NO874320L - Fremgangsmaate for bestemmelse av funksjonelle nivaaer av protein c i humant plasma, og tilknyttede reagenser. - Google Patents

Description

Protein C (PC) ble isolert fra kvegplasma av Stenflo i 1976 og fra humant plasma av Kisiel i 1979". Det syntetiseres av leveren, og en slik syntese er vitamin K-avhengig. PC tilhører proteinene av prothrombinkomplekset og er et antikoaguleringsmiddel som inaktiverer faktor VIII C og V i levringskaskaden ved proteolyse.

Kongenital mangel på protein C forårsaker faktisk død på grunn av tilbakevendende venøs trombose og pulmonar embolisme (Griffin et al., 1981).

Lik andre levrende enzymer er PC normalt til stede i plasma som zymogen og omdannes til sin aktive thrombinform ved tilsetning av den endoteliale-celle-assosierte protein-cofaktor thrombomodulin i nærvær av Ca<++->ioner.

Meget stor interesse er knyttet til funksjonell bestemmelse av PC ettersom mer eller mindre alvorlig mangel på dette protein er en thrombose-risikofaktor. Muligheten for å utføre denne funksjonelle bestemmelse i laboratoriet, sammen med tester på andre biohumorale faktorer, vil muliggjøre at thrombotisk predisponerte personer kan identifiseres mer nøyaktig.

Tre metoder for funksjonell bestemmelse av PC er allerede blitt foreslått og er hovedsakelig basert på de prinsipper som er beskrevet i det etterfølgende.

1) I den første av disse metoder (Francis R.B., Jr. og Patch M.J.; Thromb. Res. 32; 605-613, 1983) separeres PC delvis fra plasma ved adsorpsjon med bariumcitrat, prothrombinkomplekset elueres deretter med en MES-citratbuffer, pH 6, og PC aktiveres ved tilsetning av thrombin til eluatet, og blandingen inkuberes deretter i en time ved 37°C. I og med at den biologiske aktivitet av aktivert PC (PCa) vises ved bestemmelse av forlengelsen fremkalt av dette av den partielle thromboplastintid (PTT) av et plasmasubstrat, må restthrombin fra

PC-aktiveringsreaksjonen fullstendig nøytraliseres.

Dette gjøres ved tilsetning av antithrombin III, heparin og protaminsulfat til reaksjonsblandingen. Samtidig anvendelse av fire substanser som er av ekstraksjonsopprinnelse og som utviser biologisk aktivitet (thrombin, antithrombin III, heparin og protaminsulfat) gjør denne metode vanskelig å anvende i vanlig laboratoriepraksis.

2) I den andre av angitte metoder (Comp P.C., Nixon R.R. og Esmon C.T.: Blood, 63; 15-21, 1984) aktiveres PC direkte i rekalsifisert plasma med et ekvimolekylært kompleks av thrombin og thrombomodulin. Det aktiverte PC (PCa) separeres deretter fra aktiveringsblandingen ved immunoadsorpsjon med en gel bestående av perler av agarose belagt med et antistoff rettet mot humant protein C. Da PCa - selv ved binding til gelen -

opprettholder sin amidolyttiske aktivitet på det kromogene substrat S-2238, kan det til sist bestemmes kolorimetrisk. På grunn av de rådende vanskeligheter med hensyn til lokalisering av thrombomodulin, kan denne metode bare utføres i

forskningslaboratorier som er spesialiserte når det gjelder studiet av thrombotiske sykdommer.

3) I den tredje av angitte metoder (Martinoli J.L., Stocker K.: Thrombosis Research, 43; 253-264, 1986) aktiveres

PC direkte ved anvendelse av giften av et reptil av arten Agkistrodon Contortrix, og den PCa-funksjonelle bestemmelse utføres på et PC-fattig plasmasubstrat, enten ved en levringsbestemmelsesmetode eller ved en kolorimetrisk metode på det kunstige kromogene substrat BCP 300.

For at denne bestemmelse skal kunne utføres, kreves PC-fattig plasmasubstrat, og de involverte kostnader økes derfor sterkt.

Formålet med foreliggende oppfinnelse er å utvikle en metode for funksjonell bestemmelse av PC som kan utføres med akseptable kostnader og ikke for kompliserte teknikker i vanlige analyselaboratorier, og som har en høy nøyaktighet og reproduserbarhet.

Ifølge oppfinnelsen tilveiebringes således en fremgangsmåte for bestemmelse av funksjonelle nivåer av protein C i humant plasma, omfattende følgende trinn: absorpsjon av PC i plasma på materiale som har en høy affinitetsgrad for proteinene av prothrombinkomplekset; covalent binding av en PC-aktivator til et perlebærermedium; anbringelse av PC og aktivatoren på bærermediet i kontakt for å aktivere PC; separering av det aktiverte PC fra aktivatoren på bærermediet; og utførelse av en funksjonell bestemmelse av det således separerte PCa.

I den funksjonelle bestemmelsesmetode ifølge oppfinnelsen består bærermediet for aktivatoren fortrinnsvis av perler av polymeriserte dextraner (f.eks. Sepharose^ (R), "Affi-Gel", "Ultrogel" eller "Magnogel"), og aktiviteten av PCa måles ved en levringsbestemmelse på et plasmasubstrat bestående av en normal plasmaansamling eller ved en kolorimetrisk bestemmelse under anvendelse av et kromogent substrat som ikke nødvendigvis er spesifikt for PCa.

Ved den nye metode ifølge oppfinnelsen separeres PC delvis fra de andre plasmaproteiner ved adsorpsjon på materialer som har en høy affinitetsgrad for proteinene av prothrombinkomplekset (slik som anioniske bytterharpikser av bariumcitrat eller aluminiumhydroxydgel). Valg av hvilket av de forskjellige separasjonsmidler som skal anvendes, kan foretas alt etter de bestemte krav som stilles av laboratoriepersonalet (laboratorieutstyr, utøvelsestid, antall prøver som skal undersøkes, etc).

Den delvise rensing av PC nødvendiggjøres av nærvær av den fysiologiske PCa-inhibitor i plasmaet.

Ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen finner PC-aktiveringsreaksjonen sted i et heterogent system hvori PC-aktivatoren har et bærermedium bestående av perler. Dette muliggjør at aktivatoren kan fjernes fra PCa når aktiveringsreaksjonen er fullført, uten å måtte anvende reaksjoner for nøytralisering av aktivatoren, hvilket gir bestemmelsen bedre reproduserbarhet sammenlignet med f.eks. den ovenfor angitte kjente metode 1).

Følgelig kan variasjonskoeffisienter lavere enn 7% lett oppnås, og den nye fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen kan anvendes i stor målestokk, dvs. for gjentatte antall av

bestemmelser.

CR)

Aktivatorene ble bundet til Sepharose4^ CL 4B i henhold til angivelsene gitt av fabrikanten, og en covalent binding mellom aktivator og perlene ble således erholdt. Denne binding er så stabil at det erholdte reagens kan lagres ved +4°C i minst 24 måneder uten noe tap av biologisk aktivitet.

Følgende aktivatorer ble anvendt: humant thrombin, kvegthrombin og fraksjon erholdt fra renset Agkistrodon Contortrix gift.

Aktivering med thrombin, både humant og kveg, ble utført ved å bringe et eluat av prothrombinkompleks i kontakt med en suspensjon av thrombin-perler i aktiveringsbuffer bestående av 0,05 M Tris-buffer, pH 8, inneholdende 0,15 M NaCl og 1 g/l kvegalbumin ved 37°C i 60 minutter. Resultatene erholdt med de to typer thrombin, var praktisk talt de samme.

Agkistrodon Contortrix gift er en kompleks blanding av proteiner som har forskjellig biologisk aktivitet, og elektroforese med høy oppløsning (isoelektrisk fokusering med bred pH-gradient) har vist minst 25 bånd, mesteparten for et forskjellig protein. Tre biologiske aktiviteter er blitt identifisert for den angjeldende gift: en fibrinogenolyttisk aktivitet som fjerner fibrinopeptid B, en thrombin-lignende amidolyttisk aktivitet på substrat S-2238 (eller analogt substrat) som er distinkt forskjellig fra den tidligere aktivitet, og en aktivitet vedrørende in vitro-aktivering av humant PC.

Ved binding av giftfraksjonen svarende til denne

(r)

sistnevnte aktivitet til Sepharosev-^Cl-4B-perler/ har det vist seg mulig å aktivere humant PC inneholdt i et eluat av prothrombinkompleks i et tidsrom på 5 minutter ved 37°C eller ved omgivende temperatur.

Denne sistnevnte type av aktiveringsreaksjon tilveiebringer de nedenfor angitte fordeler i forhold til de tidligere angitte kjente metoder 2) og 3): a) aktiveringsreaksjonstiden er praktisk talt sammenlignbar med den som erholdes med thrombin-thrombomodulin-komplekset slik at problemer forbundet med erholdelse av thrombomodulin ikke lenger oppstår, idet dette ikke anvendes;

b) ved levringsbestemmelse med hensyn til PCa er PC-fattig plasma ikke lenger nødvendig som plasmasubstrat ved at PC er

delvis renset før det aktiveres, og aktivatoren anvendes som en bærer.

PCa-aktiviteten kan bestemmes som tidligere angitt, enten ved levringsbestemmelse eller kolorimetrisk.

Ved levringsbestemmelsen foretas det en bestemmelse av inhiberingen med PCa i testprøven av aktivert, partiell thromboplastin-tid (aPTT) av normalt, oppsamlet plasma. Kort angitt, inkuberes 0,05 ml normalt, oppsamlet plasma i 3 minutter ved 37°C med 0,1 ml av et aPTT-reagens (Cephalin +

Hagemans faktor, dvs. faktor XII) og med 0,5 ml av løsningen inneholdende PC, og når denne inkubering er fullført, rekalsifiseres blandingen med 0,1 ml 0,025 M CaCl2 / og levringsdannelsen nedtegnes.

Forlengelsen av PTT er korrelert med mengden av PCa inneholdt i testprøven, som vist i medfølgende figur 1 som viser mønsteret av en dose-effektkurve erholdt ved blanding av normalt, oppsamlet plasma og et PC-fattig plasma. Kurven er lineær som bestemt ved følgende par av forsøksverdier:

I den kolorimetriske bestemmelse bestemmes den amidolyttiske aktivitet av PCa på kromogent substrat (eksempelvis S-2366, eller andre, både spesifikke og ikke-spesifikke), idet reaksjonen utføres i en 0,15 Tris-buffer, pH 8, inneholdende 0,15M NaCl og 1% PEG 6000, og hvor konsentrasjonen av substratet er 2mM. Denne reaksjon kan overvåkes kinetisk ved 405 nm eller kan bestemmes ved å stoppe reaksjonen med 50% eddiksyre etter et egnet tidsrom.

Også i dette tilfelle kan den amidolyttiske aktivitet korreleres med mengden av PC i testprøven, som vist i den medfølgende figur 2, hvor det er lineær korrelasjon bestemt ved følgende par av forsøksverdier:

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan forskjellige teknikker anvendes for å bringe PC i kontakt med aktivatoren på dets perle-bærermedium. Lettheten med hvilken perlene kan separeres, gjør valg av spesifikk teknikk ikke kritisk, men ikke desto mindre kan det særlig vise seg å være hensiktsmessig å utføre kontakten mellom PC og perlene som tjener som en bærer for aktivatoren, ved hjelp av kolonner som inneholder perlene, gjennomstrømmet av det eluerte PC, og lengden av kolonnen vil bestemme den tid det tar for eluatet å passere gjennom den og således også kontakttiden mellom PC og aktivatoren i dens bærer. På denne måte unngås separering av perlene fra PC selv om dette er en enkel operasjon.

EKSEMPEL

Det etterfølgende eksempel på en praktisk

utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ble utført under anvendelse av adsorpsjonen av PC med aluminiumhydroxyd, idet aktiviteten av PCa ble bestemt både ved levringsbestemmelse og kolorimetrisk bestemmelse.

Til 1 ml testplasma ble tilsatt 100 mikroliter aluminiumoxydgel. Suspensjonen ble omrørt i 10

minutter ved omgivende temperatur og ble deretter sentrifugert i 10 minutter ved 3500 opm. Proteinene av prothrombin—komplekset ble eluert fra gelen med 100 mikroliter 0,2 M Na-fosfat, pH 8, og eluatet ble deretter fortynnet med 1:11 0,15 M NaCl.

100 mikroliter av det fortynnede eluat ble inkubert i 5 minutter ved 37°C med 50 mikroliter perler aktivert med fraksjonen av Agkistrodon Contortrix gift, og PCa ble separert fra aktivatoren ved kort sentrifugering (1 minutt ved 200 opm).

Ved levringsbestemmelsen med hensyn til PCa ble 50 mikroliter oppsamlet plasma inkubert i 3 minutter ved 37°C med 100 mikroliter aPTT-reagens og med 50 mikroliter av løsningen inneholdende PCa, og etter endt inkuberingsperiode ble blandingen rekalsifisert med 100 mikroliter 0,025 M CaCl2/og levringsdannelsestiden ble nedtegnet.

Ved den kolorimetriske bestemmelse med hensyn til PCa ble 100 mikroliter av PCa-løsningen blandet med 100 mikroliter 0,15 M Tris-buffer, pH 8, 0,15 M NaC!L1% PEG 6000, inneholdende 2 mM S-2366. Etter 3 minutter ble reaksjonen stoppet ved tilsetning til blandingen av 100 mikroliter 50% eddiksyre. Fargen som var. dannet under reaksjonen, ble målt ved 405 nm

under anvendelse av en blindprøve bestående av alle reagenser bortsett fra PCa.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte for bestemmelse av funksjonelle nivåer av protein C i humant plasma, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: adsorpsjon av PC tilstedeværende i plasmaet på materiale med en høy affinitetsgrad for proteinene av prothrombinkomplekset; binding av en PC-aktivator til et perle-bærermedium; anbringelse av PC og aktivatoren på bærermediet i kontakt med hverandre for å aktivere PC; separering av det aktiverte PC fra aktivatoren på bærermediet*, og utførelse av en funksjonell bestemmelse på det således separerte PCa.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at aktivatoren er bundet til perlene med en covalent binding.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at perlene er perler av polymerisert dextran.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at aktivatoren omfatter minst én fraksjon av Agkistrodon Contortrix slangegift.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at bestemmelsen for å bestemme funksjonelle nivåer av PC er en kolorimetrisk bestemmelse.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at testen for bestemmelse av funksjonelle nivåer av PC er en levringsbestemmelse.

7. PC-aktiverende reagens for utførelse av fremgangsmåten ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfatter en aktivator av PC bundet til perler.

8. Reagens ifølge krav 7, karakterisert ved at aktivatoren er bundet til perlene ved hjelp av en covalent binding.

9. Reagens ifølge krav 1, karakterisert ved at angitte perler er polymeriserte dextranperler.

10. Reagens ifølge krav 1, karakterisert ved at angitte aktivator omfatter minst én fraksjon av Agkistrodon Contortrix slangegift.