NO802589L - Mikrobiologisk prosess. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en mikrobiologisk prosess og spesielt en ny fremgangsmåte for fremstilling av plantevekstregulerende forbindelser av typen gibberelliner ved fermentering.

Gibberellinene tilhører en velkjent gruppe av tetracykliske forbindelser, som har stor betydning som planteveksthormon.'

I naturlig stand finnes enkelte av gibberellinene i høyere planter, men man kan også fremstille gibberelliner mikrobiologisk ved fermentering.

Litteraturen nevner således 50 naturlig forekommende gibberelliner, men man kan også endre gibberellinenes struktur kjemisk. Dette har medført at tallet på kjente gibberelliner i dag er langt høyere enn de 50 naturlig forekommende.

Et gibberellin er en forbindelse som består av det tetracykliske ringsystemet av ent-gibberellan:

Vanligvis biosyntesiseres gibberellinene ved fermentering av arten Gibberella.

Det er utviklet stammer av ascomyceten, Gibberella fujikuroi, som gir høyt utbytte. Fermentering av disse danner nå grunnlaget for den kommersielle produksjon av gibberelliner.

Det dannes under fermenteringen av Gibberella fujikuroi en blanding av gibberelliner som inneholder hovedsakelig GA^,

GA4og GA7.

Det er utviklet metoder for fraskilling av GA^. Derimot er det vanskelig å skille GA4og GA7 , noe som kanskje skyldes den strukturelle likheten mellom disse to gibberellinene. Dette medfører at det handelsmessige produktet normalt inneholder en blanding av de to ovennevnte gibberellinene i like mengder.

På grunn av gibberellinenes spesielle plantevekstregulerende egenskap har det vært utført et betydelig forskningsarbeid siden 1950 for frembringelse av alternative mikroorganismer egnet som referanseorganisme for identifikasjon av andre organismer med egenskaper for høyt utbytte og/ellér mer selektiv biosyntese.

Fra slutten av 50-tallet og fram til i dag har det således vært undersøkt en rekke mikroorganismer med de spesielle foretrukne egenskapene, men det har ikke vært rapportert om tilstedeværelse av gibberelliner blant metabolittene i noen annen mikroorganisme enn av slekten Gibberella forut for den foreliggende oppfinnelsen .

Vi har imidlertid vært i stand til å bekrefte tilstedeværelsen av betydelig mengder gibberelliner blant metabolittene i mikroorganismer som ikke tilhører slekten Gibberella.

Som en følge av dette vedrører derfor foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for produksjon av et plantevekstregulerende middel, spesielt gibberellin, hvilket omfatter fermentering av en Sphaceloma-art og isolering av en plantevekstregulerende forbindelse av fermenterings-produktet.

I vårt eksperimentelle arbeid har vi beskjeftiget oss med fermentering av det fungus som er ansvarlig for den sykelige kjempeveksten hos cassave i Colombia, hvilket trolig er identisk med en art som tidligere er kalt Sphaceloma manihoticola. Vår oppfinnelse foretrekker bruken av denne spesielle mikro-organismen .

I tidligere arbeider vedrørende sykelig kjempevekst hos cassave har man ikke vært i stand til å identifisere nærvær av gibberelliner i forbindelse med plantevekstregulering av infiserte planter.

Sphaceloma manihoticola finnes i naturlig tilstand i Colombia og dets morfologiske egenskaper nar vært rapportert. Vi har i vårt arbeid funnet at to isolater av Sphaceloma manihoticola har vært i stand til å gi spesielt høye utbytter av gibberelliner. Disse to stammene er nå deponert i Deutsche Sammlung von Mikro-organismen (DSM), Grisebachstrasse 8, 3400 GOTTINGEN, VEST-TYSKLAND med depotnununer: DSM Nr. 16 37 og DSM Nr. 16 38.

Til vår overraskelse har vi funnet at Sphaceloma, som er et fungus morfologisk forskjellig fra Giberella, ikke bare er i stand til å gi et stort utbytte av gibberelliner, men også er i stand til å produsere gibberellin som i det vesentlige bare består av GA4. Dette er av betraktelig handelsmessig betydning, idet det er mulig å isolere GA^fra kulturen ved en enkel ekstraksjon med et løsningsmiddel. Man slipper derfor de omstendelige og kostbare fremstillingsmetoder som nå benyttes når fermenteringen utføres med Giberella. Spesielt skal vi nevne at vår oppfinnelse tillater syntetiseringen av et GA^ , som er biosyntetisk fritt for GA^.

Vår fermentering utføres under moderate fermenterings-betingelser. Vanligvis vil fermenteringstemperaturen ligge i temperaturområdet 15 - 30°C og fortrinnsvis mellom 27 - 28°C

og i et pH-område mellom 4 til 8. pH 6 gir vanligvis gode resul-tater med våre stammer av Sphaceloma manihoticola på de substratene som vi har benyttet.

Vi har ikke sett at substratsammensetningen er av kritisk karakter under fermenteringen. Det synes som om de fleste natur-lige eller syntetiske substrater er i stand til å bevirke vekst av funguset så sant substratet er en tilstrekkelig kilde for metabolisering av karbon, nitrogen og de normale sporelementene. Til eksempel har vi vært i stand til å sikre tilstrekkelig vekst av funguset på et potet-dextrosemedium, men også syntetiske medier basert på glukose, ammoniumnitrat, kaliumdihydrogenfosfat og andre uorganiserte salter for å fremskaffe de nødvendige sporelementene, har vist seg å være egnete vekstmedier. Vi har sett at det ofte kan være en fordel å bruke disakkarider, spesielt maltose istedenfor monosakkarider som karbonkilde.

Vi har videre sett at det endelige utbyttet av gibberelliner, som fremstilles etter vår fermenteringsprosess, kan influeres betraktelig av nitrogeninnholdet i substratet. Nitrogeninnholdet er bestemmende for varigheten av veksten av mycelet under fermenteringen og kontrollerer også starten av den sekundære vekst-fasen hvorunder gibberellinene og de andre metabolittene produseres.

Fermenteringsforløpet er bestemt av de kriterier som normalt gjelder for fermenteringsprosesser. For å øke gibberellin-utbyttet bør man i det minste fortsette fermenteringen så lenge det biosyntetiseres gibberelliner av funguset.

Imidlertid vil gibberellinproduksjonen minske etter hvert under fermenteringen. Det har derfor ingen hensikt å forlenge fermenteringen utover biosyntetiserings-perioden.

Straks fermenteringen er fullstendig, må gibberellinene trekkes ut av mycelmassen ved ekstraksjon med løsningsmidler.

Man kan benytte en hvilken som helst av de vanlige organiske løsningsmidlene som benyttes ved fremstillingen av gibberelliner. Vi har dog funnet at estere av enkle monokarbonsyrer er de mest fordelaktige. Av egnete arter kan nevnes slike med fra 1 til 4 karbonatomer i alkylgruppen og med en monokarbonsyredel som inneholder fra 2 til 5 karbonatomer.Etylacetat kan nevnes som spesielt godt egnet til formålet.

Det kan også benyttes andre organiske løsningsmidler, som f.eks. dietyleter.

Løsningsmiddelekstraktet av gibberellinene kan deretter under-kastes rensemetoden som er vanlig for gibberellinkjemien. Vi har således sett at tynnskikts kromatografi vil gi en tilfreds-stillende rensningsgrad av ekstraktet.

Vi benytter gasskromatografi/massespektrometri til identifikasjon av GA4, som metabolitt produsert av Sphaceloma. Megden av denne ble bestemt ved hjelp av gasskromatografi. Målingene viste at det er mulig under de foretrukne fermenteringsbetingelsene å produsere GA4-titre opp til 7 mg/liter.

Det følgende eksempel beskriver oppfinnelsen:

Eksempel:

Fem forskjellige næringsmedier ble benyttet:

Medium 1 er et avkok av 300 g poteter pluss 20 g glukose og

fortynnet til 1 1.

Medium 2 ble fremstilt av medium 1 og vann i mengdeforholdet:

1 volumdel medium 1 og 9 volumdeler vann.

i

Medium 3 er fremstilt på kunstig måte av følgende komponenter:

80 g glukose

0,48g NH4N03

5,0 g KH2<p>o4

1,0 g Mg SO, .7H90

2,0 ml ^ernstamløsning ;

2,0 ml sporstoffstamløsning^

Komponentene ble fortynnet til 1 1 med vann. pH 4,5.

1) 100 mg FeS04. 7H20 og 134 mg Na2. EDTA

som løses i kokende vann og fortynnet til 100 ml. (Na2-EDTA er Na-saltet av etylendiamintetraeddiksyre.)

2) 160 mg ZnS04 .7h2015 mg CuS02. 7 h2<0>10 mg MnS02.7h20

10 mg Na2Mo04. 2 H20 som løses til

100 ml med vann.

Medium 4 er identisk med medium 3, bortsett fra at nitrogeninnholdet er øket ved tilsetning av 2,4 g NH4N03.

Medium 5 er identisk med medium 3, bortsett fra at glukosen

er erstattet med maltose.

Som mikroorganisme bie benyttet Sphaceloma manihoticola nr. 5 (DSM nr. 1637) og nr. 43 (DSM nr. 1638) i form av mycelkultur.

100 ml porsjoner av næringsmediet ble utpipettert i 500 ml erlenmeyere og podet med mycelkultur.

Det podete mediet ble deretter satt til inkubering i ryste-apparatet ved 21°C til fermenteringen var avsluttet. Dette tok flere dager. Noen av fermenteringsforsøkene ble holdt i gang i flere uker.

Metabolittene ble deretter fjernet fra fermenteringsmediet etter at man først fjernet mycelet ved vakuumfiltrering eller ved sentrifuger ing.

Det gjenblivende mycelet ble vasket med vann slik at ekstraktet til slutt utgjorde 100 ml. Vaeskefasen ble deretter justert til pH 2,7 med ln-HCl. Den sure løsningen ble ekstrahert fire ganger med 35 ml-porsjoner, av etylacetat, mettet med vann. Etylacetatekstraktet ble slått sammen og ekstrahert tre ganger med 70 ml-porsjoner av 0,1 m K2HP04, mettet med etylacetat.

Dette nye ekstraktet ble så justert til pH 2,7 med 5 m - HCl og ekstrahert fire ganger med 70 ml-porsjoner av etylacetatet,

mettet med vann.

De organiske fasene ble så slått sammen og vasket fire ganger

med 14 ml-porsjoner vann. Vannet var justert til pH 2,7 med HCl.

De organiske fasene ble deretter oppkonsentrert under vakuum for fjerning av løsningsmidlet. Residuet var et konsentrat av gibberelliner.

Gibberellinene i fast form ble renset ved tynnskiktskromatografi på Merck Kieselgel 60 og fremkalt med propanol-2, 25% ammoniakk og vann i et 10:1:1 volumforhold.

De rene gibberellinene hadde en retensjonsfaktor R^på:

GAX= 0,42, GA3= 0,47, GA4= 0,54, GA? = 0,60 og

GA9= 0,70.

De forskjellige sonene på kromatogrammet ble skrapt av straks etter fremkallingen, homogenisert i en morter og vasket ut med metanol i Pasteurpipetter.

Gibberellinaktiviteten ble målt med "The Lettuce hypocotyl bioessay" (Nature 185, side 255-256).

Vi fant bare gibberellinaktivitet i de fraksjoner som hadde R f mellom 0,5 og 0,6, hvilket indikerte at vårt gibberellin-

produkt kunne være GA4eller GA7, og at det ikke var bestem-

bare mengder av GA1eller GA3til stede i denne fraksjonen.

Det ekstraherte materialet ble også overført til gass-kromatograf en etter forutgående metylering og trimetylsilane-ring. Det ble fastslått at bare en komponent kunne ha en reten-sjonstid som var identisk med GA4's og forskjellig fra GA7's.

Det ble videre bekreftet ved gasskromatografi/massespektrometri at den metylerte og trimetylsilanerte prøven av ekstraktet var identisk med GA4 .

Det kunne ikke påvises andre gibberelliner fra mycelmassen ved gasskromatografering og ved gasskromatografi/massespektral-analysering, hvilket igjen bekrefter den selektive evne som våre stammer av Sphaceloma manihoticola har i produksjonen av gibberellinet GA4.

<GA>4-titrene fra våre fermenteringsforsøk er vist i følgende tabell:

I tillegg til gibberellin GA4 har de følgende gibberellinene blitt endelig identifisert ved en kombinert gasskromatografimassespektrometri (i % av gibberellin GA4) under de samme betingelser som før:<GA>13(25%), GA14(5%), GA24(0,5%), GAg (0,2%), GA15,

<GA>25'GA35og G<A>37som spor. Ingen av disse gibberellinene forstyrrer isoleringen og rensingen av gibberellin GA4.

Det ble ikke påvist spor av gibberellin GA^, qa3og GA7

ved bruk av den ytterst følsomme massefragmentografiteknikken.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av plantevekstregulerende forbindelser, karakterisert ved at den plantevekstregulerende forbindelsen produseres ved fermentering av stammer av Genus Sphaceloma og ved isolering av av den plantevekstregulerende forbindelsen fra fermenteringsproduktet.

2.. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at den plantevekstregulerende forbindelsen er et. gibberellin. _ ' .

3. Fremgangsmåte i henhold til krav 1 og 2, karakterisert ved at stammen er Sphaceloma Manihoticola.

4. Fremgansmåte i henhold til .krav 3, karakterisert • ved at stammen er Sphaceloma Manihoticola DSM 1637 eller DSM 1638.

5. Fremgangsmåte i henhold til et hvilket som helst av de fore-gående krav, karakterisert ved at fermenteringen utføres ved 27 - 28° C og ved en start pH på ca. 6.,

6. Fremgangsmåte i hehold til et hvilket som helst av de fore-gående krav, karakterisert ved at fermenteringen utføres i nærvær av mal to se; som karbonkilde.

9. Fremgangsmåte i henhold til et hvilket som helst av de fore-gående krav, karakterisert ved at den plantevekstregulerende forbindelsen, som produseres ved fermentering, hovedsaklig består av GA4 og at den i det alt vesentlige er fri for GA7.