NO761602L - - Google Patents

Description

Oppfinnelsen har til formål å frembringe en ny klasse dismutaseperoksyder og spesielt en fremgangsmåte for fremstilling av dismutaseperoksyder inneholdende jern.

Man har allerede beskrevet dismutaseperoksyder som er ekstrakter av erytrocyte av okse (Markovitz, J. Biol. Chem.

234, side 40, 1959) og av Escherichia coli (Keéle og Fridovich,

J. Biol. chem. 245, side 6176, 1970).

Dismutaseperoksyder er enzymer som kan forårsake for-vandling av peroksydioner ifølge reaksjonen:

De kan på den måten frembringe et selvbeskyttende system

for produkter eller organismer hvor de finnes siden ionene Q>2'

som er produkter fra oksydasjonsreaksjoner hvor effekten av oksygenmolekylene er meget aktiv og angriper blant annet prote-

iner ved oksydasjon av tryptofan og aminsyrer og nukleinsyrer.

Formålet med den foreliggende oppfinnelse er å fremstille dismutaseperokdyser og særlig en fremgangsmåten for å fremstille nye dismutaseperoksydenzymer som inneholder jern.

Formålet er å fremstille dismutaseperoksyder fra marine bakterier. Oppfinnelsen vedrører særlig en fremgangsmåte for ekstraksjon av disamuteperoksyder fra Photobacterium phosphoreum, Photobacterium leiognathi og Photobactdrium sepia blant andre.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen består av å dispergere

en kultur av marine bakterier i vann og holde denne på 4°C,

og justere pH i miljøet til 6,5 - 8, fortrinnsvis til 7, og holde blandingen på 50-60°C i noen minutter, og avskjøle igjen til 4°C og å sentrifugere dispersjonen for deretter å foreta en friksjonert krystallisasjon i oppløsningen ved hjelp av nøytrale salter, og sentrifugere pånytt og å foreta en ny frak-

sjonert krystallisasjon av oppløsningen ved hjelp av nøy-

trale salter for til slutt å foreta en ny sentrifugering.

Man kan eventuelt avslutte den fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen med et rensetrinn som består av at man oppløser bunnfallet fra den siste sentrifugeringen i en fosfatbuffer med pH 7,8, hvoretter den tilveiebrakte oppløsning underkastes dialyse mot den samme fosfatbuffer med pH 7.8.

Ifølge en annen utførelse kan man rense enzymekstraktet

fra den marine bakterikultur etter å ha tatt opp produktet fra den siste sentrifugeringen i fosfatbufferen med pH 7,8 og dialysert mot den samme buffer, ved kromatografi og da fortrinnsvis kolonnekromatografi og særlig kromatografi med tre etter-følgende kolonner, en kolonne med "Sephadex G 200"-gel, en kolonne med dietylaminoetyl "Sephadex" ("DEAE-Sephadex A-50") og en tredje kolonne med "Sephadex G 200"-gell

Den bakteriekultur som er kilde for enzymet i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er f.eks. en kultur av stammen Photobacterium phosphorum, Photobacterium leiognathi, eller Photobacterium sepia. For å tilpasse pH i bakteridispersjonen i vann til 6,5 - 8 ifølge det første trinn i denne fremgangsmåte, anvender man f.eks. 2N ammoniakk og tilsetter deretter kalium-klorid, fortrinnsvis KC1 3M.

Man holder deretter blandingen på en temperatur på 50-60°C

i noen minutter og fortrinnsvis 3-4 min. Man avkjøler deretter blandingen til 4°C og alle etterfølgende trinn i fremgangsmåten utføres ved denne temperatur.

Hver av de fraksjonerte fellinger utføres ved hjelp av nøytrale salt i vandig oppløsning og fortrinnsvis ved hjelp av ammoniumsalt (NH4)2S04.

Ved en foretrukken fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen ut-føres den første bunnfellingen ved hjelp av ammoniumsulfat (NH4)S04tilsatt i en slik mengde at det behandlede enzymekstrakt bringes til en endelig konsentrasjon på 30-35% i forhold til metningen ved 4°C. Man bemerker at man kan erstatte ammonium-saltet eller deler av dette med flere andre passende salt og at den totale mengde av disse alltid er en mengde som tilsvarer en-mengde som frembringer en blanding i en konsentrasjonen på 30-35% i forhold til metning ved 4°C.

Man kan eventuelt anvende et system for ultrafilterering, f.eks. et system som anvender en porøs innretning som porøse rør og særlig et system som anvender et første porøst rør som holder tilbake og konsentrerer moelkyler som har en molekylvekt på over 40.000 og et etterfølgende porøst rør som slipper igjennom dé ønskede enzymmolekyler, men som holder tilbake resten av bakteriene og derved tilveiebringer et sterilt enzymekstrakt.

Likeledes tilveiebringes med fordel den \annen fraksjonerte bunnfelling ved hjelp av ammoniumsulfat (NH^^SO^ tilsatt i en slik mengde at blandingen eller enzymekstraktet som behandles bringes i en endelig konsentrasjon på 70-75% i forhold til met-nmgen ved 4 C.

Dismutaseperoksydene som er tilveiebrakt med utgangspunkt

i forskjellige marine bakteriestammer ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er alle dismutaseperoksyder som inneholder ikke-hematitisk jern,mens de enzymer som har en dismutaseperok-sydaktivitet som man har beskrevet i det foregående og som er retrokuprein og enzymekstraktet fra Escherichia coli,inneholder divalente kationer som henholdsvis er kobber eller sink for den førstnevnte og mangan for den andre.

Undersøkelse etter nærvær av et metall i dismutaseperoksyd-enét- kan utføres ved en analyse ved hjelp av en atomabsorbsjons-spektrograf.

Man kan likeledes utføre en kolorimetrisk prøve som i det foreliggende tilfelle består i å fargelegge en gel for elektroforese av et enzympreparat ved hjelp av et fargestoff som rea-gerer spesifikt overfor toverdig jern Fe^+, nemlig batofenantrolin, eventuelt i nærvær av et reduserende middel som hydrazin. I denne prøven deler man gelen i to i lengderetningen og plaserer den ene av de to delene i koomassiblått og den andre delen i batofenantrolin. Prøven er positiv hvis man får en rosaa ring i det siste tilfelle på nivå med proteinbåndet. Det er kjent at nærvær av en slik rosa ring kan betraktes som en indikasjon på nærvær av toverdig jern, i dette tilfelle i dismutaseperoksyd-proteinet.

Man kan også anvende radioaktivt jern for å merke proteinet og derved bestemme støkiometrien med hensyn på det divalente metallkation som er tilstede.

Den foreliggende oppfinnelse har likeledes til formål å frembringe et dismutaseperoksydekstrakt fra marine bakterie-kulturerkarakterisert vedat de omfatter ikke-hematitisk jern, har en molekylvekt på 40.000 + 2.500 og en pH ved det isoelektriske punkt på 4-7 og viser et maksimum av enzymatisk aktivitet ved en pH mellom 8,5 og 10 og med et optumum på pH 9,5.

Man kan opprettholde enzymet aktivt over lange tidsperioder og bevare det i en oppløsning på mellom 70 og 80% av nøytralt ammoniumsulfat (NH.J-SO. ved 4°C.

4 2 4

For å måle aktiviteten av dismutaseperoksyd ifølge den foreliggende oppfinnelse, kan man vurdere undertrykkelsen, inhiber-ingen, av de sistnevnte på kjemo-luminiscensreaksjonen som er frembrakt av enzymsystemet oksygen-hypoxantin-xantin-oksy-dase-luminol som man allerede har vist. Dette enzymsystemet frembringer en frigjørelse av ioner 0^, som gir en kjemoluminiscens-reaksjon med luminol. Tilsats av dismutaseperoksyd til dette systemet forandrer effekten av ionene Q^'°99ir derfor en minsk-ning av intensiteten på lyset som frembringes av denne reaksjonen .

Dismutaseperoksyd katalyserer reaksjonen

Hvis man som subtrat i denne reaksjonen anvender peroksyd frembrakt av enzymreaksjonen fra xanten-oksydase og xantin eller hypoxantin, viser det seg at det peroksyd som produseres er meget ustabilt og gir spontant fra seg lys. Dette lys er imid-lertid meget svakt og det kan ikke måles med en tilstrekkelig stor reproduserbarhet.

Det er av denne grunn man i det analytiske opplegg anvender luminol eller 5-amino-2,3-dihyro-l,4-ftalazindion for å måle den mengden peroksydibner som er dannet.

Luminol + 02- hv + oksydasjonsprodukt.

Man må forøvrig likeledes korrigere for systemer som frembringer peroksydioner, det vil si kataLytiske systemer som kan frembringe oksydasjon av luminol og som består av ionene Fe 2+,

2+ 2+

Ni eller Co i vandige oppløsninger med molekylært oksygen

i nærvær av visse ligander.

Dismutaseperoksyd medfører en reduksjon av ionemengden

§2~i systemet og følgelig en reduksjon lysproduksjonen.

Man har, følgende reaksjonsblanding:

Man plaserer denne blandingen i et forsølvet kar under en fotomultiplikator. Man starter reaksjonen ved å innføre i be-holderen følgende substrat: 1 ml av en oppløsning som inneholder 0,3ymmol hypoxantin.

Man får derved■frembrakt en emisjon av fotoner som gjennom fotomultiplikatoren gir opphav til en strøm hvis intensitet man måler på et picoamperemeter og registrerer. Hvis man innfører i reaksjonsblandingen 5^ul av dismutaseperoksyd etter et reaksjonen er satt igang, får man en undertrykkelse, inhibering, av denne lysutsendelsen.

Man definerer nå vilkårlig enheten av dismutaseperoksydenzymet som den mengde av dette enzym som gir en inhibering på 50% i lysutsendelsen.

Man legger merke til at man kan likeledes vurdere aktiviteten, av dismutaseperoksyd ifølge oppfinnelsen ved,å frembringe den samme inhibering i den samme reaksjon som er nevnt ovenfor direkte ved å innføre 1 ml av en.oppløsning med 0 2--ioner fremstilt ved elektrokjemisk reduksjon (J.M. Cord, I..Fridovitch, J.B.C., vol. 244, 25(1969), sidene 6049-6055), i 2 ml av en opp-løsning som inneholder 0,5^um°l luminol og 0,17 mmol fosfatbuffer med pH 7,8.

Man kan også vurdere aktiviteten av dismutaseperoksyd

ifølge oppfinnelsen på følgende måte:

Man .innfører i det nevnte kar 0,3 ml glycin-NaOH lM-buffer, pH 9, 0,3 ml EDTA 10 - 3M som er nøytralisert, 1,1 ml flavinrmono--5

nukleotid 10 M-og 0,3 ml luminol (20 mg/70 ml). Man innfører 1 ml NaBH. 10 - 2M. Under disse betingelser får man et signal som

settes til 10 — 7 - 10 — 8 A ved en spenning på 1500 volt. Man legger merke til at oppløsningen av NaBH^ bør være laget umiddelbart mens luminolen kan oppbevares i fravær av lys ved 0°C og bør tilsettes reaksjonsblandingen for seg.

Tilsats av dismutaseperoksyd til dette systemet frembringer en viss inhibering av lyssignalet og det sistnevnte varierer lineært med den mengde enzym som er tilstede i et forhold på 75% .

Ifølge en ytterligere variantL.kan man vurdere aktiviteten av dismutaseperoksyd ved anvendelse av en reaksjonsblanding som består av 0,3 'ral glycin-NaOH IM,-buffer, pH 9, 0,3 ml EDTA

-3 -4 10 M, 1,1 ml vann og 0,3 ml luminol 10 M. Man tilsetter til denne blandingen 5^ul xantin-oksydase (1 kg/ml) og en tilhør-ende mengde dismutaseperoksyd. Man tilfører 1 ml hypoxantin (0,3 ml hypoxantin-10 _ 3M, fortynnet i siste øyeblikk med vann til 10 ml). Luminolen som kan oppbevares i fravær av lys og ved 0°C må tilsettes for seg til reaksjonsblandingen.

Det signal som tilveiebringes for doseringen av temoin (uten disputaseperoksyd) er i nærheten av 10 A ved en spenning på 1500 volt og undertrykkelsen av lyssignalet: er lineært og proporsjonalt med mengden av dismutaseperoksyd til 50%.

Som tidligere er nevnt, kan under bestemte betingelser. metallionene Fe , Ni og Co gi opphav til peroksydradikaler, og patentkreveren har vendt seg mot problemet vedrørende oksydasjon av lipider, særlig i matvarer,og sammenliknet reaksjons-mekanismen med den mekanisme som er virksom når det dannes per--oksydioner i et system som inneholder de ovennevnte metallioner og en passende ligand. Man har da kunnet konstatere at.de antioksyderende midler som vanligvis anvendes i næringsmiddelindustrien, såsom pyrogallol som bryter kjeden i frie radikaler f.eks. propylgallat eller som.undertrykker produksjonen av fri-radikaler som EDTA og askorbinsyre, mot all forventning effektivt kan fremme visse oksydasjoner som dels er katalysert av enzymer dels av virkningen av metallioner i stedet for å virke som antioksyderende midler som man hadde forventet.

Man har således fastslått at ved passende pH-betingelser, vil dismutaseperoksyd ifølge oppfinnelsen inhibere oksyderende systemer som inneholder. 0~.-ioner produsert elektrokjemisk, FMNH2/02, eller Fe 2+ , Ni 2+ eller Co 2+-ioner i vandige oppløs-ninger med molekylært oksygen i nærvær av passende ligander.Syv enheter av dismutaseperoksyd ekstrahert av Photobacterium leiognathi kan undertrykke 16,5% av lysutsendelsen,som skyldes virkningen av systemet Co 2 +/02/tetraglycin fra luminol ved 9,7 og ca. 40'% av virkningen av systemet Ni<2+>/02/cyanid på luminol ved pH 9.

Man har kunnet vise at dismutaseperoksyder effektivt be-skytter lipider og antioksyderende midler og andre konserverende midler som vanligvis anvendes i næringsmiddelindustrien, og meget sterkt undertrykket reaksjoner som skyldes produksjon av peroksydionet 02-. Man har spesielt kunnet fastslå at auto-oksydasjonen av umettede lipider som stammer fra Anchoveta under-trykkes meget sterkt av dismutaseperoksyder. I andre eksempler har man vist at dismutaseperoksyd utøver en beskyttende funksjon mot autooksydasjon i visse antioksyderende midler og særlig antioksyderende midler som anvendes for konservering av matvarer som f.eks. pyrogallol eller askorbinsyre.

Oppfinnelsen er beskrevet i detalj i de: nedenstående eksempler som ikke er begrensende.

Eksempel 1

Man dyrker bakterier av Photobacterium leiognathi stamme nr. ATCC 25.521 i et.kunstig muljø som inneholdt følgende komponenter i.gram pr. liter:

Man innstilte miljøet på pH 7,2 ved hjelp av soda og steriliserte ved 110°C i 1 time.

Denne prekulturen på 1 liter får vokse over natten og fordeles på fire Erlenmeyer-kolber som hver inneholder 250 ml for å krystallisere et gjæringsmiljø på 12. liter.

Kulturen ble hensatt i 12 timer ved 20°C ved sterk gjennom-lufting og det ble tilveiebrakt 100 g bakterier, veiet som vått produkt.

Man dispergerte 135 g av det våte bakterieprodukt av typen Photobacterium leiognathi som inneholder flere kulturer i .650 ml vann og lot dette stå ved 4°C over natten. Man tilsatte 2N ammoniakk for å justere pH området 7-8 og tilsatte deretter 18 ml KC1 3M.

Man brakte blandingen opp til 58°C og holdt den på denne temperaturen i fire minutter hvoretter man avkjølte til 4°C og sentrifugerte i ti minutter med en hastighet på 10.000 omdreininger/min. Man holdt temperaturen på 4°C og justerte væskefasen til 35% metning med ammoniumsulfat til pH 8/man sentrifugerte påny og justerte væskefasen til 75% metning med ammoniumsulfat og lot det hele stå over natten ved 4°C. Man samlet opp det bunnfelte protein ved hjelp av sentrifugering og man oppbevarte det i en oppløsning av ammoniumsulfat ved 75%.

Aktiviteten av en oppløsning av 9 mg protein pr.- ml (Biuret) er 40 enheter/mg, samtidig som den til sammenlikning har null enheter/mg av katalase i oppløsning ved 9 mg av protein/ml.

Etter ytterligere en fraksjonert bunnfelling ved hjelp av ammoniumsulfat med en konsentrasjonsgradient mellom 35 og 75%

av metning tilveiebraktes en dismutaseperoksyd som i- en oppløs-ning av 14,8 mg protein/ml (Biuret) utviste en aktivitet på

134 enheter/mg til 500 enheter/mg.

Man oppløste proteinbunnfallet i en fosfatbuffer med pH

7,8 og dialyserte i 48 timer ved 4°C. Man oppbevarte dismutaseperoksydet ved -20°C.

For å bestemme aktiviteten i enzymet anvendte man et kar som var plasert under en fotomultiplikator og som inneholdt følgende reaksjonsblanding:

Man satte.reaksjonen igang ved i karet i innføre 1 ml

-4

hypoxantin 3x10 M.

En fotonstrøm ble utsendt og denne ga gjennom foto multi-plikatoren opphav til en strøm som kan måles på et picoamperemeter og man kan likeledes registrere variasjoner i denne intensiteten .

Ved å innføre 5 ^ul av en oppløsning av dismutaseperoksyd som er fremstilg som beskrevet ovenfor i reaksjonsblandingen etterat reaksjonen var kommet igang, fikk man en undertrykkelse av lysutsendelsen og man har tilfeldig fastlagt at 1 enhet dis-mutaseperoksydenzym er den enzymmengden som frembringer en undertrykkelse på 50% i lysutsendelsen.

Ved UV-spektroskopi (ultrafiolett spekt.røskopi);; gir^dismutaseperoksydekstraktet.et klassisk spektrum for ikke-hemato-logiske proteiner med en tryptofantopp ved 290 m^u.

For å bestemme molekylvekten anvender man to kjente tek-nikker hvorav den første består i å bestemme en sentrifugerings-gradient i sakkarose og den andre benytter en "Sephadex G 200" - gel..

Man kan anvende de følgende markører hvor man kjenner molekylvekten (MV):

Man har bestemt molekylvekten til 40.000 + 2.500.

For å bestemme molekylvekten iiproteinstrukturen i enzymet har man gjennomført en elektroforese av en gel av polyakrylåmid tilsatt NDS.(natriumdodecylsulfat) til 10%.

Man har kunnet fastlegge en type under-enhet med molekylvekt på ca. 21.000. Man kan derfor bestemme molekylvekten til dismutaseperoksyd til 21.000 x 2, det vil si 42.000.

I denne polyakrylamidgelen har man funnet et rødt bånd i nærvær av batofenantrolin og hydrazin på nøyaktig.det samme nivå som peroksyddimutasebåndet frembrakt av koomassiblått.

Man har foretatt en kolorimetrisk prøve med en oppløsning av proteinet og funnet en jernverdi som på grunnlag av en molekylvekt på enzymet på 4 2.000 gir ca. 2 jernatomer. pr.mol.

Absorbsjonsspektrometri. av en proteinoppløsning på 0,2 mg/ ml bekrefter dette tallet.

Man har derfor god grunn til å anslå 2 som antall jernatomer, pr. mol dimutaseperoksyd .

Enzymekstraktet ifølge dette eksempel viser ikke noe særlig aktivitetstap etter 5 minutter ved en temperatur på 70°C.

Elektrofokalisering av dismutaseperoksydet gir en pH på

4,4 som det isolektriske punkt for dette enzym.

Enzymet gir maksimum aktivitet ved en pH på ca. 9,5.

Man har tilveiebrakt et identisk enzym med tilsvarende egenskaper med utgangspunkt i en bakteriestamme av Photoacterium leiognathi nr. ATGC 25.587.

Eksempel 2

Man underkastet en bakteriekultur av Photobacterium sepia

av stammen nr. ATCC 15.709 en behandling og omrøring i kalt vann til man, fikk 1 g bakterier beregnet.på grunnlag av våt vekt/4 ml vann. Man sentrifugerte denne ved 16.000 omdreininger/min. i 20 min. ved 4°C. Man tilsatte den gule klare væsken KC1 3M til man fikk en endelig konsentrasjon på 0,1 M.

Man varmet opp oppløsningen i 3-4 min. på et vannbad ved 60°C. Man avkjølte deretter til 4°C og sentrifugerte.

Man underkastet filtratet en fraksjonert bunnfelling ved tilsats av fast ammoniumsulfat. Den aktive fraksjon ble bunnfelt mellom 45-75% av metning av ammoniumsulfat og man skilte ved hjelp av sentrifugering. Man oppløste den aktive fraksjon i et minimalt volum K2HP0^5 x 10 - 3M ved pH 7,8 og dialyserte i en natt. mot den samme fosfatbuffer. Produktet av denne dialysen førtes

Q

deretter over i en kolonne med "Sephadex. 100"-gel eller "G

200" som var brakt i likevekt med fosfatbuffer 5 x 10 — 3M og pH 7,8. Den aktive fraksjon ble konsentrert, eluert ved hjelp av en ultrasentrifugeringsmembran av typen "Diaflo PM-10" og frak-sjonen ble deretter dialysert i løpet av en natt mot K2HPC>4

5 x 10~<3>M ved pH 7,8.

Dismutaseperoksydenzymet ble tilsatt til en kolonne med. DEAS "Sephadec A-50" med en buffer av K2HP04 5 x 10~<3>M og pH 7,8. Proteinet i kolonnen ble eluert med en lineær gradient av

-3 -1

K2HP04, pH 7,8 ( 5 x 10 M til 3 x 10 M). Dismutaseperoksydet ble eluert-med en konsentrasjon av fosfatet på 1,4 x 10 og ble deretter,konsentrert. En ytterligere filtrering under de samme betingelser som nevnt i det foregående ble foretatt på en kolonne med DEAE"Sephadex A-50". Enzymet ble eluert.ved en konsentrasjon på fosfatet på 1,6 x 10 og deretter konsentrert.

Det protein som var ekstrahert på denne måten og renset

av et .eget bånd ved elektroforese på akrylmidgel (100^,ug av protein- i gelen)".')

Man fikk 3 mg dismutaseperoksyd med utgangspunkt i 20 g frosne-Photobactorium sepia-celler (med en aktivitet på dismutase-

peroksydet på 250-5000 enheter/mg).

Enzymaktiviteten ble opprettholdt over en lengre periode under oppbevaring i en oppløsning på 70-80% av (NH^^SO^ ved 4°C.

Molekylvekten til,det rensede enzym ble bestemt ved hjelp av ultrasentrifugering ved 45.000 omdreininger i minuttet i 16 timer ved. 4°C. Sedimentasjonshastigheten ble målt ved hjelp av Marin og Ames' metode med en lineær gradient i skurose på 5-20 (i vekt/volum) under anvendelse av et Beckman Spinco-apparat modell "L2-65B" med. en rotor SW 65 K. Man^ finner en sedimenta-■ sjonskoeffisient på. 3,2 i denne dismutasen sammenliknet med koeffisienter på henholdsvis 4,82 og 7,4 for alkoholdeshydrogen-ase fra hestelever og gjær. Med utgangspunkt i denne sedimenta-sjonskoeffisienten har man beregnet molekylvekten for dismutaseperoksydekstraktet til,å være ca. 42.500.

Man har likeledes fastslått at dette proteinmolekylet inneholder 2 jernatomer.

Elektroforese av akrylamidgeler har gitt et bånd for dismutasen som tilsvarer molekylvekter på fra 20.000-20.500, noe som viser at proteinmolekylet består av to identiske under-enheter .

Dismutaseperoksyd har vist seg å være meget motstands-dyktig overfor den proteolytiske virkning av trypsin, og man kan behandle 150 ,ug av dismutaseperoksyd.i 60 min. med 10 /Ug trypsin ved 20 oC uten at man får noen forandring i den enzymat. tiske aktivitet og uten at den elektroforetiske.mobilitet i proteinet er ikke-dissosiert.

Det tilveiebrakte enzym er meget stabilt overfor forand-ringer i varme: man kan ikke merke noe tap i enzymatisk aktivitet etter 30 min. ved 20°C, 30°C eller 40°C, etter 15 min. ved 50°C•får man en reduksjon i aktiviteten på 28%, etter 30 min. ved 50°C er aktivitetstapet omtrent 50% og det er bare henholdsvis 10 og 50% etter 3 min. og 10 min. ved 60°C.

Elektrofokalisering av dismutaseperoksydet gir en pH-verdi på 4,1 som det isoelektriske punkt for dette enzym.

Ved hjelp av en oppløsning av 02'. -ioner fremstilt på elektrolytisk måte har man bestemt at enzymaktiviteten utviser et maksimum ved pH mellom 8,5 og 10, med et optimum på pH 9,5.

Eksempel 3

Man behandler en stamme nr. ATCC 11.040 av bakteriene Photobacterium phosphoreum som er marine bakterier og som følgelig har en sterk konsentrasjon av salt.

Bakerieveksten er spontan i en oppløsning av EDTA på

10~3M ved pH 7,8.

Man fjernet cellerestene ved hjelp av sentrifugering med 16.000 omdreininger/min. i 20 min. ved 0°C.

Foreløbige studier har vist at dismutaseperoksydenzymet

er stabilt ved 50°C og man kan således fjerne de andre proteinene som er termolabile ved å holde bakteriekulturen ved 50°C i 3 min. etter en tilsats av KC1 på 0,1 molar, hvoretter de dena-turerte proteiner fjernes ved vanlig sentrifugering.

Man opererte deretter ved 4°C. Ved denne temperaturen frem-brakte man en fraksjonert bunnfelling ved hjelp av ammonium-sulf at (NH4)2S04 tilsatt i en slik mengde at blandingen eller enzymekstraktet som ble behandlet ble holdt på en kons.entrasjons-gradient fra 0-30% av metningen ved 4°C. Den bunnfelte frak-sjonen fjernes ved sentrifugering i 45 min. med 16.000 omdreininger/min. og 0°C.

Den frasentrifugerte væske tilsettes den. nødvendige mengde nøytralt ammoniumsulfat for å holde den på 75% av metning ved 4°C.

De to bunnfellingsfraksjonene sammenføres ved hjelp av

en sentrifugering.

For å rense dismutaseperoksydet oppløses bunnfallet i

-3

en liten mengde fosfatbuffer 5 x 10 M ved pH 7,8 og dialyseres mot den samme buffer i 48 timer ved 4°C for å tilveiebringe et ekstrakt (A).

Proteinene skilles deretter etter størrelsen på molekylene ved hjelp av en "Sephadex G 100"-gel hvor kornstørrelsesfor-delingen er slik at proteiner med en molekylvekt over 100.000 utelukkes og. derfor forsvinner meget raskt mot overflaten i-gelen. Molekyler som har mindre molekylvekter trenger inn i gelen.og kan elueres.mer eller mindre langsomt etter sin størrel-se .

For å gjøre dette tillates Sephadex-harpiksen. å svelle i vann i 3 timer, den avgasses og filtreres i en Buchnertrakt for å fjerne vannet, hvoretter den plaseres i en filtreringsbuffer og føres, gjennom en kolonne som er 50 cm lang og med 3 cm indre diameter. Kolonnen er brakt i likevekt ved gjennomføring av 2 liter buffer.

Man tok først enzymekstraktet (A) som ble tilveiebrakt ved dialyse for å konsentrere dette i en "Diaflo"-membran ved kvelstofftrykk til et volum på 5 ml. Dette konsentratet ble innført på en kolonne som var behandlet som angitt ovenfor og -3 man eluerte ved gjennomføring av 500 ml fosfatbuffer 5 x 10 M ved pH 7,8. Utbyttet er en dråpe hvert åttende sekund og man. samlet i fraksjoner på 2,5 ml og de fraksjoner som har en mål-bar aktivitet forenes og konsentreres i Diaflo-membraner. Man tilveiebringer på denne måten et konsentrert ekstrakt (B).

Man gjennomfører ytterligere et rensetrinn ved kromatografi ved hjelp av en ionebytter basert på DEAE Sephadex hvor proteinene elueres ifølge sin ladning ved hjelp av buffere med økende ionestyrke.

For å fremstille denne kolonnen må kolonnematerialet ligge i vann, hvoretter det avgasses og vaskes med de følgende opp-løsninger :

og kolonnematerialet skylles i destillert vann mellom hver etappe til pH er nøytral. Etter filtrering i en Buchnertrakt plaseres ionebyttematerialet i suspensjon i en fosfatbuffer 0,IM pH 7,8, hvoretter det plaseres i en kolonne som er 30 cm lang og har en 3 cm indre diameter. Kolonnen bringes i likevekt ved å passere 300 ml buffer 0,1 M.

Det konsentrerte ekstrakt (B) plaseres på kolonnen. Når ekstraktet er fullstendig absorbert, elueres med 500 ml fosfatbuffer med pH 7,8 som består av 250 ml fosfatbuffer 0,IM.hvor man progressivt har tilsatt 250 ml fosfatbuffer 0,5 M. Utbyttet er en dråpe hvert femte sekund og volumet på de forskjellige fraksjoner 2,5 ml. De aktive fraksjoner slås sammen og bunnfel-les ved hjelp av ammoniumsulfat hvoretter.de oppbevares i denne form ved -18 .til -20°C.

Renheten på dismutaseperoksydenzymet kan kontrolleres ved

elektroforese på polyakrylamidgel.

En bestemmelse av molekylvekten av enzymet ved hjelp av en elueringsstudie som en filtrering ved "Séphadex G 200" til-later ved hjelp av likningen log(MV) = f(elueringsvolum) og kjente markører, gir dismutaseperoksydekstraktet en molekylvekt på ca. 40 .000 .

Man har likeledes bestemt molekylvekten ved sentrifugering i en sukrosegradient: Man har latt gradienter med sukrose fra 5-20% synkee ned i fosfatbuffer 5 x 10<o3>M ved pH 7,8 med grad-vis tilblanding av 2,60 ml av 20% oppløsningen til 225 ml av 5% oppløsningen i en passende innretning.

Til disse sukrosegradientene ble tilsatt forskjellige proteinmarkører med kjente molekylvekter og dismutaseperoksyd. Man har tilveiebrakt likevekt ved- en sentrifugering.med 45.000 omdr./min. ved 5°C i 22 timer. Man har deretter gjennomhullet rørene i bunnen og samlet opp fraksjoner på 10 dråper hvor man, har målt den enzymatiske aktivitet i de forskjellige anvendte markører. Etter å ha tegnet opp variasjonen i molekylvektene som en funksjon av nummeret på elueringsfraksjonen, er molekylvekten på dismutaseperoksyd fra Photobacterium, phosphoreium bestemt til ca. 40.000, noe som bekrefter de tidligere tilveiebrakte resultater.

For.å bestemme molekylvekten til underenhetene i proteinet har man underkastet dette sammen med markører hvor molekylvektene til underenhetene er kjent til en elektroforese på et polyakrylamidgel i nærvær av natriumdodecylsulfat. Dette gjør det mulig å bestemme verdien på molekylvekten til hver under-enhet til 20.000.

Man fikk bekreftet at dismutaseperoksyd er meget stabilt til 50°C og utviser en maksimal enzymatisk aktivitet ved en.

pH på ca. 9,5.

En elektrofokalisering av dismutaseperoksyd viser at en pH på 4,2 tilsvarer det isoelektriske punkt for-dette enzym.

En kolorimetrisk test som beskrevet i det foregående gjør. det mulig å bestemme nærværet av toverdig jern i proteinet hvor en rosa ring i proteinbåndet i en elektroforetisk gel som tidligere er tilsatt batofenantrolin kommer tilsyne. Antallet jernatomer pr. molekyl viser seg å være lik 2.

Man har bestemt undertrykkelsen av autooksydasjon i enkelte produkter på grunn av dismutaseperoksyd (DPO):

Eksempel 4

-3

Man fremstilte en oppløsning av pyrogallol 2,5 x 10 M

i en fosfatbuffer. K2HP04 2,0 x 10~2M ved pH 7,7. Denne oppløs-

ni/ng (Al: hadde et volum på 3 ml.

Man, målte økningen av den optiske tetthet (OT) ved 440-m^u pr. minutt ved forskjellige systemer og man har fått følgende prosentvise undertrykkelse (inhibering) ved hvert av de følgende systemer:

Man ser således at dismutaseperoksyd har en usedvanlig inhiberende effekt på autooksydasjon av pyrogallol.

Eksempel 5

Man går frem på samme måte som i eksempel 4, med den forskjell at pyrogallol er i oppløsning i en fosfatbuffer med følgende styrke 5,0 x 10 M, 2 x 10 M og 1<0>M. De tilveiebrakte oppløsninger kalles (B), (C) og (D).

Man får følgende resultater:

Eksempel 6

-4

Man fremstiller oppløsninger av pyrogallol 10 M i fosfat-buffere av K2HP045 x 10~2M og 2 x 10~2 med pH 7,7, mettet med molekylært oksygen. Disse oppløsningene (E) og (F) har et volum på 2,5 ml. Man måer økningen av den optiske tetthet ved 44 0 m^u/ min. og beregner den prosentvise inhibering:

Man legger merke til at 1 enhet enzym i 2,5 ml tilsvarer en enzymkonsentrasjon pa 2 x 10 -9M.

Eksempel 7

-4 Man fremstilte en oppløsning av askorbinsyre 10 M i en fosfatbuffer 2 x 10~<2>M med pH 7,7.

Man målte variasjonen i den optiske tetthet (OT) ved 265 rryu pr. min. i hvert av de følgende systemer:

Eksempel 8

Man gikk frem som i eksempel 7 med den forskjell at askor--4 -2 binsyren 10 M er i oppløsning i en fosfatbuffer 5 x 10 M med pH 8,8.

Eksempel 9

Man bestemte-virkningen av dismutaseperoksyd på oksydasjon av luminol katalysert av metallioner på følgende måte:

Eksempel 10

Man fremstilte en suspensjon på 10 vektprosent av Anchoveta-lipid i en fosfatbuffer 0,1 M ved pH 8.

Man tilsatte dismutaseperoksyd fra Photobacterium leiognathi, urenset, i. forholdt 0,01 vektprosent av enzym i forhold til lipid (dvs. 0,1 mg enzym pr. gram lipid).

I et Warburg-apparat ble forbruket av oksygen i systemet målt og i hvert tilfelle sammenliknet med den verdi man fikk i en lipidprøve med samme sammensetning, men uten dismutaseperoksyd. Man gjennomført målingene i økende tidsintervall og resultatene er uttrykt i form av prosentvis inhibering i oksydasjon i forhold til en prøve som ikke er tilsatt dismotaseper-oksyd.

Claims (14)

1. Dismutaseperoksyd, karakter is e,rt ved at det inneholder ikke-hematologisk jern, at det har en molekylvekt på 40.000 + 2.500 og et isoelektrisk punkt som tilsvarer en pH mellom 4 og 7 og.som utviser en maksimal enzymatisk aktivitet ved pH,mellom 8,5 og 10, og med et optimum på ca. 9.5.

2. Dismutaseperoksyd ifølge krav 1, tilveiebrakt med utgangspunkt i bakteriestammer av Photobacterium leiognathi nr. ATCC 25.521 eller ATCC 25.58?, karakterisert ved at det inneholder to jernatomer pr. molekyl, ved at det har en molekylvekt på ca. 42.000 og et isoelektrisk punkt ved pH 4,4, og har en maksimal enzymatisk aktivitet ved pH 9,5.

3. Dismutaseperoksyd ifølge krav 1, tilveiebrakt med utgangspunkt i kulturer av stammen Photobacterium sepia nr. ATCC 15.709, karakterisert ved at det inneholder to jernatomer pr. molekyl, ved at det har en molekylvekt på ca.

42 i 500 og et isoelektrisk punkt på 4,1 og ved at det har en maksimal enzymatisk aktivitet ved pH mellom 8,5 og 10 med et optimum på pH 9,5.

4. Dismutaseperoksyd ifølge krav 1, tilveiebrakt med utgangspunkt i kulturer av stammen Photobacterium Phosphoreum nr. ATCC 11,040,. karakterisert ved at det inneholder to jernatomer pr. molekyl, ved at det har en molekylvekt på ca. 40.' 000 og et isoelektrisk punkt ved pH 4,2 og ved at det har en maksimal enzymatisk aktivitet ved pH 9,5.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av .dismutaseperoksyder ifølge,krav 1, ved ekstraksjon av kulturer fra marine bakteriestammer, og særlig fra kulturer fra stammer av Photobacterium phosporium, Photobacterium leognathi eller Photobacterium sepia, karakterisert ved at man dispergerer i.vann og holder på 4°C en marin bakteriekultur, hvoretter pH justeres til området 6,5 - 8 og fortrinnsvis til ca. 7, hvoretter blandingen holdes på 50-60°C i noen minutter, avkjøles til 4°C, hvoretter den, ved denne temperaturen, sentrifugeres, hvoretter den frasentrifugerte væskefasen underkastes en første fraksjonert utfelling ved hjelp av nøytrale salter og hvor man etter ytterligere en.sentrifugering foretar en annen fraksjonert utfelling av den frasentrifugerte væskefase ved hjelp av nøytrale salter av sentrifugering.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert v e d at bunnfallet fra den siste sentrifugering oppløses i en fosfatbuffer med pH 7,8, hvoretter den tilveiebrakte opp-løsning dialyseres mot den samme fosfatbuffer med pH 7,8.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert v e d at produktet fra den siste sentrifugeringen tas opp i en fosfatbuffer med pH 7,8, hvoretter der gjennomføres en kromatografi med den tilveiebrakte oppløsning.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at den nevnte kromatografi består av en første kromatografi i en kolonne med. "Sephadex G 200"-gel, en kromatografi på en kolonne med dietylaminoetyl Sephadex (DEAE-S) og en ny kromatografi på en kolonne med "Sephadex G 200"-gel.

9. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 5-8, karakterisert ved at man holder den nevnte blandingen på 50-60°C i 3-4 minutter.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert v e d at det nevnte nøytrale salt en nøytralt ammoniumsulfat ( <NH>4 )2<S0>4 .

11. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert v e d at den første fraksjonerte utfelling foretas ved hjelp av (NH4)2S04 tilsatt i en slik mengde at blandingen eller enzymekstraktet som behandles blir brakt i.en endelig konsentrasjon på ca. 30-35% i forhold til metningen ved 4°C.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert v e d at den andre fraksjonerte utfellingen foretas ved hjelp av (NH4)2S04 tilsatt i en slik mengde at blandingen eller enzymekstraktet som behandles blir brakt til en endelig konsentrasjon på 70-75% i forhold til metningen ved 4°C.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert v e d at det omfatter et trinn for ultrafiltrering.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert v e d at det nevnte ultrafiltreringstrinn består av en innretning med et første porøst rør som holder tilbake og konsentrerer molekyler som har en molekylvekt på 40.000 og et annet porøst rør som slipper gjennom enzymmolekylene som er ønsket, men som holder tilbake bakterierestene og som derved tilveiebringer et sterilt enzymekstrakt.