NO761602L

NO761602L -

Info

Publication number: NO761602L
Application number: NO761602A
Authority: NO
Inventors: A M Michelsen; J Monod
Original assignee: Anvar
Priority date: 1973-04-16
Filing date: 1976-05-10
Publication date: 1974-10-17

Description

Oppfinnelsen har til formål å frembringe en ny klasse dismutaseperoksyder og spesielt en fremgangsmåte for fremstilling av dismutaseperoksyder inneholdende jern. The purpose of the invention is to produce a new class of dismutase peroxides and in particular a method for producing dismutase peroxides containing iron.

Man har allerede beskrevet dismutaseperoksyder som er ekstrakter av erytrocyte av okse (Markovitz, J. Biol. Chem. Dismutase peroxides which are extracts of bovine erythrocytes have already been described (Markovitz, J. Biol. Chem.

234, side 40, 1959) og av Escherichia coli (Keéle og Fridovich,234, page 40, 1959) and of Escherichia coli (Keéle and Fridovich,

J. Biol. chem. 245, side 6176, 1970).J. Biol. chem. 245, page 6176, 1970).

Dismutaseperoksyder er enzymer som kan forårsake for-vandling av peroksydioner ifølge reaksjonen: Dismutase peroxides are enzymes that can cause the transformation of peroxide ions according to the reaction:

De kan på den måten frembringe et selvbeskyttende system They can thus produce a self-protective system

for produkter eller organismer hvor de finnes siden ionene Q>2'for products or organisms where they exist since the ions Q>2'

som er produkter fra oksydasjonsreaksjoner hvor effekten av oksygenmolekylene er meget aktiv og angriper blant annet prote- which are products from oxidation reactions where the effect of the oxygen molecules is very active and attacks, among other things, proteins

iner ved oksydasjon av tryptofan og aminsyrer og nukleinsyrer. iners by oxidation of tryptophan and amino acids and nucleic acids.

Formålet med den foreliggende oppfinnelse er å fremstille dismutaseperokdyser og særlig en fremgangsmåten for å fremstille nye dismutaseperoksydenzymer som inneholder jern. The purpose of the present invention is to produce dismutase peroxides and in particular a method for producing new dismutase peroxide enzymes which contain iron.

Formålet er å fremstille dismutaseperoksyder fra marine bakterier. Oppfinnelsen vedrører særlig en fremgangsmåte for ekstraksjon av disamuteperoksyder fra Photobacterium phosphoreum, Photobacterium leiognathi og Photobactdrium sepia blant andre. The purpose is to produce dismutase peroxides from marine bacteria. The invention particularly relates to a method for the extraction of disamute peroxides from Photobacterium phosphoreum, Photobacterium leiognathi and Photobactdrium sepia, among others.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen består av å dispergereThe method according to the invention consists of dispersing

en kultur av marine bakterier i vann og holde denne på 4°C,a culture of marine bacteria in water and keep this at 4°C,

og justere pH i miljøet til 6,5 - 8, fortrinnsvis til 7, og holde blandingen på 50-60°C i noen minutter, og avskjøle igjen til 4°C og å sentrifugere dispersjonen for deretter å foreta en friksjonert krystallisasjon i oppløsningen ved hjelp av nøytrale salter, og sentrifugere pånytt og å foreta en ny frak- and adjusting the pH of the environment to 6.5 - 8, preferably to 7, and keeping the mixture at 50-60°C for a few minutes, and cooling again to 4°C and centrifuging the dispersion to then perform a frictional crystallization in the solution by using neutral salts, and centrifuging again and making a new fraction

sjonert krystallisasjon av oppløsningen ved hjelp av nøy-ionized crystallization of the solution by means of

trale salter for til slutt å foreta en ny sentrifugering.tral salts to finally carry out a new centrifugation.

Man kan eventuelt avslutte den fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen med et rensetrinn som består av at man oppløser bunnfallet fra den siste sentrifugeringen i en fosfatbuffer med pH 7,8, hvoretter den tilveiebrakte oppløsning underkastes dialyse mot den samme fosfatbuffer med pH 7.8. The method according to the invention can optionally be ended with a cleaning step which consists of dissolving the precipitate from the last centrifugation in a phosphate buffer with pH 7.8, after which the provided solution is subjected to dialysis against the same phosphate buffer with pH 7.8.

Ifølge en annen utførelse kan man rense enzymekstraktetAccording to another embodiment, the enzyme extract can be purified

fra den marine bakterikultur etter å ha tatt opp produktet fra den siste sentrifugeringen i fosfatbufferen med pH 7,8 og dialysert mot den samme buffer, ved kromatografi og da fortrinnsvis kolonnekromatografi og særlig kromatografi med tre etter-følgende kolonner, en kolonne med "Sephadex G 200"-gel, en kolonne med dietylaminoetyl "Sephadex" ("DEAE-Sephadex A-50") og en tredje kolonne med "Sephadex G 200"-gell from the marine bacterial culture after taking up the product from the last centrifugation in the phosphate buffer with pH 7.8 and dialyzing against the same buffer, by chromatography and then preferably column chromatography and especially chromatography with three subsequent columns, a column with "Sephadex G 200" gel, a column of diethylaminoethyl "Sephadex" ("DEAE-Sephadex A-50") and a third column of "Sephadex G 200" gel

Den bakteriekultur som er kilde for enzymet i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er f.eks. en kultur av stammen Photobacterium phosphorum, Photobacterium leiognathi, eller Photobacterium sepia. For å tilpasse pH i bakteridispersjonen i vann til 6,5 - 8 ifølge det første trinn i denne fremgangsmåte, anvender man f.eks. 2N ammoniakk og tilsetter deretter kalium-klorid, fortrinnsvis KC1 3M. The bacterial culture which is the source of the enzyme in the method according to the invention is e.g. a culture of the strain Photobacterium phosphorum, Photobacterium leiognathi, or Photobacterium sepia. To adjust the pH in the bacterial dispersion in water to 6.5 - 8 according to the first step in this method, one uses e.g. 2N ammonia and then add potassium chloride, preferably KC1 3M.

Man holder deretter blandingen på en temperatur på 50-60°CThe mixture is then kept at a temperature of 50-60°C

i noen minutter og fortrinnsvis 3-4 min. Man avkjøler deretter blandingen til 4°C og alle etterfølgende trinn i fremgangsmåten utføres ved denne temperatur. for a few minutes and preferably 3-4 min. The mixture is then cooled to 4°C and all subsequent steps in the method are carried out at this temperature.

Hver av de fraksjonerte fellinger utføres ved hjelp av nøytrale salt i vandig oppløsning og fortrinnsvis ved hjelp av ammoniumsalt (NH4)2S04. Each of the fractionated precipitations is carried out using neutral salt in aqueous solution and preferably using ammonium salt (NH4)2S04.

Ved en foretrukken fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen ut-føres den første bunnfellingen ved hjelp av ammoniumsulfat (NH4)S04tilsatt i en slik mengde at det behandlede enzymekstrakt bringes til en endelig konsentrasjon på 30-35% i forhold til metningen ved 4°C. Man bemerker at man kan erstatte ammonium-saltet eller deler av dette med flere andre passende salt og at den totale mengde av disse alltid er en mengde som tilsvarer en-mengde som frembringer en blanding i en konsentrasjonen på 30-35% i forhold til metning ved 4°C. In a preferred method according to the invention, the first precipitation is carried out using ammonium sulphate (NH4)SO4 added in such an amount that the treated enzyme extract is brought to a final concentration of 30-35% in relation to the saturation at 4°C. It is noted that one can replace the ammonium salt or parts of it with several other suitable salts and that the total amount of these is always an amount that corresponds to an amount that produces a mixture in a concentration of 30-35% in relation to saturation at 4°C.

Man kan eventuelt anvende et system for ultrafilterering, f.eks. et system som anvender en porøs innretning som porøse rør og særlig et system som anvender et første porøst rør som holder tilbake og konsentrerer moelkyler som har en molekylvekt på over 40.000 og et etterfølgende porøst rør som slipper igjennom dé ønskede enzymmolekyler, men som holder tilbake resten av bakteriene og derved tilveiebringer et sterilt enzymekstrakt. You can optionally use a system for ultrafiltration, e.g. a system that uses a porous device such as porous tubes and in particular a system that uses a first porous tube that retains and concentrates molecules that have a molecular weight of over 40,000 and a subsequent porous tube that allows the desired enzyme molecules to pass through, but that retains the rest of the bacteria thereby providing a sterile enzyme extract.

Likeledes tilveiebringes med fordel den \annen fraksjonerte bunnfelling ved hjelp av ammoniumsulfat (NH^^SO^ tilsatt i en slik mengde at blandingen eller enzymekstraktet som behandles bringes i en endelig konsentrasjon på 70-75% i forhold til met-nmgen ved 4 C. Likewise, the second fractional sedimentation is advantageously provided by means of ammonium sulphate (NH^^SO^) added in such a quantity that the mixture or enzyme extract being treated is brought to a final concentration of 70-75% in relation to met-nmgen at 4 C.

Dismutaseperoksydene som er tilveiebrakt med utgangspunktThe dismutase peroxides provided with starting point

i forskjellige marine bakteriestammer ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er alle dismutaseperoksyder som inneholder ikke-hematitisk jern,mens de enzymer som har en dismutaseperok-sydaktivitet som man har beskrevet i det foregående og som er retrokuprein og enzymekstraktet fra Escherichia coli,inneholder divalente kationer som henholdsvis er kobber eller sink for den førstnevnte og mangan for den andre. in various marine bacterial strains according to the method according to the invention, all dismutase peroxides contain non-haematitic iron, while the enzymes which have a dismutase peroxide activity as described above and which are retrocuprein and the enzyme extract from Escherichia coli, contain divalent cations which respectively are copper or zinc for the former and manganese for the latter.

Undersøkelse etter nærvær av et metall i dismutaseperoksyd-enét- kan utføres ved en analyse ved hjelp av en atomabsorbsjons-spektrograf. Examination for the presence of a metal in dismutase peroxide-one can be carried out by an analysis using an atomic absorption spectrograph.

Man kan likeledes utføre en kolorimetrisk prøve som i det foreliggende tilfelle består i å fargelegge en gel for elektroforese av et enzympreparat ved hjelp av et fargestoff som rea-gerer spesifikt overfor toverdig jern Fe^+, nemlig batofenantrolin, eventuelt i nærvær av et reduserende middel som hydrazin. I denne prøven deler man gelen i to i lengderetningen og plaserer den ene av de to delene i koomassiblått og den andre delen i batofenantrolin. Prøven er positiv hvis man får en rosaa ring i det siste tilfelle på nivå med proteinbåndet. Det er kjent at nærvær av en slik rosa ring kan betraktes som en indikasjon på nærvær av toverdig jern, i dette tilfelle i dismutaseperoksyd-proteinet. One can also carry out a colorimetric test, which in the present case consists of coloring a gel for electrophoresis of an enzyme preparation using a dye that reacts specifically to divalent iron Fe^+, namely bathophenanthroline, possibly in the presence of a reducing agent such as hydrazine. In this test, the gel is split in half lengthwise and one of the two parts is placed in coomassie blue and the other part in bathophenanthroline. The test is positive if you get a pink ring in the latter case at the level of the protein band. It is known that the presence of such a pink ring can be considered as an indication of the presence of divalent iron, in this case in the dismutase peroxide protein.

Man kan også anvende radioaktivt jern for å merke proteinet og derved bestemme støkiometrien med hensyn på det divalente metallkation som er tilstede. One can also use radioactive iron to label the protein and thereby determine the stoichiometry with respect to the divalent metal cation present.

Den foreliggende oppfinnelse har likeledes til formål å frembringe et dismutaseperoksydekstrakt fra marine bakterie-kulturerkarakterisert vedat de omfatter ikke-hematitisk jern, har en molekylvekt på 40.000 + 2.500 og en pH ved det isoelektriske punkt på 4-7 og viser et maksimum av enzymatisk aktivitet ved en pH mellom 8,5 og 10 og med et optumum på pH 9,5. The present invention also aims to produce a dismutase peroxide extract from marine bacterial cultures characterized by the fact that they comprise non-haematitic iron, have a molecular weight of 40,000 + 2,500 and a pH at the isoelectric point of 4-7 and show a maximum of enzymatic activity at a pH between 8.5 and 10 and with an optimum of pH 9.5.

Man kan opprettholde enzymet aktivt over lange tidsperioder og bevare det i en oppløsning på mellom 70 og 80% av nøytralt ammoniumsulfat (NH.J-SO. ved 4°C. One can maintain the enzyme active over long periods of time and preserve it in a solution of between 70 and 80% of neutral ammonium sulphate (NH.J-SO. at 4°C.

4 2 4 4 2 4

For å måle aktiviteten av dismutaseperoksyd ifølge den foreliggende oppfinnelse, kan man vurdere undertrykkelsen, inhiber-ingen, av de sistnevnte på kjemo-luminiscensreaksjonen som er frembrakt av enzymsystemet oksygen-hypoxantin-xantin-oksy-dase-luminol som man allerede har vist. Dette enzymsystemet frembringer en frigjørelse av ioner 0^, som gir en kjemoluminiscens-reaksjon med luminol. Tilsats av dismutaseperoksyd til dette systemet forandrer effekten av ionene Q^'°99ir derfor en minsk-ning av intensiteten på lyset som frembringes av denne reaksjonen . In order to measure the activity of dismutase peroxide according to the present invention, one can assess the suppression, the inhibition, of the latter on the chemiluminescence reaction produced by the enzyme system oxygen-hypoxanthine-xanthine-oxidase-luminol which has already been shown. This enzyme system produces a release of ions O^, which produces a chemiluminescence reaction with luminol. Addition of dismutase peroxide to this system changes the effect of the ions Q^'°99 and therefore reduces the intensity of the light produced by this reaction.

Dismutaseperoksyd katalyserer reaksjonenDismutase peroxide catalyzes the reaction

Hvis man som subtrat i denne reaksjonen anvender peroksyd frembrakt av enzymreaksjonen fra xanten-oksydase og xantin eller hypoxantin, viser det seg at det peroksyd som produseres er meget ustabilt og gir spontant fra seg lys. Dette lys er imid-lertid meget svakt og det kan ikke måles med en tilstrekkelig stor reproduserbarhet. If peroxide produced by the enzyme reaction from xanthine oxidase and xanthine or hypoxanthine is used as a substrate in this reaction, it turns out that the peroxide produced is very unstable and spontaneously emits light. However, this light is very weak and cannot be measured with a sufficiently high reproducibility.

Det er av denne grunn man i det analytiske opplegg anvender luminol eller 5-amino-2,3-dihyro-l,4-ftalazindion for å måle den mengden peroksydibner som er dannet. It is for this reason that luminol or 5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione is used in the analytical setup to measure the amount of peroxydibene that has been formed.

Luminol + 02- hv + oksydasjonsprodukt.Luminol + 02- hv + oxidation product.

Man må forøvrig likeledes korrigere for systemer som frembringer peroksydioner, det vil si kataLytiske systemer som kan frembringe oksydasjon av luminol og som består av ionene Fe 2+, Incidentally, one must likewise correct for systems that produce peroxide ions, i.e. catalytic systems that can produce oxidation of luminol and which consist of the ions Fe 2+,

2+ 2+ 2+ 2+

Ni eller Co i vandige oppløsninger med molekylært oksygenNi or Co in aqueous solutions with molecular oxygen

i nærvær av visse ligander.in the presence of certain ligands.

Dismutaseperoksyd medfører en reduksjon av ionemengdenDismutase peroxide causes a reduction in the amount of ions

§2~i systemet og følgelig en reduksjon lysproduksjonen.§2~in the system and consequently a reduction in light production.

Man har, følgende reaksjonsblanding: One has the following reaction mixture:

Man plaserer denne blandingen i et forsølvet kar under en fotomultiplikator. Man starter reaksjonen ved å innføre i be-holderen følgende substrat: 1 ml av en oppløsning som inneholder 0,3ymmol hypoxantin. This mixture is placed in a silver-plated vessel under a photomultiplier. The reaction is started by introducing the following substrate into the container: 1 ml of a solution containing 0.3 µmole of hypoxanthine.

Man får derved■frembrakt en emisjon av fotoner som gjennom fotomultiplikatoren gir opphav til en strøm hvis intensitet man måler på et picoamperemeter og registrerer. Hvis man innfører i reaksjonsblandingen 5^ul av dismutaseperoksyd etter et reaksjonen er satt igang, får man en undertrykkelse, inhibering, av denne lysutsendelsen. An emission of photons is thereby produced which, through the photomultiplier, gives rise to a current whose intensity is measured on a picoammeter and recorded. If you introduce 5 µl of dismutase peroxide into the reaction mixture after the reaction has started, you get a suppression, inhibition, of this light emission.

Man definerer nå vilkårlig enheten av dismutaseperoksydenzymet som den mengde av dette enzym som gir en inhibering på 50% i lysutsendelsen. One now arbitrarily defines the unit of the dismutase peroxide enzyme as the amount of this enzyme which gives an inhibition of 50% in the light emission.

Man legger merke til at man kan likeledes vurdere aktiviteten, av dismutaseperoksyd ifølge oppfinnelsen ved,å frembringe den samme inhibering i den samme reaksjon som er nevnt ovenfor direkte ved å innføre 1 ml av en.oppløsning med 0 2--ioner fremstilt ved elektrokjemisk reduksjon (J.M. Cord, I..Fridovitch, J.B.C., vol. 244, 25(1969), sidene 6049-6055), i 2 ml av en opp-løsning som inneholder 0,5^um°l luminol og 0,17 mmol fosfatbuffer med pH 7,8. It is noted that one can likewise assess the activity of dismutase peroxide according to the invention by producing the same inhibition in the same reaction mentioned above directly by introducing 1 ml of a solution with 0 2 ions produced by electrochemical reduction (J.M. Cord, I..Fridovitch, J.B.C., vol. 244, 25(1969), pages 6049-6055), in 2 ml of a solution containing 0.5 µm luminol and 0.17 mmol phosphate buffer with pH 7.8.

Man kan også vurdere aktiviteten av dismutaseperoksyd One can also assess the activity of dismutase peroxide

ifølge oppfinnelsen på følgende måte:according to the invention in the following way:

Man .innfører i det nevnte kar 0,3 ml glycin-NaOH lM-buffer, pH 9, 0,3 ml EDTA 10 - 3M som er nøytralisert, 1,1 ml flavinrmono--5 0.3 ml glycine-NaOH 1M buffer, pH 9, 0.3 ml EDTA 10 - 3M which has been neutralized, 1.1 ml flavin mono--5 are introduced into the aforementioned vessel

nukleotid 10 M-og 0,3 ml luminol (20 mg/70 ml). Man innfører 1 ml NaBH. 10 - 2M. Under disse betingelser får man et signal som nucleotide 10 M and 0.3 ml luminol (20 mg/70 ml). 1 ml of NaBH is introduced. 10 - 2M. Under these conditions, you get a signal that

settes til 10 — 7 - 10 — 8 A ved en spenning på 1500 volt. Man legger merke til at oppløsningen av NaBH^ bør være laget umiddelbart mens luminolen kan oppbevares i fravær av lys ved 0°C og bør tilsettes reaksjonsblandingen for seg. is set to 10 — 7 - 10 — 8 A at a voltage of 1500 volts. It is noted that the solution of NaBH^ should be made immediately while the luminol can be stored in the absence of light at 0°C and should be added to the reaction mixture separately.

Tilsats av dismutaseperoksyd til dette systemet frembringer en viss inhibering av lyssignalet og det sistnevnte varierer lineært med den mengde enzym som er tilstede i et forhold på 75% . Addition of dismutase peroxide to this system produces some inhibition of the light signal and the latter varies linearly with the amount of enzyme present in a ratio of 75%.

Ifølge en ytterligere variantL.kan man vurdere aktiviteten av dismutaseperoksyd ved anvendelse av en reaksjonsblanding som består av 0,3 'ral glycin-NaOH IM,-buffer, pH 9, 0,3 ml EDTA According to a further variant L., the activity of dismutase peroxide can be assessed using a reaction mixture consisting of 0.3% glycine-NaOH 1M buffer, pH 9, 0.3 ml EDTA

-3 -4 10 M, 1,1 ml vann og 0,3 ml luminol 10 M. Man tilsetter til denne blandingen 5^ul xantin-oksydase (1 kg/ml) og en tilhør-ende mengde dismutaseperoksyd. Man tilfører 1 ml hypoxantin (0,3 ml hypoxantin-10 _ 3M, fortynnet i siste øyeblikk med vann til 10 ml). Luminolen som kan oppbevares i fravær av lys og ved 0°C må tilsettes for seg til reaksjonsblandingen. -3 -4 10 M, 1.1 ml water and 0.3 ml luminol 10 M. 5 µl xanthine oxidase (1 kg/ml) and a corresponding amount of dismutase peroxide are added to this mixture. 1 ml of hypoxanthine is added (0.3 ml of hypoxanthine-10 _ 3M, diluted at the last moment with water to 10 ml). The luminol which can be stored in the absence of light and at 0°C must be added separately to the reaction mixture.

Det signal som tilveiebringes for doseringen av temoin (uten disputaseperoksyd) er i nærheten av 10 A ved en spenning på 1500 volt og undertrykkelsen av lyssignalet: er lineært og proporsjonalt med mengden av dismutaseperoksyd til 50%. The signal provided for the dosage of temoin (without dismutase peroxide) is close to 10 A at a voltage of 1500 volts and the suppression of the light signal: is linear and proportional to the amount of dismutase peroxide to 50%.

Som tidligere er nevnt, kan under bestemte betingelser. metallionene Fe , Ni og Co gi opphav til peroksydradikaler, og patentkreveren har vendt seg mot problemet vedrørende oksydasjon av lipider, særlig i matvarer,og sammenliknet reaksjons-mekanismen med den mekanisme som er virksom når det dannes per--oksydioner i et system som inneholder de ovennevnte metallioner og en passende ligand. Man har da kunnet konstatere at.de antioksyderende midler som vanligvis anvendes i næringsmiddelindustrien, såsom pyrogallol som bryter kjeden i frie radikaler f.eks. propylgallat eller som.undertrykker produksjonen av fri-radikaler som EDTA og askorbinsyre, mot all forventning effektivt kan fremme visse oksydasjoner som dels er katalysert av enzymer dels av virkningen av metallioner i stedet for å virke som antioksyderende midler som man hadde forventet. As previously mentioned, it can under certain conditions. the metal ions Fe, Ni and Co give rise to peroxide radicals, and the patent applicant has turned to the problem regarding the oxidation of lipids, especially in foodstuffs, and compared the reaction mechanism with the mechanism that is active when peroxide ions are formed in a system containing the above metal ions and a suitable ligand. It has then been possible to establish that the antioxidants that are usually used in the food industry, such as pyrogallol, which breaks the chain of free radicals, e.g. propyl gallate or which suppresses the production of free radicals such as EDTA and ascorbic acid, contrary to all expectations, can effectively promote certain oxidations which are partly catalyzed by enzymes and partly by the action of metal ions instead of acting as antioxidants as expected.

Man har således fastslått at ved passende pH-betingelser, vil dismutaseperoksyd ifølge oppfinnelsen inhibere oksyderende systemer som inneholder. 0~.-ioner produsert elektrokjemisk, FMNH2/02, eller Fe 2+ , Ni 2+ eller Co 2+-ioner i vandige oppløs-ninger med molekylært oksygen i nærvær av passende ligander.Syv enheter av dismutaseperoksyd ekstrahert av Photobacterium leiognathi kan undertrykke 16,5% av lysutsendelsen,som skyldes virkningen av systemet Co 2 +/02/tetraglycin fra luminol ved 9,7 og ca. 40'% av virkningen av systemet Ni<2+>/02/cyanid på luminol ved pH 9. It has thus been established that under suitable pH conditions, dismutase peroxide according to the invention will inhibit oxidizing systems which contain. 0~ ions produced electrochemically, FMNH2/02, or Fe 2+ , Ni 2+ or Co 2+ ions in aqueous solutions with molecular oxygen in the presence of suitable ligands. Seven units of dismutase peroxide extracted by Photobacterium leiognathi can suppress 16.5% of the light emission, which is due to the effect of the system Co 2 +/O 2 /tetraglycine from luminol at 9.7 and approx. 40'% of the effect of the system Ni<2+>/O2/cyanide on luminol at pH 9.

Man har kunnet vise at dismutaseperoksyder effektivt be-skytter lipider og antioksyderende midler og andre konserverende midler som vanligvis anvendes i næringsmiddelindustrien, og meget sterkt undertrykket reaksjoner som skyldes produksjon av peroksydionet 02-. Man har spesielt kunnet fastslå at auto-oksydasjonen av umettede lipider som stammer fra Anchoveta under-trykkes meget sterkt av dismutaseperoksyder. I andre eksempler har man vist at dismutaseperoksyd utøver en beskyttende funksjon mot autooksydasjon i visse antioksyderende midler og særlig antioksyderende midler som anvendes for konservering av matvarer som f.eks. pyrogallol eller askorbinsyre. It has been possible to show that dismutase peroxides effectively protect lipids and antioxidants and other preservatives that are usually used in the food industry, and very strongly suppress reactions due to the production of the peroxide ion 02-. In particular, it has been established that the auto-oxidation of unsaturated lipids originating from Anchoveta is very strongly suppressed by dismutase peroxides. In other examples, it has been shown that dismutase peroxide exerts a protective function against autoxidation in certain antioxidants and in particular antioxidants used for the preservation of foodstuffs such as e.g. pyrogallol or ascorbic acid.

Oppfinnelsen er beskrevet i detalj i de: nedenstående eksempler som ikke er begrensende. The invention is described in detail in the following non-limiting examples.

Eksempel 1Example 1

Man dyrker bakterier av Photobacterium leiognathi stamme nr. ATCC 25.521 i et.kunstig muljø som inneholdt følgende komponenter i.gram pr. liter: Bacteria of Photobacterium leiognathi strain no. ATCC 25.521 are cultivated in an artificial lake which contained the following components in grams per liters:

Man innstilte miljøet på pH 7,2 ved hjelp av soda og steriliserte ved 110°C i 1 time. The environment was adjusted to pH 7.2 using soda and sterilized at 110°C for 1 hour.

Denne prekulturen på 1 liter får vokse over natten og fordeles på fire Erlenmeyer-kolber som hver inneholder 250 ml for å krystallisere et gjæringsmiljø på 12. liter. This 1-liter preculture is allowed to grow overnight and distributed among four Erlenmeyer flasks each containing 250 mL to crystallize a 12-liter fermentation medium.

Kulturen ble hensatt i 12 timer ved 20°C ved sterk gjennom-lufting og det ble tilveiebrakt 100 g bakterier, veiet som vått produkt. The culture was left for 12 hours at 20°C with strong through-aeration and 100 g of bacteria were obtained, weighed as wet product.

Man dispergerte 135 g av det våte bakterieprodukt av typen Photobacterium leiognathi som inneholder flere kulturer i .650 ml vann og lot dette stå ved 4°C over natten. Man tilsatte 2N ammoniakk for å justere pH området 7-8 og tilsatte deretter 18 ml KC1 3M. One dispersed 135 g of the wet bacterial product of the type Photobacterium leiognathi containing several cultures in .650 ml of water and left this to stand at 4°C overnight. 2N ammonia was added to adjust the pH range to 7-8 and then 18 ml of KC1 3M was added.

Man brakte blandingen opp til 58°C og holdt den på denne temperaturen i fire minutter hvoretter man avkjølte til 4°C og sentrifugerte i ti minutter med en hastighet på 10.000 omdreininger/min. Man holdt temperaturen på 4°C og justerte væskefasen til 35% metning med ammoniumsulfat til pH 8/man sentrifugerte påny og justerte væskefasen til 75% metning med ammoniumsulfat og lot det hele stå over natten ved 4°C. Man samlet opp det bunnfelte protein ved hjelp av sentrifugering og man oppbevarte det i en oppløsning av ammoniumsulfat ved 75%. The mixture was brought up to 58°C and held at this temperature for four minutes, after which it was cooled to 4°C and centrifuged for ten minutes at a speed of 10,000 revolutions/min. The temperature was kept at 4°C and the liquid phase was adjusted to 35% saturation with ammonium sulphate to pH 8/centrifuged again and the liquid phase was adjusted to 75% saturation with ammonium sulphate and the whole was left overnight at 4°C. The precipitated protein was collected by centrifugation and stored in a solution of ammonium sulphate at 75%.

Aktiviteten av en oppløsning av 9 mg protein pr.- ml (Biuret) er 40 enheter/mg, samtidig som den til sammenlikning har null enheter/mg av katalase i oppløsning ved 9 mg av protein/ml. The activity of a solution of 9 mg of protein per ml (Biuret) is 40 units/mg, while for comparison it has zero units/mg of catalase in solution at 9 mg of protein/ml.

Etter ytterligere en fraksjonert bunnfelling ved hjelp av ammoniumsulfat med en konsentrasjonsgradient mellom 35 og 75% After a further fractional sedimentation using ammonium sulphate with a concentration gradient between 35 and 75%

av metning tilveiebraktes en dismutaseperoksyd som i- en oppløs-ning av 14,8 mg protein/ml (Biuret) utviste en aktivitet på of saturation provided a dismutase peroxide which, in a solution of 14.8 mg protein/ml (Biuret), exhibited an activity of

134 enheter/mg til 500 enheter/mg.134 units/mg to 500 units/mg.

Man oppløste proteinbunnfallet i en fosfatbuffer med pHThe protein precipitate was dissolved in a phosphate buffer of pH

7,8 og dialyserte i 48 timer ved 4°C. Man oppbevarte dismutaseperoksydet ved -20°C. 7.8 and dialyzed for 48 hours at 4°C. The dismutase peroxide was stored at -20°C.

For å bestemme aktiviteten i enzymet anvendte man et kar som var plasert under en fotomultiplikator og som inneholdt følgende reaksjonsblanding: To determine the activity of the enzyme, a vessel was used which was placed under a photomultiplier and which contained the following reaction mixture:

Man satte.reaksjonen igang ved i karet i innføre 1 ml The reaction was started by introducing 1 ml into the vessel

-4 -4

hypoxantin 3x10 M.hypoxanthine 3x10 M.

En fotonstrøm ble utsendt og denne ga gjennom foto multi-plikatoren opphav til en strøm som kan måles på et picoamperemeter og man kan likeledes registrere variasjoner i denne intensiteten . A photon current was emitted and this gave rise, through the photo multiplier, to a current that can be measured on a picoammeter and you can also register variations in this intensity.

Ved å innføre 5 ^ul av en oppløsning av dismutaseperoksyd som er fremstilg som beskrevet ovenfor i reaksjonsblandingen etterat reaksjonen var kommet igang, fikk man en undertrykkelse av lysutsendelsen og man har tilfeldig fastlagt at 1 enhet dis-mutaseperoksydenzym er den enzymmengden som frembringer en undertrykkelse på 50% i lysutsendelsen. By introducing 5 µl of a solution of dismutase peroxide prepared as described above into the reaction mixture after the reaction had started, a suppression of the light emission was obtained and it has been randomly determined that 1 unit of dismutase peroxide enzyme is the amount of enzyme which produces a suppression of 50% in the light output.

Ved UV-spektroskopi (ultrafiolett spekt.røskopi);; gir^dismutaseperoksydekstraktet.et klassisk spektrum for ikke-hemato-logiske proteiner med en tryptofantopp ved 290 m^u. By UV spectroscopy (ultraviolet spect.roscopy);; The dismutase peroxide extract gives a classical spectrum for non-hematological proteins with a tryptophan peak at 290 m^u.

For å bestemme molekylvekten anvender man to kjente tek-nikker hvorav den første består i å bestemme en sentrifugerings-gradient i sakkarose og den andre benytter en "Sephadex G 200" - gel.. To determine the molecular weight, two known techniques are used, the first of which consists in determining a centrifugation gradient in sucrose and the second uses a "Sephadex G 200" - gel.

Man kan anvende de følgende markører hvor man kjenner molekylvekten (MV): The following markers can be used where the molecular weight (MV) is known:

Man har bestemt molekylvekten til 40.000 + 2.500. The molecular weight has been determined to be 40,000 + 2,500.

For å bestemme molekylvekten iiproteinstrukturen i enzymet har man gjennomført en elektroforese av en gel av polyakrylåmid tilsatt NDS.(natriumdodecylsulfat) til 10%. In order to determine the molecular weight in the protein structure of the enzyme, an electrophoresis of a polyacrylamide gel with 10% NDS (sodium dodecyl sulfate) has been carried out.

Man har kunnet fastlegge en type under-enhet med molekylvekt på ca. 21.000. Man kan derfor bestemme molekylvekten til dismutaseperoksyd til 21.000 x 2, det vil si 42.000. It has been possible to determine a type of sub-unit with a molecular weight of approx. 21,000. One can therefore determine the molecular weight of dismutase peroxide as 21,000 x 2, that is 42,000.

I denne polyakrylamidgelen har man funnet et rødt bånd i nærvær av batofenantrolin og hydrazin på nøyaktig.det samme nivå som peroksyddimutasebåndet frembrakt av koomassiblått. In this polyacrylamide gel, a red band has been found in the presence of bathophenanthroline and hydrazine at exactly the same level as the peroxide dimutase band produced by coomassie blue.

Man har foretatt en kolorimetrisk prøve med en oppløsning av proteinet og funnet en jernverdi som på grunnlag av en molekylvekt på enzymet på 4 2.000 gir ca. 2 jernatomer. pr.mol. A colorimetric test was carried out with a solution of the protein and an iron value was found which, on the basis of a molecular weight of the enzyme of 4 2,000, gives approx. 2 iron atoms. per mole

Absorbsjonsspektrometri. av en proteinoppløsning på 0,2 mg/ ml bekrefter dette tallet. Absorption spectrometry. of a protein solution of 0.2 mg/ml confirms this figure.

Man har derfor god grunn til å anslå 2 som antall jernatomer, pr. mol dimutaseperoksyd . There is therefore good reason to estimate 2 as the number of iron atoms, per moles of dimutase peroxide.

Enzymekstraktet ifølge dette eksempel viser ikke noe særlig aktivitetstap etter 5 minutter ved en temperatur på 70°C. The enzyme extract according to this example does not show any particular loss of activity after 5 minutes at a temperature of 70°C.

Elektrofokalisering av dismutaseperoksydet gir en pH påElectrofocalization of the dismutase peroxide gives a pH of

4,4 som det isolektriske punkt for dette enzym.4.4 as the isoelectric point for this enzyme.

Enzymet gir maksimum aktivitet ved en pH på ca. 9,5.The enzyme gives maximum activity at a pH of approx. 9.5.

Man har tilveiebrakt et identisk enzym med tilsvarende egenskaper med utgangspunkt i en bakteriestamme av Photoacterium leiognathi nr. ATGC 25.587. An identical enzyme with similar properties has been obtained from a bacterial strain of Photoacterium leiognathi No. ATGC 25.587.

Eksempel 2Example 2

Man underkastet en bakteriekultur av Photobacterium sepiaOne submitted to a bacterial culture of Photobacterium sepia

av stammen nr. ATCC 15.709 en behandling og omrøring i kalt vann til man, fikk 1 g bakterier beregnet.på grunnlag av våt vekt/4 ml vann. Man sentrifugerte denne ved 16.000 omdreininger/min. i 20 min. ved 4°C. Man tilsatte den gule klare væsken KC1 3M til man fikk en endelig konsentrasjon på 0,1 M. of the strain No. ATCC 15.709 a treatment and stirring in cold water until 1 g of bacteria was calculated. on the basis of wet weight/4 ml of water. This was centrifuged at 16,000 revolutions/min. for 20 min. at 4°C. The yellow clear liquid KC1 3M was added until a final concentration of 0.1 M was obtained.

Man varmet opp oppløsningen i 3-4 min. på et vannbad ved 60°C. Man avkjølte deretter til 4°C og sentrifugerte. The solution was heated for 3-4 min. in a water bath at 60°C. It was then cooled to 4°C and centrifuged.

Man underkastet filtratet en fraksjonert bunnfelling ved tilsats av fast ammoniumsulfat. Den aktive fraksjon ble bunnfelt mellom 45-75% av metning av ammoniumsulfat og man skilte ved hjelp av sentrifugering. Man oppløste den aktive fraksjon i et minimalt volum K2HP0^5 x 10 - 3M ved pH 7,8 og dialyserte i en natt. mot den samme fosfatbuffer. Produktet av denne dialysen førtes The filtrate was subjected to fractional sedimentation by addition of solid ammonium sulphate. The active fraction was settled between 45-75% of saturation with ammonium sulphate and separated by centrifugation. The active fraction was dissolved in a minimal volume of K 2 HPO 5 x 10 - 3 M at pH 7.8 and dialyzed overnight. against the same phosphate buffer. The product of this dialysis was passed

Q Q

deretter over i en kolonne med "Sephadex. 100"-gel eller "Gthen into a column with "Sephadex. 100" gel or "G

200" som var brakt i likevekt med fosfatbuffer 5 x 10 — 3M og pH 7,8. Den aktive fraksjon ble konsentrert, eluert ved hjelp av en ultrasentrifugeringsmembran av typen "Diaflo PM-10" og frak-sjonen ble deretter dialysert i løpet av en natt mot K2HPC>4200" which had been brought into equilibrium with phosphate buffer 5 x 10 - 3M and pH 7.8. The active fraction was concentrated, eluted by means of an ultracentrifugation membrane of the type "Diaflo PM-10" and the fraction was then dialyzed during one night against K2HPC>4

5 x 10~<3>M ved pH 7,8.5 x 10~<3>M at pH 7.8.

Dismutaseperoksydenzymet ble tilsatt til en kolonne med. DEAS "Sephadec A-50" med en buffer av K2HP04 5 x 10~<3>M og pH 7,8. Proteinet i kolonnen ble eluert med en lineær gradient av The dismutase peroxide enzyme was added to a column with. DEAS "Sephadec A-50" with a buffer of K2HP04 5 x 10~<3>M and pH 7.8. The protein in the column was eluted with a linear gradient of

-3 -1 -3 -1

K2HP04, pH 7,8 ( 5 x 10 M til 3 x 10 M). Dismutaseperoksydet ble eluert-med en konsentrasjon av fosfatet på 1,4 x 10 og ble deretter,konsentrert. En ytterligere filtrering under de samme betingelser som nevnt i det foregående ble foretatt på en kolonne med DEAE"Sephadex A-50". Enzymet ble eluert.ved en konsentrasjon på fosfatet på 1,6 x 10 og deretter konsentrert. K 2 HPO 4 , pH 7.8 (5 x 10 M to 3 x 10 M). The dismutase peroxide was eluted with a phosphate concentration of 1.4 x 10 and then concentrated. A further filtration under the same conditions as mentioned above was carried out on a column of DEAE "Sephadex A-50". The enzyme was eluted at a phosphate concentration of 1.6 x 10 and then concentrated.

Det protein som var ekstrahert på denne måten og rensetThe protein thus extracted and purified

av et .eget bånd ved elektroforese på akrylmidgel (100^,ug av protein- i gelen)".') of a separate band by electrophoresis on an acrylic medium gel (100 µg of protein in the gel)".')

Man fikk 3 mg dismutaseperoksyd med utgangspunkt i 20 g frosne-Photobactorium sepia-celler (med en aktivitet på dismutase- 3 mg of dismutase peroxide was obtained from 20 g of frozen Photobactorium sepia cells (with an activity on dismutase

peroksydet på 250-5000 enheter/mg).the peroxide of 250-5000 units/mg).

Enzymaktiviteten ble opprettholdt over en lengre periode under oppbevaring i en oppløsning på 70-80% av (NH^^SO^ ved 4°C. Enzyme activity was maintained over a longer period of time during storage in a 70-80% solution of (NH^^SO^ at 4°C.

Molekylvekten til,det rensede enzym ble bestemt ved hjelp av ultrasentrifugering ved 45.000 omdreininger i minuttet i 16 timer ved. 4°C. Sedimentasjonshastigheten ble målt ved hjelp av Marin og Ames' metode med en lineær gradient i skurose på 5-20 (i vekt/volum) under anvendelse av et Beckman Spinco-apparat modell "L2-65B" med. en rotor SW 65 K. Man^ finner en sedimenta-■ sjonskoeffisient på. 3,2 i denne dismutasen sammenliknet med koeffisienter på henholdsvis 4,82 og 7,4 for alkoholdeshydrogen-ase fra hestelever og gjær. Med utgangspunkt i denne sedimenta-sjonskoeffisienten har man beregnet molekylvekten for dismutaseperoksydekstraktet til,å være ca. 42.500. The molecular weight of the purified enzyme was determined by ultracentrifugation at 45,000 revolutions per minute for 16 hours at 4°C. The sedimentation rate was measured by the Marin and Ames method with a linear gradient in sucrose of 5-20 (w/v) using a Beckman Spinco apparatus model "L2-65B" with. a rotor SW 65 K. Man^ finds a sedimentation coefficient on. 3.2 in this dismutase compared with coefficients of 4.82 and 7.4 respectively for alcohol dehydrogenase from horse liver and yeast. Based on this sedimentation coefficient, the molecular weight for the dismutase peroxide extract has been calculated to be approx. 42,500.

Man har likeledes fastslått at dette proteinmolekylet inneholder 2 jernatomer. It has also been established that this protein molecule contains 2 iron atoms.

Elektroforese av akrylamidgeler har gitt et bånd for dismutasen som tilsvarer molekylvekter på fra 20.000-20.500, noe som viser at proteinmolekylet består av to identiske under-enheter . Electrophoresis of acrylamide gels has given a band for the dismutase corresponding to molecular weights of 20,000-20,500, which shows that the protein molecule consists of two identical subunits.

Dismutaseperoksyd har vist seg å være meget motstands-dyktig overfor den proteolytiske virkning av trypsin, og man kan behandle 150 ,ug av dismutaseperoksyd.i 60 min. med 10 /Ug trypsin ved 20 oC uten at man får noen forandring i den enzymat. tiske aktivitet og uten at den elektroforetiske.mobilitet i proteinet er ikke-dissosiert. Dismutase peroxide has been shown to be very resistant to the proteolytic action of trypsin, and 150 µg of dismutase peroxide can be treated in 60 minutes. with 10 µg trypsin at 20 oC without any change in the enzyme. tical activity and without the electrophoretic.mobility in the protein being non-dissociated.

Det tilveiebrakte enzym er meget stabilt overfor forand-ringer i varme: man kan ikke merke noe tap i enzymatisk aktivitet etter 30 min. ved 20°C, 30°C eller 40°C, etter 15 min. ved 50°C•får man en reduksjon i aktiviteten på 28%, etter 30 min. ved 50°C er aktivitetstapet omtrent 50% og det er bare henholdsvis 10 og 50% etter 3 min. og 10 min. ved 60°C. The provided enzyme is very stable to changes in heat: no loss in enzymatic activity can be noticed after 30 min. at 20°C, 30°C or 40°C, after 15 min. at 50°C•you get a reduction in activity of 28%, after 30 min. at 50°C the loss of activity is approximately 50% and it is only 10 and 50% respectively after 3 min. and 10 min. at 60°C.

Elektrofokalisering av dismutaseperoksydet gir en pH-verdi på 4,1 som det isoelektriske punkt for dette enzym. Electrofocalization of the dismutase peroxide gives a pH value of 4.1 as the isoelectric point for this enzyme.

Ved hjelp av en oppløsning av 02'. -ioner fremstilt på elektrolytisk måte har man bestemt at enzymaktiviteten utviser et maksimum ved pH mellom 8,5 og 10, med et optimum på pH 9,5. Using a resolution of 02'. -ions produced electrolytically, it has been determined that the enzyme activity exhibits a maximum at pH between 8.5 and 10, with an optimum at pH 9.5.

Eksempel 3Example 3

Man behandler en stamme nr. ATCC 11.040 av bakteriene Photobacterium phosphoreum som er marine bakterier og som følgelig har en sterk konsentrasjon av salt. One processes a strain No. ATCC 11,040 of the bacteria Photobacterium phosphoreum, which are marine bacteria and which consequently have a strong concentration of salt.

Bakerieveksten er spontan i en oppløsning av EDTA påThe bakery growth is spontaneous in a solution of EDTA at

10~3M ved pH 7,8.10~3M at pH 7.8.

Man fjernet cellerestene ved hjelp av sentrifugering med 16.000 omdreininger/min. i 20 min. ved 0°C. Cell debris was removed by centrifugation at 16,000 revolutions/min. for 20 min. at 0°C.

Foreløbige studier har vist at dismutaseperoksydenzymetPreliminary studies have shown that the dismutase peroxide enzyme

er stabilt ved 50°C og man kan således fjerne de andre proteinene som er termolabile ved å holde bakteriekulturen ved 50°C i 3 min. etter en tilsats av KC1 på 0,1 molar, hvoretter de dena-turerte proteiner fjernes ved vanlig sentrifugering. is stable at 50°C and you can thus remove the other proteins that are thermolabile by keeping the bacterial culture at 50°C for 3 min. after an addition of 0.1 molar KC1, after which the denatured proteins are removed by normal centrifugation.

Man opererte deretter ved 4°C. Ved denne temperaturen frem-brakte man en fraksjonert bunnfelling ved hjelp av ammonium-sulf at (NH4)2S04 tilsatt i en slik mengde at blandingen eller enzymekstraktet som ble behandlet ble holdt på en kons.entrasjons-gradient fra 0-30% av metningen ved 4°C. Den bunnfelte frak-sjonen fjernes ved sentrifugering i 45 min. med 16.000 omdreininger/min. og 0°C. The operation was then carried out at 4°C. At this temperature, a fractionated sedimentation was produced by means of ammonium sulphate (NH4)2S04 added in such an amount that the mixture or enzyme extract being treated was maintained on a concentration gradient from 0-30% of saturation at 4°C. The settled fraction is removed by centrifugation for 45 min. with 16,000 revolutions/min. and 0°C.

Den frasentrifugerte væske tilsettes den. nødvendige mengde nøytralt ammoniumsulfat for å holde den på 75% av metning ved 4°C. The centrifuged liquid is added to it. necessary amount of neutral ammonium sulfate to keep it at 75% of saturation at 4°C.

De to bunnfellingsfraksjonene sammenføres ved hjelp avThe two settling fractions are brought together by means of

en sentrifugering.a centrifugation.

For å rense dismutaseperoksydet oppløses bunnfallet iTo purify the dismutase peroxide, the precipitate is dissolved in

-3 -3

en liten mengde fosfatbuffer 5 x 10 M ved pH 7,8 og dialyseres mot den samme buffer i 48 timer ved 4°C for å tilveiebringe et ekstrakt (A). a small amount of phosphate buffer 5 x 10 M at pH 7.8 and dialyzed against the same buffer for 48 hours at 4°C to provide an extract (A).

Proteinene skilles deretter etter størrelsen på molekylene ved hjelp av en "Sephadex G 100"-gel hvor kornstørrelsesfor-delingen er slik at proteiner med en molekylvekt over 100.000 utelukkes og. derfor forsvinner meget raskt mot overflaten i-gelen. Molekyler som har mindre molekylvekter trenger inn i gelen.og kan elueres.mer eller mindre langsomt etter sin størrel-se . The proteins are then separated according to the size of the molecules using a "Sephadex G 100" gel where the grain size distribution is such that proteins with a molecular weight over 100,000 are excluded and. therefore the i-gel disappears very quickly towards the surface. Molecules with smaller molecular weights penetrate the gel and can be eluted more or less slowly depending on their size.

For å gjøre dette tillates Sephadex-harpiksen. å svelle i vann i 3 timer, den avgasses og filtreres i en Buchnertrakt for å fjerne vannet, hvoretter den plaseres i en filtreringsbuffer og føres, gjennom en kolonne som er 50 cm lang og med 3 cm indre diameter. Kolonnen er brakt i likevekt ved gjennomføring av 2 liter buffer. To do this, the Sephadex resin is allowed. to swell in water for 3 hours, it is degassed and filtered in a Buchner funnel to remove the water, after which it is placed in a filtration buffer and passed through a column 50 cm long and of 3 cm internal diameter. The column is brought to equilibrium by passing 2 liters of buffer.

Man tok først enzymekstraktet (A) som ble tilveiebrakt ved dialyse for å konsentrere dette i en "Diaflo"-membran ved kvelstofftrykk til et volum på 5 ml. Dette konsentratet ble innført på en kolonne som var behandlet som angitt ovenfor og -3 man eluerte ved gjennomføring av 500 ml fosfatbuffer 5 x 10 M ved pH 7,8. Utbyttet er en dråpe hvert åttende sekund og man. samlet i fraksjoner på 2,5 ml og de fraksjoner som har en mål-bar aktivitet forenes og konsentreres i Diaflo-membraner. Man tilveiebringer på denne måten et konsentrert ekstrakt (B). The enzyme extract (A) obtained by dialysis was first taken to concentrate this in a "Diaflo" membrane under nitrogen pressure to a volume of 5 ml. This concentrate was introduced onto a column which had been treated as stated above and -3 was eluted by running through 500 ml of phosphate buffer 5 x 10 M at pH 7.8. The yield is one drop every eight seconds and mon. collected in fractions of 2.5 ml and the fractions that have a measurable activity are combined and concentrated in Diaflo membranes. A concentrated extract (B) is provided in this way.

Man gjennomfører ytterligere et rensetrinn ved kromatografi ved hjelp av en ionebytter basert på DEAE Sephadex hvor proteinene elueres ifølge sin ladning ved hjelp av buffere med økende ionestyrke. A further purification step is carried out by chromatography using an ion exchanger based on DEAE Sephadex where the proteins are eluted according to their charge using buffers with increasing ionic strength.

For å fremstille denne kolonnen må kolonnematerialet ligge i vann, hvoretter det avgasses og vaskes med de følgende opp-løsninger : To prepare this column, the column material must lie in water, after which it is degassed and washed with the following solutions:

og kolonnematerialet skylles i destillert vann mellom hver etappe til pH er nøytral. Etter filtrering i en Buchnertrakt plaseres ionebyttematerialet i suspensjon i en fosfatbuffer 0,IM pH 7,8, hvoretter det plaseres i en kolonne som er 30 cm lang og har en 3 cm indre diameter. Kolonnen bringes i likevekt ved å passere 300 ml buffer 0,1 M. and the column material is rinsed in distilled water between each stage until the pH is neutral. After filtration in a Buchner funnel, the ion exchange material is placed in suspension in a phosphate buffer 0.1M pH 7.8, after which it is placed in a column that is 30 cm long and has a 3 cm inner diameter. The column is brought to equilibrium by passing 300 ml of buffer 0.1 M.

Det konsentrerte ekstrakt (B) plaseres på kolonnen. Når ekstraktet er fullstendig absorbert, elueres med 500 ml fosfatbuffer med pH 7,8 som består av 250 ml fosfatbuffer 0,IM.hvor man progressivt har tilsatt 250 ml fosfatbuffer 0,5 M. Utbyttet er en dråpe hvert femte sekund og volumet på de forskjellige fraksjoner 2,5 ml. De aktive fraksjoner slås sammen og bunnfel-les ved hjelp av ammoniumsulfat hvoretter.de oppbevares i denne form ved -18 .til -20°C. The concentrated extract (B) is placed on the column. When the extract has been completely absorbed, elute with 500 ml of phosphate buffer with pH 7.8, which consists of 250 ml of phosphate buffer 0.1M, to which 250 ml of phosphate buffer 0.5 M have been progressively added. The yield is one drop every five seconds and the volume of the different fractions 2.5 ml. The active fractions are combined and precipitated using ammonium sulphate, after which they are stored in this form at -18 to -20°C.

Renheten på dismutaseperoksydenzymet kan kontrolleres ved The purity of the dismutase peroxide enzyme can be checked by

elektroforese på polyakrylamidgel.electrophoresis on polyacrylamide gel.

En bestemmelse av molekylvekten av enzymet ved hjelp av en elueringsstudie som en filtrering ved "Séphadex G 200" til-later ved hjelp av likningen log(MV) = f(elueringsvolum) og kjente markører, gir dismutaseperoksydekstraktet en molekylvekt på ca. 40 .000 . A determination of the molecular weight of the enzyme by means of an elution study which a filtration with "Séphadex G 200" allows by means of the equation log(MV) = f(elution volume) and known markers, gives the dismutase peroxide extract a molecular weight of approx. 40,000.

Man har likeledes bestemt molekylvekten ved sentrifugering i en sukrosegradient: Man har latt gradienter med sukrose fra 5-20% synkee ned i fosfatbuffer 5 x 10<o3>M ved pH 7,8 med grad-vis tilblanding av 2,60 ml av 20% oppløsningen til 225 ml av 5% oppløsningen i en passende innretning. The molecular weight has also been determined by centrifugation in a sucrose gradient: Gradients with sucrose from 5-20% have been allowed to sink into phosphate buffer 5 x 10<o3>M at pH 7.8 with the gradual addition of 2.60 ml of 20 % solution to 225 ml of the 5% solution in a suitable device.

Til disse sukrosegradientene ble tilsatt forskjellige proteinmarkører med kjente molekylvekter og dismutaseperoksyd. Man har tilveiebrakt likevekt ved- en sentrifugering.med 45.000 omdr./min. ved 5°C i 22 timer. Man har deretter gjennomhullet rørene i bunnen og samlet opp fraksjoner på 10 dråper hvor man, har målt den enzymatiske aktivitet i de forskjellige anvendte markører. Etter å ha tegnet opp variasjonen i molekylvektene som en funksjon av nummeret på elueringsfraksjonen, er molekylvekten på dismutaseperoksyd fra Photobacterium, phosphoreium bestemt til ca. 40.000, noe som bekrefter de tidligere tilveiebrakte resultater. Different protein markers with known molecular weights and dismutase peroxide were added to these sucrose gradients. Equilibrium has been achieved by centrifugation at 45,000 rpm. at 5°C for 22 hours. The tubes were then pierced at the bottom and fractions of 10 drops were collected, where the enzymatic activity of the various markers used was measured. After plotting the variation in molecular weights as a function of elution fraction number, the molecular weight of dismutase peroxide from Photobacterium, phosphoreium is determined to be approx. 40,000, which confirms the previously provided results.

For.å bestemme molekylvekten til underenhetene i proteinet har man underkastet dette sammen med markører hvor molekylvektene til underenhetene er kjent til en elektroforese på et polyakrylamidgel i nærvær av natriumdodecylsulfat. Dette gjør det mulig å bestemme verdien på molekylvekten til hver under-enhet til 20.000. In order to determine the molecular weight of the subunits in the protein, this has been subjected to electrophoresis on a polyacrylamide gel in the presence of sodium dodecyl sulfate, together with markers where the molecular weights of the subunits are known. This makes it possible to determine the value of the molecular weight of each subunit to 20,000.

Man fikk bekreftet at dismutaseperoksyd er meget stabilt til 50°C og utviser en maksimal enzymatisk aktivitet ved en. It was confirmed that dismutase peroxide is very stable at 50°C and exhibits a maximum enzymatic activity at a.

pH på ca. 9,5.pH of approx. 9.5.

En elektrofokalisering av dismutaseperoksyd viser at en pH på 4,2 tilsvarer det isoelektriske punkt for-dette enzym. An electrofocalization of dismutase peroxide shows that a pH of 4.2 corresponds to the isoelectric point for this enzyme.

En kolorimetrisk test som beskrevet i det foregående gjør. det mulig å bestemme nærværet av toverdig jern i proteinet hvor en rosa ring i proteinbåndet i en elektroforetisk gel som tidligere er tilsatt batofenantrolin kommer tilsyne. Antallet jernatomer pr. molekyl viser seg å være lik 2. A colorimetric test as described above does. it is possible to determine the presence of divalent iron in the protein where a pink ring in the protein band in an electrophoretic gel previously added to bathophenanthroline appears. The number of iron atoms per molecule turns out to be equal to 2.

Man har bestemt undertrykkelsen av autooksydasjon i enkelte produkter på grunn av dismutaseperoksyd (DPO): The suppression of autoxidation in some products due to dismutase peroxide (DPO) has been determined:

Eksempel 4Example 4

-3 -3

Man fremstilte en oppløsning av pyrogallol 2,5 x 10 MA solution of pyrogallol 2.5 x 10 M was prepared

i en fosfatbuffer. K2HP04 2,0 x 10~2M ved pH 7,7. Denne oppløs- in a phosphate buffer. K2HP04 2.0 x 10~2M at pH 7.7. This dissolve-

ni/ng (Al: hadde et volum på 3 ml.ni/ng (Al: had a volume of 3 ml.

Man, målte økningen av den optiske tetthet (OT) ved 440-m^u pr. minutt ved forskjellige systemer og man har fått følgende prosentvise undertrykkelse (inhibering) ved hvert av de følgende systemer: Man, measured the increase of the optical density (OT) at 440-m^u per minute with different systems and the following percentage suppression (inhibition) has been obtained with each of the following systems:

Man ser således at dismutaseperoksyd har en usedvanlig inhiberende effekt på autooksydasjon av pyrogallol. It is thus seen that dismutase peroxide has an exceptionally inhibitory effect on the autoxidation of pyrogallol.

Eksempel 5Example 5

Man går frem på samme måte som i eksempel 4, med den forskjell at pyrogallol er i oppløsning i en fosfatbuffer med følgende styrke 5,0 x 10 M, 2 x 10 M og 1<0>M. De tilveiebrakte oppløsninger kalles (B), (C) og (D). One proceeds in the same way as in example 4, with the difference that pyrogallol is in solution in a phosphate buffer with the following strength 5.0 x 10 M, 2 x 10 M and 1<0>M. The solutions provided are called (B), (C) and (D).

Man får følgende resultater:The following results are obtained:

Eksempel 6 Example 6

-4 -4

Man fremstiller oppløsninger av pyrogallol 10 M i fosfat-buffere av K2HP045 x 10~2M og 2 x 10~2 med pH 7,7, mettet med molekylært oksygen. Disse oppløsningene (E) og (F) har et volum på 2,5 ml. Man måer økningen av den optiske tetthet ved 44 0 m^u/ min. og beregner den prosentvise inhibering: Solutions of pyrogallol 10 M are prepared in phosphate buffers of K2HP045 x 10~2M and 2 x 10~2 with pH 7.7, saturated with molecular oxygen. These solutions (E) and (F) have a volume of 2.5 ml. One has to increase the optical density at 44 0 m^u/min. and calculates the percentage inhibition:

Man legger merke til at 1 enhet enzym i 2,5 ml tilsvarer en enzymkonsentrasjon pa 2 x 10 -9M. One notices that 1 unit of enzyme in 2.5 ml corresponds to an enzyme concentration of 2 x 10 -9M.

Eksempel 7Example 7

-4 Man fremstilte en oppløsning av askorbinsyre 10 M i en fosfatbuffer 2 x 10~<2>M med pH 7,7. -4 A solution of ascorbic acid 10 M was prepared in a phosphate buffer 2 x 10~<2>M with pH 7.7.

Man målte variasjonen i den optiske tetthet (OT) ved 265 rryu pr. min. i hvert av de følgende systemer: The variation in the optical density (OT) was measured at 265 rryu per my. in each of the following systems:

Eksempel 8 Example 8

Man gikk frem som i eksempel 7 med den forskjell at askor--4 -2 binsyren 10 M er i oppløsning i en fosfatbuffer 5 x 10 M med pH 8,8. The procedure was the same as in example 7, with the difference that the ascorbic acid 4-2 butic acid 10 M is in solution in a phosphate buffer 5 x 10 M with pH 8.8.

Eksempel 9 Example 9

Man bestemte-virkningen av dismutaseperoksyd på oksydasjon av luminol katalysert av metallioner på følgende måte: The effect of dismutase peroxide on oxidation of luminol catalyzed by metal ions was determined in the following way:

Eksempel 10 Example 10

Man fremstilte en suspensjon på 10 vektprosent av Anchoveta-lipid i en fosfatbuffer 0,1 M ved pH 8. A suspension of 10% by weight of Anchoveta lipid in a phosphate buffer 0.1 M at pH 8 was prepared.

Man tilsatte dismutaseperoksyd fra Photobacterium leiognathi, urenset, i. forholdt 0,01 vektprosent av enzym i forhold til lipid (dvs. 0,1 mg enzym pr. gram lipid). Dismutase peroxide from Photobacterium leiognathi, purified, was added in a ratio of 0.01 weight percent of enzyme in relation to lipid (i.e. 0.1 mg of enzyme per gram of lipid).

I et Warburg-apparat ble forbruket av oksygen i systemet målt og i hvert tilfelle sammenliknet med den verdi man fikk i en lipidprøve med samme sammensetning, men uten dismutaseperoksyd. Man gjennomført målingene i økende tidsintervall og resultatene er uttrykt i form av prosentvis inhibering i oksydasjon i forhold til en prøve som ikke er tilsatt dismotaseper-oksyd. In a Warburg apparatus, the consumption of oxygen in the system was measured and in each case compared with the value obtained in a lipid sample with the same composition, but without dismutase peroxide. The measurements were carried out in increasing time intervals and the results are expressed in the form of percentage inhibition in oxidation in relation to a sample to which dismotase peroxide has not been added.

Claims

1. Dismutase peroxide, characterized in that it contains non-haematological iron, that it has a molecular weight of 40,000 + 2,500 and an isoelectric point corresponding to a pH between 4 and 7 and that exhibits a maximum enzymatic activity at pH, between 8.5 and 10, and with an optimum of approx. 9.5.

2. Dismutase peroxide according to claim 1, provided starting from bacterial strains of Photobacterium leiognathi no. ATCC 25.521 or ATCC 25.58?, characterized in that it contains two iron atoms per molecule, in that it has a molecular weight of approx. 42,000 and an isoelectric point at pH 4.4, and has a maximum enzymatic activity at pH 9.5.

3. Dismutase peroxide according to claim 1, provided starting from cultures of the strain Photobacterium sepia No. ATCC 15,709, characterized in that it contains two iron atoms per molecule, in that it has a molecular weight of approx.

42 in 500 and an isoelectric point of 4.1 and in that it has a maximum enzymatic activity at pH between 8.5 and 10 with an optimum of pH 9.5.

4. Dismutase peroxide according to claim 1, provided starting from cultures of the strain Photobacterium Phosphoreum no. ATCC 11,040,. characterized by the fact that it contains two iron atoms per molecule, in that it has a molecular weight of approx. 40.' 000 and an isoelectric point at pH 4.2 and in that it has a maximum enzymatic activity at pH 9.5.

5. Process for the production of dismutase peroxides according to claim 1, by extracting cultures from marine bacterial strains, and in particular from cultures from strains of Photobacterium phosporium, Photobacterium leognathi or Photobacterium sepia, characterized by dispersing in water and keeping at 4° C a marine bacterial culture, after which the pH is adjusted to the range 6.5 - 8 and preferably to approx. 7, after which the mixture is kept at 50-60°C for a few minutes, cooled to 4°C, after which, at this temperature, it is centrifuged, after which the centrifuged liquid phase is subjected to a first fractional precipitation using neutral salts and where, after a further .centrifugation performs another fractional precipitation of the centrifuged liquid phase using neutral salts of centrifugation.

6. Method according to claim 5, characterized in that the precipitate from the last centrifugation is dissolved in a phosphate buffer with pH 7.8, after which the provided solution is dialyzed against the same phosphate buffer with pH 7.8.

7. Method according to claim 5, characterized in that the product from the last centrifugation is taken up in a phosphate buffer with pH 7.8, after which a chromatography is carried out with the provided solution.

8. Method according to claim 7, characterized in that said chromatography consists of a first chromatography in a column with. "Sephadex G 200" gel, a chromatography on a column of diethylaminoethyl Sephadex (DEAE-S) and a new chromatography on a column of "Sephadex G 200" gel.

9. Method according to any one of claims 5-8, characterized in that the said mixture is kept at 50-60°C for 3-4 minutes.

10. Method according to claim 5, characterized in that the said neutral salt is a neutral ammonium sulfate ( <NH>4 )2<S0>4 .

11. Method according to claim 16, characterized in that the first fractional precipitation is carried out with the help of (NH4)2S04 added in such an amount that the mixture or the enzyme extract being treated is brought to a final concentration of approx. 30-35% compared to the saturation at 4°C.

12. Method according to claim 10, characterized in that the second fractional precipitation is carried out with the help of (NH4)2S04 added in such an amount that the mixture or the enzyme extract being treated is brought to a final concentration of 70-75% in relation to the saturation at 4 °C.

13. Method according to claim 5, characterized in that it comprises a step for ultrafiltration.

14. Method according to claim 13, characterized in that the said ultrafiltration step consists of a device with a first porous tube that retains and concentrates molecules that have a molecular weight of 40,000 and a second porous tube that lets through the enzyme molecules that are desired, but that keeps return the bacterial remains and thereby provide a sterile enzyme extract.