnelsen har hovedsakelig den samme mobilitet som Bowe's melanoma-tPA, hvilket tyder på at dens glykosylering sannsynligvis ligner meget på "naturlig" tPA til forskjell fra materiale som stammer fra CHO.

N-terminal sekvensbestemmelse av myeloma-tPA på Applied Biosystems 470 og 477A gassfase-sekvensbestemmere tyder på

nærvær av to typer tPA, en som starter ved ser + 1 og den andre med sekvensen GLY ALA ARG før ser + l-form bestemt fra forholdet av primær- til sekundærsekvens oppnådd, under N-terminal-analyse. I Bowe's melanoma-tPA er forholdet mellom de to former 1:1 (Wallen et al Eur J. Biochem 132 s. 681-686, 1983).

tPA-blandingene fremstilt som angitt ovenfor, har blitt undersøkt utstrakt i in vitro-målinger og dyremodeller ved bruk av etablerte forskrifter for å bestemme dets virkning som et intravaskulært fibrinolytisk middel mot andre tPA-blandinger og andre fibrinolytiske preparater.

Et sett av in vitro-eksperimenter sammenlignet de spesi-

fikke aktivitetene til rekombinant, overveiende enkeltkjedet tPA-blanding fra denne oppfinnelsen ("DPA") med tPA fremstilt med Bowe's melanoma fra forskjellige kilder: enkelt- og dobbeltkjedede typer fra American Diagnostics, en dobbeltkjedet type fra Bioscot (BSdc) og en enkeltkjedet type. Den fibrinolytiske aktiviteten til de forskjellige tPA-typene ble målt ved å bestemme deres evne til å aktivere elementer i humant plasma (innbefattet plasminogen) til å lyse en<125>I-fibrinogen-merket sammenklumpning. Trombolysegraden ble beregnet fra mengden radioaktivitet frigjort fra sammenklumpningen til plasmaet. Fibrinogenolytisk aktivitet ble bestemt ved å måle mengden av

<125>I som var igjen i plasmaet etter utsettelse for tPA og derfor tilgjengelig for sammenklumpning. Disse in vitro-

undersøkelser viste dose-relaterte virkninger i det undersøkte området. Imidlertid ble ingen signifikante forskjeller i de lytiske aktiviteter for de forskjellige tPA'er observert.

Direkte og indirekte in vitro-aktivitetsmålinger av DPA mot en standard tPA (produsert fra Bowe's melanoma, American Diagnostics, Inc.) er også blitt utført. Den indirekte måling innbefatter det kromogene substrat S-2251; den direkte måling innbefatter substratet S-2288. Forsøksmetodene er velkjente (se f.eks. Current Status of Activity Assays for Tissue Plasminogen Activator, Enzyme Engineering, No. 7, Vol. 434). I den indirekte målingen bestemmes aktiviteten av forsøksprøven ved å måle fargeutviklingen av S-2251 ettersom den spaltes med plasmin. Plasmin produseres ettersom plasminogen spaltes av tPA'et i nærvær av fibrinogen. I den direkte måling spaltes tPA'et med plasmin og gir de dobbeltkjedede undertyper, plasminet inaktiveres og S-2288 settes til reaksjonsblandingen. Det tp-kjedede tPA virker direkte på substratet. Aktiviteten i er proporsjonal med fargeintensiteten. I begge fremgangsmåter ble substratkonsentrasjonene utover Km anvendt.

I den indirekte målingen viste DPA i nærvær av fibrinogen en aktivitet som var omtrent to ganger større enn for standard-tPA'et (ca. IO<6>enheter/mg); i den direkte målingen var aktiviteten til både DPA og standard hovedsakelig identisk.

I et separat forsøk ble aktiviteten av DPA'et målt ved å bruke et modifisert direkte forsøk innbefattende S-2288. Matrex Pd 102-kuler (Amicon) ble belagt med fibrinmonomer. Kulene er 1-2 mikron i diameter, og omfatter polyakrylnitril innbefattende N-hydroksysuksinimid-karboksylatestergrupper og fri karboksylgrupper for kovalent kobling med fri aminogrupper på protein. Fibrinogen ble koblet til kulene, og deretter omdannet til fibrinmonomer med trombin. Dette reagenset ble så brukt i den direkte aktivitetsmålingen. Disse eksperimentene viste mettbar, spesifikk binding av DPA til fibrin. DPA hydrolyserte S-2288 i fravær av fibrinmonomer med typiske genetiske konstanter på ca. 0,3 3 mM<-1>for Km og kca-t- =

3,51 s-<1>. I nærvær av oppløselig fibrinmonomer (67^g/ml dannet fra fibrinogen i nærvær av 1,5 mM glykoyl-prolyl-arginyl-prolin) enzymatisk aktivitet ble betydelig øket med Km

relativ konstant på ca. 0,34 mM-<1>, men kcat<=>9,02 s-1.

Resultatene av disse eksperimentene er grafisk illustrert på

Fig. 7. Denne aktivitetsøkningen frembrakt med fibrinmonomerer adskiller seg fra tilsvarende for CHO-avledet og Bowe's tPA,

hvori fibrin-indusert aktivering medfølges av en reduksjon i Km uten en signifikant økning i kca-t-. Med hensyn til naturlig forekommende tPA, skyldes aktivitetsøkningen i nærvær av fibrin en øket affinitet for plasminogen av fibrin-bundet tPA, og ikke forandring av den katalytiske hastighetskonstant (Houlaerts et al., J. Biol. Chem., 257, 2912, 1982). Observasjonen av den økede kca-(- for DPA i nærvær av fibrin koblet med den observasjon at nærvær av fibrinogen øker DPA-aktiviteten i det indirekte forsøket med overskudd substrat i forhold til naturlig materiale, tyder på at DPA erkarakterisert vedforskjellig farmakokinetisk virkning med en økning i Vmax i nærvær av fibrin.

En gruppe av in vivo-eksperimenter sammenlignet de trombolytiske virkninger og halveringstider av DPA med tilsvarende for BSdc og urokinase (UK) hos kaniner. Plasma-prøver oppnådd fra kaniner infusert med de forskjellige aktivator-løsninger ble undersøkt etter deres fibrinolytiske aktivitet ved lysingstidsmåling av fortynnet blodsammenklumpning. Plasma oppnådd fra kaniner behandlet med DPA lyset fullstendig en in vitro-sammenklumpning i løpet av en 24-timers inkuberingstid,

mens den som var oppnådd fra kaniner behandlet med BSdc eller UK, ikke gjorde det. Halveringstiden for DPA var sammenlignbar

med den for BSdc, men var kortere enn den for UK ved lignende konstanttilstands-konsentrasjoner.

Virkningene av disse trombolytiske midlene på koaguleringssystemet ble bestemt ved å måle protrombin-tid (PT) som påviser abnormaliteter i koaguleringsfaktorene VII, X, II, V og I for det utvendige forløp, og partiell tromboplastin-tid (PTT) som bestemmer svikter i koaguleringsfaktorene VIII, IX, X, XII, prekallikrien og kininogen for det innvendige forløp (samt for II, V, X og I) for plasma. Ingen signifikante forskjeller ble observert mellom DPA- eller BSdc-behandlet plasma og kontroll. Imidlertid var en forlengelse av PT tydelig i det UK-behandlede plasma.

Fibrinogenolytiske parametre for blod ble undersøkt under og etter infusjon med disse trombolytiske midler. Ingen signifikante forskjeller ble observert i konsentrasjonene av fibrinogen eller plasminogen i de tPA-behandlede grupper sammenlignet med kontroller; UK-behandling førte til reduksjoner av begge faktorer. Antiplasmin-nivåer i DPA-behandlede kaniner avtok til 62 % av kontrollen, og for BSdc til 46 % av kontrollen under infusjon, men disse nivåer ble gjenopprettet til kontroll-nivåer umiddelbart etter infusjon; nivåer i UK-behandlede

kaniner falt til 1 % av kontrollen under og etter infusjon.

Disse resultater tyder på at UK har en forlenget systemisk fibrinolytisk virkning i motsetning til tPA, og at DPA kan ha større klinisk verdi enn tPA som stammer fra Bowe's melanoma på grunn av sin økte trombolytiske aktivitet målt ved lysingstidsmåling av fortynnet blodsammenklumpning, og dets reduserte

virkning på konsentrasjonene av alfa-2-antiplasmin.

Andre arbeider søkte , å. sammenligne-' de -trombolytisket^,^-

virkninger av DPA med et tilsvarende for streptokinase (STR) i en in vivo-(hunde-)-modell av koronararterie-trombose. I disse eksperimenter ble koronararterie-infarkt frembrakt ved elektro-lytisk stimulering. Den nødvendige tid for å oppnå reperfusjon av arterien ble redusert hos hunder behandlet med en høy dose DPA i forhold til en mellomliggende eller lav dose, eller behandling med STR, selv om forskjellen ikke var statistisk signifikant. Med høy-dose-DPA-behandling var imidlertid ingen trombus tilbake tre timer etter medikamentinfusjon, og hyppig-heten av retrombose var lavere. I tillegg var DPA's trombolytiske aktivitet ved enhver undersøkt konsentrasjon større enn

for STR bestemt ved måling av trombus-massen, og denne aktiviteten virket på en dose-avhengig måte. PT, PTT og fibrinogen-analyse ble utført hovedsakelig som beskrevet ovenfor for å bestemme hvilke virkninger intravenøst DPA hadde på resirkuler-ende koaguleringsfaktorer. Målbar fibrin/fibrinogen-spaltning eller -spaltningsprodukter (FSP) var en indikasjon på den proteolytiske nedbrytning av fibrin/fibrinogen.

PT-, PTT-, FSP- og fibrinogen-nivåene var signifikant abnormale under og etter infusjon av høye doser av DPA- medikamentet. I tillegg ble en reduksjon i plasma-konsentrasjonen av fibrinogen samtidig med en økning i fibrin/ fibrinogen nedbrytningsprodukter (FSP) observert. Ved mellomliggende doser av DPA var disse målingene abnormale under infusjon, men vendte tilbake til nær normal etter infusjon.

Til tross for tidligere rapporter av systemisk fibrinolyse sammen med blødning etter STR-administrering, påviste under-søkelsen ingen vesentlige forandringer i blodkoagulerings-parametre; PT og PTT var sammenlignbare med kontroll både under og etter infusjon, og det var bare en svak reduksjon i plasma-fibrinogenkonsentrasjonen sammen med en moderat økning i FSP.

I den andre modellen (hunn) ble sammenklumpninger som inneholdt en gamma-kilde fremstilt i Chandler-sløyfer. Sammenklumpningene ble så overført til en ekstfakorporeal sløyfe, som deretter ble innført i halsvenen. De trombolytiske aktiviteter for IV-injisert DPA, både enkelt- og dobbeltkjedede undertyper, ble sammenlignet med sådanne for UK ved å kontrollere forsvinning av tellinger i kretsen (sammenklumpningslysing). Resultatene tyder på at DPA-enkeltkjede undersøkt ved 0,14 mg/kg gav 1,2 x mer lysing enn den samme konsentrasjonen av DPA-dobbeltkj ede.

I den tredje modellen som medførte venøs trombose hos kaniner, ble en trombus dannet i halsvenen fra<125>I-fibrinogen, blod og trombin. Trombolysen ble bestemt ved å måle isotop som ble frigjort i blodet. De økende doser av DPA's evne til å lyse sammenklumpningen ble sammenlignet med tilsvarende for tPA som stammet fra Bowe's melanoma og ble bestemt i andre under-søkelser ved å bruke den identiske modellen. Ved enhver undersøkt konsentrasjon hadde DPA større lytisk aktivitet i denne modellen enn tPA fra Bowe's melanoma. Disse resultater tyder på at DPA kan ha større klinisk verdi i noen in vivo-modeller enn i andre.

Enda en annen serie eksperimenter utført ved The University of Texas Health Science Center, sammenlignet effektiviteten av vevsplasminogen-aktivatorer fra muse-myelomaceller (DPA); fra kinesiske hamster-eggstokkceller (CHO tPA); og fra Bowe's melanomaceller (Bowe's tPA). Undersøkelsene ble foretatt ved å bruke kanin-halsvene-klumpmodellen som beskrevet av Coilen og en modifikasjon av denne modell som anvender en bolus-injeksjon utviklet i laboratoriet ved The University of Texas. DPA ble oppdelt i to typer basert på prosentdelen av enkeltkjedet tPA

(D-I var ca. 60 % enkeltkjedet, D-II var større enn 90 % enkeltkjedet. CHO tPA'et var ca. 75 % enkeltkjedet, og Bowe's tPA var ca. 90 % enkeltkjedet.

Halsveneklumpen ble fremstilt som beskrevet av Coilen og

fikk eldes i 30 minutter før klemmene ble fjernet. Vevsplasminogen-aktivatoren ble levert med en pumpe med konstant hastighet over et tidsrom på fire timer i den kontralaterale venen. Dosen ble fortynnet i 20 ml bærerbuffer (0,3 M NaCl med 0,01 % Tween 80). To milliliter ble gitt som en bolus-injeksjon og de gjenværende 18 ml ble gitt over 4 timers-tidsrommet. Blodplasma og blodprøver ble tatt ved 0, 1,0, 3,0 og 4,5 timer. Serumprøvene ble samlet i en aprotininløsning og ble brukt for fibrinogen-spaltningsprodukt-bestemmelser. Ved 4,5 timer ble klumpen fjernet, og trombolysegraden beregnet som en forskjell mellom den opprinnelige radioaktivitet som var i klumpen og den som var igjen i venesegmentet. Resultatene ble uttrykt i prosent av den opprinnelige radioaktivitet.

Plasmaprøvene ble analysert på standard-trombin-tid og på plasminogen-nivåer etter aktivering med urokinase. Serumprøvene ble også brukt for fibrinogen-spaltningsprodukt-bestemmelser.

Et annet sett eksperimenter ble utført ved å bruke den

samme klump-fremstillingsteknikk, men dosen ble gitt i en 2 ml bolus-injeksjon over et 5-minutters tidsrom. I disse eksperimenter ble blodplasma- og blodserum-prøver tatt ved 0, 0,5,

1,0 og 2,0 timer, og klumpen ble fjernet etter 2,5 timer.

Resultatene av klumplysingsbestemmelsene er vist i Tabell

I for 4-timers-infusjonseksperimentene og i Tabell II for bolus-injeksjonseksperimentene. Alle prøvene viste god lysing av klumpen, og det var ingen signifikant forskjell mellom prøver som ble gitt ved en kontinuerlig infusjon. De Bowe's tPA-behandlede kaniner ved bolus-injeksjon var mindre aktive enn både CHO og DPA, men denne observasjon bygget på ett eneste dyr.

Fibrinogen-spaltningsprodukter ble målt ved å bruke latex-partikkelmetoden kjøpt fra Wellcome Diagnostics. Forsøket ble bare kjørt på prøvene fra 0,5 mg/kg dosen. Disse prøver viste ingen målbare fibrinogen-spaltningsprodukter sammenlignet med standard positive kontroller frembrakt med diagnosesettet. Da ingen fibrinogen-nedbrytningsprodukter var å se ved den høyeste dosen, konkluderte man med at de lavere doser også ville være negative.

Oppfinnelsen kan utføres i andre spesifikke former.

Claims (18)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av en human vevsplasminogen-aktivatorblanding, hvilken fremgangsmåte omfatter trinnene: ekspresjon, i en dyrkbar myelomacellelinje, av et DNA valgt fra gruppen bestående av DNA'et til genet som er angitt i Fig. 2, alleliske varianter derav og et DNA som koder for den samme sekvens av aminosyrer, og høsting av en human vevsplasminogen-aktivator fra cellelinjen.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, omfattende trinnet ekspresjon av DNA'et i en J558L-celle, ATCC CRL 9132.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, hvori aktivatoren høstes fra et medium.brukt til å opprettholde metabolisme i ; cellelinjen, hvilken fremgangsmåte omfatter det ytterligere trinn rensing av aktivatoren ved å bruke en fremgangsmåte som medfører trinnene fraksjonering av proteiner i mediet på glass eller på en affinitetskromatografi-matrise omfattende bundet antistoff mot en epitop av aktivatoren.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, omfattende trinnene eluering av aktivatoren fra matrisen ved bruk av en citrat-løsning.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, omfattende trinnene dyrkning av myelomacellelinjen i porøse mikrokapsler oppslemmet i et medium.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 3, hvori mediet er fritt for serum.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, hvori myeloma-cellelinjen er plassert i et medium inneholdende EACA.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, omfattende det ytterligere trinn plassering av blandingen i en løsning av EACA for å opprettholde løseligheten derav.

9. Fremgangsmåte for rensing av en vevsplasminogen-aktivator omfattende trinnene å kontakte en vandig løsning inneholdende aktivatoren og andre proteiner med en matrise omfattende immobilisering av antistoff mot en epitop av aktivatoren for å fortrinnsvis binde aktivatoren til antistoffet, vaske matrisen og eluere aktivatoren med en citration-løsning.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, omfattende trinnet å samle en elueringsfraksjon fra matrisen med et totalt proteininnhold omfattende utover 90 vekt% av aktivatoren.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 9, omfattende det ytterligere trinn å fraksjonere proteinet i den vandige løsning på glass før kontakt med matrisen.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 9, omfattende det ytterligere trinn å plassere den eluerte aktivator i en vandig løsning av EACA for å opprettholde aktivatorens løselighet.

13. Human vevsplasminogen-aktivatorblanding med in vivo fibrinolytisk aktivitet omfattende en blanding av proteiner uttrykt fra DNA'et på Fig. 2, alleliske varianter derav, eller et DNA som koder for den samme aminosyresekvens i myelomaceller og er karakterisert ved : a. et glykosyleringsmønster som gir et par bånd som vist i Fig. 6 på tegningen når den rensede blanding underkastes SDS-polyakrylamidgel-elektroforese under reduserende betingelser; b. et enkeltkjede-proteininnhold utover 90 % av den totale vekt av aktivt protein i blandingen.

14. Blanding ifølge krav 13, videre karakterisert ved : å inneholde et første protein med en aminosyresekvens som angitt på Fig. 1, men er fri for de første 35 aminoterminale aminosyrerester, idet det første protein utgjør utover minst ca. 70 % av den totale vekten av aktivt protein i blandingen.

15. Blanding ifølge krav 14, videre karakterisert ved at den inneholder et andre protein med en aminosyresekvens som angitt på Fig. 1, men som er fri for de første 32 aminoterminale aminosyrerester.

16. Blanding ifølge krav 13, videre karakterisert ved en øket kca^ i nærvær av f ibrinmonomer i forhold til kca-t- i mangel av fibrin målt ved hydrolyse av det kromogene substrat S-2288.

17. Blanding ifølge krav 13 eller 14, plassert i en fysiologisk fordragelig citratløsning.

18. Blanding ifølge krav 13 eller 14, karakterisert i en fysiologisk fordragelig EACA-løsning.