JPS63111469A - ヒト血漿中の蛋白質ｃの官能性レベルの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト血漿中の蛋白質Ｃの官能性レベルの測定
方法、及びそれに用いる試薬に関する。

蛋白質Ｃ（本明細書でｒＰＣｌと略記することがある。

）は、１９７６年にステンフロ（Ｓｔｅｎｆｌｏ）によ
ってウシ血漿から、そして１９７９年にキジール（Ｋｉ
ｓｉｅｌ）によってヒト血漿から、分離された。

これは肝臓によって合成され、その合成はビタミンに依
存性である。ＰＣは、プロトロンビン錯体の蛋白質類に
属し、そして蛋白質加水分解による凝固カスケードにお
いて因子■Ｃ及び因子Ｖを不活性化させる抗凝血体であ
る。

先天性の蛋白質Ｃ欠乏症は、再発性静脈血栓症及び肺静
脈塞栓症による死を引き起こす［１９８１年、グリッツ
イン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）等］。

その他の凝血酵素と同様に、ＰＣは正常にはチモーゲン
の形で血漿中に存在し、そしてＣａ　　イオンの存在下
での内皮細胞会合蛋白質助因子トロンボモデュリンの添
加によりその活性なトロンビン形に転化される。

この蛋白質の多少なりともの深刻な欠乏は血栓症の危険
要因であるのでＰＣの官能性測定分析に大きな興味が注
がれている。その他の体液指標のための試験と共に、研
究室においてこの官能性測定分析が実施できれば、血栓
症原因事項事物を一層正確に特定することが可能となろ
う。

ＰＣ官能性分析測定法として三つのものが、既に提案さ
れており、これらのものは主として下記の如き原理に基
いている。

（１）第１の方法〔フランシス（Ｆｒａｎｃｉｓ）　Ｒ
，Ｂ、　Ｊｒ。

及びパッチ（Ｐａｔｃｈ）　Ｍ、　Ｊ、の論文ｒＴｈｒ
ｏｍｂ。

Ｒｃｓ、Ｊ　３２　；　６０５−６１３．１９８３参照
〕においては、ＰＣはクエン酸バリウムでの吸着によっ
て血漿から部分的に分離され；次いでプロトロンビン錯
体がＭＥＳクエン酸塩緩衝液（ｐＨ６）で溶離され；そ
の溶離液にトロンビンを添加することによりＰＣが活性
化され；次いでその混合物が３７℃において１時間イン
キュベートされる。活性化されたＰＣ（ＰＣａ）の生物
学的活性が、それによって引き起こされる血漿基質の部
分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）の延長を測定する
ことにより証明されれば、ＰＣ活性化反応からの残留ト
ロンビンは完全に中和されなければならない。

これは、反応混合物に対して、抗トロンビン■、ヘパリ
ン及びプロタミンサルフェートを混合することにより実
施される。抽出によって取得され、生物学的活性を有す
る４種の物質（トロンビン、抗トロンビン■、ヘパリン
及びプロタミンサルフェート）を同時に使用することに
より、この方法は日常的な研究室業務に採用されるのが
困難である。

（２）第２の方法〔コンブ（Ｃｏｍｐ）　　Ｐ、　Ｃ，
、ニクソン（Ｎｉｘｏｎ）　Ｒ，Ｒ，及びエスモン（Ｅ
ｓｍｏｎ）　Ｃ，Ｔ。

の論文ｒＢＩｏｏｄＪ　６３　；　１５−１２．１９８
４参照〕において、ＰＣは、カルシウム再添加血漿中で
トロンビン及びトロンボモゾュリンの等モル錯体によっ
て直接に活性化される。この活性化されたＰＣ（ＰＣａ
）は、ヒト蛋白質Ｃに対向された抗生物質を被覆された
アガロースのビーズからなるゲルを用いての免疫吸着に
よって、活性化処理混合物から分離される。最後に、ゲ
ルに結合されてもＰＣａは色原体基質Ｓ　−２２３８〔
スエーデン、カビ・ダイアグノスチカ（ＫａｂｉＤｉａ
ｇｎｏｓｔｉｃａ））上でそのアミド分解活性を維持す
るので、それは比色分析法で測定できる。最近トロンボ
モゾュリンを探し出すのが困難であるので、この方法は
血栓症の研究の専門の研究所でもっばら実施されうる。

（３）第３の方法［マーチノリ（Ｍａｒｔｉｎｏｌｆ）
　Ｊ、　Ｉ。

ストッカ（Ｓｔｏｃｋｅｒ）　Ｋ、の論文ｒ　Ｔｈｒｏ
ｍｂｏｓｉｓＲｅｓｅａｒｃｈＪ　４３　；　２５３−
２６４．１９８８参照］において、ＰＣはアゲキストロ
トンφコンドルトリクス（Ａｇｋｌｓｔｒｏｄｏｎ　Ｃ
ｏｎｔｏｒｔｒｉｘ）種のヘビの蛇毒の使用により直接
活性化され、ＰＣａ官能性測定分析は、凝固法または比
色法のいずれかによって、人工色原体基質Ｂ　ＣＰ　３
００上で、ＰＣ欠乏血漿基体についてなされる。

この分析方法を実施するのには、ＰＣ欠乏血漿を必要と
し、従って費用が非常にかさむ。

本発明の目的は、許容しうる費用で、また著しく複雑な
技法を用いずに、普通の分析試験所で実施でき、かつ高
い精度及び再現性を有するＰＣの官能性分析方法を具体
化することである。

この目的の達成のために、本発明は、ヒト血漿中に存在
する蛋白質Ｃ（ＰＣ）をプロトロンビン錯体の蛋白質類
に高度の親和性を有する物質に吸着させ；ビーズ状支持
媒体に対して蛋白質Ｃ（ＰＣ）活性化剤を結合させ：そ
の蛋白質Ｃ（Ｐ　Ｃ）と支持媒体上の活性化剤とを接触
させて蛋白質Ｃ（ＰＣ）を活性化させ；活性化された蛋
白質Ｃ（ＰＣａ）を支持媒体上の活性化剤から分離し；
このようにして分離された活性化蛋白質Ｃ（ＰＣａ）に
ついて官能性レベル測定を実施する；ことからなるヒト
血漿中の蛋白質Ｃの官能性レベルの測定方法を提供する
。

本発明の官能性レベル測定方法において、活性化開用の
支持媒体は、重合したデキストランのビーズからなるの
が有利である。例えば、スエーデン、ウプサラのファー
マシアφファイン・ケミカルス社の商標ｒ　５ｅｐｈａ
ｒｏｓｃＪのもの、米国カリフォルニヤ州リッチモンド
のバイオ・ラッド社の商標ｒＡｆｆｉ　−Ｇｅ１Ｊのも
の、フランスのＩＢＦ−ＬＫＢ社の商標ｒ　Ｕ　Ｉ　ｔ
　ｒｏｇｅ　Ｉ　ＪまたはｒＭａｇｎｏｇｅｌＪのもの
等がある。またＰＣａの活性は、正常血漿質を用いての
比色分析法により、測定するのが有利である。

本発明の新規な方法においては、プロトロンビン錯体の
蛋白質類に対して強度の親和性を示す物質（例えばクエ
ン酸バリウムまたは水酸化アルミニウムのアニオン交換
樹脂）にＰＣを吸着させることによりその他の血漿蛋白
質類からＰＣを部分的に分離する。異なる分離手段のう
ちのどれを採用選択するかは、研究者または実施者の個
々の要件（研究室設備、実施時間、分析されるべき試料
数等）に応じて行うことができる。

ＰＣの部分的精製は、血漿中に生理的ＰＣａ抑制因子が
存在するために、必要とされる。

本発明の方法によれば、ＰＣ活性化反応は、ＰＣ活性化
剤がビーズから構成されたベヒクルまたは支持媒体に付
着されている不均一系において行なわれる。このため、
活性化反応が完了したときには、活性化剤を中和するた
めの反応使用する必要なく、ＰＣａから活性化剤を除去
することが可能となり、またこれによって、例えば上記
の公知方法（１）と比較して一層良好な再現性を与える
ことができる。

その結果として、７％以下の変動係数が容易に得られ、
従って本発明方法は大規模に、すなわち多数の分析操作
に応用できる。

スエーデン、ウプサラのファーマシア中ファイン・ケミ
カルス社製のｒｓｅｐｈａｒｏｓｅｃＬ　　４ＢＪ（商
標）に対して該社の使用指針に従って活性化剤を結合し
、これにより活性化剤とそのビーズ（支持媒体）との間
に共有結合を生じさせた。この結合は安定であるので、
得られたこの試薬を＋４℃で少なくとも２４ケ月間貯蔵
することができ、しかも生物学的活性の損失は全くない
。

ヒトのトロンビン、ウシのトロンビン、及び精製アグキ
ストロドン・コントルトリクス種の蛇毒から得た区画、
の三種の活性化剤を用いた。

ヒト及びウシのトロンビンでの活性化は、プロトロンビ
ン錯体の溶離液を、０．０５Ｍ　トリス緩衝液（ｐＨ８
）及び０．１５ＭのＮａＣΩとＩｇ／Ｎのウシ・アルブ
ミンからなる活性化緩衝液（３７℃）中のトロンビン・
ビーズ懸濁物と６０分間接触させることにより実施した
。この二つのタイプのトロンビンで得られた結果は、実
用上同じであった。

アグキストロドン・コントルトリクス蛇毒は種々の生活
性を有する蛋白質類の複雑な混合物である。高解像電気
泳動法（広いｐＨ傾斜での等電化焦点）で少なくとも２
５本の帯が示され、そのほとんどは別異の蛋白質のもの
であった。ここで用いた蛇毒について三種の生活性が示
された。

すなわち、フィブリノペプチドＢを除去するフィブリン
分解活性；前記活性とは異なり、基質Ｓ−２２３８（ま
たは類似基質）上でのトロンビン類似のアミド分解活性
；及びヒトＰＣのインビトロ活性化に関係する活性；で
あった。

この最後に述べた活性に対応する蛇毒区画をｒＳｅｐｈ
ａｒｏｓｅ　ＣΩ−４Ｂ」　（商標）ビーズに結合する
ことにより、プロトロンビン錯体の溶離液中に含まれた
ヒトＰＣを３７℃または周囲温度において５分間で活性
化できることが証明された。

この後者のタイプの活性化反応は下記のごとき利点を〔
公知方法（２）及び（３）と比較したときに〕与える。

（ａ）活性化反応時間は、トロンビンートロンボモデュ
リン錯体で得られたものと比肩でき、従ってトロンボモ
デュリンの入手に関連した問題はもはや生じない（それ
を使用する必要がない）。

（ｂ）ＰＣａについての凝固分析において、ＰＣ欠乏血
漿は血漿基質としてもはや必要ではない。

なんとなればＰＣは活性化前に部分精製され、活性化剤
はベヒクルとして使用されるからである。

Ｐｅａ活性は前述のように比色分析法または凝固分析法
によって、分析できる。

凝固分析法においては、試験試料中のＰＣａによる正常
貯留（血液）血漿の活性化部分的トロンボプラスチン時
間（ａＰＴＴ）の抑制により推定が行なわれる。簡潔に
述べると、０．０５ｍ１の正常貯留（血液）血漿を、０
．１ｍｌのａＰＴＴ試薬〔セファリン（Ｃｅｐｈａｌｉ
ｎ）　＋　ヘイグマン（ｌｌａｇｅｍａｎ）因子、すな
わち因子Ｘｆｉ）及び０．５ｍｌのＰＣ含有溶液と共に
、３７℃で３分間インキュベートし、このインキュベー
ションが終了したときに混合物を０．１　ｍｌの０．０
２５ＭのＣａＣΩ２でカルシウム再添加処理して凝血形
成を記録する。ＰＴＴの延長を試験試料中に含まれるＰ
Ｃａの世と関係づける（第１図参照）。第１図は正常血
液（貯留）血漿とＰＣ欠乏血漿との混合により）昇られ
る（Ｐ　Ｃａ添加の効果）曲線パターンを示すものであ
る。このパターンは線型であり、下記の実験データ対か
ら決定された。

Ａ（添加量）％　　　ａＰＴＴ（秒） １２．５　　　　　　　　　　　　４０比色分析法では
、ＰＣａのアミド分解活性を色原体基質〔例えばＳ　−
２３６６、カビ・デアグノスチカ、（スエーデン）ある
いはその他のもの；特異性及び非特異性のいずれも〕で
測定する。この反応は、Ｏ，１５ＭのＮａＣ，Ｑ及び１
％のＰ　Ｅ　Ｇ６ＱＯＯを含む０．１５Ｍ　トリス緩衝
液（ｐＨ８）中で実施され、その基質の濃度は２ＩＩＩ
Ｍである。この反応は４０５ｎｍで化学速度論的に観察
記録され、適当な時間経過後に５０％酢酸で反応を停止
させることにより、特定時間の終りに反応速度を推定で
きる。この場合にも、アミド分解活性を試験試料中のＰ
Ｃ量と相関させる（第２図参照）。この図は下記の実験
データ対から決定されて線型相関を示す。

Ａ％　（Ｐ　Ｃ）　　　　　　　　Ｏ，Ｄ。

１００−　　　　　　　　　　０．９７７５０　　　　
　　　　　　０．５７２ ２５　　　　　　　　　　０．３４８ １２．５　　　　　　　　　０．２４００　　　　　　
　　　　　０．１４７ 本発明による方法では、ＰＣをビーズ支持媒体上の活性
化剤と接触させるためにいろいろな方法を用いることが
できる。ビーズを容易に分離できるので、特定の技法の
選択を必須としない。それにもかかわらず、ＰＣと活性
化剤のベヒクルとして働くビーズとの間の接触を、その
ビーズを含むカラムを用い、そのカラムに溶離ＰＣを通
過させるのが殊に好適であろう。そのカラムの長さは、
それを溶離液が通過するのに要する時間、従ってＰＣと
そのベヒクル中の活性化剤との間の接触時間を、決定す
ることになる。このようにして、簡単な操作ではあるけ
れどもＰＣからのビーズの分離は省かれる。

実施例 本発明の方法の実施の一例として以下に示す実施例は水
酸化アルミニウムＡｊ！（ＯＨ）３によりＰＣを吸着さ
せることにより行なわれ、ＰＣａの活性は、凝固分析法
及び比色分析法の両方により測定した。

試験血漿１ｍｌに対して１００μｇの水酸化アルミニウ
ムゲルを添加した。この懸濁物を周囲温度で１０分間か
きまぜ、次いで３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した
。プロトロンビン錯体の蛋白質類を１００μｇの０．２
Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８）でゲルから溶離し、最後
に溶離液を０．１５ＭのＮａＣ１溶液で１／１１に稀釈
した。

この稀釈溶離液の１００μｇを、アグキストロドン・コ
ントルトリクス蛇毒の分画によって活性化したビーズ５
０μｇと共に、３７℃５分間インキュベートし、ＰＣａ
を簡便遠心分離（２００ｒｐｍで１分間）により活性化
剤から分離した。

ＰＣａの凝固分析法において、５０Ｍｇの貯留（ｐｏｏ
　Ｉ　）血漿を、１００　μｌｌのａＰＴＴ試薬及び５
０ＭｇのＰＣａ含有溶液と共に３７℃で３分間インキュ
ベートした。このインキュベーションの完了時に、混合
物を０．０２５ＭのＣａ　ＣＲ２溶液１００μｇでカル
シウム再添加処理し、凝固形成時間を記録した。

ＰＣａの比色分析法では、ＰＣａ溶液ｉｏｏμｇを、２
ｍＨのＳ　−２３６８を含む０．１５Ｍ　トリス緩衝液
（ｐＨ８）　　（０，１５Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｃｆｌ　、　
１％のＰ　Ｅ　（：８０００含有）の１００μｇと混合
した。３分後、混合物に５０％酢酸１００μｇを添加す
ることにより反応を停止させた。この反応中に生じた色
を、ＰＣａ以外のすべての成分を含むブランク（空試料
）と比較して、４０５ｎｍで測定した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、凝固分析法における試験試料中のＰＣａＯ量
（縦軸）とａＰＴＴの延長（横軸）との関係を示すグラ
フである。 第２図は比色分析法における試料中のＰＣ量（縦軸）と
アミド分解活性（光学的密度０．０．　　；横軸）との
関係を示すグラフである。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト血漿中に存在する蛋白質Ｃ（ＰＣ）をプロト
   ロンビン錯体の蛋白質類に高度の親和性を有する物質に
   吸着させ；ビーズ状支持媒体に対して蛋白質Ｃ（ＰＣ）
   活性化剤を結合させ；その蛋白質Ｃ（ＰＣ）と支持媒体
   上の活性化剤とを接触させて蛋白質Ｃ（ＰＣ）を活性化
   させ；活性化された蛋白質Ｃ（ＰＣａ）を支持媒体上の
   活性化剤から分離し；このようにして分離された活性化
   蛋白質Ｃ（ＰＣａ）について官能性レベル測定を実施す
   る；ことからなるヒト血漿中の蛋白質Ｃの官能性レベル
   の測定方法。
2. （２）活性化剤を共有結合によってビーズに対して結合
   する特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）ビーズは重合化されたデキストランである特許請
   求の範囲第１項記載の方法。コントル
4. （４）活性化剤はアグキストロドン・コントルトリクス
   種ヘビの蛇毒の少なくとも一分画からなる特許請求の範
   囲第１項記載の方法。
5. （５）蛋白質Ｃ（ＰＣ）の官能基レベルの測定方法は比
   色法である特許請求の範囲第１項記載の方法。
6. （６）蛋白質Ｃ（ＰＣ）の官能性レベルの測定試験方法
   は凝固法である特許請求の範囲第１項記載の方法。
7. （７）ビーズに結合された蛋白質Ｃ（ＰＣ）活性化剤か
   らなる、特許請求の範囲第１項の方法を実施するための
   蛋白質Ｃ（ＰＣ）活性化用試薬。
8. （８）活性化剤はビーズに対して共有結合により結合さ
   れている特許請求の範囲第７項記載の試薬。
9. （９）ビーズは重合化されたデキストランのビーズであ
   る特許請求の範囲第７項記載の試薬。
10. （１０）活性化剤はアグキストロドン・コントルトリク
    ス種ヘビの蛇毒の少なくとも一分画からなる特許請求の
    範囲第７項記載の試薬。