NO844561L - Spesifikk bindingsproeve basert paa enzymkaskadeamplifikasjon - Google Patents

Abstract

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer spesifike bindingsforsøksmetoder og reagenssystemer for den kvantitative eller kvalitative bestemmelsen av en analytt i et væskemedium basert på heterogene eller homogene fremgangsmåter. Oppfinnelsen gjelder spesielt bruken av spesifike bindingsforsøks-teknikker hvor merket er en deltager i eller en modulator av en enzymreaksjon, hvorved et første enzym virker på et første substrat for å produsere et andre enzym. Det andre enzymet kan anvendes for å katalysere en påvisbar respons eller kan virke på et andre substrat for å produsere et tredje enzym. Merket velges fra det første substratet eller en kofaktor eller modulator av det første enzymet. I en utførelsesform, er det første substratet et zymogen som når det påvirkes av det første enzymet, produserer et andre enzym. Når det endelige enzymproduktet anvendes for å katalysere produksjonen av en påvisbar res-spons som er proporsjonal med konsentrasjonen av analytten, oppnås en forsterkning som muliggjør en meget følsom bestemmelse.

Description

Utviklingen av spesifike bindingsførsøksteknikker har gitt meget anvendbare analytiske metoder for bestemmelse av forskjellige organiske substanser av diagnostisk, medisinsk , miljømessig og industriell betydning, og som forekommer i væskemedier i meget lave konsentrasjoner. Spesifike bind-ingsforsøk er basert-på den spesifike reaksjonen mellom substansen som skal bestemmes, her referert til som "analytten", og et bindingsmotstykke til denne. Når en av analytten og dens bindingsmotstykke er et antigen, er forsøket kjent som et immunoforsøk.

I konvensjonelle spesifike bindingsforsøksteknikker, kombineres en prøve av det flytende medium som skal analyseres med et reagenssystem av forskjellige blandinger. En slik blanding innbefatter et påvisningsreagens som omfatter en bindingsbestanddel forgrenet med merke. Bindingsbestanddelen i påvisningsreagenset reagerer med andre bestanddeler i reagenssystemet, og analytten i det medium som skal analyseres, for å danne et bindingsreaksjonssystem som gir to arter eller former av påvisningsreagenset, en bundet form og en ubundet form.

I den bundne formen, er bindingsbestanddelen, f.eks. et hapten eller antigen, i påvisningsreagenset bundet med et tilsvarende bindingsmotstykke, f.eks. et antistoff, mens bindingsbestanddelen i den ubundne formen ikke er så bundet.

Den relative mengden av påvisningsreagens som oppstår i den bundne formen, sammenlignet med den ubundne formen, er en funksjon av nærværet (eller mengden) av analytten i prøven.

Når påvisningsreagenset i den bundne formen i hovedsake ikke kan skilles fra påvisningsreagenset i den ubundne formen i nærvær av hverandre i det systemet som anvendes for å kon-trollere merket, må den bundne formen og den ubundne formen være fysisk separert fra hverandre for å fullføre forsøket. Denne type forsøk refereres til på fagområdet som "heterogen". Når de bundne formene og ubundne formene av påvisningsrea genset kan skilles fra hverandre i nærvær av hverandre, kan det følges et "homogent" forsøk, og separasjonstrinnet unn-gås .

Oppfinnelsen gjelder spesifike bindingsforsøksmetoder og reagenssystemer for den kvantitative eller kvalitative bestemmelsen av en analyt i et væskemedium basert på heterogene eller homogene forsøk. Spesielt gjelder foreliggende oppfinnelse anvendelse av spesifike bindingsforsøksteknikker når merket er en deltager i eller en modulator av en enzymatisk reaksjon.

Det første meget følsomme, spesifike bindingsforsøk som ble oppdaget, var radioimmunoforsøket som anvender seg av en radioaktiv isotop som merke. Et slik forsøk må nødvendigvis følge den heterogene formen, siden den kontollerte responsen på merket ikke forandres signifikant i den ubundne og bundne formen. På grunn av ulempene med og vanskeligheten med hånd-tering av radioaktive materialer, og nødvendigheten av et separasjonstrinn, er det utviklet homogene forsøkssystemer hvor det anvendes andre materialer enn radioisotoper som merkebestanddel, omfattende enzymer, bakteriofager, metaller og organometalliske komplekser, enzymsubstrater, koenzymer, enzyminhibitorer, cyklerende reaktanter, spinnradikaler, organiske og uorganiske katalysatorer, prostetiske grupper, kjemiluminscente reaktanter og fluorescerende molekyler.

GB-PS 2.059.421A beskriver en fremgangsmåte for bestemmelse av en ligand eller en reseptor som anvender som merkebestanddel, et konjugat mellom (i) en ligand eller en reseptor og (ii) et primært enzym som selv er i stand til å produsere eller fjerne en modulator for et sekundært system eller som er det første enzymet i et enzymsystem som er istand til å produsere eller fjerne en modulator for et sekundært system. For å fullføre forsøket, bestemmes merkebestanddelen ved

å tilsette det primære enzymet og eventuelle andre enzymer i enzymsystemet, la det sekundære systemet fungere i nærvær

eller fravær (slik det passer) av modulatoren, og bestemme et produkt av det sekundære systemet. Det er foreslått å gjøre bruk av enzymet C3-konvertase som merket. C3-konvertase virker på komplementfaktoren C3 for å produsere C3b. C3b,

I nærvær av andre bestanddeler, vil også C3b omdanne C3 til C3b og er således autoaktiverende. Det er to ulemper med dette systemet som hindrer bruken av det i et praktisk labo-ratorieimmunoforsøk. For det første er merket et ustabilt enzym og for det andre er det ingen C3b-substrater tilgjengelig for å tilveiebringe et kromogent påvisningssystem.

Generelt representative for homogene, spesifike bindings-forsøk er de som er beskrevet i følgende henvisninger: US-PS 4.1341792, 4.226.978, 4.230.797, 4.238.195, 4.238.565, 4.208.479, 4.233.401, 4.265.834, 3.817.837, 4.043.872, 4.233.402, 4.160,645 og 3.690.834.

Ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en spesifik bindingsforsøksmetode og et reagenssystem hvor merkebestanddelen som anvendes i påvisningsreagenset er en deltager i eller en modulator av en enzymkaskadereaksjon hvor et første enzym virker på et første substrat for å produsere et andre enzym. Produksjonen av det andre enzymet kan følges eller det ander enzymet kan virke på et andre substrat for å produsere et tredje enzym, hvis produksjon kan følges.

Forsøket kan være av den heterogene eller homogene typen

og den sistnevnte typen foretrekkes. Når en homogen fremgangsmåte anvendes, kontrolleres fremdriften av forsøket ved å måle den modulerende effekten av den spesifike bindin-gen av påvisningsreagenset med et bindingsmotstykke derav på produksjonen av det andre, tredje eller påfølgende enzym. En slik binding forårsaker vanligvis en inhibering av enzym-produksjon, men det kan også forekomme økning av enzymproduksjonen. Metoden kan anvendes for bestemmelse av en lang rekke analytter, og får anvendelse i forskjellige utførelsesformer, fra flytende testsystemer til testanord-

ninger i fast tilstand, og fra manuelle til automatiske systemer .

I den homogene utførelsesformen, omfatter fremgangsmåten

for bestemmelse av en analyt i et flytende medium fortrinnsvis dannelse av en reaksjonsblanding ved å kombinere det flytende mediet med et reagenssystem som inneholder et bindingsmotstykke til analytten og et påvisningsreagens. Påvisningsreagenset inneholder analytten, eller en bindingsanalog av analytten, sammenblandet med merket. Kombinasjonen av det flytende mediet med reagenssystemet, resulterer i dannelsen av en bundet form av påvisningsreagenset, hvor påvisningsreagenset er bundet til bindingsmotstykket, og en ubundet form av påvisningsreagenset, hvor påvisningsreagenset ikke er så bundet. Merkets evne til å delta i eller modulere enzym kaskadereaksjonen, er målbart forskjellig når påvisningsreagenset foreligger i den bundne sammenlignet med den ubundne formen. Aktiviteten til det andre, tredje eller påfølgende enzym (dannet i enzymkaskadereaksjonen)

i reaksjonsblandingen måles så som en funksjon av analytten i værskemediet.

Alle enzymer kan utvirke forsterkning, dvs. et enzymmolekyl kan katalysere dannelsen av tusener av produktmolekyler fra et gitt substrat i en gitt tidsperiode. Virkelig forsterkning, øket følsomhet for forsøkssystemet, oppstår imidlertid når enzymproduktet av enzymreaksjonssystemet anvendes i en andre reaksjon for å katalysere dannelsen av et andre produkt. I det meste er tidligere kjente metoder for styring av konkurrerende proteinbindingsforsøk basert på bruken av enzymreaksjoner som ikke produserer et enzymprodukt. Derfor er virkelig forsterkning, en øket følsomhet for forsøks-systemet for konsentrasjonen av den analytt som er av interesse, ikke mulig. Fordelen med foreliggende oppfinnelse er at siden reaksjonsproduktet også er et enzym, kan det i sin tur katalysere dannelsen av tusener av molekyler av et andre produkt. Dersom dette produkt er påvisbart, kan konsentrasjonen av dette relateres til konsentrasjonen av analytten som er oppnådd i en entrinns forsterkning. Når dette andre produkt er et tredje enzym som kan katalysere dannelsen av et tredje produkt, som kan gi en påvisbar respons som er proporsjonal med konsentrasjonen av analytten, resulterer en "dobbelt" forsterkning. Denne dobbelte for-sterkningskaskade vil muliggjøre en meget følsom analyse. Enzymkaskaden kan fortsettes for å tillate ytterligere forsterkning dersom det tredje produktet også er et enzym. Fig. 1 er et flytskjema som viser det zymogenaktiverings-immuno-forsøkssystemet som er vist i eksempel 1, hvor zymogen faktor X og faktor X-aktiverende enzym fra Fussell's huggormgift utgjør merket/første enzympar. Tilsetning av et antistoff for analytten inhiberer deltagelse av zymogenmerket i enzymkaskaden. Påvisning gjennomføres ved innvirkning av enzymproduktet (andre enzym) på et kromogent substrat for å produsere farge. I fig. 1 er det faktor X-aktiverende enzymet fra Russell's huggormgift forkortet RVV; antistoff er forkortet Ab; og analytt, A. A-faktor X betegner påvisningsreagenset og Ab:A og Ab:A-faktoren X betegner antistoff-bundne former. Fig. 2 er et diagram som viser aktiveringshastigheten for zymogen-substratet til enzymproduktet ved tilsetning av antistoff til analytten. I eksempel 1 er substratet/det første enzymparet faktor X/aktiveringsenzym fra Russell's huggormgift, det andre enzymet er faktor Xa og analytten er tiofyl-lin. Aktiveringshastigheten måles som hellningen av en avsetning av absorbsjon mot (tid) 2. I diagrammet er aktiveringshastigheten i absorbsjon pr. (minutter) 2 avsatt mot konsentrasjonen av antistoff til theofyllin tilsatt i mikroliter pr. ml (ml) av forsøksløsninger. En mikroliter av renset antistoff preparat inneholder 5,62 \ iq protein. Fig. 3 er en dose-respons-kurve som viser aktiveringshastigheten for substrat til enzymprodukt med tilsetning av den frie analytten, som beskrevet i eksempel 1. Dette forsøk utføres i nærvær av antistoff til theofyllin. I diagrammet er aktiveringshastigheten i absorbsjon pr. (minutter) 2avsatt mot konsentrasjonen av tilsatt analytt i mikromol. Fig. 4 er et flytskjema som viser zymogent immunofor-søkssyste met for blodkoaguleringen, hvor zymogen-faktor X og faktor X-aktiverende enzym fra Russell's huggormgift utgjør merket/første enzympar. Tilsetning av et antistoff for analytten inhiberer deltagelse av zymogenmerket i enzymkaskaden. Faktor Xa, det andre enzymet, virker på protrombin for å produsere trombin, det tredje enzymet. Påvisning gjennomføres ved innvirkning av protrombinet på et kromogent substrat for å produsere farge. I flytskjemaet forkortes faktor X-aktiverende enzym fra Russell's huggormgift til RVV, analytten forkortes til A, og antistoffet til analytten, Ab. A-faktor X betegner påvisningsreagenset, Ab:A og Ab:A-faktor X er betegnelser som anvendes for de bundne formene av henholdsvis analytten og påvisningsreagenset. I eksemplet er analytten biotin og et naturlig bindingsprotein, avidin, anvendes istedet for et antistoff for analytten. Fig. 5 er et diagram som viser den prosent av aktiviteten av det første zymogensubstratet, faktor X, som blir igjen etter tilsetningen av avidin, et bindingsprotein for analytten biotin. Aktiveringshastigheten måles som hellningen på en avsetning av absorbsjon ved 406 nanometer mot (tid i minutter) . Fig. 6 er en dose-respons-kurve som viser hastigheten for faktor X-aktivering til faktor Xa, målt som beskrevet i eksempel 3, ved tilsetning av den frie analytten, biotin,

i nanomol/liter (nM). Førsøket utføres i nærvær av avidin, et protein som binder seg til biotin. Hastigheten angit i absorbsjonsenheter pr. (minutter) 3.

I foreliggende beskrivelse skal følgende uttrykk defineres som følger med mindre annet er angitt: Analytt. Den substansen eller klasse av beslektede substanser hvis nærvær eller mengde i et flytende medium skal bestemmes.

Bindingsmotstykke til analytten. En hvilken som helst substans eller klasse av substanser som har en spesifik bindingsaffinitet, normalt reversibel, for analytten.

Spesifik bindingsanalog av analytten. En hvilken som helst substans eller klasse av substanser som opptrer på lignende måte som analytten når det gjelder binding av et bindingsmotstykke til analytten.

Reagenssystem. En blanding, prøveanordning, prøve-utstyr, eller annet fysisk arrangement eller kombinasjon av reagenser, for bruk ved utførelse av foreliggende forsøks-fremgangsmåte.

Merke. Deltager i eller modulator av en enzymreaksjon hvor et enzym virker på et første substrat for å produsere et andre enzym. Merket velges fra det første substratet eller en kofaktor eller modulator av det første enzymet. Merket er et spesielt nytt aspekt ved oppfinnelsen, og defineres mere detaljert i den følgende beskrivelse.

Påvisningsreagens. Dette omfatter en bindingsbestanddel som er sammenblandet med merket.

Den tenkte, generelle enzymkaskadereaksjonen er en som følger ligningen:

Det første enzymet (enzym 1) kan katalysere addisjon, spaltning eller omordning av substratet for å fremstille det andre enzymet. Det enzym som dannes (enzym 2) kan anvendes som en katalysator for en ytterligere reaksjon som resulterer i en påvisbar respons med etterfølgende, virkelig forsterkning .

r

Det påtenkte, dobbelte enzymkaskadesystemet er et som følger ligninge:

Som foran kan det første enzymet (enzym 1) katalysere addisjon, spaltning eller omordning av et første substrat for å produsere en andre enzym (enzym 2). Det andre enzymet kan så katalysere addisjon, spaltning eller omordning av et andre substrat for å produsere et tredje enzym. Det dannede enzymet (enzym 3) kan anvendes som en katalysator for ytterlig reaksjon som resulterer i en påvisbar respons. Dette dobbelte enzymkaskadesystemet resulterer i to trinn eller dobbelt forsterkning. Fler-trinns forsterkning kan oppnås dersom det tredje produktet også er et enzym.

Det foreligger en rekke naturlig forekommende, multiple kaskadereaksjoner som er anvendbare i foreliggende oppfinnelse. Eksempler på slike multiple kaskadereaksjoner finnes i blodkoaguleringskaskaden, hemolymfekoaguleringssystemet i hesteskokrabben, zymogener fra fordøyelsesproteaser og en fosfory-leringskaskade. Det første enzym/første substrat-paret må velges slik at enzymproduktet (enzym 2) kan katalysere dannelsen av et tredje enzym ved dets virkning på et andre substrat. Fortrinnsvis velges reaksjonsbestandelene slik at det er spesifike substrater som påvirkes av enzym 3 for å tilveiebringe en påvisbar respons.

1. Merke.

Når et ønskelig første enzym/substrat-par er valgt, baseres foreliggende oppfinnelse på bruken av en merkebestanddel i påvisningsreagenset fra det første substratet, en nødvendig kofaktor eller en hvilken som helst modulator for den første enzymreaksj onen.

a. Substrat som merke.

Det første substratet vil vanligvis være et proenzym eller et reguleringsenzym som kan aktiveres eller inaktiveres. Vanligvis vil spaltning eller tilsetning av fosfat, en adenylgruppe eller et polypeptid forårsake aktivering av et proenzym eller et reguleringsenzym, eller inaktaivering av et reguleringsenzym.

Når spaltningen av en polypeptidgruppe fra et proenzym katalyseres ved et første enzym for å produsere et andre enzym, kalles proenzym-substratet et zymogen. Zymogener er spesielt foretrukne merker.

Egnede zymogen/første enzym-par omfatter chymotrypsinogen/ trypsin, trypsinogen/enteropeptidase, prokarboksypeptidase A/trypsin, prokarboksypeptidase B/trypsin, proelastase/ trypsin, protrombin/faktor Xa,'plasminogen/urokinase, og faktor X/faktor X-aktiverende enzym fra Russell's huggormgift.

En annen gruppe av egnede substrater er reguleringsenzymene som kan aktiveres eller inaktiveres ved spaltning eller tilsetning av fosfat eller adenylgrupper (se f.eks. tabell 1). Når dobbelt forsterkning er ønsket, omfatter passende zymogen/ første enzym par: 1) fra blodkoaguleringskaskaden: faktor X/faktor X-aktiverende enzym fra Russell's huggormgift, faktor X/faktor IXa, faktor IX/faktor XIA, faktor XI/faktor XII; 2) fra hemolymfesystemet i hesteskokrabben: faktorB/faktor X-aktiverende enzym fra Russell's huggormgift, 3)

fra fordøyelseszymogenene: trypsinogen/enterokinase og 4)

fra fosforyleringskaskaden: fosforylase-kinase/protein-kinase. I hvert tilfelle virker det første enzymet på det første substratet for å produsere et andre enzym, hvilket andre enzym virker på et andre substrat for å produsere et tredje enzym, hvilket resulterer i et dobbelt enzymkaskadesystem.F.eks.: faktor X-aktiverende enzym fra Russell's huggormgift (det faktor X-aktiverende enzym fra Russell's huggormgift refereres her til som RVV) virker på faktor X for å produsere faktor Xa, et enzym som i sin tur kan virke på protrombin for å produsere trombin i et andre enzym, virker enterokinase på trypsinogen for å produsere trypsin, et enzym som i sin

tur virker på proelastase for å produsere elastase. I hvert tilfelle kan det tredje enzymet, trombin eller elastase, katalysere produksjonen av et tredje produkt som tilveiebringer en påvisbar respons som kan relateres til konsentrasjonen av den analytt som er av interesse.

I en foretrukket utførelsesform, virker RVV på faktor X

for å produsere faktor Xa. Faktor Xa virker så på protrombin for å produsere et tredje enzym, trombin. Et egnet kromogent substrat for trombin tilveiebringes slik at en påvisbar respons utvikles som kan relateres til konsentrasjonen av analytten .

For dobbelt forsterkning er reguleringsenzymene en annen gruppe egnede substrater, som kan aktiveres eller inaktiveres ved spaltning eller tilsetning av et fosfat. Et egnet første substrat/første enzym-par er fosforylase b kinase/proteinkinase. Proteinkinase katalyserer tilsetningen av fosfat til fosforylase b kinase for å produsere fosforylase a kinase, den aktive formen av enzymet. Fosforylase a kinase virker på et andre substrat, fosforylase b, for å produsere et tredje enzym, fosforylase a. Et egnet substrat for fosforylase a tilveiebringes, hvilket fullstendiggjør den dobbelte for-sterkningskaskaden, slik at det utvikles en påvisbar respons som kan relateres til konsentrasjonen av analytten.

b. Kofaktor som merke.

Dersom det første substrat/første enzym-paret som velges krever en kofaktor for å produsere- det andre enzymet, kan denne kofaktor anvendes som merke. Egnede kofaktorer er adenosin-monofosfat, (AMP), adenosin-trifosfat (ATP), niko-tin-adenin-dinukleotid (NAD) og andre nuklaotid-koenzymer. ATP kreves eksempelvis for fosforyleringen av glykogen-syntetase (I) med protein kinase og av fosforylase b med fosforylase b kinase. 3', 5'-cyklisk AMP modulerer fosforyleringen av glykogen-syntetase (I) for å danne glykogen-syntetase

(D). I de dobbelte forsterkningskaskadene modulerer 3',5'-

cyklisk AMP tilsetningen av en fosfatgruppe (fosforylering) til fosforylase b kinase med protein kinase. I en hvilken som helst av disse reaksjonene, kan kofaktoren anvendes som merke. I blodkoaguleringskaskaden kreves faktor Villa,

+2

Ca og fosforlipid som kofaktorer for aktiveringen av faktor X ved faktor IXa.

c. Modulator av det første enzymet som merke.

En hvilken som helst substans som modulerer den katalytiske virkningen av det første enzymet på det første substratet for å produsere et andre enzym, kan også anvendes som merke. Moduleringen finner vanligvis sted i form av inhibering,

men økning av produksjonen av det andre enzymet kan imidlertid også tenkes.

Disse modulatorer omfatter naturlige inhibitorer, syntetiske inhibitorer og antistoffer eller fragmenter derav for det første enzymet. En naturlig inhibitor fra en enkelt forsterknings enzymkaskade, er soyabønne trypsin inhibitor. Soyabønne trypsin inhiberer virkningen av trypsin og chymotrypsinogen, og minsker derved produksjonen av chymotrypsin. En naturlig inhibitor fra en dobbelt forsterknings enzymkaskade, er a^-makroglobulin. c^-makroglobulin inhiberer virkningen av RVV på faktor X, og minsker derved produksjonen av faktor Xa.

F.eks. vil slike forbindelser som

inhibere evnen hos trypsin til å katalysere omdannelsen av chymotrypsinogen til chymotrypsin. Slike forbindelser som diisopropylflourfosfat, o-fenantreolin, etylendiamintetra-acetat og etylenglykolbis(B-aminoetyleter)-N,N,N',N<1->tetra-eddikysre vil inhibere evnen hos RVV til å katalysere omdannelsen av faktor X til faktor Xa. Denne første enzymreaksjon kan anvendes i en multienzymkaskade, når det tilveiebringes et passende andre substrat for faktor Xa.

Som et modulatormerke kan det også anvendes et antistoff

som er opphøyet til det første enzym, eller et fragment av et slikt antistoff. Teknikker som anvendes for å oppnå antistoffet, er vel kjente for fagmannen. I reaksjonsblandingen vil et slikt antistoffmerke binde det første enzymet, hvilket påvirker den normale reaksjonen mellom det første enzymet og det er første substratet, og derved minske eller øke produksjonen av det andre, tredje eller påfølgende enzymet.

Naturlige bindingsproteiner kan anvendes på lignende måte.F.eks. er avidin et naturlig protein som binder biotin.

2. Påvisningsreagens.

Påvisningsreagenset omfatter to hovedbestanddeler som er koblet til hverandre enten ved direkte kjemisk binding, f.eks. ved kovalente bindinger, eller ikke kovalent binding, eller ved indirekte feste, f.eks. ved hjelp av mikrokapsler eller liposomer. En bestanddel er bindingsbestanddelen, hvis funksjon er vel kjent på fagområdet. Bindingsbestanddelen og analytten i prøven deltar i det spesifike bindingsreaksjonssystemet. Avhengig av den spesielle forsøksfremgangsmåte som anvendes, vil bindingsbestanddelen vanligvis være analytten selv, en spesifik bindingsanalog av analytten eller en bindingspartner for analytten. Valget av en spesiell bindingsbestanddel i et gitt forsøk og fremgangsmåter for innblanding av denne i påvisningsreagenset, er lett for fagmannen .

Den andre bestanddelen i påvisningsreagenset er den nye merkebestanddelen ifølge foreliggende oppfinnelse, en deltager i eller en modulator av den første enzymreaksjonen i en enzym kaskadereaksjon. Ved valg av festestilliger på bindingsbestanddelen og merke ifølge foreliggende oppfinnelse, er viktige overveielser på det generelle nivået: (1) bevar-else av den bundne bindingsbestanddelens evne til å delta effektivt i det valgte bindingsforsøkssystemet og (2) bevar-else av det bundne merkes evne til å delta i .eller modulere den første enzymreaksjonen. I begge tilfeller i en slik grad at det vil oppnås en anvendbar analyse for den spesielle analytten som undersøkes, og for de spesielle konsentrasjoner i hvilke dette skal påvises. Vanligvis vil bindingsgruppen omfatte en kjemisk binding, vanligvis en enkeltbindings, eller en kjede inneholdende fra 1 til 20, mere vanlig 1 til 10, karbonatomer, og 0-10, mere vanlig 1 til 5, heteroatomer, valgt fra nitrogen, oksygen og svovel. Videre detaljer når det gjelder valg av bindingsgrupper kan finnes i US-PS 4.238.565 og 3 .817 .837 .

I det mest vanlige tilfellet, vil deltageren i eller modulatoren av den første enzymreaksjonen i en enzymkaskade som anvendes som merke i foreliggende oppfinnelse, og bindingsbestanddelen som skal kobles med dette, ha tilgjengelige amino- og karboksy1-funksjonaliteter for kobling ved konvensjonelle peptid kondensasjonsreaksjoner. Når det valgte merke er et protein, f.eks. når et substrat zymogen eller en modulator som f.eks. et antistoff eller en annen naturlig proteininhibitor eller -stimulator anvendes som merke, vil det ha flere aktive amino- og karboksyl-grupper som kan delta i peptidkondensasjonen. Ofte vil analytten selv inneholde en amino- eller karboksyl-gruppe som er anvendbar for kobling til merket ved peptidkondensasjon, slik som når analytten er et protein eller et polypeptid, eller er et hapten som er et primært amin eller en karboksylsyre. Når analytten ikke har en tilgjengelig funksjonalitet for kobling til merket, ken en slik lett innføres ved å danne et amino- eller karboksyl-derivat av analytten. Typiske analyttderivater av denne typen (dvs. spesifike bindingsanaloger av analytten) og ytterligere detaljer angående dannelsen av påvisningsreagenset ved peptidkondensasjon og ekvivalente teknikker tilveiebringes i US-PS 4.226.992, spesielt i kolonnene 3-10 deri, som inntas her som referanse.

Konvensjonelle peptidkondensasjonsreaksjoner omfatter karbodi-imid reaksjonen (Science 144:1344 (1964)), den blandede anhy-dridreaksjonen (Erlanger et al., Methode in Immunology and Immunochemistry, utg. Williams og Chase, Academic Press (New York 1967) s. 149), og syreazid- og aktivester-reaksjonene (Kopple, Peptides and Amino Acids, W.A. Benjamin, Inc. (New York 1966)). Som en generell oversikt vises til Clin. Chem. 22:726 (1976)). I en foretrukken utførelsesform, der faktor X er merke, festes analytten til dette zymogen-første substrat ved kovalent konjugering til den karbohydratsidekjeden som er festet til asparagin 36 i hovedkjeden i okse faktor X, via periodat oksydasjon og etterfølgende reduktiv aminering med en aminogruppe på analytten.

Når en kofaktor eller en syntetisk inhibitor anvendes som merke, kan analytten eller dens bindingsanalog bindes ved hjelp av en fri aminogruppe for å danne påvisningsreagenset. Det skal forstås at andre vel kjente metoder ,er tilgjengelige for kobling av analytten og merket for å danne påvisningsreagenset ifølge foreliggende oppfinnelse. Bifunksjo-nelle reagenser kan eksempelvis anvendes for å koble aminer til aminer, f.eks. hvis bisisocyanater, bisimidoestere og glutaraldehyd (Immunochem. 6:53 (1969)). Funksjonelle grupper på analytten, eller en bindingsanalog derav, og på merket forskjellig fra amino- og karboksyl-grupper kan anvendes som festestilling avhengig av den syntesemetode som velges. Disse syntetiske fremgangsmåter er tilgjengelige fra litteraturen for fagmannen.

3. Forsøksteknikker.

I prinsippet kan foreliggende forsøksmetode utføres ifølge

en hvilken som helst av de konvensjonelle,

homogene eller heterogene fremgangsmåtene. Homogene fremgangsmåter foretrekkes generelt siden de er spesielt enkle å utføre. I de tilfeller der virkningen av påvisningsreagenset på enzymkaskadereaksjonen imidlertid i hovedsake ikke kan skilles mellomm bundne former og ubundne former,

vil en heterogen fremgangsmåter følges for å utføre forsøk.

a. Homogen fremgangsmåte.

I den homogene forsøksteknikken, dvs. en førsøksteknikk som ikke krever en fysisk separasjon av de bundne formene og de ubundne formene, forårsaker reaksjonen mellom bindingsbestanddelen i påvisningsreagenset og et tilsvarende bindingsmotstykke, en målbar forandring, enten i en positiv eller en negativ retning, i merkets deltagelse i eller modulasjon av den første enzymreaksjonen i en enzymkaskade. Fordelingen av påvisningsreagenset mellom de bundne formene og de ubundne formene differensieres vanligvis ved at merket ikke har evnen til eller har en endret evne til å påvirke enzymproduksjonen når det foreligger i de bundne formene. Flere manipulerings-teknikker er tilgjengelige for utførelse av et homogent for-søk, idet en vanlig teknikke er den konkurrerende bindingsteknikken. I den konkurrerende bindingsteknikken kombineres prøven med et bindingsmotstykke til analytten, et påvisningsreagens omfattende merket som er koblet til analytten eller en spesifik bindingsanalog derav, og de andre bestanddelene som er nødvendige for å produsere det andre enzymet, og deretter måle produksjonen av det andre eller tredje eller på-følgende enzymet i reaksjonsblandingen. Når det brukes en sekvensprøvefremgangsmåte, kombineres alternativt prøven og analyttbindingsmotstykket, og deretter tilsettes påvisningsreagenset .

Homogene fremgangsmåter kan anvendes for bestemmelse av en hvilken som helst ønskelig analytt, omfattende antigene proteiner og polypeptider og haptener. Antistoffer kan bestemmes som antigene proteiner ved bruk av enten et anti-antistoff antistoff som bindingsmotstykke, dette antistoff-forsø-ket vil bare være klassespesifikt siden det ikke er istand til å skille antistoffer ifølge deres antigen-spesifisiteter), eller et antigen eller hapten som bindingsmotstykke. I det sistnevnte tilfelle, når antistoffer, eller andre bindingsproteiner, reseptorer eller bindingsmaterialer generelt, bestemmes ifølge deres motstykke-spesifisiteter, kan det anvendes en direkte teknikk. Det flytende mediet kombineres med et påvisningsreagens omfattende merket koblet til et bindingsmotstykke til analytten, og de andre bestanddelene som er nødvendige for å produsere det andre, tredje eller påfølgende enzym, og deretter måles igjen det sluttenzym som er produsert i reaksjonsblandingen. I dette tilfellet kan "analytten" være antistoffer som har spesifisitet for et spesielt antigen eller hapten (som i sin naturlige form eller en bindingsanalog form tjener som bindingsmotstykke i påvisningsreagenset), eller kan være bindingskapasiteten til prøven til å binde en spesiell substans på grunn av nær været i prøven av et spesielt bindingsprotein, en reseptor, en bærersubstans e.l., f.eks. trijodthyronin- eller thyroxin-bindingskapasitet (T3~opptak eller T4~opptak).

Når det anvendes en homogen forsøksteknikk, kan generelt bestanddelene i forsøksreaksjonen, dvs. det væskemedium som mistenkes for å inneholde analytten, påvisningsreagenset, andre bestanddeler som er nødvendige for å produsere det andre, tredje eller påfølgende enzym, og om nødvendig, et bindingsmotstykke til analytten, kombineres i hvilke som helst mengder, på hvilken som helst måte og i hvilken som helst rekkefølge, forutsatt at enzymproduksjonen målbart forandres når væskemediet inneholder analytten i en mengde eller konsentrasjon som er signifikant for formålene ved forsøket. Fortrinnsvis er alle bestanddelene i den spesifike bindingsreaksjonen løselige i væskemediet. I tillegg vil reaksjonsblandingen dannes slik at den inneholder en konvensjonell inidkatorblanding som produserer en påvisbar respons, f.eks. lysabsorbsjon, farge, fluorescens, kjemilu-minescens osv. som en funksjon av produksjon av det andre enzymet.

b. Heterogene fremgangsmåter.

Foreliggende forsøksmetode kan også anvendes på de konvensjonelle forsøksteknikker av den heterogene typen, hvor de bundne og ubundne formene av påvisningsreagenset separeres og merkebestanddelen bestemmes i den ene eller den andre. Reagenssystemet for utførelse av et slikt heterogent forsøk, kan ha mange forskjellige former. Generelt omfatter et slikt system tre hovedbestanddeler, som er (1) den analytt som skal påvises, (2) et bindingsmotstykke til analytten og (3) påvisningsreagenset, sammen med de andre bestanddelene som er nødvendige for å produsere det andre, tredje eller påfølg-ende enzym. Deltagerne i bindingsreaksjonen kombineres sam-tidig eller i en serie tilsetninger, og med passende inkuber-ings-periode eller -perioder, påvisningsreagenset bindes til dets tilsvarende bindingsmotstykke, slik at graden av binding, dvs. forholdet mellom mengden påvisningsreagens som er bundet til et bindingsmotstykke (den bundne formen)

og den mengde som er ubundet, er en funksjon av mengden av tilstedeværende analytt. De bundne og ubundne formene separeres fysisk og mengden av merke som er tilstede i en av dem, bestemmes ved å måle produksjonen av det andre, tredje eller påfølgende enzym deri, og sammenligning av dette med en negativ kontroll eller standard resultater, f.eks. en standard kurve.

Forskjellige midler for utførelse av separasjonstrinnet og for dannelse av bindingsreaksjonssystemet, er tilgjengelige på fagområdet. Separering kan omfatte slike konvensjonelle teknikker som de som omfatter det som vanligvis er kjent som et fast-fase-antistoff eller -antigen, et andre antistoff, eller et fast-fase andre antistoff, såvel som bruken av immunkompleksutfellingsmidler, absorbsjonsmidler osv. Bindingsreaksjonssystemer som kan anvendes, omfatter den såkalte konkurrerende bindingsteknikken, sekvensmetningstek-nikken, "sandwich"-teknikken osv. Ytterligere detaljer angående de forskjellige kjente heterogensystemene er lett tilgjengelig i litteraturen, f.eks. i US-PS 4 .230.797 .

Det er meningen at behandlingsskjemaer omfattende andre til-setningsrekkefølger og andre bindingsreaksjonsfremgangsmåter kan anvendes for utførelse av homogene og heterogene, spesifike bindingsforsøk, uten å avvike fra foreliggende oppfinn-elses ide.

4. Analytt.

Foreliggende forsøk kan anvendes for påvisning av en hvilken som helst analytt, for hvilken det er tilgjengelig et spesifikt bindingsmotstykke. Analytten er vanligvis et peptid, polypeptid, protein, karbohydrat, glykoprotein, steroid eller et annet organisk molekyl som det foreligger et spesifikt bindingsmotstykke til i biologiske systemer eller kan synte-tiseres. Analytten velges i funksjonell betydning vanligvis fra gruppen omfattende antigener og antistoffer til disse, haptener og antistoffer til disse, hormoner, vitaminer, metabolitter og farmakologiske midler, og deres bindingsmotstyk-ker, og hybridiserbare nukleinsyrer, f.eks. DNA og RNA. Vanligvis er analytten et immunologisk aktivt polypeptid eller protein, vanligvis med en molekylvekt på mellom ca. 1000 og ca. 10 000 000, som f.eks. et antistoff eller et antigent polypeptid eller protein, eller et hapten med en molekylvekt på minst ca. 100, og vanligvis mindre enn ca. 1500 .

Forsøket er imidlertid spesielt anvendbare når størrelsen

av analytten er 10 000 dalton eller mindre, mere foretrukket mindre enn 5000, og mest foretrukket mindre enn 1500. Naturligvis må den valgte enzymreaksjon være slik at den ikke innvirker på analytten selv. Dersom analytten er et protein og det anvendes et ikke-spesifikt proteolyttisk enzym, kan enzymet påvirke analytten og forårsake avvikelser i forsøks-resultatene .

Representative polypeptidanalytter er angiotensin I og II, C-peptid, oksytocin. vasopressin, neurofysin, gastrin, sekre-tin, bradykinin og glykagon.

Representative proteinanalytter omfatter klassene protaminer, mucoproteiner, glykoproteiner, globuliner, albuminer, sclero-proteiner, fosfoproteiner, histoner, lipoproteiner, kromo-proteiner og nukleoproteiner. Eksempler på spesifike proteiner er prealbumin, a^-lipoprotein, humant serum-albumin, a^-syre glykoprotein, a^-antitrypsin, a^-glykoprotein, trans-kortin, tyroksinbindende globulin, haptoglobin, hemoglobin, myoblogin, ceruloplasmin, a2~lipoprotein, a-makroglobulin,

6 -lipoprotein, erytropoietin, transferrin, hemopeksin, fibrinogen og immunoglobulinene som f.eks. IgG, IgM, IgA, IgD og IgE, og deres fragmenter, f.eks. F C og F dD, , komple- mentfaktorer, prolaktin, blodkoagulerende faktorer som f.eks. filbrinogen, trombin osv., insulin, melanotropin, somatotro-pin, tyrotropin, follikkel-stimulerende hormon, leutiniserende hormon, gonadotropin, tyroid-stimulerende hormon, placentalt laktogen, "intrinsic faktor", transcobalmin, serumenzymer som f.eks. alkalisk fosfatase, melkedehydrogenase, amylase, lipase, fosfataser, cholinesterase, glutamin-eddiksyre-transaminase, glutamin-pyrodruesyre-transaminase, og uropep-sin, endorfiner, enkefaliner, protamin, vev-antigener, bak-terielle antigener og virusantigener, som f.eks. hepatitt-assosierte antigener (f.eks. HBgAg, HBcA og HBeAg).

Representative haptenanalytter omfatter de generelle klasser av medisiner, metabolitter, hormoner, vitaminer og lignende organiske forbindelser. Hapteniske hormoner omfatter tyroxin og trijodtyronin. Vitaminer omfatter vitaminene A, B, f .eks. B C, D, E og K, folinsyre og tiamin. Medisiner omfatter antibiotika som f.eks. aminoglukosider, f.eks. gentamycin, tobramycin, amikacin, sisomicin,

kanamycin og netilmicin, penicillin, tetracyklin, terramy-cin, kloromycetin og aktinomycetin; nukleocier og nucleotider som f.eks. adenosi difosfat (ADP) adenosin trifosfat (ATP), flavin-mononucleotid (FMN), nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD) og dets fosfatderivater (NADP), tymidin, guanosin og adenosin; prostaglandiner, steroider som f.eks. østrogenene, f.eks. estroil og estradiol, steroider, og andre som f.eks. fenobarbital, fenytoin, primidon, etosuximid, karbamazepin, valproat, teofyllin, kaffein, propranolol, procainamid, kini-din, amitryptilin, cortisol, desipramin, disopyramid, doxepin doxurubicin, nortryptilin, metotrexat, imipramin, lidokain, prokainamid, N-acetylprokainamid, amfetaminer, katekolaminer og antihistaminer.

5. Reaksjonsblanding.

Det væskemedium som skal undersøkes kan være en naturlig forekommende eller kunstig dannet væske som mistenkes for å inneholde analytten, og er vanligvis en biologisk væske eller en fortynning derav. Biologiske væsker som kan under-søkes, omfatter serum, plasma, urin, saliv og amniotiske og cerebrospinale væsker.

Bindingsreaksjonen vil i nesten alle tilfeller tillates

å foregå under milde betingelser. Reaksjonsblandingen vil generelt være et vandig medium med hvilke som helst ønskelige organiske koløsningsmidler tilstede i mindre mengder. Temp-eraturen ved reaksjonen vil holdes på et konstant nivå i normale omstendigheter i hele inkuberingsperioden og enzym-målingstrinnet. Temperaturene vil generelt være mellom 5

og 50°C, mere vanlig mellom 20 og 40°C. Fortrinnsvis vil reaksjonen foregå ved romtemperatur. pH i reaksjonsblandingen vil variere mellom 5 og 10, mere vanlig mellom 6 og 9. konsentrasjonen av forskjellige reagenser vil avhenge av mengden av ventet analytt i testmediet, idet en slik mengde vanligvis ligger mellom 10 -3 og 10 -12 molar (M). Som når det gjelder de tidligere beskrevne reaksjonsparameterne,

er valget primært basert på empirisk oppnådd optimering balansert mot preferanser og behov hos den tekniker som til slutt vil utføre forsøkene på rutinebasis. Ingen av paramet-rene er derfor av en kritisk natur for foreliggende oppfinnelse, og en fagmann på området vil kunne bestemme disse.

6. Reagenssystem.

Reagenssystemet i foreliggende oppfinnelse omfatter alle

de essensielle kjemiske elementer som kreves for å utføre en ønsket forsøksmetode som omfattes av foreliggende oppfinnelse. Reagenssystemet presenteres i en kommersielt pakket form, som en blanding der forenligheten til reagensene vil gjøre det mulig å oppbevare de nødvendige reagensene i en testanordningsutforming, eller som en prøveutrustning, dvs.

en pakket kombinasjon av en eller flere beholdere. Inkludert i reagenssystemet, er de reagenser som passer til det ønskede bindingsreaksjonssystemet, som alltid krever et påvisnings-

reagens og de andre bestanddelene som er nødvendige for å produsere det andre, tredje eller påfølgende enzymet som definert foran. Slike bindingsreaksjonsreagenser kan i tillegg til påvisningsreagenset omfatte et bindingsmotstykke til analytten, den enzymatiske indikatorblandingen osv. Reagenssystemet kan naturligvis også inneholde andre reagenser som er kjente på fagområdet, og som kan være ønskelige fra

et kommersielt eller bruker-standpunkt, som.f.eks. buffere, fortynningsmidler, standarder osv.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer spesielt en prøveut-rustning for bestemmelse av en analytt i et væskemedium, omfattende (a) et påvisningsreagens som inneholder merket og analytten eller en bindingsanalog derav, (b) et bindingsmotstykke, f.eks. et antistoff til analytten, (c) de andre bestanddelene i enzymreaksjonen som er nødvendige for å produsere det andre, tredje eller påfølgende enzym,

og (d) eventuelt en indikatorblanding som produserer en påvisbar respons som en funksjon av produksjonen av

det endelige enzymet i enzymkaskaden.

Foreliggende oppfinnelse skal nå illustreres med følgende eksempler, som ikke menes å være begrensende.

Eksempel 1.

Et spesifikt bindingsforsøk for bestemmelse av teofyllin

som analytt ble anordnet ved bruk av faktor X/faktor X-aktiverende enzym fra Russell's huggormgift som substrat/ første enzym-par. Faktor X er et zymogen som spaltes av

det aktkiverende enzymet som foreligger i Russell's huggormgift (det aktiverende enzymet refereres her til somRVV)

for å danne enzymet, faktor Xa. Fig. 1 er et flytskjema som viser det forsøk som anvender seg av enzymreaksjonen.

Substratet, faktor X, ble valgt som merke. Påvisningsreagenset ble dannet ved å fremstille et konjugat av teofyllin og faktor X ved hjelp av de tilgjengelige lysingruppene på zymogenet. I nærvær av antistoff til teofyllin, ble reaktiviteten til faktor X i påvisningsreagenset inhibert. Denne inhibering kunne omvendes ved tilsetning av fritt teofyllin til systemet. (Se fig. 3). Zymogen aktiverings immuno-forsøkssystemet svarte på forandringer i ubundet analytt-konsentrasjon for å gi en dose-respons-kurve for teofyllin. Aktivering ble målt ved tilsetning av et kromogent substrat, S-2222 (et produkt fra Kabi Bitrum AB og tilgjengelig i

USA fra Helena Laboratories, Baumont, TX). for enzymproduktet faktor Xa. Substratet undergår en fargeforandring når det påvirkes av faktor Xa.

Absorbsjon ble målt med et spektrofotometer (Hewlett Packard Model 8450) og avsatt mot (tid i minutter) 2 for å o gi en lineær avsetning. Detaljer i forsøksprotokoller og resultater følger.

A. Fremstilling av teofyllin: Faktor X-konjugater.

Materialer.

Merket, faktor X, ble sammenblandet med analytten, teofyllin, som følger: Til 1 mg (mg) okse-faktor X (levert fra Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), inneholdende 0,42 mikromol (^mol) lysin i

1 milliliter (ml) 0,2 molar (M) natriumkarbonat, pH 8,5,

ble det tilsatt 0,21 mg (0,84^imol) av et blandet anhydrid av teofyllin (fremstilt som beskrevet av Cook, CE. et al.,Chem.Pathol.&Pharmacol, 13: 3497:505 (1976)) i 0,4 ml p-dioksan. Blandingen ble omrørt i 4 timer ved 5°C, og faktor X-teofyllin-konjugatet ble renset ved dialyse mot en løsning inneholdende 0,14 M natriumklorid og 0,05 M natrium-citrat ved pH 5,8 eller ved filtrering gjennom en Sephadex R G-25 (levert fra Pharmacia, Inc.,Piscataway, NJ)-kolonne, bragt i likevekt i samme buffer. Aktiviteten i kolonnefrak-

sjonene ble bestemt som beskrevet nedenfor. Teofyllin sub-stitusjonsgraden ble beregnet fra optiske densitetsdata mot ved 280 nanometer (nm) og Bradford-proteinforsøket (Bradford, M., Anal. Biochem. 72, 248 (1976)).

B. Karakterisering av teofyllin-faktor X-konjugater.

To faktor X-derivater ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det første konjugatet, renset ved dialyse, inneholdt 15,5 mol teofyllin pr. mol faktor X, tilsvarende derivatisering av 67% av de totale lysiner. Det andre konjugatet, renset ved gelkromatografi, inneholdt 9,5 mol lysin pr. mol protein (42% av lysinser derivatisert). Begge konjugataer viste en eneste utfelningslinje i radial immunodiffusjon når de ble testet mot antitoefyllin-antistoffer.

C. Rensing av anti-teofyllin-antistoff.

Det ble produsert et anti-teofyllin-antistoff ved bruk av standard polyklonale teknikker og renset som følger: 25 ml anti-etofyllin-antiserum (Li, T. M. et al., Clin. Chem. 27, 22-26 (1981)) ble bragt til 50% metning med ammoniumsulfat, og det utfelte proteinet ble oppsamlet ved sentrifuger-ing. Etter suspendering i 10 millimolar (mM) kaliumfosfat ved pH 7,0, ble løsningen igjen bragt til 50%-ig metning med ammoniumsulfat. Bunnfallet ble oppsamlet og gjensuspen-dert i 10 ml 10 mM kaliumfosfatbuffer. Etter dialyse mot 4x1 liter 10 mM kaliumfosfat-buffer, pH 7,5, ble dialysatet sentrifugert for å fjerne utfelt protein.

Protein A-agarose ble fremstilt ved å svelle 1 g av den tørkede gelen (levert fra Sigma Chemical Co.) i 100 mM natriumfosfat, pH 7,0 og vaske den svellede harpiksen i 200 ml av den samme buffer. Gelpreparatet ble pakket i en 1,2

x 3,5 cm kolonne og bragt i likevekt over natten med 100

mM mononatriumf osf at (NaHPC>4), pH 7,0. 1/3 (7 ml) av

det ammoniumsulfatutfelte, dialyserte materialet ble vasket med 100 mM fosfatbuffer, inntil den optiske densiteten for eluatet målt ved 280 nm ( OD^ qq) var på bakgrunnsnivå. Immunoglobulin .G-fraksjoner av antiteofyllin-antiseraene

ble eluert med 1 M eddiksyre. De fraksjoner som hadde en høy optisk densitet ved 280 nm (C^qq) ble samlet og dialysert mot en løsning inneholdende 0,14 M natriumklorid og 0,05

M citrat ved pH 5,8. Konsentrasjonen av det rensede antistoff var 5,62 mg protein/ml løsning. D. Renhet og aktivitet til anti-teofyllin-antistoff. Tilsetning av anti-teofyllin-antiserum til zymogen-aktiverings-systemet førte til positive reaksjoner, på grunn av nærværet av aktiverte blodkoaguleringsfaktorer i serumprøven. Protein A-rensede anti-teofyllin-antistoffer tilførte hver-ken positive eller negative påvirkninger til systemet. Det rensede antistoffet bibeholdt sin evne til å reagere med teofyllin, og viste en eneste utfellningslinje ved radial immunodiffusjon når det ble testet mot faktor X-teofyllin-konjugater.

Fremgangsmåter og resultater.

A. Enzymforsøk.

Alle forsøk ble utført i et totalvolum på 1 ml som inneholdt 15 mM tris(hydroksymetyl)-amino-metan-hydroklorid-buffer ved pH 8,2, 70 mM natriumklorid og 7,5 mM kalsiumglukonat. Det faktor X-aktiverende enzymet fra Russell's huggormgift (RVV, levert fra Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), katalyserte omdannelse av faktor X til faktor Xa. Denne reaksjon ble undersøkt i løsninger som inneholdt 0,6 mM av et kromogent substrat S-2222 for faktor Xa, faktor Xa-substrat, 0,2NIHenheter av faktor X eller faktor X-analyttkonjugat og 0,01 til 0,05 enheter RVV. Alle forsøk ble utført ved 25°C og kontrollert kontinuerlig ved 406 nm på et Hewlett Packard 8450 spektrofotometer. Absorbsjon ble avsatt mot

(tid i minutter) 2for å gi en lineær kurve. En NIH-enhet av en blodkoagulasjonsfaktor er den mengde som er ekvivalent med mengden av 1 ml av normalt DEF humant plasma. En enhet RVV er den mengde aktiverende enzym som vil produsere en koaguleringstid på mellom 14 og 22 sekunder i en en-trinns bestemmelse av faktor X, som beskrevet av Bachamnn, F., et al., Thromb. et Diath. Haemorrh. 2, 24 (1958).

B.. Kinetikk ved zymogen aktivering.

Immunoforsøks-reaksjonsskjemaet er vist i fig. 1. Når zymogenet, faktor X, ble inkubert med det kromogene substratet, S-2222, for faktor Xa, ble det dannet svært lite farge.

Når imidlertid RVV ble tilsatt for å katalysere omdannelsen av faktor X til faktor Xa, var fargeutviklingen rask og ikke-lineær med hensyn på tiden. En serie ligninger ble dannet som forutsa at (1) fargedannelsen i systemet skal være lineær med kvadratet av tiden og (2) hellningen av den linje som dannes ved en avsetning av absorbsjon mot (tid) 2 skal være et mål på hastigheten for den RVV-katalyserte reaksjonen. Hastigheten ved denne reaksjonen er i sin tur avhengig av konsentrasjonen av faktor X og/eller RVV i systemet. Disse forutsigelser ble verifisert eksperimentelt ved bruk av renset RVV og faktor X.

Når anti-teofyllin-antistoff ble tilsatt til zymogensyste-rnet, avtok aktiviteten (målt som hellningen av absorbsjon mot (tid) 2) nar antistoff-konsentrasjonen øket, som vist i fig. 2. Ved høye konsentrasjoner av antistoff, (200-400 |ig/ml), ble aktiviteten i systemet minsket til mindre enn 10% av kontrollverdier.

En antistoffkonsentrasjon (121 \ ig/ ml) ble valgt som inhiberte systemer med ca. 75% og en doseresponskurve ble oppnådd ved tilsetning av fritt teofyllin til systemet. Som vist i fig. 3, når fritt teofyllin i konsentrasjoner mellom 5 og 50 mikro- molar ble innført i forsøket, ble inhibering av antistoff opphevet, og aktiviteten i systemet (målt som hellningen av en avsetning av absorbsjon mot (tid) 2 ) ble gjenopprettet. Det var derfor mulig å generere en doseresponskurve for analytten, teofyllin, ved bruk av zymogen aktivator systemet.

Eksempel 2.

Et spesifikt bindingsforsøk for bestemmelsen av teofyllin som analytten (A), kan utføres ved bruk av chymotrypsinogen/ trypsin som substrat/første enzym-par. Den enzym-reaksjonen som anvendes er i hovedsak

hvor chymotrypsinogen er det første substratet, trypsin er det første enzymet og chymotrypsin er det andre enzymet eller enzymproduktet.

Chymotrypsin hydrolyserer substratet, N-benzolyl-L-tyrosin-etylester, for å produsere en påvisbar respons (en høyere absorbsjon ved 256 mn). Forsøket anvender en modulator for enzymreaksjonen, søyabønnetrypsin inhibitor, som merke, som inhiberer produksjonen av chymotrypsin og derved minsker den påvisbare responsen. Soyabønnetrypsin inhibitor brukes som merke for å danne påvisningsreagenset, A-I.

Dersom ingen analytt er tilstede, vil antistoffet til analytten, Ab, binde påvisningsreagenset, A-I, (heri referert til som inhibitoren), og minske den inhiberende virkningen av soyabønnetrypsin inhibitor, og derved øke den påvisbare responsen i systemet. Dersom analytt er tilstede, vil antistoffet til analytten, Ab, binde analytten, og la påvisningsreagenset, A-I, utøve sin fulle inhiberende virkning på

enzymresponsen i systemet.

Materialer.

A. Fremstilling av en soyabønne trypsin inhibitor: 8-(3-karboksypropyl)-teofyllin-konjugat.

Påvisningsreagenset fremstilles ved å binde soyabønne trypsin inhibitor til en analog av teofyllin, 8-(3-karboksypropyl)-teofyllin. Laktamet av 8-(3-karboksypropyl)-teofyllin fremstilles ved metoden til Cook et al., Res. Comm. Chem. Pathol. Pharmacol. 13, 497 (1976). 10 mg (0,45 mmol) av soyabønne trypsin-inhibitor (tilgjengelig fra Sigma Chemival Co.,

St. Louis MO) i 3 ml 2,0 M natriumbikarbonat kombineres med 10,7 mg (0,45 mmol) av laktamet i 100 |il dimetylformamid. Denne reaksjonsblanding får stå ved romtemperatur i 1 time

og så ved 4°C i 5 timer. Etter henstand kromatograferes reaksjonsblandingen på o en2,5 x 28 cm kolonne av Sephadex<R>G-25 (medium) (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J.)

og bringes i likevekt med 80 mM tris(hydroksymetyl)-amino-metan-(tris-hydroklorid)-buffer, pH 7,8. Kromatogrammet utvikles med denne buffer og 1 ml fraksjoner oppsamles.

De fraksjoner som inneholder den første proteintoppen, på-vist ved absorbsjon ved 280 nm, samles og lagres ved 4°C.

B. Fremstilling av antistoff til teofyllin.

Antistoff til teofyllin fremstilles som beskrevet av Li et al., Clin. Chem. 27 (1981). Immunoglobulin G, IgG-fraksjonen isoleres ved affinitetskromatografi på protein A "Sepharose"

(Pharmacia Fine Chemicals). En 1 ml prøve av antiserumet påføres på 1x6 cm kolonnen av affinitetsharpiksen og kolonnen vaskes med 50 mM N,N-bis(2-hydroksyetyl)glycin (Biscin)-buffer, pH 8,3, inneholdende 0,2 M NaCl inntil absorbsjonen av utløpet ved 280 nm er mindre enn 0,05. Det bundne IgG elueres så med 0,1 M glycin-buffer, pH 3,0, og 1 ml fraksjoner oppsamles i rør inneholdende 0,1 ml IM Bicin-buffer, pH 8,3.

Fraksjoner med absorbsjoner som er større enn 0,2 ved 280

nm, samles og dialyseres mot 80 mM tris-hydroklorid-buffer,

pH 8,0, inneholdende 0,1 M kalsiumklorid.

C. Fremstilling av andre reagenser.

Chymotrypsinogen A (fra oksepancreas, Sigma Chemical Co.) oppløses i en konsentrasjon fra 2 til 50[ig/ml i 80 mM tris-hydroklorid-buf fer, pH 7,8, inneholdende 0,1 M kalsiumklorid og lagres ved 4°C.

Fremgangsmåter og resultater.

A. Undersøkelse av chymotrypsin-aktivitet.

Chymotrypsin hydrolyserer estergruppene i N-benzolyl-L-tyro-sin-etylester, og produktet har en høyere absorbsjon ved 256 nm enn esteren. Esteren hydrolyseres ikke av trypsin,

og således er hastigheten for økning av absorbsjon ved 256 nm et spesifikt mål på chymotrypsin-aktivitet. Undersøkelsen utføres ved 25°C i 80 mM tris-hydroklorid-buffer, ph 7,8, inneholdende 0,1 M kalsiumklorid.

B. Titrering av trypsin.

Chymotrypsinogen A har ingen enzymaktivitet men trypsin hydrolyserer en peptidbinding for å danne reaktivt -chymotrypsin som vist nedenfor:

Det nyedannede it-chymotrypsin kan virke på chymotrypsinogen A for å danne neo-chymotrypsinogen som omdannes til det aktive a-chymotrypsin av enten trypsin eller a-chymotrypsin.

Immunoforsøksreaksjonssystemet optimeres først ved å kombinere forskjellige konsentrasjoner av trypsinet med en fast mengde chymotrypsin, og så måles chymotrypsin-aktivitet. Denne optimering utføres med molforhold mellom chymotrypsinogen A

og trypsin som varierer fra 50 til 50.000.

Trypsin og chymotrypsinogen kombineres og inkuberes ved 2 5°C

i 5 minutter. Ettersubstratet tilsettes og reaksjonshastigheten nedtegnes. Det chymotrypsinogen A/trypsin mol-

forhold som gir en betydelig reaksjonshastighet, målbar i løpet av en 1-3 minutters periode, anvendes for ytterligere eksperimentering. C. Titrering av soyabønne trypsin inhibitor-teofyllin-konjugat.

Et område av konsentrasjoner av soyabønne trypsin-inhibitor-teofyllin-konjugat kombineres, i 80 mM tris-hydroklorid-buf fer, 0,IM kalsiumklorid, ved den optimale konsentrasjonen av trypsin som er bestemt som i del B ovenfor. Det molforhold mellom trypsin og inhibitor som anvendes, er 0,2-5,0. Fem minutter etter kombinasjon av trypsinet og inhibitoren tilsettes chymotrypsinogen A. Etter 5 minutters ytterligere inkubering, tilsettes substratet og reaksjonshastigheten nedtegnes. En konsentrasjon av inhibitor-teofyllinkonjugat som produserer 80% inhibering av aktiveringen av chymotrypsinogen A, anvendes for ytterligere forsøk.

D. Titrering av antistoff til teofyllin.

Forskjellige konsentrasjoner av antistoff til teofyllin kombineres med den optimale mengde av inhibitor-teofyllin konjugat i 80 mM tris-hydrokloridbuffer, 0,1 M kalsiumklorid. Trypsin og chymotrypsin A tilsettes så som angitt ovenfor (del C). Chymotrypsin-aktivitet måles. Aktiviteten øker når økende mengder antistoff inaktiverer større porsjoner av inhibitor-teofyllin-konjugatet. Den antistoffkonsentrasjon som gjenvinner 80% av chymotrypsin-aktiviteten, målt i fravær av inhibitor, anvendes for ytterligere målin-ger .

E. Konkurrerende bindingsforsøk for teofyllin.

Forskjellige konsentrasjoner av teofyllin kombineres med

den optimale mengde av antistoff som bestemt i del D. Disse reaksjoner foretas i 80 mM tris-hydroklorid-buffer, 0,1 M kalsiumklorid. Inhibitor-teofyllin-konjugat, trypsin og chymotrypsinogen A tilsettes så som beskrevet i del A. Ende-lig tilsettes substrat og reaksjonshastigheten nedtegnes. Når teofylllinmengden økes, vil chymotrypsin-aktiviteten avta.

Eksempel 3.

Et spesifikt bindingsforsøk for bestemmelse av biotin ble utført ved bruk av faktor X/faktor X-aktiverende enzym fra Russell's huggormgift som det første substrat/enzympar og protrombin som det andre substratet. Faktor X er et zymogen som spaltes av en protease som foreligger i Russell's huggormgift (referert til heri som faktor X-aktiverende enzym fra Russell's huggormgift, og forkortet RVV) for å danne enzymet, faktor XA. Faktor XA spalter deretter protrombin, et andre zymogen som foreligger i reaksjonsblandingen, for å danne det aktive enzymet, trombin. Det endelige enzymproduktet, trombin, anvendes i et påvisningssystem hvor det virker på et kromogent substrat for å produsere en påvisbar respons.

Det første substratet, faktor X, ble valgt som merke. Analytten, biotin, ble konjugert med den karbohydratsidekjeden som er festet til asparagin-36 i hovedkjeden i okse-faktor X, for å danne påvisningsreagenset. I nærvær av avidin,

et protein som binder biotin, ble reaktiviteten til faktor X i påvisningsreagenset inhibert. Denne inhibering kunne på konkurrerende måte omvendes ved tilsetning av fritt biotin til systemet (se fig. 6). Det dobbelte zymogen-aktiverings-immunoforsøkssystemets respons på forandringer i konsentrasjoner av ubundet biotin, kan representeres ved dosere-sponskurven for biotin. Aktiviteten i systemet ble målt ved tilsetning av et kromogent substrat for trombin. Substratet, S-2238 (et produkt fra Kabi Vitrum, AB og solgt 1 USA av Helena Laboratories, Inc., Beaumont, TX), forandrer farge når det påvirkes av trombin. Absorbsjonsforandringer med tiden ble målt på et Hewlett-Packard model 8450 spektrofotometer og absorbsjon ble avsatt mot "tid i minutter)<3>

for å produsere en lineær kurve. Detaljer i forsøksprotokoller og resultater følger.

Fremstilling av faktor X- biotin- konjugat.

A. Selektiv oksydasjon av sialinsyrerester av faktor X.

2 mg okse-faktor X (oppnådd fra Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.) ble dialysert over natten med en buffer inneholdende 0,1 molar (M) natriumacetat, pH 5,6 og 0,15M natriumklorid. Den resulterende dialyserte løsningen ble justert til å inneholde 5 millimol (mM) natriummetaperjodat og fikk reagere i 10 minutter ved 4°C, 72 mikroliter (|il) etylen- glykol ble deretter tilsatt. Reaksjonsblandingen ble dialysert over natten mot 2 liter 10 mM natriumfosfat, pH 7,0,

0,15 M natriumklorid før ytterligere reaksjon.

B. Konjugering av oksydert faktor X til piperazin-biotin.

Til det dialyserte, oksyderte materialet som representerer 0,254 mikromol ((imol) oksyderte sialinsyrerester, ble det tilsatt 0,56 |_imol (bestemt som aminogrupper) , av piperasin-biotin. (Fremstilling følger).

Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 25°C i 2 timer for å danne en Schiff's base. Så ble 1 mg natriumcyanoborhydrid i 100 |il PBS (en løsning av 0,01 M natriumf osf at, pH 7,0,

og 0,15 M natriumklorid) tilsatt, og Schiffs ble tillatt å redusere over natten ved 4°C.

C. Fremstilling av biotin-piperazin.

En løsning inneholdende 1,22 g biotin (5 millimol), 863 mg N-hydroksysuccinimid (7,5 millimol), og 15 ml dimetylformamid (DMF) inndampet ved 3 0°C, ved et trykk på 0,1 millimeter (mm) kvikksølv. Denne fremgangsmåte ble gjentatt. Resten av de to fordampningene ble suspendert i 10 milliliter (ml) DMF, avkjølt til 0°C og behandlet med en løsning inneholdende 1,135 g N,N<1->dicykloheksylkarbodiimid (5,5 millimol), i 7,5 ml DMF. Den resulterende suspensjon ble så omrørt i 0,5

time ved 0°C, og tilllatt å varme seg opp til omgivelsestemperatur i løpoet av 3 timer. Løsningen som inneholdt aktivert ester ble filtrert og tilsatt til en løsning omrørt ved 0°C, inneholdende 1,502 g 1-(3-aminopropyl)-4-(3-t-butoksykarbonyl-aminopropyl)-piperazin og 700 |al trietylamin (511 mg eler 5,05 millimol) i 5 ml DMF. Den resulterende reaksjonsblanding fikk lov å varme seg opp til omgivelsestemperatur med omrøring over natten. Reaksjonsblandingen ble konsentrert på en rotasjonsfordamper ved 30°C, 0,1 mm kvikksølv, for å gi 5,1 g av en rødaktig olje. Oljen ble oppløst i metanol,

absorbert på 5 g silicagel, SiC^-GO (EM Reagents, Darmstadt, Germany), og inndampet ved 40°C, 12 mm kvikksølv. Det resulterende pulver ble plassert på toppen av en kromatografikolonne pakket med 300 g SiC>2-60 som var pakket og bragt i likevekt med en løsningsmiddelblanding inneholdende 90:10:1 volumdeler (v/v/v) kloroform (CHCl^), metanol og 28%-ig ammo-niumhydroksyd. Kolonnen ble så eluert med 3 liter av den ovenstående løsningsmiddelblandingen, fulgt av eluering med 2 liter av en løsning inneholdende 80:10:1 volumdeler (v/v/v) blanding av de samme løsningsmidler. Kolonnen ble eluert med en strømningshastighet på 2 l/minutt. Fraksjoner på 12 ml ble oppsamlet. Fraksjonene 330-440 inneholdt produktet, som så ble samlet og konsentrert for å gi 1,14 g av et lysegult glass (forbindelse I).

Forbindelse 1:

CMR (22.5 MHz, D20)s:174,2, 162,8, 155,7 ppm IR(KCl): 1695, 1640 cm"<1>

MS(FAB, Xg): M/e 527 (M + 1, 42,4%)

En løsning inneholdende 881 mg av forbindelse I (1,67 millimol), i 20 ml trifluoreddiksyre ble omrørt i 90 minutter ved 0°C. Løsningsmidlet ble inndampet ved 0°C, 0,1 mm kvikk-sølv, for å gi 1,15 g av en oljeaktig rest. Denne rest ble oppløst i 10 ml vann og justert til pH 8 med 28%-ig ammonium-hydroksyd. Prøven ble så kromatografert på en 3,7 x 37 cm-kolonne av Waters R C^g motsatt faseharpiks (40 |am masker, oppnådd fra Waters Associates, Inc., Milford, MA), eluert med vann med en strømningshastighet på 6 ml/min. Fraksjoner på 12 ml ble uttatt. Fraksjoner som inneholdt produktet,

ble kombinert i to samlinger på basis av renhet og konsentrert for å gi henholdsvis 44 mg og 610 mg. De glassaktige faststoffene ble så renset ved separate passeringer på en 2,5 x 60 cm-kolonne av Sephadex R LH-20 (oppnå°dd fra Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige), eluert med vann med en strømningshastighet på 1 ml/min. Fraksjoner som inneholdt rene produktet, ble samlet og konsentrert for å gi en total på 154 mg av sluttproduktet som et glass. Pro-

duktet som her refereres til som biotin-piperazin, ble opp-løst i E^O og ble analysert på frie aminogrupper ved hjelp av metoden til Habeeb, A.F.S.A. Anal. Biochem. 14, 28 (1966)

og på biotin ved hjelp av metoden til Green, M. Meth. Enzymol. 18A, 418 (1970).

Biotin-piperazin:

CMR (22,5 MHz, D20)6: 174,98, 160.08 ppm.

MS(FAB, Xe): m/e = 427 (M + 1, 62%).

D. Fremstilling av en avidin-affinitetskolonne.

Sepharose R CL-4B (oppnåodd fra Pharmacia, Inc. Piscataway,

NJ) (10 g) ble aktivert ved hjelp av metoden til Wilchek,

T., og Miron, T. Biochem. Int. 629, (1982), aktiveringstiden oversteg ikke 15 minutter. 30 mg avidin (oppnådd fra Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.) i 15 ml 0,2 molar natriumbikarbonat, pH 8,4, ble tilsatt til den aktiverte harpiksen. Materialet ble rotert i 40 timer ved 4°C. Avidin-"Sepharose" ble filtrert og vasket i rekkefølge med 0,1 M natriumbikarbonat, pH 8,4, og vann. 10 ml 1,0 molar etanolamin, pH 9,0,

ble tilsatt til den vaskede harpiksen. Harpiksen ble rotert ende mot ende i 1 time, vasket i rekkefølge med 0,1 M natriumbikarbonat og PBS, og pakket i en 1,5 x 15 cm kromatografi-kolonn.

Bindings-affiniteten og -kapasiteten til denne avidin-"Sepharose"-kolonnen ble deretter modifisert ved behandling av harpiksen med guanidinium-hydroklorid som følger: to kolonnevolumer av 6 M guanidiniumhydroklorid ble vasket gjennom avidinkolonnen. Kolonnen ble korket og tillatt å inkubere i ca. 18 timer ved 25°C. Kolonnen ble så vasket med 6M guanidinium-hydroklorid inntil den optiske densiteten ved 280 nanometer (OD2gQ) for eluatet var under 0,01 (enheter). Etter guanidiniumhydroklorid-behandling ble kolonnen vasket

i rekkefølge med to kolonnevolumer av PBS, 2,0 millimol biotin (oppnådd fra Sigma Chemical Co., St. Louis MO) i PBS, 0,1

molar glycin, pH 2,0 og PBS, og så lagret ved 4°C.

E. Rensing av faktor X-biotin-konjugat.

Etter reduktiv aminering ble prøven plassert på en 1,25 x

25 cm kromatografikolonne pakket med Sephadex R G-25 (oppnådd fra Pharmacia Ing., Piscataway, N.M.) bragt i likevekt med Tris-NaCl (15 mM tris-(hydroksymetyl)-aminometan (Tris-HC1), pH 8,2., inneholdende 70 mM natriumklorid) og eluert med den samme buffer ved 4°C for å fjerne overskudd biotin-piperazin. Fraksjoner ble analysert på proteininnhold ved bestemmelse av 0D_on. Proteinholdige fraksjoner ble under-søkt på faktor X-aktivitet som beskrevet nedenfor. De aktive fraksjonene ble samlet for etterfølgende påføring på avidinkolonnen.

Fraksjoner som inneholdt faktor X-aktivitet ble så påført

på en 1 x 7 cm kolonne av immobilisert avidin. Kolonnen ble eluert ved 25°C med Tris-NaCL inntil intet mer protein, slik det bestemmes ved optiske densitetsmålinger, målt ved 280 nm, ble vasket fra kolonnen. Faktor X-biotinkonjugat ble spesielt eluert fra affinitetsharpiksen med 2 mM biotin i Tris-NaCl. Fraksjoner ble undersøkt på faktor X-aktivitet og de fraksjoner som hadde høy og middels aktivitet ble samlet separat. Totalutbyttet av faktor X-aktivitet var 47,7%.

Det samlede materialet ble oppfylt til 1 mg/ml med okseserum-albumin (oppnådd fra Miles Scientific, Naperville, IL) og dialysert over natten mot Tris-NaCl for å fjerne fritt biotin.

F. Stabilitet av faktor X-biotinkonjugat.

Faktor X-biotinkonjugatet, fremstilt som beskrevet ovenfor, ble testet i løpet av 5 dager på dets evne til å bibeholde faktor X-aktivitet. De samlede fraksjonene med middels faktor X-aktivitet, tapte omtrent 30% av sin aktivitet etter den første lagringsdagen, og ble deretter stabilisert. De samlede fraksjonene med høy faktor X-aktivitet, tapte mindre enn 20% av deres aktivitet i løpet av stabilitetsundersøkels-ene og oppviste en stabilitet som var ekvivalent med den til ubehandlet faktor X.

G. Bestemmelse av ekvivalent aktivitet i faktor X-biotin

og ubehandlet faktor X.

Den spesifike aktiviteten til faktor X-biotinkonjugat ble beregnet plassert på dets evne til å aktiveres av RW. Faktor X-biotinkonjugat med en aktivitet som er ekvivalent med den til 0,25 NIH enheter pr. ml ubehandlet faktor X,

ble brukt for etterfølgende forsøk. (En NIH-enhet av en blodkoaguleringsfaktor, er definert som den mengde blodkoaguleringsfaktor som er ekvivalent med den som finnes i en ml normalt humant plasma). En enhet RVV er den mengde enzym som vil gi en koaguleringstid på mellom 14 og 22 sekunder ved en en-trinns bestemmelse av faktor X, som beskrevet av Bachmann, F., et al., Thromb. et Diath. Haemorrh., 2, 24

(1958).

H. Aktivitet av faktor X-biotinkonjugatet i det multiple

zymogen aktiverings-systemet.

Begge samlede fraksjoner ble testet på deres evne til å reagere i den fullstendige kaskaden. En gjenavsetning av absorbsjon mot tiden i tredje (i minutter) var lineær, hvilket indikerte at det faktor X-konjugerte derivatet hadde bibeholdt sin evne til å reagere riktig med trombin. Hellningen av denne lineære kurven anvendes som et mål på faktor X-aktiviteten i kaskadesystemet (Blake, D.A., Blake, R.C., II,

og Smith P.J. Fed. Proe. 42, 1863 (1983)).

Tilsetning av det biotin-bindende proteinet, avidin, til systemet, resulterte i en minskning av fargedannelsen, med et bibehold av riktig kinetisk respons. Titrering av faktor X-biotin-kaskaden med avidin vises i fig. 5. Inhibering

av systemet var lineær når 2 til 10 mikrogram/milliliter

(ug/ml) avidin ble tilsatt, i meget høye konsentrasjoner av avidin (200-500^g/ml) nådde inhiberingen et maksimum på ca. 85%.

En avidinkonsentrasjon (8 ug/ml) ble valgt som produserte

ca. 50% inhibering av kaskadeaktiviteten, og fritt biotin ble tilsatt i et forsøk på å gjøre følsomheten av systemet avhengig av analyttkonsentrasjonen, som vist i fig. 6. Disse resultater indikerer .at det oppnås en lineær dose-respons-kurve ved tilsetning av 20-100 nanomolar biotin.

I. Enzymforsøk.

RVV og protrombin ble oppnådd fra Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. Alle forsøk ble utført i et 1 ml totalvolum som inneholdt 15 mM Tris-H 1, pH 8,2, 70 mM natriumklorid og 10 mM kalsiumklorid. RVV katalyserte omdannelse av faktor X til faktor Xa, og ble undersøkt i løsninger som også inneholdt 0,6 mM S-2222 (faktor Xa-substrat, et produkt fra Kabi Vitrum, AB, og oppnådd fra Helena Laboratories, Beaumont, Tx), 0,05 til 0,10 enheter RVV og varierende konsentrasjoner av faktor X eller faktor X-analyttkonjugat. Multippel zymo-genaktivering ble undersøkt i løsninger som inneholdt buffer-salter som beskrevet ovenfor, 20 £g/ml fosfolipid, 0,075

mM S-2238 (et trombinsubstrat), 0,2 NIH enheter protrombin, 0,05 enheter RVV og faktor X-analyttkonjugat med aktivitet som er ekvivalent med aktiviteten til 0,25 NIH enheter av ubehandlet faktor X. Analyttbindende protein ble tillatt å inkubere i 5 minutter ved 25°C med faktor X-analytt med og uten fri analytt før start av reaksjonen. Fosfolipid-løsninger ble nyfremstilt hver uke ved lydbehandling av en 2 mg/ml oppløsning av L-alfa-fosfotidylcholin (oppnådd fra Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.) i Branson sonikator (50 milliamper, 2x2 minutter påvirkninger).

Alle forsøk ble utført ved 25°C og kontrollert kontinuerlig ved 406 nm på Hewlett Packard 8450 spektrofotometer. Avhengig av den kontrollerte reaksjonen, ble absorbsjon avsatt mot. (tid i minutter) 2 for aktiveringen av faktor X, eller i (tid i minutter)"^ multippel for zymogenaktiveringen, for å gi lineære kurver.

Det kan selvsagt foretas mange andre modifikasjoner og varia-sjoner av oppfinnelsen slik den er angitt foran, uten å avvike fra dens ånd og område.

Claims (10)

1. Spesifik bindingsforsøksmetode for bestemmelse av en analytt i en prøve, hvilken metode omfatter følgende trinn: (a) prøven kombineres med et reagenssystem omfattende et påvisningsreagens som blandes med et merke, hvilket resulterer i dannelsen av en bundet form av påvisningsreagenset og en ubundet form av reagenset, og (b) påvisningsreagenset bestemmes i den bundne formen eller i den ubundne formen ved hjelp av merket, som en funksjon av analytten i prøven, karakterisert ved at merket er en deltager i en enzymatisk reaksjon hvor et første enzym virker på et første substrat for å produsere et andre enzym, idet merket velges fra det første substratet eller en kofaktor eller modulator av det første enzymet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det andre enzymet virker på et andre substrat for å produsere et tredje enzym.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det første substratet enten er et zymogen eller det andre enzymet dannes ved tilsetningen av en kjemisk gruppe til det første substratet eller ved spaltningen av en kjemisk gruppe fra det første substratet, hvilken tilsetning eller spaltning katalyseres av det første enzymet.

4. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-3 av den homogene type, karakterisert ved at påvisningsreagenset måles uten separering av de bundne og ubundne former derav.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved følgende trinn: (a) en reaksjonsblanding dannes ved å kombinere det flytende mediet med et reagenssystem omfattende (i) en bindingspartner for analytten og (ii) påvisningsreagenset som omfatter analytten, eller en bindingsanalog av analytten, sammenblandet med et merke, hvorved det oppstår en bundet form av påvisningsreagenset i reaksjonsblandingen, hvor påvisningsreagenset er bundet til bindingspartneren, og en ubundet form av påvisningsreagenset, hvor påvis- ningsreagaenset ikke er så bundet, idet merket har en påvisbar egenskap som er målbart forskjellig når påvisningsreagenset er i den bundne formen sammenlignet med den ubundne formen og (b) den påvisbare egenskapet til merket måles i reaksjonsblandingen som en funksjon av analytten i væskemediet.

6. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-3 av den heterogene typen, karakterisert ved at de bundne og ubundne formene av påvisningsreagenset separeres og merket måles i en av dem.

7. Reagenssystem for anvendelse i den spesifike bind-ingsf orsøksbestemmelsen av en analytt i en prøve, hvilket system omfatter et påvisningsreagens som er sammenblandet med et merke, idet kombinasjonen av reagenssystemet og prøven resulterer i dannelsen av en bundet form av påvisningsreagenset og en ubundet form av påvisningsreagenset, idet bestemmelsen av påvisningsreagenset i den bundne formen eller i den ubundne formen ved hjelp av merket er en funksjon av analytten i prøven, karakterisert ved at merket er en deltager i en enzymreaksjon hvor et første enzym virker på et første substrat for å produsere et andre enzym, idet merket velges fra det første substratet eller en kofaktor eller en modulator av det første enzymet.

8. Reagenssystem ifølge krav 7, karakterisert ved at det andre enzymet virker på et andre substrat for å produsere et tredje enzym.

9. Reagenssystem ifølge kravene 7 eller 8, karakterisert ved at substratet enten er et zymogen eller det andre enzymet dannes ved tilsetningen av en kjemisk gruppe til det første substratet, eller ved spaltning av en kjemisk gruppe fra det første substratet, hvilken tilsetning eller spaltning katalyseres av det første enzymet.

10. Reagenssystem ifølge et av kravene 7 til 9 i form av en prøveutrustning for bruk i den homogene immunoforsøks-bestemmelsen av en analytt i et væskemedium, karakterisert ved at det omfatter: (a) en bindingspartner for analytten, og (b) et påvisningsreagens omfattende analytten, eller en bindingsanalog av analytten, sammenblandet med merket.