NO870148L - Orale vaksiner. - Google Patents

Description

TEKNISK OMRÅDE

Foreliggende oppfinnelse vedrører den spesifikke stimulering av serum- og sekretantistoffer gjennom tilførsel av antigener til slimhinne.

BAKGRUNNSTEKNIKK

Flere infeksjoner hos pattedyr har tilstrekkelig skade-lige virkninger på pattedyret til å garantere vaksinasjon mot det bestemte antigen som er ansvarlig for infeksjonen. Det er derfor iverksatt vaksinasjonsprogrammer hvor pattedyret ut-fordres antigent med et antigen slik at det utløses en respons som gir pattedyret immunitet.

Antigenadministrering til pattedyret kan skje på flere måter, deriblant injeksjon intramuskulært (i.m.), subkutant (s.c.) eller gjennom oral administrering (per os). I.m.-

eller s.c.-injeksjon av antigen lider av de ulemper at det er påkrevet med forholdsvis spesialiserte kunnskaper, det er vanskelig å utføre i stor skala, det er kostbart og en rekke bivirkninger kan oppstå enten mot det immuniserende antigen eller mot emulgeringsreagenset som det foreligger i. Oral administrering av vaksiner er derimot forholdsvis problem-fritt, bortsett fra at oral tilførsel av en rekke antigener krever forholdsvis store mengder antigen ettersom den stoff-mengde som faktisk absorberes og er i stand til å stimulere en effektiv immunrespons, vanligvis er lav. Således over-skrider den påkrevde antigenmengde for oral immunisering vanligvis langt det som er påkrevet for systemisk induksjon av immunitet. Det er også en hovedulempe ved den orale tilfør-sel av de store antigenmengder som er påkrevet for å gi anti-stoff respons , og det er at denne tilførsel av disse store mengder antigen ofte fører til induksjon av systemisk toleranse (Tomasi, 1980; Mowat, 1985; Mowat og Parrot, 1983; Ngan&Kind, 1978, Hanson et al, 1979, Richman et al, 1978, Rothberg et al, 1973).

Det bevismateriale som i dag foreligger antyder at

den mekanisme hvorved antigen tas opp av tynntarmen etter oral tilførsel, vanligvis primært skjer via ikke-spesifikt uttak av innholdet i hulrom i tarmkanalen ved hjelp av 11M"-celler som ligger over "Peyer's Patches" og andre lymfeknuter

i GALT (tarm-assosiert-lymfevev) (Bland and Britton, 1984). Den derpå følgende sensitivisering av lokale lymfocytpopula-sjoner fører til genereringen av lokale IgA-immunresponser pluss sensitiviseringen av IgG-suppressorceller med ledsagende undertrykkelse av serum-IgG-responser (Tomasi, 1980; Mowat, 1985; Mowat and Parrot, 1983, Ngan&Kind, 1978,

Hanson et al, 1979, Richman et al, 1978; Rothberg et al, 1973).

Det er derfor åpenbart at stedet for antigenopptak, enten det skjer gjennom "Peyer's Patches" eller tarmtott-epitelet, og svært sannsynlig mengden av antigen som admini-streres, dikterer den type immunrespons som genereres ved hjelp av oralt administrert antigen. Spørsmålet er da hvorvidt det finnes noen andre antigener bortsett fra kolera-toksin som oppviser evnen til spesifikt å utløse slimhinne-immunsystemet etter oral utfordring og/eller å stimulere den humorale immunrespons på en doseavhengig måte uten å indusere systemisk toleranse og uten behovet for urimelig store doser antigen.

Med denne oversikt i minne bestemte vi oss for å under-søke det mulige potensiale hos visse molekyler med evne til å binde seg, som har vært implisert i den innledende binding av en rekke tarmpatogener, når det gjelder å stimulere immunresponsen etter å være blitt administrert oralt. Disse over-flateantigener som tilfører bindende egenskaper til en rekke stammer av enterotoksikogen E. Coli (ETEC), er blitt identi-fisert som ikke-flagellære, filamentære proteinholdige ved-heng eller pili (Gaastra&de Graaf, 1982). Eksempler omfatter antigenene CAF I og CFA II til humane ETEC-stammer og K88-, K99-, F41- og 987P-piliene til animalske ETEC-stammer (Gibbons et al, 1975; Evans&Evans, 1978; Levine et al, 1980; Morgan et al, 1978; de Graaf&Roorda, 1982) til animalske ETEC-stammer. I tillegg har vi undersøkt evnen hos en rekke andre proteiner, som ikke har noen åpenbar rolle ved kolonisering, når det gjelder å utløse immunsystemet etter oral tilførsel. Disse antigenene omfatter flere lektiner,

et serotypisk antigen hos S. typhimurium (type "i"-flagell) inaktivert flu-virus og S. typhimuriumendotoksin (LPS). Oral utløsning ble sammenlignet med responsen frembragt mot full-

stendig intramuskulær utfordring (i.m.).

Målet ved disse undersøkelser var således å tilveiebringe en fremgangsmåte hvorved opptaket av et immunogen eller antigen ved hjelp av slimhinnen i mage- og tarmkanalen for-bedres i en slik utstrekning at det er mulig å frembringe serum-og sekresjonsantistoffer ved oral tilførsel av små doser av immunogenet uten induksjon av oral toleranse.

Følgelig beskriver oppfinnelsen en gruppe molekyler (slimhinneimmunogener) som etter tilførsel fører til produksjon av serumantistoffer mot proteinene ved nivåer som er sammenlignbare med de som oppnåes ved intramuskulær injeksjon av molekylene. Når videre større mengder av disse antigenene tilføres, skjer det en ledsagende stimulering av produksjonen av slimhinneantistoffer mot de immuniserende molekyler .

Ved et ytterligere aspekt av oppfinnelsen er det beskrevet en fremgangsmåte hvorved den frembragte antistoff-respons mot de oralt tilførte molekyler kan forøkes eller endres ved hjelp av samtidig tilførsel av flere kostmolekyler.

Ved et annet aspekt av oppfinnelsen beskrives det en fremgangsmåte hvorved et hapten eller protein kan kobles til et slimhinneimmunogen og hvor komplekset av disse, når det tilføres, resulterer i produksjonen av antistoffer mot hap-tenet eller det tilkoblede protein.

BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

I en første form tilveiebringer oppfinnelsen et kompleks som omfatter: et immunogen, bundet til et bærermolekyl som spesifikt er i stand til å reagere med slimhinnepitelet hos en virveldyrvert, hvor både den immunologiske aktivitet til immunogenet og bærermolekylets kapasitet til spesifikt å reagere med slimhinnepitelet hos virveldyrverten hovedsakelig opprettholdes, og hvor komplekset er i stand til å frembringe en systemisk, cellulær og/eller slimhinne-immunrespons hos virveldyrverten.

Foretrukne immunogener ifølge oppfinnelsen omfatter: alt, en del, analoger, homologer, derivater eller kombina-sjoner derav og et hormon, et terapeutisk middel, antigen eller hapten. Disse immunogener omfatter slike hormoner som LHRH (hormon som frigjør luteiniserende hormon), FSH, HGH og Inhibin,slike allergener som gresspollen (f.eks. bygg og kveke), ugresspollen (f.eks. kløver, høymole), trepollen (f.eks. ask, sypress), plantepollen (f.eks. gyvel), epiteler (f.eks. kattehår, hundehår, grisebust)og husstøv, hveteagner og Kapok, immunogener for vaksiner mot slike midler som influensa, meslinger, Rubella, kopper, gulfeber, difteri, stivkrampe, kolera, pest, tyfus, BCG, haemophilus influenzae, Neisseria catarrhalis, Klebsiella pneumonia, pneumokokker og streptokokker,særlig S. mutans; og pili, deriblant pili avledet fra E. coli, N. gonorrheae, N. meningitis, N. catarrhalis , Yersinia spp, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas spp, Moraxella bovis, Bacteroides nodosus, Staphylococci spp, Streptococci spp og Bordetella spp.

Foretrukne bærermolekyler omfatter bakterieadhesiner, slik som 987P, K99, CFAI, CFAII, K88 eller F41, virus- hemagglutininer slik som de fra influensa-, mesling-, Rubella-, kopper- eller gulfebervirus, toksiner eller bindende underenheter derav, slik som LTB-ricin, abrin, difteri-toksin, modecin, tatanus-toksin og andre med lignende strukturer, og lektiner, enten fra plante eller av annen opprinnelse. Lektiner omfatter f.eks. conconavalin A, kermesbær-mitogen eller lektiner fra Lens culinaris, Helix pomatia, Glycine max, Arachis hypogea eller Ulex europeus eller Abrin, slørasparagesert, bønnevikke, kamelfottre, ricinusfrø, favabønne, grønnalger, lodnevikke, hestegram, hestskokrabbe, jakktrebønne, japansk blåregn, paternosterert, skotsk gullregn, limabønne, limulin, lotus, europeisk misteltein, mungbønne, gultre, pagodetre, hageert, potet,rødsnittebønne, rødalger, sibirertebusk, spiselig sneglblomst, havesneglblomst, vanlig beinved, søtert, tomat, hvetekim eller aspargesert.

Ved en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen tilveiebringes det et kompleks som omfatter hormon som fri-gjør luteiniserende hormon, og LTB.

Ved en annen form tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av et kompleks som beskrevet ovenfor, og som omfatter: (a) Omsetning av immunogenet med bærermolekylet, hvorved man får komplekset, (b) kjemisk modifisering av immunogenet for å tilveiebringe minst én funksjonell gruppe som er i stand til å danne en kjemisk binding, og omsetning av immunogenet og bærermolekylet til komplekset, eller (c) kjemisk modifisering av bærermolekylet for å tilveiebringe minst én funksjonell gruppe som er i stand til å danne en kjemisk binding, og omsetning av immunogenet og bærermolekylet til komplekset, (d) kjemisk modifisering av immunogenet og bærermolekylet for å tilveiebringe funksjonelle grupper som er i stand til å danne en kjemisk binding, og omsetning av immunogenet og bærermolekylet til komplekset, (e) omsetning av immunogenet og minst ett bindingsmiddel, og omsetning av immunogenet og bærermolekylet til komplekset, (f) omsetning av bærermolekylet med minst ett bindingsmiddel og omsetning av immunogenet og bærermolekylet til komplekset, (g) omsetning av immunogenet og bærermolekylet med minst ett bindingsmiddel, og omsetning av immunogenet og bærermolekylet til komplekset, eller (h) en kombinasjon av hvilke som helst av fremgangsmåtetrinnene ovenfor.

I en annen form tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte som omfatter å tilveiebringe et rekombinant DNA-molekyl omfattende en første DNA-sekvens som etter ekspresjon koder for aminosyresekvensen til immunogenet, en andre DNA-sekvens som etter ekspresjon koder for aminosyresekvensen til bærermolekylet, og vektor-DNA, omdannelse av en vert med det rekombinante DNA-molekyl, slik at verten er i stand til å uttrykke et hybridproteinholdig produkt som omfatter komplekset, dyrking av verten for å oppnå ekspresjonen og oppsamling av det hybride proteinholdige produkt.

Alternativt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et kompleks som omfatter (a) kjemisk syntetisering av immunogenet og/eller bærermolekylet, og dannelse av komplekset ved hjelp av kjemisk omsetning, eller (b) syntetisering av et hybridpeptid som omfatter aminosyresekvensene til immunogenet og bærermolekylet. Fortrinnsvis fremstilles peptidet ved hjelp av peptidsyntese i fast fase, enzymatisk eller manuell peptidsyntese.

Ved en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen kobles det syntetiserte immunogen- eller bærermolekyl, mens det er bundet til harpiksen i peptidsynteseblandingen i fast fase, til henholdsvis bærermolekylet og immunogenet.

I en annen form av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes det en transformant vert som er transformert med et rekombinant DNA-molekyl omfattende en første DNA- sekvens som etter ekspresjon koder for aminosyresekvensene til hele, en del, en analog til, en homolog av, et derivat av eller en kombinasjon av immunogenet, en andre DNA-sekvens som etter ekspresjon koder for aminosyresekvensen til hele, en del av, en analog med, en homolog av, et derivat av eller en kombinasjon av bærermolekylet, samt vektor-DNA.

Ved en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen

er den transformante vert en gram negativ eller gram positiv bakterie, en gjær, sopp eller en høyere eukaryot celle. Ved en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er verten E. coli. En kultur av en transformant mikroorganisme som faller innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse, er blitt deponert ved American Type Culture Collection og er blitt betegnet med tallet ATCC 67114.

I en ytterligere form tilveiebringer oppfinnelsen et rekombinant DNA-molekyl som omfatter en første DNA-sekvens som etter ekspresjon koder for aminosyresekvensen til immunogenet, en andre DNA-sekvens som etter ekspresjon koder for aminosyresekvensen til bærermolekylet, og vektor-DNA. Ved en foretrukket utførelsesform av denne form av oppfinnelsen er vektor-DNA plasmid-DNAfmen innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse er det regnet med alternative vektorer og disse omfatter virus, bakteriofager og cosmider. I en foretrukket form av oppfinnelsen er plasmid pBTAK66 tilveiebragt som,

når en vertcelle transformeres med plasmidet, vil gi et pro-teinlignende produkt som omfatter et polypeptid som faller innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse.

I en ytterligere form av oppfinnelsen er det tilveiebragt en polynukleotidsekvens som omfatter en første hybridpolynukleotidsekvens som virker som en kodende sekvens for et fusjonsprodukt omfattende en aminosyresekvens av et immunogen bundet til en aminosyresekvens av et bærermoleky1, en polynukleotidsekvens som er tilstrekkelig beslektet med den første hybridpolynukleotidsekvens til å hybridisere til den første hybridpolynukleotidsekvens, en polynukleotidsekvens avledet ved hjelp av mutasjon, deriblant substitusjoner, strykninger, innføringer og omdannelser av én eller flere baser, fra den første hybridpolynukleotidsekvens eller hybridiserende sekvens, eller en polynukleotidsekvens som etter ekspresjon koder for et polypeptid som oppviser lignende biologisk eller immunologisk aktivitet som fusjonsproduktet. Fortrinnsvis er polynukleotidsekvensen en hvor den første hybridpolynukleotidsekvens virker som en kodende sekvens for aminosyresekvensen til hele, en del, en analog,

en homolog, et derivat eller en kombinasjon av LHRH bundet til aminosyresekvensen til et bærermolekyl, helst LTB.

I en ytterligere form av oppfinnelsen er det tilveiebragt et medikament som omfatter et kompleks ifølge oppfinnelsen sammen med et farmasøytisk akseptabelt bærermiddel eller fortynningsmiddel. Eksempler på farmasøytisk akseptable bærermidler og fortynningsmidler omfatter slike typiske bærere og fortynningsmidler som tabletter, vandige oppløs-ninger, natriumbicarbonatoppløsninger og lignende fortynningsmidler som nøytraliserer magesyre eller har lignende buffer-kapasitet, glycoler, oljer, olje-i-vann- eller vann-i-olje-emulsjoner, og omfatter medikamenter i form av emulsjoner, geler, masser og viskøse kolloiddispersjoner. Medikamentet kan frembys i kapsel-, tablett-, sakteavgivelse- eller eliksir-form, eller som en gel eller masse, eller kan frembys som en nesespray og kan i denne form foreligge i nærvær av en aerosol. Videre kan medikamentet tilveiebringes som et buskapsfor eller som mat egnet for humant forbruk.

Foreliggende oppfinnere har også funnet at samtidig administrering av visse kostmolekyler sammen med et kompleks ifølge foreliggende oppfinnelse, selektivt kan modulere størrelsen på og/eller typen av immunresponsen mot immunogenet i komplekset.

Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse videre et medikament som omfatter komplekset ifølge foreliggende oppfinnelse sammen med et kostmolekyl som selektivt kan modulere størrelsen på og/eller typen av immunresponsen mot immunogenet i komplekset.

Kostmolekylet som kommer i betraktning ved foreliggende oppfinnelse, omfatter basiske, nøytrale og sure aminosyrer, slik som arginin, histidin, lysin,alanin, cystein, cystin, glycin, isoleucin, leucin, methionin, fenylalanin, prolin, serin, threonin, tryptofan, tyrosin, valin, asparagin-syre, glutaminsyre, vannoppløselige- og uoppløselige vitaminer, slik som thiamin, riboflavin, pyridoxal, cyancobalamin (V.B.12) askorbinsyre (V.C.) Vit D2, etc. - Ergosterol, Vit. E, Vit. A, Vit. K, etc; sukkere inkluder monosaccharider, f.eks. galaktose, mannose, mannitol, sorbitol, glukose, xylose, allose, altrose, arabinose, digitoxose, eryhtose, fruktose, lyxose, muraminsyre, mannose, pyrodruesyre, ribose, tagatose, talose og de amiderte og N-acetylerte derivater derav; oligo-sachharider, f.eks. laktose, maltose, melibiose, sukrose, cellibiose, N,N-diacetyl-chitobiose, gentobiose, isomaltose, lactobionsyre, trehalose, turanose; og kostmineraler og ko-faktorer, slik som mangan, magnesium, sink, kalsium og jern.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte

for tilførsel av et kompleks ifølge foreliggende oppfinnelse som omfatter slimhinneadminstrering av et kompleks ifølge foreliggende oppfinnelse sammen med det et kostmolekyl som er i stand til å modulere størrelsen på og/eller typen av immunogenets immunrespons.

Oppfinnelsen tilveiebringer også den orale administrering av medikamentet ifølge oppfinnelsen for å frembringe en respons på det aktive molekyl i verten. En slik respons kan i det tilfellet hvor det aktive molekyl er et antigen eller hapten, være en systemisk og/eller slimhinneimmunrespons. I det tilfellet hvor det aktive molekyl er LHRH eller et derivat, en analog, en homolog, en del eller en kombinasjon derav, vil responsen være inhibering av gonadefunksjon i verten. Når det orale medikament inneholder et kostmolekyl ifølge oppfinnelsen, tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å øke vertens respons på det aktive molekyl som omfatter administrering av et slikt oralt medikament til verten.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Fig. 1 viser den N-terminale aminosyresekvens hos pilinunderenheten 987P sammenlignet med den N-terminale aminosyresekvens hos andre pelinproteiner.

UTFØRELSESFORMER FOR OPPFINNELSEN

Materialer

Lektiner ble ervervet fra Sigma Chemical Company. Inaktivert flu-vaksine ble ervervet fra Commonwealth Serum Labs.

(Australia). Sukkere og vitaminer ble erholdt fra følgende kilder: Laktose (AR-grad) - Ajax Chemicals, Sydney, Australia; Fruktose D(-), Mannose D(+), Sorbitol og Xylose D( + ) (alle

AR-grad) - B.D.H. Chemicals Ltd. Poole, England; Melibiose D(+) - Sigma Chemicals Co., St. Louis, Miss., Retinal (Vit.

A. - aldehyd) - Fluka AG, Chemicals, Fabrik Buchs, Switzer-land - HC1 (Vit. B±), Riboflavin (Vi. B2), Pyridoxal (Vit. Bg), Cyancobalamin (Vit. B^2>, L-askorbinsyre (Vit. C), Ergosterol (Pro Vit. D) og dl-a-tokoferol (Vit. E) - Sigma Chemical Co., St. Louis, Miss.

Bakteriestammer og medier

Stammene E. coli K99, 987P og LTD som ble brukt i disse forsøkene, er angitt i tabell 1, og var generøse gaver fra Dr. Susan Clark (Molecular Biology Laboratory Biotechnology Australia). Kulturer ble dyrket ved 37°C (med mindre annet er angitt) under rysting i Luria dyrkningsvæske (LB)

med eller uten 1 mM isopropylthio-n-D-galaktopyranosid

(IPGT) som angitt (tabell 1). Salmonella thyphimurium ble dyrket ved 37°C med rysting i LB pluss 0,2% glycerol.

RENSING AV ANTIGENER

Fremstilling av pili

E. coli som uttrykte den klonede pili, slik det ble bestemt ved å bruke radioaktivt merket antiserum ble innhøstet under logaritmisk vekstfase. Kulturer ble varmet opp ved 60°C

i 30 minutter, hvoretter organismene ble pelletert ved sentrifugering (3000 x g, 30 minutter, 4°C). Supernatanten ble under-søkt med hensyn på piliinnhold ved hjelpe av 12,5% SDA-PAGE Under anvendelse av en modifikasjon av fremgangsmåten til Laemmli (Laemmli, 1970; Salit et al., 1980).

Rensing av K99: Kultursupernatanten ble regulert til pH 9,7 med 10 N NaOH og omrørt ved værelsetemperatur (R.T.)

i 10 minutter. Det resulterende bunnfall som inneholdt pili ble utvunnet ved sentrifugering (3000 x g, 30 minutter, 4°C)

og resuspendert i 100 ml destillert E^O (dr^O) pH 7,2. Denne fremgangsmåte ble gjentatt to ganger.

Rensing av 9 8 7P: De anvendte fremgangsmåter var som nærmere angitt ovenfor, bortsett fra at pili-utfelling ble oppnådd ved å regulere pH til 3,9 med iseddik.

Hydroxyapatitt- kromatografi

Hydroxyapatitt (HA) (DNA-gra Bio-Gel HTP, Bio-Rad) ble forsiktig svellet i et overskudd av dE^O, og etter et kort tidsrom (mindre enn 2 minutter) ble små korn forsiktig fradekantert. Frisk dH^O ble tilsatt og brukt til forsiktig å re-suspendere gelen, hvoretter små korn på nytt ble fradekantert. Denne fremgangsmåte ble gjentatt flere ganger. En kolonne

(30 x 5 cm) ble fylt med en oppslemming av omtrent 30% HA og fikk sette seg ved hjelp av tyngdekraften. Deretter ble tett pakning oppnådd ved å sende dH20 gjennom kolonnen ved en strømningshastighet på 16 ml/time inntil overflaten av gel-laget var stasjonært. Prøver (100 ml) av enten K99 eller 987P ble tilført ved strømningshastigheter som ikke overskred 30 ml pr. time. Kolonnen ble deretter vasket med inntil ikke noe protein ble påvist i gjennomstrømningen ved på-visning ved 280 nm. Pili ble eluert med en strømningshastighet på 30 ml/time under anvendelse av en lineær gradient på 15 - 250 mm natriumfosfat, pH 7,5. Fraksjoner ble samlet opp og under-søkt ved hjelp av SDS-PAGE. Pili-toppen ble utvunnet og slått sammen.

Ionebytterkromatografi

Sammenslåtte fraksjoner av K99 - og 987P-pili (fra HA-kromatograferingen) ble på nytt utfelt med henholdsvis NaOH (pH 9,7) eller iseddik (pH 3,9). Etter sentrifugering (3000 x g, 10 minutter) ble pelletene som inneholdt pili resuspendert i 50 mm citratbuffer, pH 5,5 (K99) og 50 mm Tris-HC1, pH 8,5 (987P) før påfylling i ionebytterkolonnene ekvilibrert med de samme buffere. K99 og 987P ble påfylt henholdsvis CM- og DEAE-kolonner ved en strømningshastighet på 100 ml/time, vasket med 2 volumdeler påfyllingsbuffer og piliene ble eluert ved å bruke en lineær gradient fra 10 mm til 0,5 M NaCl i ekvilibreringsbufferne. Fraksjoner ble undersøkt ved hjelp av SDS-PAGE med hensyn på proteininnhold og LPS-foru rensning ifølge fremgangsmåten til Tsai and Frasch (1982). LTB- rensing

tre liter LTD-supernatant ble fortynnet til 6 liter med dH20. pH ble regulert til 6,5 med iseddik og det ble påfylt en 5 x 30 cm kolonne med hurtigstrømnings-CM-Sepharose<®>ekvilibrert med 10 mM fosfatbuffer, pH 6,5, ved en strømnings-hastighet på 1,2 liter/time. Kolonnen ble deretter vasket med 400 ml 10 mM fosfatbuffer, pH 6,5, og bundet protein ble eluert ved en lineær gradient på 10 - 500 mM NaCl i 10 mM fosfat, pH 5,5. Fraksjoner ble samlet opp og analysert ved hjelp av SDS-PAGE, LTD-toppen ble slått sammen.

Isolering av flageller

Bakteriekulturer i den siste del av logaritmisk dyrkningsfase ble pelletert ved sentrifugering (3000 x g i 15 minutter ved 4°C). Cellene ble resuspendert i saltoppløs-ning og varmet opp ved 60°C i 30 minutter, etterfulgt av sentrifugering (3000 x g, 10 minutter, 4°C). Supernatanten ble utfelt ved å tilsette en oppløsning av 100% TCA (vekt/ volum), hvorved man fikk en sluttkonsentrasjon på 10% (vekt/ volum), og sentrifugert i 10 minutter ved 1500 x g, 4°C. Pelleten ble resuspendert i et lite volum 1 M Tris, pH 8,8, og ultralydbehandlet inntil den forelå i oppløsning. Ethanol ble tilsatt inntil en sluttkonsentrasjon på 80% (volum/volum) og flagellene spunnet ned ved 2000 x g, 10 minutter ved 4°C. Pelleten ble resuspendert i aceton, ultralydbehandlet inntil suspensjon og på nytt utfelt ved sentrifugering (5000 x g). Til slutt ble pelleten bragt i oppløsning ved å koke i 10% SDS og 50 mM EDTA i 10 mM Tris. HC1 pH 8,0, før kromatogra-fering med Sephacryl<®>S-200.

Rensing av flageller

Etter koking i 15 minutter ble flagellene klaret ved sentrifugering i 15 minutter i en Beckman bordmikrosentrifu-ge for å fjerne ikke-oppløseliggjort materiale. Supernata-tanten ble tilført en 2,5 x 80 cm kolonne med Sephacryl<®>S-200 (Pharmacia, Fine Chemicals) ekvilibrert med 20 mM Tris, pH 8,8, 0,1% SDS og 10 mM EDTA, og eluert ved å bruke den samme buffer. Fraksjoner ble samlet opp og analysert ved hjelp av SDS-PAGE. Til slutt ble flagelltoppen slått sammen og utfelt med 10% (sluttkonsentrasjon) TCA, etterfulgt av sentrifugering, ethanol- og acetonvaskinger som tidligere beskrevet. Sluttpelleten ble resuspendert i dE^O.

Rensing av lipopolysaccharid ( LPS)

Kulturer av S. typhimurium som var dyrket over natten, ble ekstrahert (30 minutter, værelsetemperatur) med 0,5 M CaC^ i 20% ethanol (volum/volum) som inneholdt 100 mM citrat, pH 3,0, og Zwittergent 3,12 (vekt/volum) (Calbiochem.). Bakterier ble pelletert ved sentrifugering (3000 x g, 10 minutter ved 4°C) og pelleten resuspendert i 50 mM EDTA, pH, 8,0. Sus-pensjonen ble kraftig omrørt i 30 minutter ved værelsetemperatur. Etter fjerning av bakteriene ved sentrifugering, ble ethanol tilsatt til supernatanten inntil en sluttkonsentrasjon på 75%. Proteinmateriale ble pelletert og supernatanten regulert til 90% ethanol. Det dannede bunnfall ble pelletert og vasket med aceton, på nytt utfelt og til slutt resuspendert i dE^O. Preparatet ble analysert med hensyn på sukker-innhold under anvendelse av Anthrone-reagenset (Herbert et al, 1985) og kontrollert med hensyn på tilstedeværelse av forurensende proteiner under anvendelse av SDS-PAGE. Kommersielt E. coli LPS (Sigma Chemical Co:, ) ble brukt som en standard

i begge analysene. Geler ble farget for LPS under anvendelse av en sølvfarge ifølge fremgangsmåten til Tsai og Frasch

(1982) .

Fremstilling av polysaccharid ( PS)

Lipid A ble avspaltet fra S. Typhymurium LPS-preparatet ved inkubering av LPS med 1 M iseddik og oppvarming ved 100°C

i 2 - 5 timer. Lipid A ble deretter fjernet ved sentrifugering ved 3000 x g i 10 minutter ved 4°C.

Beskrivelse av rensede antigener

SDS-PAGE-analyse av rensede K99- og 987P-piliprepa-rater avslørte tilstedeværelse av et enkelt bånd ved 17500

og 20000 molvekt (henholdsvis) under reduserende betingelser (fig. 1). Dette stemmer overens med de publiserte data til Isaacson og andre (Isaacson & Richter, 1981; Morris et al, 1980; de Graaf et al, 1981; Fusco et al, 1978). Den letthet hvorved disse proteinene utfelles ved pH 9,7 og 3,9 (for henholdsvis K99 og 987P) antyder at pl for disse to proteinene

er omtrent ved disse områder (se Isaacson & Richter, 1981;

de Graaf et al, 1981).Sølvfarging av disse preparatene viste at de inneholdt lite (mindre enn 1 ug/100 ug protein) eller ingen forurensning med LPS.

Bestemmelse av den aminoterminale sekvens i 987P

Aminoterminal mikrosekvensering ble utført for oss

av Biotechnology Research Enterprises S.A. Pty. Ltd., Adelaide, South Australia. En 100 nmol prøve av 987P renset som beskrevet ovenfor ble analysert. Den aminoterminale sekvens til 987P ble sammenlignet med den publiserte sekvens til K99 og avslørte homologi mellom disse to molekylene (fig. 1.)

(Gaastra og de Graaf, 1982).

Renset LTB og S. typhimurium-flageller ble også funnet å være fri for forurensende LPS, og å bevege seg som monomerer ved tilsynelatende molekylvekter på henholdsvis 12500 og 52000 når de ble undersøkt ved SDS-PAGE under reduserende betingelser .

Sølvfargede SDS-PAGE-geler av renset LPS avslørte ingen påvisbar proteinforurensing. Innhold av komplekst sukker, analysert ved hjelp av Anthron-reaksjon, ble funnet å være 2 mg/ml. Polysaccharid fritt for lipid A ble også funnet å inneholde 2 mg/ml polysaccharid og dets unnlatelse når det gjelder å bevege seg på SDS-PAGE (slik det ble av-slørt i de sølvfargede geler) viste at det var fritt for forurensende lipid.

Dinitrofenylering av antigener

K99, LTB og lektiner ble dinitrofenylert ifølge fremgangsmåten til Little og Eisen (1967). I korte trekk ble bærere (i 0,1 M carbonat/bicarbonat-buffer, pH 9,5) omsatt med 0,1 M oppløsning av DNFB 8( i aceton) over natten ved værelsetemperatur. Proteinene ble deretter dialysert grundig mot koblingsbufferen. Tidligere undersøkelser av oss har vist at 987P ikke har noen frie aminogrupper eksponert for kobling, slik at et diamino-mellomledd først ble bundet til de frie carboxylrestene i proteinet på følgende måte: 10 mg renset 987P ble utfelt ved pH 3,9 ved tilsetning av iseddik. Piliene ble fjernet ved sentrifugering ved 3000 x g, 10 minutter ved 4°C . Pelleten ble resuspendert i dH20 og pH økt til 6,5 med 1 N NaOH. Pilioppløsningen ble deretter omsatt med l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-HCL (EDAC, Bio Rad Laboratories, Richmond, California), til en sluttkon-sentras jon på 0,5 mM i nærvær av 20 mM 1,2-diaminoethan (BDH Chemicals Ltd., Poole, England), over natten ved værelsetemperatur (20 - 23°C). Den aminosubstituerte 987P ble dialysert i 24 timer mot to endringer av 0,1 M carbonat/bicarbonat-buffer, pH 9,5, før den ble brukt i de etterfølgende konjuga-sjonstrinn. Lektin-bindende steder ble beskyttet under reaksjon med DNFB ved tilsetning av de lektin-spesifikke sukkere. Således ble det tilsatt 50 mM oppløsning av D-glukose, D-mannose, N-acetyl-D-galaktosamin, D-galaktose, N-acetyl-D-galaktosamin, D-gal(1-3)-D-galN-Ac og L-fukose til de føl-gende lektiner: henholdsvis Conconavalin A, kermesbær-mitogen, Lens culinaris, Helix pomatia, Phaseolus vulgaris, Glycin max, Arachis hypogea og Ulex eruopeus.

Administrering av antigen

C57BL/6J-mus av hunkjønn (18 - 22 g) ble erholdt fra Animal Resources Centre (Perth, Western Australia). Alle

musene ble sultet i 3 - 4 timer før oral eller intramuskulær (i.m.) administrering av antigener. Musene ble tilført antigen ved passende konsentrasjoner i 0,5 ml 0,1 M carbonat/ bicarbonat-buffer, pH 9,5, under anvendelse av en spesielt fremstilt tilførselsnål. Parallelle doser med antigen ble injisert i.m. i 0,1 ml steril fysiologisk saltoppløsning i venstre bakben. Grupper på 5 mus mottok antigen enten oralt eller intramuskulært, ble gitt to identiske doser med antigen, på dag 0 og dag 14. En blodprøve ble tatt (omtrent 0,5 ml)

fra det retroorbitale plexus på dag 14 og dag 21. Deretter ble musene avlivet ved cervikal dislokasjon og tarmvaskinger utført i tynntarmen på følgende måte. Tynntarmen ble forsiktig fjernet og en liten mengde vaskebuffer (1,0 ml, 30 mM Tris. HC1, pH 8,8, 0,9% NaCl, 50 mM EDTA pluss 1,0% Tween<®>20) innført i hulrommet i tarmen via en tilførselsnål med butt ende. Etter forsiktig massering av tarmen, ble innholdet klemt ut mellom pekefinger og tommel. Tarmutvaskingene som ble erholdt på denne måte, ble øyeblikkelig sentrifugert for å fjerne nedbrytningsrester og lagret ved -20°C inntil de ble analysert.

Blodprøver fikk koagulere ved 4°C før fjerning av serumet,

og lagret ved -20°C.

Enzymbundet immunosorbentanalyse ( ELISA)

ELISA for bestemmelse av antistofftiterer ble utført som beskrevet tidligere av Russell-Jones et al, (1984).

EKSEMPEL 1

Identifikasjon av molekyler som er aktive som slimhinneimmunogener

Den eventuelle evne hos en rekke molekyler som er kjent for å ha evne til å binde seg til tarmslimhinnen og stimulere produksjonen av en immunrespons etter oral administrering av molekylene, ble undersøkt. Den respons som ble frembragt av disse molekylene, ble sammenlignet med responsen som fåes etter lignende tilførsel av andre molekyler uten noen slimhinnebindende grupper.

Som det vil sees av tabell 1.1, ble det i disse for-søkene påvist tre store klasser proteiner: de som frembragte en serum- og tarmrespons, K99, 987P, LTB, flu-vaksine og de forskjellige lektiner (klasse I) (disse vil heretter bli hen-vist til som slimhinneimmunogener), de som frembragte bare en serumrespons (LPS) (klasse II) og de som unnlot å frembringe enten en serum- eller tarmrespons ved de testede doser (flageller, BSA og P.S.) (klasse III). Blant antigenene i klasse I var 987P en betydelig bedre stimulator for IgA-antistoff (ab) (48,5 t 1,8) sammenlignet med LTB (12,2 - 4,4), eller K99 (3,2 - 4,9). I tillegg stimulerte 987P også gastro-intestinal IgG (10,8 - 1,76) i en større utstrekning enn både K99 (3,0 - 5,3) og LTB (1,0), og bare 987P var i stand til å stimulere serum-IgA (10,8 8,8). Alle fire antigenene i klasse I stimulerte serum-IgG i like stor grad (tabell 1.1.) Antigenet i klasse II, LPS, stimulerte en liten serum-IgG-respons (12,8 - 1,0) uten noen ledsagende IgA- eller gastro-intestinal reaktivitet. Endelig unnlot BSA, flageller og polysaccharidresten fra LPS, antigenene i klasse III, å indusere både serum- og intestinal IgG eller IgA. Representative prøver fra alle tre klassene: K99, 987P, LTP, LPS og flageller, ble administrert intramuskulært og undersøkt med hensyn på både serum- og intestinal respons (tabell 1.2). Antigener fra klasse I og II ga lignende serum-IgG-responser, men unnlot å gi serum-IgA- eller tarm-IgG/IgA-Ab-responser. Bare anti-LPS-serum-IgG-responsen viste seg å være betydelig for-bedret ved hjelp av intramuskulær injisering. Både 987P, K99 og LTB ble videre undersøkt i doseresponsstudier etter både oral og intramuskulær administrering. Som det sees i tabellene 1.3 og 1.4, ga 987P konsekvent høyere titere enn både K99 og LTB, uansett administreringsmåte. Interessant nok oppviste antigenet fra klasse I, LTB, en klokkeformet doserespons med et platåmaksimum mellom 10 og 50 pg. Ingen av de øvrige antigener fra klasse I ga denne effekt, og heller ikke LTB når det ble administrert intramuskulært. Oral administrering av alle antigener fra klasse I (Ag) frembragte høyere nivåer av intestinal IgA Ab (S-IgA) over det brede område av testede doser. Sammenligning mellom de to administreringsmåtene antyder at selv om intramuskulær injeksjon konsekvent ga høyere titere, så resulterte oral administrering av slimhinneimmunogener i antistoffproduksjonsnivåer som er sammenlignbare med det som ble erholdt ved hjelp av den intramuskulære måte mellom 10 og 100 ug antigen for antigener fra klasse I og II.

Eksempel 2

Virkning av kostmolekyler på immunresponsen på slimhinneimmunogener etter oral tilførsel.

Innledende undersøkelser i vårt laboratorium under anvendelse av utavlede sveitsiske hanmus antydet at det var mulig å endre immunresponsen mot oralt tilførte antigener ved hjelp av samtidig tilførsel av visse kostmolekyler. Føl-gelig ble slimhinneimmunogene K99, 987P og LTB tilført musene i nærvær av flere kostsukkere og -vitaminer. Det ble trukket den slutning at ettersom de forskjellige antigenene var kjent for å bindes til forskjellige molekyler på overflaten av tarmepitelet, og ettersom det er kjent at det skjer en endring i fordelingen av glycoproteiner og glycolipider utover i tarmen, samt en endring i fordeling av absorberende celler, vil det kunne være mulig å stimulere opptaket av molekyler bundet til disse cellene ved å tilføre antigenene i nærvær av det bestemte kostmolekyl som normalt tas opp av disse cellene. Et tillegg til dette argument ville være at profilen av stimu- lerende molekyler endret seg fra antigen til antigen.

Resultatene som er angitt i tabell 2.1 og 2.2 og 2.3, viser at selv om de fleste vitaminene og sukkerne har hatt en viss virkning når det gjelder å modulere immunresponsen på K99, 987P og LTB, så synes noen kostmolekyler å være selektive med hensyn til hvilket slimhinneimmunogen de viste seg å innvirke på, men også med hensyn til hvorvidt de induserte primært en sekretorisk respons eller serumrespons. Således ble serum-antistoffresponsen på K99 betydelig økt (p < 0,05) ved samtidig administrering av vitamin B^°9melibiose, uendret når det ble gitt sammen med vitamin B^, vitamin B, vitamin E, fruktose eller mannose, og redusert i varierende grad ved vitamin A, vitamin B± ,, vitamin Brfa, vitamin C, laktose, sorbitol og xylose (tabell 2.1.).

Derimot ble serum-Ab-responsen på oral 987P (tabell

2.2) forhøyet når 987P ble administrert sammen med vitamin Bg, vitamin B, o, vitamin C, vitamin E, fruktose eller mannose, den forble uendret med vitamin A, vitamin B^, vitamin B^ > laktose, melibiose, sorbitol og xylose, og redusert i nærvær av vitamin D. LTB oppviste på den annen side en unik profil for effekten av samtidig tilførsel av diettmolekyler på serum-Ab-nivåene. Resultatene i tabell 2.3 viser klart en forøkt serumtiter mot LTB i nærvær av vitamin A, vitamin B^, vitamin D, fruktose, mannose og xylose. Liten eller ingen endring med vitamin B^, vitamin B^» vitamin C eller melibiose, og nesten fullstendig inhibering med vitamin B^, vitamin E, laktose. melibiose og sorbitol. Inhiberingen av en immunrespons som ble iakttatt med vitamin Bfa,, laktose, melibiose og sorbitol, var å vente på grunn av likhetene i struktur mellom disse forbindelsene og galaktose som er påberopt å være den spesifikke sukkerdetereminant på GMl-gangliosidet som LTB er kjent for å bindes til. Disse resultatene antyder grovt sett at K99, 987P og LTB bindes til og tas opp av mikrovilli-epitelet.

Doseresponsforsøk (tabellene 2.4, 2.5 og 2.6) viser

at det er mulig å stimulere sekresjonsgrenen av immunsystemet uten samtidig stimulering av serumantistoffer, eller omvendt å øke serumresponsen uten å påvirke nivået av sekresjons-Ab, ganske enkelt ved tilsetning av kostmolekylet til de oralt

tilførte slimhinneimmunogener. Således fører samtidig til-førsel av store doser vitamin B^2eller melibiose og K99 til en henholdvis to ganger og åtte ganger økning i serum-Ab med liten ledsagende økning i sekresjons-Ab. Omvendt fører samtidig tilførsel av vitamin D i økende doser til et fall i serum-Ab og en økning i sekresjons-Ab. Visse kostmolekyler resulterer på den annen side også i stimulering av både sekresjons- og serum-Ab-titere, som vist ved en åtte ganger økning i serum-Ab og en 1000 ganger økning i S-IgA etter samtidig tilførsel av vitamin C og 987P.

Forsøk hvor slimhinneimmunogenene ble injisert intramuskulært sammen med vitaminer eller sukkere viste liten virkning, om i det hele tatt noen, på immunresponsen, og demonstrerte derved at endringen i respons på grunn av samtidig tilførsel av disse molekylene og slimhinneimmunogenene må oppstå på eller nær stedet for absorpsjon av molekylene,

og ikke direkte i immunsystemet (tabell 2.7).

Eksempel 3

De to eksemlene ovenfor viste at små doser oralt administrerte slimhinneimmunogener har evne til å indusere betyde-lige serum-IgG-titere med eller uten en samtidig økning i sekresjons-IgA-antistoffnivåer. Videre ble det vist at immunresponsen kan forlenges ved samtidig administrering av kostmolekyler. Det funn at lektinene som ble brukt i den første undersøkelse var i stand til å virke som bærere som utløser en anti-DNP-respons, antydet at muligheten foreligger for at minst noen av disse slimhinneimmunogenene virker som "bærere" for andre antigener, og derfor forbedrer det forholds-vise dårlige opptak av de fleste antigener gjennom tarmepitelet.

Følgende undersøkelser ble utformet for å undersøke hvorvidt denne bærer eventuelt foreligger og å fastslå noen av de forskjellige parametere for dens vellykkede anvendelse som middel til å utforme nye og mer effektive orale vaksiner og/eller oralt administrerte legemidler.

Materialer og metoder

Konjugasjon av antigener til slimhinneimmunogenene Dinitrofenylering av bærere

DNFB ble reagert med lektiner og bærer slik som beskrevet ovenfor (se generelle metoder)

Konjugasjon av lipopolysaccharid ( LPS) og polysaccharid ( PS)

S. Typhimurium LPS og PS ble renset som beskrevet tidligere (ledsagende eksempler). LPS og PS ble koblet til MI under anvendelse av perjodatmetoden (Avrameus og Ternynck, 1971).

Sammenbinding med glutaraldehyd

Hormon som frigjør lutiniserende hormon (LHRH), bovint serumalbumin (BSA) (fra Sigma Chemical Co., St. Louis, Miss.) og S. typhimurium flageller ble hver for seg bundet til MI ved å bruke den to-trinns glutaraldehydfremgangsmåte til Ayrameus et al (1978). I korte trekk ble det påkrevde protein omsatt med 0,2% glutaraldehyd i 2 timer ved værelsetemperatur. Proteinene ble dialysert over natten mot carbonat/bicarbonat-buffer, pH 9,5, etterfulgt av tilsetning av MI ved molare forhold på 5, 10, 20 og 40:1, antigen:MI, alt ettersom, og omsatt i 24 timer ved værelsetemperatur. Til slutt ble ethan-clamin (Sigma) tilsatt inntil en sluttkonsentrasjon på 0,1 M (1 time, værelsetemperatur), etterfulgt av dialyse over natten ved 4°C mot 0,1 M carbonat/bicarbonat- buffer, pH 9,5.

Peroxydase- konjugerte lektiner

Kommersielle preparater av peroxydase konjugert til lektinene fra Glycine max, Arachis hypogea, Tetragonolobus purpureas og conconavalin A ble erververvet fra Sigma.

Kjemisk syntese av LHRH- konjugater

LHRH ble konjugert til LTB under anvendelse av glutar-aldehydf remgangsmåten som er redegjort for ovenfor. Glutar-aldehydaktivert LHRH ble tilsatt til LTB i et forhold på 20:1, LHRH:LTB, og fikk bindes over natten ved værelsetemperatur. Det resulterende konjugat ble dialysert grundig mot 0,1 M carbonat/bicarbonat-buffer, pH 9,5, før tilførsel. Kontroller besto av LHRH eller LTB som var blitt behandlet med bare glutaraldehyd.

Genetisk fusjon av LHRH til [ 3- galaktosidase og LTB

KONSTRUKSJON AV EN PLASMIDVEKTOR SOM UTTRYKKER ET FUSJONERT LTB/ LHRH- HYBRIDPOLYPEPTID

1• DNA- fragment som inneholder LTB- kodende sekvenser

Et Hind III fragment ble oppnådd fra et pBR322-basert plasmid som inneholdt det klonede LTB-gen (Leong et al, 1985), fra plasmidet NP307 i E. coli stamme RC411 (Dallus et al, 1970) som var blitt modifisert, ved å bruke et Spe I sted nær stopp-kodonet for LTB, og deretter oppløsning med nuklease fra mung-bønne under anvendelse av standardbetingelser. (Med mindre annet er angitt, er betingelsene som ble brukt for standard rekombinant DNA-teknikker og nukleinsyremodifiserende enzymer, som beskrevet i Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Maniatis, Fritsch og Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory, 1980). Dette eliminerte det stoppkodon som normalt er å finne etter aminosyre 123 i LTB, fjernet 9 basepar DNA og frembragte tilfeldig et Hind II sted som vist nedenunder:

Dette fragment ble ligert inn i vektoren pUC13 (Messing, 1983) etter oppløsning med Hind III og fosfatasebe-handling av plasmidet under anvendelse av standard betingelser. Dette tjente til å plassere det gjenværende polylinker-område fra pUCl3, deriblant et Pstl-, Sali-, Xbal-, BamHI-, Smal-, Sstl- og EcoRi-sted nedstrøms for LTB-sekvensen som inneholder DNA-innskudd.

2. Fremstilling av syntetiske LHRH- kodende oligonukleotider

To oligonukleotider med 30 baser i lengde, med sekvenser beskrevet i A og B nedenunder, ble utformet for å danne overlappende hybridduplekser, slik som vist i C, og som resulterer i en dupleks som vil utkode rettkjedede ende-til-ende-gjentagelser av de 10 aminosyrene som koder for pep- tidhormonet LHRH (Schally and Coy, 1983, Role of Peptides and Proteins in Control of Reproduction, McCann and Dhindsa eds. Elsevier Science Publishing Co. Inc. s. 89-110). I denne sekvensen erstatter glutarainsyre den normale N-terminale pyroglutaminsyre.

Oligonukleotidene ble varmebehandlet sammen i 1 time ved 40°C i 50 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,5, endefylt med Klenow, og deretter ble blandingen ligert inn i Smal-kuttet M13 mpl8 under anvendelse av standard fremgangsmåter. Ml3-fag som inneholdt innskudd ble isolert, og DNA-sekvensene til inn-skuddene ble bestemt ved hjelp av dideoxyteknikken. En rekombinant, betegnet P29, ble valgt ut for den fusjonerte konstruksjon. Dens DNA-sekvens sammen med aminosyrene som den koder for, i området for innskuddet ved Smal-stedet er gjen-gitt nedenunder.

N-ende i 3-galaktosidase, a-fragment

DNA-sekvensen bekreftet innføringen av DNA fra de syntetiske oligonukleotider for å plassere en fusjon av omtrent 3 og en halv gjentagelser av den LHRH-kodende sekvens (34 aminosyrer) innenfor rammen. De fullstendig LHRH-kodende blokker er indikert ved hjelp av pilene.

Kopiene av DNA fra P29 ble oppløst med EcoRI og HincII (steder angitt i DNA-sekvensen ovenfor), og endefylt under anvendelse av standard betingelser. Det lille fragment med 140 basepar ble isolert fra en polyacrylamingel.

3 . Konstruksjon av LTB/ LHRH- fusjonsvektoren

Plasmidet pUC13 som inneholder den LPB-kodende sekvens innskutt i Hind III-stedet (avsnitt 1 ovenfor) ble oppløst med Sali, endefylt og fos fatasebehandlet under anvendelse av standard betingelser. Vektor-DBA ble deretter ligert til det endefylte EcoRI/HincII-fragment fra P29 (avsnitt 2 ovenfor). Fusjonen bør ha aminosyresekvensen nedenunder.

Det er et stoppkodon 24 baser videre ut fra LHRH-sekvensen som bestemmer produksjonen av et 176 aminosyrepoly-peptid, med 122 aminosyrer fra LTB, 34 aminosyrer som koder for LHRH-gjentagelsen, og ytterligere 20 aminosyrer avledet fra de tilknyttede områder.

Den korrekte konstruksjon ble utsortert ved oppløsning av DNA fra minipreparater med EcoRI og utplukking av plasmider med det passende store EcoRI-fragment. De antatte posi-tive plasmider ble ytterligere sortert med hensyn på ekspresjon av dette polypeptid, drevet fra lac-promoteren i pUC13. Bakterieekstrakter ble analysert på polyacrylamidgeler etterfulgt av overføring av nitrocellulosepapir og Western blotting med kaninantisera rettet mot et LTB- og LHRH-konjugat. Det ble påvist et peptid med den forventede størrelse ved hjelp av begge antisera.

4. Konstruksjon av ekspresjonsplasmid K66 og ekspresjons-stamme BTA1185

Et 573 bp EcoRI-fragment fra pUC13 LTB-LHRH-fusjons-plasmidet beskrevet i 3, som inneholder det kodende område for LTB-LHRH-fusjon i sin helhet, ble isolert fra en agarose-gel og ligert inn i EcoRI-kuttet, fosfatasebehandlet ekspre-sjonsvektor pKK233-3 (fra Pharmacia). Det resulterende ekspresjonsplasmid PBTA K66 plasserte ekspresjonen av fusjonsproteinet under kontroll fra tac-promoteren, hvor ekspresjon induseres med IPTG. Plasmidet ble transformert inn i E.coli vertstamme JM101 ( SupE, thi, (lac-pro AB) [F<1>traD36, pro AB lacl^ Z M 15), hvorved man fikk vertvektorekspresjonssystemet BTA1185.

5. Produksjon og rensing av LTB/ LHRH- fusjonsprotein for dyreforsøk

Den LTB(LHRH). -produserende stamme ble dyrket som beskrevet ovenfor. Etter induksjon med IPTG i 2 timer, ble bakterier pelletert ved sentrifugering (3000 x g, 10 minutter ved 4°C) . Bakterier ble deretter resuspendert i 3-^ 2®°9lysert i en fransk presse. Etter fjerning av bakterierestene ved sentrifugering (18000 x g, 10 minutter ved 4°C), ble supernatanten fylt på en kolonne med agthio-galaktose (Sigma). Fusjonsproteinet ble deretter eluert med 0,5 M galaktose og dialysert mot 0,1 M carbonat/bicarbonat-buffer, pH 9,5.

Antigenadministrering og måling av immunresponsen

Alle orale tilførselsfremgangsmåter, antistoffopp-samlingen og ELISA-bestemmelser var som tidligere beskrevet.

RESULTATER

Demonstrasjon av bærerpotensiale hos slimhinneimmunogenene

Alle slimhinneimmunogenene som ble testet, oppviste evne til effektivt å transportere den covalent bundne hapten-DNP gjennom tarmslimhinnen og å utløse en serum-anti-DNP-Ab-respons etter tilførsel av det dinitrofenylerte MI. DNP-modifisert BSA var imidlertid fullstendig ineffektiv når det gjelder å utløse en anti-DMP- eller anti-BSA-respons når det ble tilført ved de testede konsentrasjoner (tabell 3.1). Innledende forsøk hvor K99 og 987P ble bundet i kompleks med mye større molekyler enn DNP, mislyktes når det gjelder å frembringe immunresponser mot enten slimhinneimmunogenet eller molekyler koblet til det (tabellene 3.2 og 3.3), muli-gens på grunn av sterisk påvirkning av bindingen av piliene til slimhinneepitelet. Det ble derfor bestemt å variere for-holdet mellom antigen og MI. Når forskjellige forhold mellom BSA:pili ble testet, ble det funnet at når større forhold enn 1:20, BSA:pili, ble tilført, var det ikke mulig å frembringe hverken anti-BSA- eller anti-pili-responser, selv med en mengde på 500 ug, hvilket viste at det ikke var mulig for kompleksene effektivt å bli bundet til slimhinneepitelet, og derfor å frembringe en immunrespons. Når forholdene 1:20 eller 1:40 imidlertid ble anvendt, ble det iakttatt gode responser både på BSA og pili (tabellene 3.2 og 3.3). Størrel-sen på immunresponsen ble lett variert ved å endre mengdene av tilført kompleks (tabell 3.4).

Oral administrering av LHRH koblet til LTB førte til en betydelig reduksjon i de samlede livmor- og eggstokk-vekter hos hunmus som mottok enten 20 eller 50 ug LHRH-LTB

(P 0,05), (tabell 3.5, 3.6). Ingen slike vekttap ble iakttatt hverken med LHRH eller LTB tilført alene eller sammen, eller mot intramuskulær injeksjon av LHRH-(3-galaktosidase, LHRH-LTB eller fritt LHRH. Virkningen av vekttapet ble også iakttatt utviklingsmessig ettersom det var et fullstendig fravær av modne follikler i eggstokkene, dyrene ble således effektivt "kastrert". Det var en liten reduksjon i vektene av forplantningskanalen når mus ble tilført det genetisk konstruerte LTB-(LHRH)^ ^-fusjonsprotein (tabell 3.6), men i dette forsøk var reduksjonen ikke signifikant ved de mengder som ble prøvd.

Eksempel 4

Induksjon av celleformidlet immunitet etter oral administrering av antigen

Tilførsel av slimhinneimmunogener ble påvist å være effektiv når det gjelder å utløse humorale responser, slik disse ble målt ved produksjonen av serum- og tarmantistoffer. Det var imidlertid ikke kjent hvorvidt det skjedde en led-dagende stimulering av en celleformidlet immunrespons (CMI) mot slimhinneimmunogenene.

Følgende undersøkelser ble utformet for å sammenligne CMI generert ved hjelp av oral tilførsel av et slimhinneimmunogen, med det som frembringes ved klassisk subkutan (s.c.) injeksjon av antigen i fullstendig Freund's hjelpestoff (CFA).

Metoder

C57B1/6J-hanmus ble immunisert ved å tilføre 20 ug antigen i 0,1 M carbonat/bicarbonat-buffer, pH 9,65, eller ved å injisere 20 ug antigen i CFA s.c. Kontroller fikk bare buffer eller hjelpestoff. 7 dager etter immunisering ble musene injisert i den venstre bakfotpute med 10 ug antigen i 20 ul saltoppløsning, og injisert med 20 ul saltoppløsning alene i den høyre bafotpute. Etter ytterligere 24 timer ble forskjellen i tykkelse mellom den venstre og høyre bakfotpute målt ved å bruke et mikrometer.

Resultater

Resultatene vist i tabell 4.1 viser at en god cellulær immunrespons ble frembragt etter oral tilførsel av enten 987P eller LTB slimhinneimmunogener. Responsen var faktisk overraskende høy ettersom den bare var litt mindre enn den som ble frembragt ved hjelp av subkutan injeksjon av disse antigenene i CFA.

INDUSTRIELL ANVENDELIGHET

Industriell anvendelse av oppfinnelsen omfatter frem-stillingen av orale medikamenter for administrering til virveldyrverter.

Potensielle vaksineemner for oral vaksine

Allergener: Forskjellige gresspollen: bygg, malt Ugresspollen: kløver, høymole

Trepollen: ask, sypress

Plantepollen: gyvel

Epitel: kattehår, hundehår, grisebust Forskjellig: husstøv, hveteagn, Kapok.

Hormoner: LHRH, FSH, HGH, Innhibin

Vaksiner: Hemagglutininer fra

Influensa, meslinger, Rubella, kopper, gulfeber, difteri, stivkrampe, kolera, pest, tyfus, BCG, Haemophilis influenzae, Neisseria catarrhalis, Klebsiella pneumonia,

Pneumococci, streptokokker, særlig S. mutans. Pili fra: E. coli, N. gonorrheae, N. meningitis,

N. catarrhalis, Yersinia spp., Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas spp., Moraxella bovis, Bacterioides nodosus, Staph. spp., Strep. spp., Bordetella spp.?

LITTERATURHENVISNINGER

Avremeas, S., Ternynck, T.&Geudson, J.-L- 1978 Coupling of Enzymes to antibodies andantigens. Scand. J. Immunol., 8. suppl. 7, 7-23.

Avrameas, S. & Ternynck, T. 1971 Peroxidase labelled antibody and Fab conjugate with enhanced intracellular penetration. Immunochem., 8 1175-1179.

Befus, A.D., og J. Bienenstock, 1982. Factors involved in symbiosis and host resistance at the mucosa-parasite inter- 8IENENST0CK, J., and'A.0. Se<r>us. 1980. Mucosal Immunology. Immunology. 41 : 249.

8LA<E. M.S., and E.C Gotscnlich. 1984. Purification and partial characterization of the opac:ty-associated protsins of Neisseria gonorrhoeae. 159 : 452.

BLAND, P.W. & Britton, O.C. (1984) Morphological study of antigen-sampling structures in the rat large intestine. Infact. Immun., 43, 693-699.

CLARK, S., A. Cahill, C. Stirzaker, P. Greenwood and R. Gregson. 1985. Prevention by vaccination-animal bacteria, p. 481-487. In S. Tzipori (ed.) Infectious diarrhoea in the young. Elsevier Science Publishers 8.V.

CONTEY, J.R., and L.R. Inman. 1981. Oiarrhea due to Escherichia coli strain RDEC-1 ln the rabbit. The Peyer's patch as the initial site of attachment and colon!zation. J. Infect. Ois. 43 : 440.

DALLAS et. al. (1979) Cistrons encoding Escherichia coli heat labile toxin J. Bact. 139 850-858.

AVREMEAS, S., Ternynck, T. 4 Geudson, J.-L. 1978 Coupling of enzymes to antibodies andantigens. Scand. J. Immunol., 8. suppl. 7, 7-23.:AVRAMEAS, S. i Ternynck.. T. 1971 Peroxidase labelled antibody and Fab conjugate with enhanced intracel1 ular penetration. Immunochem., 8, 1175-1179.

BEFUS, A.D., and J. Bienenstock.. 1982. Factors involved in symbiosis and host resistance at the nucosa-parasite interface. Prog. Allergy. 31 : 76.

81ENENSTOCK, J., and A.D. 3efus. 1980. Mucosal Immunology. Immunology. 41 : 249.

BLAKE. M.S., and E.C. Gotscnlich. 1984. Purification and partial characterization of the opacity-associated proteins of Neisseria gonorrhoeae. 159 : 452.

BLAND, P.W. & Britton, D.C. (1984) Morphological study of antigen-sampling structures in the rat large intestine. Infect. Immun., 43, 693-699.

CLARK, S., A. Cahill, C. Stirzaker, P. Greenwood and R. Gregson. 1985. Prevention by vaccination-animal bacteria, p. 481-487. In S. Tzipori (ed.) Infectious dlarrhoea in the young. Elsevier Science Publishers B.V.

CONTEY, J.R., and L.R. Inman. 1981. Diarrhea due to Escherichia coli straln RDEC-1 ln the rabbit. The Peyer's patch as the initial site of attachment and colonlzatlon. J. Infect. D1s. 43 : 440.

DALLAS et. al. (1979) Clstrons encoding Escherichia coli heat labile toxln J. Bact. 139 850-858.

ELSON, CO. & EALDING, W. (1984a) General ized systemic and mucosal Immunity in mice after mucosal stimulation with cholera toxin. J. Immunol.. 132, 2736-2741 .

ELSCN, CO. & EALDING, ' A. (1984b) Cholera toxin did not induce oral tolerance in mice and abrogated oral tolerance to an unrelated antigen. J. Immunol. 133, 2892-2897.

EVANS, D.G. & Evans, D.J. (1978) New surfaca-associatad heat-1 aoi le colonization factor antigen (CFA/11) producad by enterotoxigeni; Escherischia coli of sercgroups 06 and 08. Inf. Immun., 21, 633-547.

De GRAAF, F.K., P. Klemm, and W. Gaastra. 1981. Purification, characrarization and partial covalent structure of the adhesiva antigen <99 of Escherichia coli. Infect. Immun. 33 : 377.

De GRAAF,<F.>K. & Roorda, I. (1882) Production, pur i f i eat i on, ane charac:er'zation of the f;, m b r i al adhesive antigen F41 isolatad~'om calf enterooathogenic EsCari chia coli strai.n 341M. Infect. Immun., 36 , 751-753.

FUJITA, (<. i Finkelstein, R.A. 1972 Antitoxic immunity in axper:-nentai Cholera. j. Infect. Dis., 125, 647-655.

FUSCO, ?., A. To, S. To, and C. Brinton, Jr. 1978. The pur i f i zation and cnaracrarisation of four types of E. Coli pili and the specificity of E. coli pili for immunity colonization and adhesion, p. 60-70. I C. Miller (ed.), XIIIth U.S. Japan Conference on Cholara, Atlanta, ' Ga., 1977. National institution of Health, 3ethesda, Md.

GAASTRA, ' A., and F.K. de Graaf. 1982. Host specific fimbrial adhesion of noninvasive enterotoxigenic Escherichia Coli strains< Microbiol. Rev. 46 : 129.

GAASTRA, R.A. (1975) Anattempt to identify the intestinal receptor for the K88.ashes1n by means of a haemaggluti nation inhibition test uslng glycoproteins and fractions and sow colostrum. J. Gen. Microbiol., 86, 228-240.

GIBBONS, R.A. (1975) Anattempt to identify the intestinal receptor for the K88 ashesin by means of a haemaggluti nation inhibition test using glycoproteins and fractions from sow colostrum. J. Gen. Microbiol., 86, 228-240.

HANSON, D.G.. VA7., N.M. , MAIA,. L.C.S. 4 LYNCH, J.M..U 979) Inhibition of specific Immune responses by feeding protein antigens. J. Immunol., 123, 2337-2343.

HERBERT, D., P.J. Phipps, and R.E. Strange. 1985. Carbohydrate analyses, determination of total carbohydrate, p. 265-279. In J.R. Norris, and D.W. Ribben (ed.), Methods in Microbiology. v. 5B. ISAACSON, R.E., J. Colmenero, and P. Richter. 1981. Escherichia coli K99 pili are composed of one subunit spee i es. FEMS Microbiol. Lett. 12 : 229.

ISAACSON, R.E., and P. Richter. 1981. Escherichia Coli 987P Pi lus. Pur i f ication-and partial characterization. J. Bacteriol. 146 : 784.

KLIPSTEIN, F.A., ENGERT, R.F., & SHORT, H.3. (1980) Protective effect of immunization with heat -labile antertoxin in gnotobiotic rats monocentamintaed with enterotoxigenic Escnerichia coli. Inf. Immunol., 28, 163-170.

LAEMMLI, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature (Lond.) 227 : 530.

LEONG et. al. (1985) Nucleotide sequence comparison between heat labile toxin B-subunit cistrons from Escherichia coli of human and porcine origin Infection and Immunity 48 73-77.

LEVINE, M.M., Rennels, M.3., Oaya, V. 4 Hughes, T.P. (1980) Haemaggluti nation and colonizatlon factora in enterotoxigenic and enteropathogenic Escherichia coli that cause diarrhea. J. Inf. Dis., 141, 733-737.

LITTLE, J.R. & Eisen, H.N. (1967) Preparation of immunogenlc 2,4-dlnitrophenyl and 2,4,6- tri itrophenyl proteins. In "Methods ln Immunology and Immunochemi stry" (Ed. Williams, CA. & Chase, M.W.). I, p. 128. Academic Press, New York.

MESSIER, 3., and'CP. Le Blond (1960). Ce 11 prol i f eration and migration as revealed by radioautography after injection of thymidine

-H3 into male rats and mice. An. J. Anat. 106 : 247.

MESSING (1983) New M13 Vectors for doning Methods in Enzymologv 101 20-78

MORGAN, R.-., Isaacson, R.E., Moon, H.W., Br in ton, CC. & To, C-C

(1978) Immunization of suckling pigs against enterotoxigenic Escherichia col i-induced diarrheal disease by vaccinating dams -»ith purified 937 or ;<99 pili. Inf. Immun., 22, 771-777.

MORRIS, J.A., C.J. Thorns, and W.J. Sojka. 1980. Evidence for :wo adhesive a.ntigens cn the <99 reference strain Escherichia coli 5-1.

J. Gen. Microbiol. 113 : 107.

MOWAT, A. Mc I.,(1985) The role of antigen recognition and suppressor cells in mice with oral tolerance to ovalbumin. Immun., 56, 252-250.

MOWAT, A.Mc!. & PARROT, D.M.V.U 983) Immuno 1 cg i ca 1 responses to -"ed protein an:<;>gens in mice. Immun., 50, 547-554.

NGAN, J. 4 <IND, L.S.,<1978) Suppressor T cells for IgE and IgG in peyer's parches of mice tolerant by the oral administration of ovalbumin. J. Immunol., 120, 861-865.

PIERCE, N.F. & KOSTER, F.T./(1980) Priming and suppressi.on of the intestinal immune responsa to cholera toxoid/toxin by parenteral toxoid in rats. J. Immunol., 124, 307-311.

PIERCE, N.F., SACK, R.B., & SIRCAR, B.K., (1977) Immunity to experimental cholera. J. Inf. Dis., 135, 888-896.

RICHMAN, L.K., CHILLER, J.M., BROWN, W.R., HANSON, D.G. & NELSON, N.M.

(1978) Enterlcally induced immunologi cal tolerance. J. Immunol., 121, 2429-2434.

RICHMAN, L.K., A.S. Graeff, and W. Strober. 1981 Antigen presentation by macrophage enriched cells from the mouse Peyer's patch. Cell Immunol. 62 : 1100.

R0THBERG R.M., KRAFT, S.C, £ MICHALEK, S.M.,(1973) Systemic immunity after local antigenic stimulation of the lymphoid

tissue of the gastrointastinal tract. J. Immunol., 111, 1906-1913.

RUSSELL-JONES, G.J., E.C. Gotscnlich, and M.S. Blake. 198*. A surface receptor specific for human IgA on group B streptococci possessing the Ibc protein antigen. J. Exp. Med. 160 : 1467.

RUSSELL-JONES, G.J., and E.C. Gotschlich. 1984. Identification of protein antigens of grouo B streptococci, with special reference to the Ibc antigen. J. Exp. Med. 160 1476.

SALIT, I.E., M. Blake, and E.C. Gotschlich. 1980. Intrastrain heterogeneity of gonococcal pili is related to capacity colony variance. J. Exp. Med. 151 : 716.

SCHALLY AND COY (1983). Stimulatory and inhibitory analogues of LH-releasing hormone: 3asic and clinical studies in Role of Peorides and Proteins in Control of Reproduction McCann and Dhindsa eds. Elsevie Science Publishing Co. Inc. ppS9-110. Maniatis, Fritsch and Sambrook (1982) Molecular Cloning, Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory.

SEVENNERHOLM, A.M. & Holmgren, J. 1978 Inditi fication of E. coli heat-labile enterotoxin by means of a gang 1 i os i de immunosorbent assay CGM-1 ELISA) procedure. Curr. Microbiol. 1, 19-23.

TOMASI, T.B.,(1980) Oral tolerance. Transplantation, 29, 353.

TONER, P.G., K.E. Carr, and G.M. Wyburn (1971). Intestine. In The Digestive System - An Ultrastructural Atlas and Review, Butterworths, London.

TSAI, C.M., and Frasen, CE. 1982. A sensitive Silver stain for detacting 1 ipopofysaccharide in polyacrylamide gels. An 1 al. Biochem., 119, 115-119.

175

Claims (63)

1. Kompleks, karakterisert ved at det omfatter et immunogen bundet til et bærermolekyl som er i stand til spesifikt å reagere med slimhinneepitelet hos en virveldyrvert, hvor både den immunologiske aktivitet til immunogenet og bærermolekylets evne til spesifikt å reagere med slimhinneepitelet hos virveldyrverten i det vesentlige opprettholdes, og idet komplekset er i stand til å frembringe en systemisk, cellulær og/eller slimhinneimmunrespons i virveldyrverten.

2. Kompleks ifølge krav 1, karakterisert ved at immunogenet er valgt fra alt, del(er), en analog, homolog, et derivat eller en kombinasjon derav av et hormon, terapeutisk middel, antigen eller hapten.

3. Kompleks ifølge krav 1, karakterisert ved at komplekset er i stand til å frembringe en systemisk eller cellulær immunrespons i virveldyrverten.

4. Kompleks ifølge krav 1, karakterisert ved at komplekset er i stand til å frembringe en slimhinneimmunrespons i virveldyrverten.

5. Kompleks ifølge et av kravene 1-4, karakterisert ved at immunogenet er alt, del, en analog, homolog, et derivat eller kombinasjon derav av et antigen eller hapten.

6. Kompleks ifølge et av kravene 1-5, karakterisert ved at immunogenet er alt, del, en analog, homolog, et derivat eller en kombinasjon derav av et hormon.

7. Kompleks ifølge et av kravene 1-6, karakterisert ved at immunogenet er alt, del, en analog, homolog, et derivat eller en kombinasjon derav av et hormon som frigjør luteiniserende hormon.

8. Kompleks ifølge et av kravene 1-6, karakterisert ved at immunogenet er FSH, HGH, inhibin.

9. Kompleks ifølge et av kravene 1-5, karakterisert ved at immunogenet er et aller-gen .

10. Kompleks ifølge krav 9, karakterisert ved at allergenet er gresspollen, ugresspollen, trepollen, plantepollen, kattehår, hundehår, grisebust eller annet epitel eller husstøv, hveteagn eller Kapok.

11. Kompleks ifølge et av kravene 1-4, karakterisert ved at immunogenet er et over-flateprotein avledet fra influensa-, mesling-, Rubella-, kopper-, gulfeber-, difteri-, stivkrampe-, kolera-, pest-, tyfus- eller BCG-forårsakende midler, Haemophilus influenzae, Neisseria catarrhalis, Klebsiella pneumoniae, pneumokokker og streptokokker; eller pilus avledet fra E. coli, N. gonorrhoeae, N. meningitidis, N. catarrhalis, Yersinia spp, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas spp, Moraxella bovis, Bacteroides nodosus, Staphylococci spp, Streptococci spp og Bordetella spp.

12. Kompleks ifølge et av kravene 1-4, karakterisert ved at immunogenet er et over-flatepolysaccharid avledet fra difteri-, stivkrampe-, kolera-, pest-, tyfus- eller BCG-forårsakende midler, Haemophilus influenzae, Neisseria catarrhalis, Klebsiella pneumoniae, pneumokokker og streptokokker eller en pilus avledet fra E. coli, N. gonorrhoeae, N. meningitidis, N. catarrhalis, Yersinia spp, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas spp, Moraxella bovis, Bacteroides nodosus,S taphylococci spp, Strepto cocci spp og Bordetella spp.

13. Kompleks ifølge et av kravene 1-4, karakterisert ved at immunogenet er et sekre-sjonsprodukt avledet fra difteri-, stivkrampe-, kolera-, pest-, tyfus- eller BCG-forårsakende midler, Haemophilus influenzae, Neisseria catarrhalis, Klebsiella pneumoniae, pneumokokker og streptokokker eller en pilus avledet fra E. coli, N. gonorrhoeae, N. meningitidis, N. catarrhalis, Yersinia spp, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas spp, Moraxella bovis, Bacteroides nodosus, Staphylococci spp, Streptococci spp og Bordetella spp.

14. Kompleks ifølge et av kravene 11 - 13, karakterisert ved at overflateproteinet, -polysaccharidet eller sekresjonsproduktet er avledet fra Streptococcus mutans.

15. Kompleks ifølge et av kravene 1-14, karakterisert ved at bærermolekylet er alt, del, en analog, homolog, et derivat eller en kombinasjon derav av et bakterieadhesin, virushemagglutinin, et toksin eller den bindende underenhet derav, eller et lektin enten av planteopprinnelse eller annen opprinnelse.

16. Kompleks ifølge krav 15, karakterisert ved at bærermolekylet er alt, del, en analog, homolog, et derivat eller en kombinasjon derav av det varmelabile toksin fra enterotoksigen E. coli.

17. Kompleks ifølge krav 15, karakterisert ved at bærermolekylet er alt, del, en analog, homolog, et derivat eller en kombinasjon derav av en bakteriepilus.

18. Kompleks ifølge krav 17, karakterisert ved at bakteriepilusen er K99-eller 987P-pilus fra E. coli.

19. Kompleks ifølge krav 17, karakterisert ved at bakteriepilusen er CFAI, CFAII, K88 eller F41.

20. Kompleks ifølge krav 15, karakterisert ved at bærermolekylet er alt, del, en analog, homolog, et derivat eller en kombinasjon derav av et lektin.

21. Kompleks ifølge krav 20, karakterisert ved at lektinet er Conconavalin A, kermesbær-mitogen eller lektinet fra Lens culinaris, Helix pomatia, Glycine max, Arachis hypogea eller Ulex europeus.

22. Kompleks ifølge krav 20, karakterisert ved at lektinet er lektin fra abrin, sløraspargesert, bønnevikke, kamelfottre, ricinusfrø, favabønne, grønn sjøalge, lodnevikke, hestegram, høstsko-krabbe, jaktrebønne, japansk blåregn, paternosterert, skotsk gullregn, limabønne, limulin, lotus, europeisk misteltein, mungbønne, gultre, pogadatre, haveert, potet, rød snittebønne, rød sjøalge, sibirsk ertebusk, spiselig snegleblomst, have-snegleblomst, vanlig beinved, søtert, tomat, hvetekim eller aspargesert.

23. Kompleks ifølge krav 15, karakterisert ved at bærermolekylet er alt, del, en analog, homolog, et derivat eller kombinasjon derav av et virushemagglutinin.

24. Kompleks ifølge krav 23, karakterisert ved at virushemagglutininet er et hemagglutinin avledet fra influensa-, mesling-, Rubella-, kopper- eller gulfebervirus.

25. Kompleks ifølge et av kravene 1-4, karakterisert ved at immunogenet er alt, del, en analog, homolog, et derivat eller en kombinasjon derav av LHRH, og bærermolekylet er alt, del, en analog, homolog, et derivat eller en kombinasjon derav av LTB.

26. Fremgangsmåte for fremstilling av et kompleks ifølge et av kravene 1-25, karakterisert ved at: (a) immunogenet omsettes med bærermolekylet slik at komplekset dannes, (b) immunogenet modifiseres kjemisk slik at det fåes minst én funksjonell gruppe som er i stand til å danne en kjemisk binding, og immunogenet og bærermolekylet omsettes slik at komplekset dannes, eller (c) bærermolekylet modifiseres kjemisk slik at det fåes minst én funksjonell gruppe som er i stand til å danne en kjemisk binding, og immunogenet og bærermolekylet omsettes slik at komplekset dannes, (d) immunogenet og bærermolekylet modifiseres kjemisk slik at det fåes funksjonelle grupper som er stand til å danne en kjemisk binding, og immunogenet og bærermolekylet omsettes slik at komplekset dannes, (e) immunogenet omsettes med minst ett bindingsmiddel, og immunogenet og bærermolekylet omsettes slik at komplekset dannes, (f) bærermolekylet omsettes med minst ett bindingsmiddel, og immunogenet og bærermolekylet omsettes slik at komplekset dannes, (g) immunogenet og bærermolekylet omsettes med minst ett bindingsmiddel, og immunogenet og bærermolekylet omsettes slik at komplekset dannes, eller (h) det utføres en kombinasjon av hvilke som helst av fremgangsmåtetrinnene ovenfor.

27. Fremgangsmåte for fremstilling av et kompleks ifølge et av kravene 1 - 25, karakterisert ved at det tilveiebringes et rekombinant DNA-molekyl som omfatter en første DNA-sekvens som etter ekspresjon koder for aminosyresekvensen til immuno genet, en andre DNA-sekvens som etter ekspresjon koder for aminosyresekvensen til bærermolekylet, og vektor-DNA, en vert transformeres med det rekombinante DNA-molekyl slik at verten blir i stand til å uttrykke et hybrid proteinprodukt som omfatter komplekset, verten dyrkes slik at ekspresjonen oppnåes og det hybride proteinprodukt utvinnes.

28. Fremgangsmåte for fremstilling av et kompleks ifølge et av kravene 1 - 25, karakterisert ved : (a) immunogenet og/eller bærermolekylet syntetiseres kjemisk og i komplekset dannes ved hjelp av reaksjoner i hen-hold til fremgangsmåten ifølge krav 26, eller (b) et hybridpeptid som omfatter aminosyresekvensene til immunogenet og bærermolekylet syntetiseres.

29. Fremgangsmåte ifølge krav 28, karakterisert ved at peptidet fremstilles ved hjelp av peptidsyntese i fast fase, enzymatisk eller manuell peptidsyntese.

30. Fremgangsmåte ifølge krav 29, karakterisert ved at peptidet fremstilles ved hjelp av peptidsyntese i fast fase.

31. Fremgangsmåte ifølge krav 30, karakterisert ved at det syntetiserte immunogen eller bærermolekyl, mens det er bundet til harpiksen i fastfase-peptidsynteseapparatet, kobles til henholdsvis bærermolekylet eller immunogenet.

32. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 28 - 31, karakterisert ved at det syntetiske peptid er alt, del, en analog, homolog, et derivat eller en kombinasjon derav av LHR.

33. Fremgangsmåte ifølge krav 26, karakterisert ved at bærermolekylet er LTB og bindingsmidlet er glutaraldehyd.

34. Kompleks ifølge et av kravene 1-25, karakterisert ved at det er fremstilt ved hjelp av en fremgangsmåte ifølge et av kravene 26 - 31.

35. Ekspresjonsprodukt fra en transformant vert, karakterisert ved at det omfatter et kompleks ifølge et av kravene 1-25.

36. Transformant vert, karakterisert ved at den er transformert med et rekombinant DNA-molekyl som omfatter en første DNA-sekvens som ved ekspresjon koder for aminosyresekvensene til alt, del, en analog, homolog, et derivat eller en kombinasjon derav, av immunogenet, en andre DNA-sekvens som ved ekspresjon koder for aminosyresekvensen til alt, del, en analog, homolog, et derivat eller en kombinasjon derav, av bærermolekylet, og vektor-DNA.

37. Transformant vert ifølge krav 30, karakterisert ved at verten er en gram negativ bakterie, en gram positiv bakterie, en gjær, en sopp eller en høyere eukaryot celle.

38. Transformant vert ifølge krav 36 eller 37, karakterisert ved at verten er E. coli.

39. Kultur, karakterisert ved at den består av den transformante mikroorganisme betegnet ATCC 67114.

40. Rekombinant DNA-molekyl, karakterisert ved at det omfatter en første DNA-sekvens som ved ekspresjon koder for aminosyresekvensen til immunogenet, en andre DNA-sekvens som ved ekspresjon koder for aminosyresekvensen til bærermolekylet, og vektor-DNA.

41. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 40, karakterisert ved at vektor-DNA er plasmid-DNA.

42. Plasmid, karakterisert ved at det er pBTAK6 6.

43. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 40, karakterisert ved at vektor-DNA er virus-, bakteriofag- eller cosmid-DNA.

44. Polynukleotidsekvens, karakterisert ved at den omfatter en første hybrid polynukleotidsekvens som virker som en kodende sekvens for et fusjonsprodukt omfattende en aminosyresekvens fra et immunogen fusjonert med en aminosyresekvens fra et bærermolekyl, en polynukleotidsekvens som er tilstrekkelig beslektet med den første hybridnukleotidsekvens til å kunne hybridisere til den første hybridpolynukleotidsekvens, en polynukleotidsekvens beslektet ved mutasjon, som omfatter enkle eller multiple baseutbyttinger, -fjerninger, -inn-føringer og -ombyttinger, med den første hybridpolynukleotidsekvens eller hybridiserende sekvens, eller en polynukleotidsekvens som ved ekspresjon koder for et polypeptid som gir lignende biologisk eller immunologisk aktivitet som fusjonsproduktet.

45. Polynukleotidsekvens ifølge krav 44, karakterisert ved at den første hybride polynukleotidsekvens virker som en kodende sekvens for aminosyresekvensen i alt, del, en analog, homolog, et derivat eller en kombinasjon derav, av et antigen eller hapten fusjonert med aminosyresekvensen til et bærermolekyl.

46. Polynukleotidsekvens ifølge krav 44, karakterisert ved at den første hybride polynukleotidsekvens virker som en kodende sekvens for aminosyresekvensen til alt, del, en analog, homolog, et derivat eller en kombinasjon derav, av LHRH fusjonert med aminosyresekvensen til et bærermolekyl.

47. Medikament, karakterisert ved at det omfatter et kompleks ifølge et av kravene 1-25 sammen med en farmasøytisk aksep-tabel bærer eller fortynningsmiddel.

48. Medikament ifølge krav 47, karakterisert ved at det er tilpasset for oral administrering.

49. Medikament ifølge krav 47, karakterisert ved at det er tilpasset for nasal administrering.

50. Medikament ifølge et av kravene 47 - 49, karakterisert ved at medikamentet foreligger i kapsel-, tablett-, sakteavgivelse-, eliksir-, gel-, pasta-eller nesesprayform.

51. Medikament ifølge et av kravene 47 - 50, karakterisert ved at det i tillegg omfatter et kostmolekyl som selektivt kan modulere størrelsen og/eller typen av immunrespons mot immunogenet i medikamentet.

52. Medikament ifølge krav 51, karakterisert ved at kostmolekylet er valgt fra aminosyrer, vitaminer, monosaccharider og oligosaccha-rider.

53. Medikament ifølge krav 51 eller krav 52, karakterisert ved at kostmolekylet er valgt fra vitamin A, vitamin B^ , vitamin B^ , vitamin B^ , vitamin B12 , vitamin C, vitamin D, vitamin E, fruktose, laktose, mannose, melibiose, sorbitol og xylose.

54. Fremgangsmåte for tilførsel av et kompleks ifølge et av kravene 1-25 til en virveldyrvert, karakterisert ved at den omfatter slimhinne-administrering av et medikament ifølge et av kravene 4 7 - 51.

55. Fremgangsmåte for tilførsel av et kompleks ifølge et av kravene 1-25 til en virveldyrvert, karakterisert ved at den omfatter oral administrering av et medikament ifølge et av kravene 47, 48, 50" og 51.

56. Fremgangsmåte for tilførsel av et komleks ifølge et av kravene 1-25 til en virveldyrvert, karakterisert ved at den omfatter nasal administrering av et medikament ifølge et av kravene 47, 49, 50 eller 51.

57. Fremgangsmåte for inhibering av gonadefunksjonen hos et pattedyr, karakterisert ved at den omfatter slimhinne-administrering av et medikament ifølge et av kravene 47 - 51.

58. Fremgangsmåte for selektiv modulering av størrelsen og/eller typen av immunrespons mot immunogenet i et kompleks ifølge et av kravene 1-25, karakterisert ved at den omfatter slimhinne-administrering av et medikament ifølge krav 51 til en virveldyrvert .

59. Fremgangsmåte for selektiv modulering av cellulære immunresponser mot et kompleks ifølge et av kravene 1 - 25, karakterisert ved at den omfatter slimhinne-administrering av et medikament ifølge krav 45 på en slik måte at den cellulære immunrespons mot komplekset i virveldyrverten spesifikt øker eller avtar.

60. Fremgangsmåte ifølge krav 58 eller krav 59, karakterisert ' ved at den omfatter administrering av et medikament ifølge et av kravene 47 - 50 og et kostmolekyl.

61. Kompleks, karakterisert ved at det er hovedsakelig som beskrevet ovenfor under henvisning til eksemplene.

62. Fremgangsmåte for induksjon eller modulering av en immunrespons hos en vert, karakterisert ved at den er hovedsakelig som beskrevet ovenfor under henvisning til eksemplene.

63. Bærermolekyl, karakterisert ved at det er hovedsakelig som beskrevet ovenfor under henvisning til figuren.