NO860167L - Fremgangsmaate til bestemmelse av aktiviteten av blodets komplementsystem. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte til bestemmelse av aktiviteten av blodets komplementsystem'hos mennesker og dyr.

Komplementsystemet utøver i human og dyrisk organisme en rekke funksjoner. Som viktigste gjelder Chemotaxis, opso-nering og lyse av cellene. Det understøtter kroppens immun-system som består av antistoffer og immunkompetente celler.

En hel rekke av berøringspunkter består mellom komplement-

og andre reguleringssystemet i blodet, eksempelvis koagulerings- og fibrinolysesystemet. Således kan en ved hjelp av komplement fastslått lyse av leukozytter frigjøre trombo-plastin, hvilket fører til aktivering av det eksogene koa-guleringssystem. På den annen side kan imidlertid også aktiverte koaguleringsfaktorer som brombin aktivere komple-mentsystemets proteiner. Også tilkommer den viktigste koaguleringsinhibitor, Antitrombin III, en regulatorisk funksjon i komplementsystemet. Den ved aktiveringen av koaguleringssystemet samtidig induserte dannelse av plasmin fører også til en aktivering av komplementfaktorene C1R og Cls, ved lengere innvirkning imidlertid til deres desakti-vering. Den ved koagualeringen aktiverte faktor Xlla for-bruker den viktige komplementinhibitor Cl-inaktivator og aktiverer likeledes komplement.

En kjent fremgangsmåte til fremstilling av komplementet

er di,-Q-bestemmelsen ifølge Mayer, som vanligvis gjennom-føres i serum. I serum er imidlertid koagulerings- og fibrinolysefaktorene allerede aktivert, også blodplatene har avgitt deres innhold og inhibitorer som AT III er delvis forbrukt, således at den fulle biologiske virkning av komplementsystemet er ødelagt.

Det er kjent at i visse tilfeller ved anvendelse av serum fåes patologiske verdier ved CHj.^-bestemmelser, enskjønt bestemmelsen av enkelte komplementfaktorer og CHj. Q-aktiviteten i plasma gir normale verdier (oversikter: Th.F. Lint, Laboratory Detection of Complement Activation and Comple ment Activation and Complement Deficiencies, Am. J. Med. technol. (1982) 48, 743 og A.T. Luskin og M.C. Tokin, Alternations of Complement Component in Disease, Am. J. Med. Technol. (1982) 48, 749). Av disse ved innvirkning av koagulasjonssystemet in vitro dannede komplementeffekter synes en bestemmelse i plasma å være mer fordelaktig enn i serum.

En ytterligere fremgangsmåte til fastslåelse av komplementaktivitet i serum er omtalt i Z. Naturforschung 20b, 569-574 (1965).

I denne metode gripes lysen av en saueerytrozytt-suspensjon som ble sensibilisert med kaninantistoffer mot saueerytrozytter ved hjelp av serum og den tid bestemt, hvori sus-pensjonens ekstinksjon er sunket til det halve. Tids-målingen gir dermed en uttalelse over serumets aktivitet. Denne fremgangsmåten er imidlertid omstendelig og fører spesielt ved små komplementaktiviteter til forholdsvis lange måletider.

Overraskende ble det funnet at aktiviteten av komplementsystemet av blod kan bestemmes, idet citratplasma blandes med i en kalsium- og magnesiumionholdig puffer suspendert og med antistoffer sensitiverte erytrozytter, tiden til oppnåelse av en bestem£ ekstinétsjonssenking måles og settes i forhold med den tid som måles på en plasmastandard.

Ekstinksjonssenkingen behøver bare å utgjøre en differans på f.eks. 0,1 av den optiske tetthet (O.D.) av suspensjonen direkte etter forening av prøve og reagens, således at det fremkommer en fordelaktig forkortelse av tidsbehovet for en bestemmelse spesielt ved lavere komplementaktiviteter og forenkling sammenlignet med den kjente optiske fremgangsmåte for serum.

Oppfinnelsens gjenstand er derfor en kinetisk fremgangsmåte til- bestemmelse av aktiviteten av den klassiske vei av komplementsystemet av humant eller pattedyrblod ved hjelp av fotometrisk forfølgelse av lysen av med antistoffer sensitiverte saueerotrozytter i en kalsium- og magnesiumionholdig puffer, idet fremgangsmåten erkarakterisert vedat det anvendes et citratplasma av blodet som prøvematerial.

En spesielt fordelaktig ny utførelsesform ifølge oppfinnelsen består i at det måles den tid, hvori systemets optiske tetthet ved 578 nm avtar rundt 0,025 til 0,2, fortrinnsvis 0,05 till 0,15. Alternativt kan det også anvendes andre bølgelengder på 540 inntil 800 nm, hvor man kan måle uklar-heten av en erytrozyttsuspensjon.

Det er fordelaktig å bestemme komplementaktiviteten i et prøvematerial, hvori koagulasjonssystemet er best mulig intakt som i citratplasma. Prøven kan i denne form imidlertid også, med de nevnte begrensninger, gjennomføres på serum.

Til utvinning av plasma for en undersøkelse av komplement-funksjonen må det være sikret at komplementsystemet ikke inaktiveres ved en antikoagulens, som bevirker fjerning av de komplement- og koaguleringsaktive kalsiumioner og også de for komplementsystemet nødvendige'magnesiumioner.

I den her omtalte fremgangsmåte kan det anvendes det for koaguleringsundersøkelser vanlige citratplasma, ikke imidlertid EDTA-plasma, som tydeligvis fører til en inaktivering av den klassiske vei av komplementsystemet.

I motsetning hertil ble det i ovennevnte litteratur også henvist til anvendelse av EDTA-plasma (Lint og Luskin ogTokin). Også heparinplasma kan anvendes i den fotometriske prøve. Det måles fotometrisk i langbølget område av det synlige lys turbiditetsendringen av den ved komplement fastslåtte lyse av suspenderte med antistoffer mot saueerytrozytter av kaniner sensibiliserte saueertrozytter. Erytrozyttene er suspendert i en kalsium- og magnesiumionholdig puffer. Alternativt kan det anvendes en renset immunglobulinfraksjon eller også et antiserum til sensibi-lisering.

Da reaksjonshastigheten øker med økende temperatur, er det fordelaktig å arbeide ved forhøyet temperatur og anvend-elsen av et fortemperert reagens. Det arbeides fortrinnsvis ved 37°C. Den i Z. Naturforschung omtalte metode derimot benytter på is lagret reagens, idet en temperatur-konstant under bestemmelsen ikke er sikret, da det under reaksjonen kommer til en stadig oppvarming av reagenset, således at aktive sera i løpet av kort tid reagerer ved relativt lav temperatur, mindre aktive imidlertid ved høyere temperatur. Overraskende er imidlertid det i eksempel 1 omtalte reagens også stabilt ved 37°C over minst 8 timer og kan derfor godt anvendes ved denne temperatur.

Den til suspendering av de sensibiliserte saueerytrozytter anvendte puffer har fortrinnsvis en pH-verdi fra 6-8, fortrinnsvis fra 7-7,5. Som pufferstoffer kan det eksempelvis anvendes Veronal, Hepes, Tris eller Imidazol, fortrinnsvis Hepes . Egnede pufferstoffkonsentrasjoner er 5-100, fortrinnsvis 20 mM.

Reaksjonshastigheten avhenger også av saueerytrozyttenes oppladningstetthet. Derfor er en optimal dosering av kaninantistoffer mot saueerytrozytter viktig. En egnet konsentrasjon er angitt i eksempel 1. Selve celletettheten spiller imidlertid for reaksjonstidene bare en underordnet rolle, når man benytter metoden ifølge oppfinnelsen. Derimot er tiden for 50% hemolyse ved høyere celletettheter avhengig av erytrozyttkonsentrasjonen.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av noen eksempler.

Eksemgel_l

200 |il av en suspensjon av vaskede saueerytrozytter ble blandet med 200 ul av en oppløsning av kaninantistoffer mot saueerytrozytter (Ambozeptor 6000, (Behringwerke AG, Marburg, BRD, fortynning 1.50, eller også en renset immunglobulinfraksjon av dette antiserum) og oppfylt til 10 ml med en puffer som inneholdt 0,15 mmol/1 CaCl2, 0,5 mmol/1 MgCl2, 20 mmol/1 Hepes, pH 7,3, 150 mmol/1 NaCl og 1 g/l gelatin. Erytrozytt-suspensjonens celletetthet utgjorde 2 x 10^ celler/ml.

Etter ca. 10 minutter er reagenset bruksferdig. Før anvendelse i den fotometriske prøve ble suspensjonen oppvarmet til 37°C og eventuelt sedimentert erytrozytter forsiktig opp-rystet.

Under en bestemmelse kan det imidlertid sees bort fra cellenes sedimentasjon.

Eksem<p>e<l>_<2>

Målefremgangsmåte

50 pl human-citratplasma ble pipettert i en til 37°C foroppvarmet kyvette og tilsatt 500 \ il av det ovenfor frem-stilte reagens, som var blitt holdt på 37°C. Etter sammen-blanding av komponentene ble ekstinksjonen bestemt ved 578 nm. Som måleparameter bestemmes tiden for oppnåelse av en ekstinksjonsdifferans på -0,1 O.D., som frembringes ved lyse av erytrozytter ved komplement. Denne tid er selvsagt kortere enn den for en lyse av halvparten av erytrozyttene. Spesielt ved patologiske plasmaer benyttes nedsatt komplementaktivitet viser tidsgevinsten seg ved anvendelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen sammenlignet til en bestemmelse av den for den halvmaksimale lyse nødvendige tid (fig. 1).

Eksemgel_3

1 ml citratplasma ble blandet med 200 |il av en oppløsning av Fab'-fragmenter av kaninantistoffer (Behringwerke AG, Marburg, BRD) mot komplementfaktorene Clq, Cls, C3, C4 eller C5 av den klassiske vei eller faktor B av den alternative vei. For fortynning av oppløsningen av Fab'-fragment ble den blandet med fysiologisk koksaltoppløsning.

Tabell_l

Innvirkning av antistoff-fragment Fab' mot Clq,Cls, C3, C4, C5 og faktor B på reaksjonstiden.

Blanding: 60 ja 1 plasma

30 |il Fab'- resp. NaCl-oppløsning

600 fil suspensjon av sensitivert erytrocytter

(37°C)

I tabell I ser man hvorledes stigende Fab'-konsentrasjoner mot Clq, Cls, C3, C4 og C5 forlenger reaksjonstiden for kontrollene (Fab'-konsentrasjon = 0, bare NaCl-oppløsning). Antistoffer mot faktor B viser derimot ingen innvirkning. Dette resultat viser at reagenset anviser følsomt alle undersøkte faktorer av den klassiske vei, imidlertid ikke en mangel på faktor B fra den alternative vei av komplementet.

Eksemp_el_4

Bestemmelse_av_en_enkeltf aktor_.(_C4]__

C4-mangelserum ble oppnådd fra marsvin med genetisk betinget C4-mangel. Til bestemmelse av aktiviteten av faktor C4

ble humant citratplasma utfortynnet med NaCl.

20 ul plasma ble blandet med et overstående av 100 ul mangelserum og reaksjonen startet ved tilsetning av sensitiverte erytrozytter. Ved dobbelt logaritmisk oppføring ble det funnet et lineært forhold mellom C4-konsentrasjoner og reaksjonstid.

En sammenlignbar blanding lar seg gjennomføre med et C2-mangelserum for C2.

Eksemp_el_5_

Jh2Yi£lS!3i22_5Y_££2£2§ser _§Y_IS2É2yi§liD2§§Yt§m§t_2i_komgle-mentaktiviteten

Innvirkningen av trombin, kallikrein og plasmin, som akti-veres under koagulering på komplementaktiviteten av plasma viser tabell 2. Av disse resultater lar det seg avlede at koaguleringssystemet kan påvirke komplementaktiviteten. Således fåes ved trombin- og kallikreininnvirkning på plasma lengere måletider.

Blanding:

20 ul enzymoppløsning og 60 ul citratplasma ble inkubert 60 sekunder ved 37°C. Deretter ble det tilsatt 600 ul raegens ifølge eksempel 1. Det bestemmes tiden for Delta-E = 0,1.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte til bestemmelse av aktiviteten av komplementsystemet av humant eller pattedyrblod ved hjelp av fotometrisk forfølgelse av lysen av sensitiverte erytrozytter i en kalsium- og magnesiumionholdig puffer, karakterisert ved at som prøvematerial anvendes blodplasma, som som antikoagulens inneholder sitronsyre eller et salt derav.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den tidsvarighet måles, hvori systemets optiske tetthet ved en bølgelengde på 540 til 800 nm, fortrinnsvis 578 nm, avtar rundt 0,025 til 0,2, fortrinnsvis 0,05 til 0,15.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at erytrozyttene er slike fra sau.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at erytrozyttene ble sensitivert med antistoffer, som ble dannet ved immunisering av kaniner ved hjelp av erytrozytt-antigener fra sau.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at pufferen er en Hepes-holdig puffer, konsentrasjonsområdet 5-100, fortrinnsvis 20 nM, pH 6,5-8,5, fortrinnsvis 7,3.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at pufferen inneholder kalsiumioner i en konsentrasjon på 0,05-0,5, fortrinnsvis 0,15 mmol/1, og magnesiumioner i et konsentrasjonsomrpde på 0,1-2 mmol/1, fortrinnsvis 0,5 mmol/1, samt koksalt til oppnåelse av en fysiologisk ledningsevne (15 mS + 2,5 mS).

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det tilsettes et mangelplasma eller mangelserum av en faktor av den klassiske vei av-komplementet i overskudd og aktiviteten av denne mangelfaktor bestemmes i prøvematerialet.