NO751661L

NO751661L -

Info

Publication number: NO751661L
Application number: NO751661A
Authority: NO
Inventors: S I Shapiro; G Ertingshausen
Original assignee: Union Carbide Corp
Priority date: 1974-05-10
Filing date: 1975-05-09
Publication date: 1975-11-11
Also published as: DE2520714A1; JPS5436879B2; GB1507934A; NL7505497A; ES454172A1; ES437523A1; HU172910B; CH607013A5; DE2520714C3; CA1050867A; JPS5116090A; AU8050975A; ES443619A1; IL55099A0; BE828901A; US3953172A; DE2520714B2; NZ177467A; CS190477B2; FR2280084A1

Abstract

Fremgangsmåte og apparat for analysering av flytende materiale.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører analyser av flyt-

ende materiale. Spesielt vedrører oppfinnelsen bestemmelse av faststoffnivået i en væskeprøve, f.eks. et serum, ved at væskeprøven bringes til å reagere med en eller flere reagenser og reaksjonskomponentene adskilles ved sentrifugering for at man skal få en nøyaktig angivelse av nivået av den aktuelle substans.

Ved analyse av væsker, f.eks. sera, er det ofte av betydning å få bestemt nivået av substanser, som skjoldbruskhormon, kjønnshormon, cardialglykosider, vitaminer og canserantigener, Det er videre ytterst viktig at slike nivåer bestemmes nøyaktig og hurtig.

Tidligere kjente teknikker omfatter tidkrevende indi-viduell blanding, reaksjon, adskillelse og måling av prøver.

Foreliggende oppfinnelse går ut på å tilveiebringe en fremgangsmåte for hurtig og nøyaktig analyse av substansnivåer i væsker.

Andre formål ved oppfinnelsen vil fremgå av nedenstående

beskrivelse og krav, samt tegningen, hvor :

Fig. 1 er et sideriss av et apparat som er egnet for

gjennomføring av en utførelsesform av oppfinnelsen,

fig. 2 er et partielt oppriss av apparatet ifølge fig.l, fig. 2(a) viser en detalj ved apparatet ifølge fig.2, fig. 3 gjengir en skjematisk måleanordning til bruk

ifølge foreliggende oppfinnelse,

fig. 4 gjengir et diagram av den type som kan benyttes

som referansestandard ifølge oppfinnelsen,

fig. 5 a,b og c illustrerer skjematisk funksjonen av de væskefase-adskillende organer i en spesiell utførelse av fore-

liggende oppfinnelse, og

fig. 6 og 6a er partielle planriss henholdsvis sideriss av et apparat som er hensiktsmessig til bruk ved en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse.

En fremgangsmåte ifølge en spesiell utførelsesform av foreliggende oppfinnelse for analyse av flere væskeprøver omfatter (i) at minst to væsker bringes til å reagere i flere fordypninger, (ii) at det anordnes organer for adskillelse av væskefasene i kommunikasjon med fordypningene, (iii) at fordypningene og organene for adskillelse av væskefasene utsettes for en tilstrekkelig sterk sentrifugalkraft til å overføre fordypningenes væskeinnhold til de kommuniserende organer for adskillelse av væskefasene og at det sørges for fraskillelse av den væske som er overført i minst to faser og (iv) at i det minste en egenskap av en fraskilt fase måles.

Foreliggende oppfinnelse skal beskrives nærmere under henvisning til tegningen, hvor fig. 1 viser et hensiktsmessig apparat for gjennomføring av oppfinnelsen. Apparatet omfatter en dreibar bærer 15 festet til en aksel 20 som kan drives av en motor 30 med forskjellige hastigheter. Ovennevnte deler avstøt-tes av en basisplate 40 og er innelukket i et hus 50, som er forsynt med et avtagbart deksel 60. En ring 70 er avtagbart festet til den dreibare bærer 15 og avstøtter flere avtagbare reagensrør 65 som er i inngrep med ringen 70 via kuleseter 80, slik at reagensrørene er fritt bevegelige fra en hvilestilling 90 til en dreiestilling 100 ved passende rotasjon av bæreren 15. En skive 110 er avtagbart montert på bæreren 15 og markert, slik at hver rekke 120 (.fig. 2) av radiale fordypninger 130 og 140 er stort sett på linje med et reagensrør 65. Rørene 65 er noe forskutt fra en nøyaktig radial innstilling overfor motstående fordypninger 130 og 140 for kompensering av væsketregheten under overføringen til rørene 65 og slik at et gitt apparat kan bestemmes og justeres rutinemessig.

For praktisk gjennomføring av oppfinnelsen, f.eks. for bestemmelse av nivået av en substans i sera eller seralignende prøver, anordnes en nøyaktig mengde reagens 150 i fordypningene 130 og en nøyaktig mengde serum 160 i fordypninger 140, hvorved reagensen er av en slik art at den reagerer med den substans i prøven hvis nivå søkes bestemt, slik at det fremstilles et fysisk adskilbart reaksjonsprodukt. Fordypningene 130 og 140 kan således fylles manuelt med pipette eller ved bruk av et apparat som beskrevet i U.S. patentskrift 3.801.283 (S. Shapiro og T. Picunko) av 2. april 1974. Motoren 30 akseleres til en første hastighet, slik at den utviklede sentrifugalkraft fører til at reagensen 150 overføres fra fordypningene 130 til fordypningene 140 og blandes og reagerer med prøven 160 i fordypningene 140. Motorens 30 hastighet reguleres slik at innholdet i fordypningene 140 ikke tvinges ut av fordypningene 140 av sentrifugalkraften. Reagensen 150 og prøvene 160 reagerer i fordypningene 140 og det vil etter hvert dannes en økende mengde reaksjonsprodukt i fordypningene 140. Til slutt oppstår en like-vekttilstand, og etter dette tidspunkt kan en analyse ved kjente teknikker av fordypningenes 140 innhold brukes til å bestemme nivået av den søkte substans i prøvene 160. Dette vil imidlertid i beste fall være brysomt og ta lang tid, opp til en time eller mer for mange substansers vedkommende. Ved gjennomføring av foreliggende oppfinnelse er det imidlertid ikke nødvendig at reaksjonen i fordypningene 140 fortsetter til likevekt er nådd, men bare inntil en målbar mengde reaksjonsprodukt eller en endring i reaktansmengden er fremkalt i fordypningene 140, hvorpå motorens 30 hastighet økes, slik at innholdet i fordypningene 140 over-føres ved sentrifugalkraft til de væskefaseadskillende organer 190. De sistnevnte er vist som kromatografiske gelkolonner 200 i glassbeholdere 210 med åpen topp, som er avtagbart anordnet i rørene 65. Det flytende materiale som kommer i kontakt med gel-kolonnene 200 blir kromatografisk adskilt av disse etter tilsetting av et elueringsmiddel. Dette oppnås med apparatet ifølge fig. 1 ved at en strøm av en hensiktsmessig væske, f.eks., bufferoppløs-ning, tilsettes fra et forråd 222, via elueringsmiddelpumpen 220, gjennom liédningen 230 og utløpet 240, til fordypningene 130, like etter at innholdet 160 i fordypningene er overført til gelkolon-nene 200. Ved apparatet ifølge fig. 1 betjenes pumpen 220 ved hjelp av en konvensjonell tidstyringsinnretning 212 på et passende tidspunkt, f.eks. 15 sekunder etter at den økte, andre hastighet er oppnådd. Pumpen 220 gir en fastsatt strømningshastig-het av elueringsmiddel i en bestemt tidsperiode, og den totale elueringsmiddelmerigde fordeles automatisk på fordypningene 130. Elueringsmidelet overføres ved sentrifugalkraft til gelkolon-nene 200 via fordypningene 130 og 140. Etter overføring av elueringsmidlet til gelkolonnen 200, fremkaller sentrifugalkraften kromatografisk adskillelse av komponentene i den væske som er overført fra fordypningene 140. Ved et passende valg av gel-kolonne 200 og under henvisning til den fremgangsmåte som er beskrevet som eksempel nedenfor, kan en reaksjonskomponent i materialet i gelkolonnen raskt adskilles ved eluering og over-føres ved sentrifugalkraft til reagensrørene 65, som vist ved 100. Hvis en anvendt reaksjonskomponent var radioaktiv, kan hvert reagensrør 65 fjernes fra ringen 70 og innholdets radioaktivitet måles ved bruk av den konvensjonelle anordning ifølge fig. 3, som omfatter en gammastråle-detektor 230, f.eks. en natrium-jodid-krystall/fotomultiplikator-rørkombinasjon, en forsterker 240, en pulsnivå-analysator 245, en teller 250 og en fremvisningsinnretning 260, f.eks. en digitalskriver. Ut fra den verdi som således oppnås for hvert reagensrør 65 kan man finne substansnivået i prøven ved beregning eller sammenligning med en standard.

Som vist i det spesielle utførelseseksempel i fig. 2a, kommuniserer en fordypning 130 i indre rekke med fordypningen 140 i ytre rekke, som er opprettet på linje med 130 ved hjelp av en traulignende passasje, antydet ved 500, som dannes av sideflatene og den stigende bunnflaten for en indre fordypning 130. Ved tilstrekkelig rotasjon og sentrifugalkraft, vil væsken i en fordypning 130 strømme over i en ytre fordypning 140 på linje med denne. En fordypning 140 i ytre rekke kommuniserer også med et organ for adskillelse av flytende fase, som er anordnet på linje med 140 ved en traulignende forlengelse antydet ved 600, som dannes av sideflatene og den stigende bunnflaten av en ytre fordypning 140 og kanalen 70. Ved tilstrekkelig rotasjon og sentrifugalkraft vil væske i en ytre fordypning 140 strømme over og over-føres til et adskillende organ på linje med 140. Men hellingen 145 av de ytre fordypninger 140 er brattere enn hellingen 147

av de indre fordypninger 130, slik at væsken holdes igjen i ytre fordypning 140, med det forhøyede parti 800 virkende som en

demningslignende barriere, inntil økt sentrifugalkraft ut-øves , dvs. en kraft som er sterkere enn den som kreves for at væske skal strømme fra en indre fordypning 130 til en ytre fordypning 140.

Ved gjennomføring av foreliggende oppfinnelse, som omtalt ovenfor, er det teoretisk mulig å beregne konsentrasjonen av et reaksjonsprodukt eller en reaksjonskomponent ved en gitt reaksjon og ved gitte, spesielle konsentrasjoner av reaktanser, på et gitt tidspunkt etter reaksjonens begynnelse. Forholdet mellom konsentrasjoner og tidsfaktor kan kartlegges, og målte konsentrasjoner på bestemte tidspunkter kan sammen-lines med de kartlagte verdier. Ved et enkelt tilfelle kan fremgangsmåten være som følger :

For en hypotetisk, bimolekulær, irreversibel reaksjon A + B ^C, hvor like konsentrasjoner av A og B blandes på tidspunkt t = 0, da konsentrasjonen av C = 0, kan det påvises at konsentrasjonen på ethvert gitt tidspunkt etter t = 0 fremkommer ved

hvor

Ao er utgangskonsentrasjonen av komponentene A og B K^=A (-Ea/RT) - Arrhenius ligning, hvor A er hyp-pighetsfaktoren, Ea er reaksjonens aktiverings-energi,

T er reaksjonstemperaturen og R er den generelle gasskonstant.

Ved hjelp av en slik beregning og et skjema ut-arbeidet på grunnlag av denne for den gitte reaksjona kan konsentrasjonen, målt etter forholdsvis kort reaksjonstid,»-; rutinemessig omregnes til den totale konsentrasjon eller det totale nivå av den aktuelle substans.

Ved en spesiell utførelse av foreliggende oppfinnelse benyttes en standard, hvor man unngår bryet ved ovennevnte fremgangsmåte. Ved denne utførelse, se fig. 1 og 2,

er en generell fremgangsmåte som illustrerer dette utførelses-eksempel, at antistoff anbringes som en reaksjonskomponent p de innerste fordypninger 130 i skiven 110, og at serumprøver

som inneholder en ukjent mengde av et stoff, f.eks. thyroxine, (T-4), sammen med en radioaktiv T-4 reagens og en fortreng-ningsreagens i de ytre fordypninger 140. Skiven akselereres hurtig til en første omdreiningshastighet, i løpet av hvilken antistoff fra de indre fordypninger 130 av sentrifugalkraften beveges til de ytre fordypninger 140, hvor antistoffet og T-4 blandes og reagerer. Under reaksjonen vil T-4 i serum-prøvene fortrenges fra sin bærer og bli fri til å konkurrere med radioaktivt merket T-4 om et begrenset antall bindings-steder på antistoffkomponenten. På ethvert tidspunkt etter blandingen og under den vedvarende reaksjon i fordypningen 140 vil forholdet mellom antistoffbundet, radioaktivt merket T-4

og fritt, radioaktivt merket T-4 i fordypningene 140 gi et mål på det opprinnelige nivå av T-4 i serumprøvene. Når reaksjonen således har fortsatt ved opprinnelig hastighet i kort tid, tilstrekkelig til å gi meningsfult målbare, radioaktivitetsdata og i god tid før reaksjonslikevekt oppnås, økes skivens 110 rotasjon til en høyere verdi, hvor innholdet i de ytre fordypninger 1 140 av sentrifugalkraften slynges inn i kommuniserende sepa-reringsorganer 200, hvor T-4 antistoffkomplekset (som inneholder både radioaktivt og ikke radioaktivt T-4), sammen med ikke reagert antistoff føres gjennom de adskillende organer 200, slik at det ikke-komplekse T-4 (både radioaktivt og ikke-radioaktivt) absorberes av de adskillende organer 200.

Denne forholdsregel stanser den kompleksdannende reaksjon ved at i det minste en komponent (antistoff) fjernes fra reaksjonsmiljøet (gelsøylene 200) , og følgelig vil en måling av radioaktiviteten av det fraskilte antistoff T-4 kom-pleks ved sammenligning med en standard, gi et mål på det opprinnelige T-4 innhold i prøven som analyseres. Standarden kan tilveiebringes ved bruk av sera eller serumlignende materialer med kjente, men forskjellige T-4 nivåer, ved samme reaksjonsbetingelser som for analyseprøvene som mevnt ovenfor, hvorved radioaktivitetsnivåene (eller forholdstallene) som oppnås for hvert materiale kartlegges i forhold til dets kjente nivå av T-4. Ved en foretrukket fremgangsmåte anbringes "standardmaterialene" i passende fordypninger 140 i samme skive 110 som brukes for analyseprøver med ukjent T-4 nivå, og standarddata samt analysedata fremkommer samtidig.

Fig. 4 som knytter seg til det spesielle eksempel som er omtalt nedenfor, viser et standarddiagram til bruk på ovennevnte måte og viser radioaktivitetstellinger pr. minutt, oppnådd ved bruk av "standard" utgangsmaterialer som inneholder en kjent telling av T-4. Fig 4 viser som eksempel at det opprinnelige nivå av T-4 i en serumprøve under de spesielle reaksjonsbetingelser er 6,2 jxq T-4 pr. 100 ml prøve når det oppnås en telling på 4000 fra en serumprøve som be-handles samtidig med "standard"-materialene. Det vil være innlysende at passende og nøyaktig kontrollerte mengder av reagenser benyttes ved gjennomføring av foreliggende oppfinnelse, og at oppfinnelsen spesielt kan tillempes på alle væské-væske-reaksjoner, især de som benyttes ved de velkjente kliniske analyseteknikker for blodserum eller serumlignende materialer ved btøuk av kjente reaksjonstoffer.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan spesielt benyttes for analyse av et vidt spektrum av fysiologisk vik-tige molekyler, f.eks. som angitt i Clinical Chemistry, Vol. 19, nr. 2, 1973 (Artikkel av D.S. Kelley, L.P. Brown og P.K. Besch på side 146).

Nedenstående eksempel vil ytterligere bidra til

å illustrere oppfinnelsen.

Eksempel.

Kliniske serumprøver ble analysert for bestemmelse av prøvenes nivå av thyroxin (T-4) ved bruk av et apparat av den type som er vist i fig. 1, 2 og 3 og et standarddiagram som vist i fig. 4. Ni kliniske serumprøver med ukjent T-4 nivå, i to utgaver, og fem "standard" oppløsninger med forskjellige, men kjente T-4 nivåer, likeledes i to utgaver ble behandlet samtidig. Dette ble gjennomført ved at to ytre fordypninger 140 i skiven 110 ble forsynt med 35 mikroliter hver av en spesiell klinisk serumprøve, slik at 18 ytre fordypninger, foar enkelhets skyld betegnet 1,1' i 2,2' ; 3,3'... 9,9' i fig. 2 ble fylt. Dessuten ble to ytre fordypninger 140 i skiven 110 forsynt med 35 mikroliter hver av ett bestemt av de fem "standard" oppløsninger, slik at 10 ytre fordypninger 140, betegnet cå,a' , b,b', e,e' i fig.. 2 ble fylt. T-4 nivåene i "standard" oppløsningene, fremstilt som beskrevet ovenfor, var som følger :

Under påfyllingen av de ytre fordypninger som angitt ovenfor, ble hver 35 mikroliter-mengde blandet med 65 mikroliter destillert vann. I tillegg ble det til hver ytre fordypning 140, fylt som nevnt, tilsatt 50 mikroliter av en radioaktiv T A- 125 i oppløsning (fremstilt som beskrevet Hver 1-4 I oppløsning (fremstilt som beskrevet nedenfor). Hver indre fordypning 10, 10' ....90, 90' og A,A" .... E,E' ble forsynt med antistoff (som beskrevet nedenfor) Skiven 110 i apparatet ifølge fig. 1 ble deretter hurtig akselerert til en første hastighet, slik at innholdet i de indre fordypninger 1,1' ....9,9' og a,a<1>... e,e' i løpet av 3 sekunder ble overført til de respektive, kommuniserende ytre fordypninger 10,10' ... 90,90' og A,A' ... g,E' som følge av sentrifugalkraften. I de respektive ytre fordypninger startet reaksjonen og fortsatte i 30 minutter.

Etter 30 minutter ble skivens 110 omdreiningshastighet raskt akselerert til en andre hastighet og sentrifugalkraften som derved oppsto, førte til at innholdet i fordypningene 10,10' ... 90,90' og A,A' .... E,E' ble overført til respektive, kommuniserende kromatografiske kolonner 200. Femten sekunder etter skivens 110 akselerasjon til denne andre hastighet, ble elueringsmiddel-pumpen, vist ved 220 i fig. 1, aktivisert ved hjelp av en konvensjonell tidsstyrings-innretning 212 for avgivning av 2 ml bufferoppløsning (beskrevet nedenfor) fra en beholder 222 til hver indre fordypning 130 via utporsjoneringsanordningen 240. Ved utlevering av 30 ml/min. t&minutter, avgis tilsammen en strøm på 60 ml, og denne strøm vil ved de 30 fordypninger fordeles med 2 ml pr. fordypning. Den oppløsning som således ble tilsatt ved hjelp av utporsjoneringsanordningen 240 .vil ved sentri-fugalkraftpåvirkning overføres fra fordypningene 10,10' ... 90,90' og A,A' ... E,E' til 1,1' .... 9,9' og .a,a-'"...e,e' og til de respektive kromatografiske kolonner 200, hvor komponentene og reaksjonsproduktene utsettes for eluering, som følge av sentrifugalkraften som opprettes ved rotasjon og , påvirker elueringsmidlet. Som følge av dette vil T-4 anti-stof f-kompleks (bestående av både radioaktivt og ikke-radioaktivt T-4) sammen med ureagert antistoff hurtig, f.eks. i løpet av et minutt, elueres fra de enkelte kromatografiske kolonner 200 og, som følge av sentrifugalkraft slynges ut i reagensrør 65, som antydet ved 152 i fig. 1 og 2. Ureagert

125

T-4- I oppløsning og serumkomponenter med lav molekyl-vekt vil forbli i de kromatografiske kolonner 200. I foreliggende eksempel vil ovennevnte reaksjon etter fraskillelse av antistoffer ved eluering stanses på fraskillingstids- . punktet i hver kromatografisk kolonne 200. På et passende tidspunkt etter elueringen overføres reagensrørene 65 til en innretning som vist i fig. 3, og hvert rør 100 med sitt innhold 152 telles i ett minutt, som vist i nedenstående tabell.

De kjente T-4 nivåer i p. q T-4 pr. 100 ml prøve av "standard"-prøvene a,a' ... e,e' ble inntegnet i forhold til de oppnådde tellinger pr. min. for oppstilling av diagrammet ifølge fig. 4 ved bruk av de målte tellinger i tabellen svarende til prøvene. De bestemte nivåer for kliniske prøver i tabellen ble oppnådd fra diagrammet i fig. 4. Nedenfor følger en detaljert beskrivelse av materialene og fremgangsmåten ved ovennevnte eksempel.

I. Substanser for analyse.

Kliniske serumprøver

II. Benyttede materialer

1. Thyroxin (T-4), fri syre:Kat. nr. 2376

Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)

2. Thyroxin-<125>I (T-4-125) : Kat.nr. 6751 "Tetramet-125" (Abbott Labs. North Chicago, Illinois) 3. Anti-thyroxin serum (kanin): Wien Labs., Succasunna,

New Jersey

4. Saltsyre: Kat.nr. A-144, Fisher Scientific, New York,N. Y. 5. Natriumhydroksyd, 0,1N: Kat.nr. SO-S-276, Fisher Scientific. 6. Natriumbarbital: Kat. nr. B-22, Fisher Scientific.

7. Natriumazid: Kat.nr. S-227, Fisher Scientific

8. Normalt kaninserum

9. 8-anilin-l-naftalensulfonsyre, natriumsalt (ANS):

Kat.nr. 9041, K&K Labs, Plainview, New York.

10. Normal, kombinert menneskeplasma: Plasma Products. 11. Aktivert trekull: Darco G-60, Matheson, Coleman&

Bell, Rutherford, New Jersey

12. Sephadex G-25, fin (kromatografisk gel):

Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J.

13. Kolonner (for kromatografisk gel): Kat. nr. 102/2,

Walter Sarstedt, Inc., Princeton, N.J.

14. Reagensrør: 12 x 75 mm og 17 x 100 mm reagensrør.

III. Benyttede reagenser.

A. 6N saltsyre, 1 liter

B. Barbitalbuffer, 0,075M, pH 8, 6; 1 liter. Oppløs 15,54 g natriumbarbital og 100 mg natriumazid i 800 ml destillert vann. Bruk en standardisert pH-måler, reguler oppløsningens pH til 8,6 ved dråpevis tilsetting av 6N HC1, idet barbitalet hele tiden blandes omhyggelig. (Ca. 2 ml 6N HC1 er nødvendig). Fyll til 1 liter med destillert vann. Denne buffer holder i en måned i kjøleskap.

C. 2% normal kaninserum- bårbital buffer, 100 ml

Tilsett 2 ml normalt kaninserum til 98 ml barbital-buf f er, bland omhyggelig. Holder i to uker i kjøleskap.

D. Thyroxin- fri menneskeplasma, 20 ml

Bland omhyggelig 3 g aktivert trekull med 20 ml kombinert menneskeplasma i et 50 ml konisk sentrifugerør, påse at alt trekull fuktes. Dekk til blandingen og sett denne i kjøleskap natten over. Neste dag sentri-fugeres blandingen ved ca. 8000 omdr./min. i 10 minutter. Ved bruk av en 20 ml sprøyte utstyrt med en 25 mm Millipore filterholder méd en Swinnex adaptor, filtreres den flytende fase etter tur med (1) filter- papir, (2) et 0,45 mikron filter, (3) et 0,22 mikron filter. Fremstilles hver uke og oppbevares i kjøle-skap. Hvis det fryses, holder det minst 3 måneder. E. Thyroxin ( T- 4) standardpreparat.

1. T-4 (0,6 mg/ml)

Oppløs 6,00 mg T-4 i et minstevolum av 0,1 N natriumhydroksyd. Fyll opp til 10 ml med destillert vann. Dette kan oppdeles i 0,2 ml ampuller og lagres i fros-sen tilstand i 3 måneder.

2. " Arbeids"- standardprøver

Gjør klar 12 x 75 mm reagensrør og forsynt med nummerer-ing 1-5. Fremstill T-4 arbeidsstandardprøvene på føl-gende måte :

3æ Standard til bruk

Merk fem 17 x 100 mm reagensrør 1-5, tilsett 5,0 ml T-4 fri plasma til hvert. Fjern 50 mikroliter av tilsvarende "arbeidsstandard", som angitt ovenfor. Blandt godt. De ehidelige resultater vil være:

Frys i 0,5 ml alikvoter

125

F. Thyroxin I oppløsning

1. ANS oppløsning

Oppløs 60 mg 8-anilin-l-naftalen-sulfonsyre i 10 ml reagens C.

2. Isotopoppløsning

En minsteordre Tetramet-125 er 500 mikrocurie. Opp-løsningen er holdbar i 6 uker. Utløpsdagen er angitt på Abbotts etikett. Aktiviteten, dvs. mikrocurie pr. ml vil variere fra sats til sats, den er også angitt for hver sats på etiketten. 14.000 tellinger pr. min. (CPM), tilsettes hvert reagensrør i 50 mikroliter; 14.000 cpm er ca. 0,014 mikrocurie. Bestem det totale antall reagensrør, standard og ukjente prøver, øk med 10% som sikkerhetsfaktor og multipliser resultatet med 0,014, derved fremkommer det totale antall nødvendige mikrocurie. Deretter multipliseres det totale aniiall reagensrør, inklusive de ekstra 10% med 50. Derved fremkommer det totale antall nødvendige milliliter ANS. Trekk antallet mikroliter fra Tetramet-125 tilsvarende antallet mikrocurie og legg til det korrekte volum

av ANS. Fremstill på anvendelsesdagen.

G . Antistoffreagens

Antistoffet kommer fra Wien Labs lyofilisert i ampuller betegnet "100 Test". Hver ampulle rekondi-sjoneres med 14,0 ml reagens C. Holdbar i 2 uker

i kjøleskap.

S.V Protokoll

A. Reaksjonsbetingelser:

125

50 mikroliter T-4- I oppløsning

35 mikroliter standard- eller serumprøve, og 65

mikroliter destillert vann blandes sammen.

200 mikroliter antistoffreagens tilsettes deretter. Reaksjonen får pågå i 30 minutter ved værelsestempera-tur ved første hastighet av inkubatoren/separatoren. Når hastigheten økes til andre nivå, overføres hele reaksjonsvolumet til en kolonne Sephadex G-25, fin. Komplekset elueres med 2,0 ml Barbital-buffer. Komplekset telles i 1 minutt i en gammateller.

Hver prøve og standardprøve kjøres dobbelt; stand-ardprøvene 1-4 opptar 10 plasser.

B. Behandling av data

Standardprøvene inntegnes som følger: Tellinger

pr. minutt på y-aksen mot log. ug/100 ml på x-aksen. Standardene fremstilt som ovenfor er : 0, 2, 6, 12, 30 ug thyroxin pr. 100 ml. Ukjente prøver bestemmes ut fra standardprøvekurven ved at man finner ug thyroxin pr. 100 ml verdien som svarer

til tellingen for den ukjente prøve.

V. Analysert substans

Kliniske serumprøver.

Ved den utførelse av foreliggende oppfinnelse som

er illustrert ved ovenstående eksempel, oppnås spesielle fordeler ved at man i det vesentlige . stanser den omtalte kbmpleksdannende reaksjon etter hurtig fraskillelse av reaksjonsmiddél-komponentene under kontrollerte forhold i den kromatografiske kolonne 200.

Ved et almindelig tilfelle anbringes reaktanser A og B i indre og ytre fordypninger 130 henholdsvis 140 og bringes til å blande seg og reagere i de ytre fordypninger for dannelse av økende mengder av et reaksjonsprodukt C. Blandingen av A, B og C blir i de kromatografiske kolonner 200 adskilt i faser, av hvilke en samles i reagensrør 65 og inneholdern minst en reagens, f.eks.

enten A eller B. Den C-produserende reaksjon stanses i det vesentlige i de kromatografiske kolonner og selv om rotasjonen fortsetter, vil det ikke produseres ytterligere mengder av C. Eludering finner sted og

parameteren for den eluderte fase som skal måles, f.eks. radioaktivitet, farge, fluorescens, enzym, "fikseres" i det vesentlige samtidig for alle prøver som analyseres. Denne utførelsesform er spesielt fordelaktig for kinet-iske analyser, som omfatter bestemmelse av en prøves skjoldbrusk-hormoner, kjønnshormoner, cardialglykosider, vitaminer, canserantigener ved bruk av standard radio-immuno-analyse-reagenser.

Det ovenstående vil bli bedre forstått under henvisning til fig. 5a, som skjematisk gjengir et tidspunkt, da den ikke reagerte porsjon av reagensene A og B og reaksjonsproduktet C er overført til den kromatografiske gel 200', men før overføringen av eluerings-

middel til den kromatografiske del 200'. Under slike be-tingelser kan A og B fortsette å reagere og produsere ytterligere mengder av C. Etter overføring av elueringsmiddel til den kromatografiske gel 200', som i dette tilfelle er valgt for fraskillelse av reagensen B sammen med reaksjonsprodukt C, vil B og C imidlertid hurtig skilles fra A i en fase som beveges langs den kromatografiske gel 200' , som antydet i fig. 5b, slik at dannelsen av ytterligere reaksjonsprodukt C stanses. Fasen som omfatter faste andeler B og C, overføres ved sentrifugalkraft til reagensrøret 100', som antydet i fig. 5c og den faste verdien av den .aktuelle parameteren av B eller C kan måles når det ønskes.

Ved andre anvendelser som omfatter fremgangs-

måten ifølge foreliggende oppfinnelse, hvor det ikke er av avgjørende betydning å stanse reaksjonen i den kromatografiske gel 200 og hvor alle prøver og standardprøver utsettes for i det vesentlige samme reaksjons- og adskillelsesbe-tingelser, kan den kromatografiske gel velges slik at den eluer-er og fraskiller reaksjonsproduktet fra reaksjonskomponentene, især i de tilfelle hvor ytterligere dannelse av reaksjonsprodukt i gelen og eluering derav vil kompenseres ved bruk av en samtidig fremstilt standard.

Ved praktisk bruk av oppfinnelsen kan den aktu-

elle parameter være radioaktivitet, som spesielt omtalt ovenfor, farge, fluorescens eller en annen hensiktsmessig fysisk eller kjemisk egenskap. I stedet for en telleinnretning for radioaktivitet, kan det følgelig benyttes andre konvensjonelle registreringsinnretninger.

Ved ytterligere en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse (fig. 6) benyttes en skive 510 med flere enkeltfordypninger 520 i stedet ■'or par av fordypninger 130, 140 som ligger radialt på linje med hverandre, som i apparatet ifølge fig. 1. Ved praktisk gjennomføring av oppfinnelsen ved bruk av apparatet ifølge fig. 6, anbringes nøyaktige mengder av to eller flere reagenser, f.eks. serum og reagens, antydet ved 535, i fordypningene 520, hvor en .reaksjon finner.sted for dannelse av et fysisk fraskillbart reaksjonsprodukt. Påfyl- ling av fordypningene 520 kan skje ved hjelp av pipette, som nevnt ovenfor. En eller flere av fordypningene 520 kan fylles med standard reagenser på samme måte som tidligere om-

talt og den således fylte skive 510 kan anbringes på bæreren 15 på samme måte som skiven 110 i fig. 1, og dreies med tilstrekkelig stor hastighet til at innholdet i fordypningene 520 overføres ved sentrifugalkraft til kommuniserende, adskillende organer 190. Fra dette punkt fortsetter fremgangsmåten på samme måte som ovenfor omtalt i forbindelse med apparatet ifølge fig. 1<p>g et standard diagram, som eksempelvis angitt i fig. 4. Ved praktisk anvendelse av denne fremgangsmåte kan skiven 510 med fordypningene 520 forsynes med reaksjonskomponenter og reaksjonen kan fortsette til likevekt opprettes. Dette vil si at skivene 510 kan forsynes med reaksjonskomponenter og lagres i lengre tid, f.eks. i noen timer eller lenger, hvorpå skivene 510 kan anordnes i stedet for skivene 110 i apparatet ifølge fig. 1 og en analyse kan utføres som beskrevet ovenfor. Denne utførelsesform kan med fordel anven-des ved langsomme reaksjoner, f.eks. ved bestemmelse av vekst-hormon i blodserum fra mennesker, som ved bruk av den ovenfor omtalte utføreisesform av apparatet med dobbelte fordypninger ville kreve upraktisk lang rotasjonstid ved de høyere hastigheter, f.eks. 1 time eller mer. Når skivene 510 er forsynt med reaksjonskomponenter over en tidsperiode, som for de sær-lig langsomme reaksjoner, kan det alternativt være praktisk at reaksjonene i de forskjellige enkeltfordypninger startet samtidig. Skiven 510 kan roteres og innholdet i fordypningene 520 overføres til kommuniserende, adskillende organer 190, på ethvert tidspunkt når en målbar mengde adskillbart reaksjonsprodukt er produsert i fordypningene 520. Denne fremgangsmåte er effektiv i de tilfelle da tap av analysenøyak-tighet, som måtte skyldes forskjellige reaksjonstider i de forskjellige fordypninger, ikke er avgjørende sammenlignet med den tid man sparer.

Spesielle fordeler ved den mekanisk og kjemisk kontinuerlige tandem-metode ifølge foreli>g.gende oppfinnelse omfatter eliminering av manuell eller mekanisk inngripen under gjennomføring av en analyse som reduserer betydningen av andre variabler enn de aktuelle til et minimum, og evnen til å utnytte korte reaksjonstider og tillate samtidige ki-netiske undersøkelser under kontrollerte tidsbetingelser.

Til bruk i forbindelse med foreliggende oppfinnelse omfatter reaksjonskomponentene substanser som reagerer kjemisk for tilveiebringelse av et kjemisk forskjellig reaksjonsprodukt og likeledes substanser som kan sies å reagere fysisk (f.eks. visse fysiske adsorpsjonsfenomener) for dannelse av ett eller flere fysisk forskjellige materialer.

Det organ for adskillelse av væskefaser, som

i praksiå benyttes i forbindelse med oppfinnelsen kan være en konvensjonell kromatografisk innretning, f.eks. en som fremkaller adskillelse på basis av molekylstørrelse, fysiske adsorpsjonsfenomener, kjemisorpsjon, ioneutvekslingsegen-skaper, spesielle molekulæraffiniteter (affinitets-kromato-grafi) og andre kjente teknikker ved bruk av f.eks. gel, fast-stoffer og harpikser.

Claims

1. Fremgangsmåte for analysering av flere væske-prøver, karakterisert ved at

(i) minst to flytende materialer får reagere i et antall fordypninger, for dannelse av en væske, som inneholder minst ett reaksjonsprodukt, (ii) det anordnes organer for adskillelse av flytende faser, kommuniserende med fordypningene, (iii) fordypningene og organene for adskillelse av flytende fase utsettes for tilstrekkelig store sentrifugal-krefter til at væskeinnholdet i fordypningene overføres til nevnte organer for adskillelse av flytende faser og dén over-førte væske adskilles i minst to faser og at (iv) i det minste en egenskap av en fraskilt fase måles.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at minst ett av nevnte flytende materialer inneholder en radioaktiv bestanddel og at den egenskap som måles i trinn (iv) er radioaktivitet.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at overføringen av innholdet i nevnte fordypninger til organene for adskillelse av flytende faser, finner sted på et tidspunkt, da økende mengder av minst ett reaksjonsprodukt er under dannelse.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav^karakterisert ved at minst en av fasene som adskilles i nevnte organ for adskillelse av væskefaser, overføres fra dette organ ved sentrifugalkraft som fremkalles ved rotasjon av det dreibare organ.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at minst en av fasene som adskilles i nevnte organ for adskillelse av væskefaser ved hjelp av sentrifugalkraft overføres fra nevnte organ til en beholder som kommuniserer med dette.

6.. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at den fase som overføres til nevnte beholder er radioaktiv.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at minst en egenskap av nevnte fase som overføres til beholderen, blir målt.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at en væske tilføres nevnte fordypninger etter overføringen av væske til nevnte organ for adskillelse av væskefaser og under rotasjon av fordypningen, for tilførsel av et elueringsmiddel til organet for adskillelse av væskefaser etter tilførsel ved sentrifugalkraft.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at minst en av fordypningene inneholder flytende materialer, som etter reaksjon gir en bestemt verdi av en målbar egenskap i minst en av dé adskilte fasene.

10. Fremgangsmåte for analyse av flere væskeprøver, karakterisert ved at (i) flytende materiale anbringes i flere, i det vesentlige sirkulært anordnede fordypninger, (ii) et annet flytende materiale som kan reagere med førstnevnte, flytende materiale i førstnevnte fordypninger anbringes i flere, i det vesentlige sirkulært anordnede andre fordypninger, (iii) det anordnes flere organer for adskillelse av flytende fase i en stort sett sirkulær anordning, idet de første og andre fordypninger og organene for adskillelse av flytende fase anordnes i det vesentlige konsentrisk om en felles akse, med organene for adskillelse av flytende fase anbragt radialt sett ytterst i forhold til de andre fordypninger som i sin tur er radialt ytterst i forhold til de første fordypninger, hvorved organene for adskillelse av flytende faser befinner seg i tandem-kommunikasjon med en andre fordypning, som er i tandem-kommunikasjon med en første fordypning, (iv) fordypningene settes i rotasjon om den felles akse, slik at det opprettes en sentrifugalkraft som er stor nok til å overføre væsken i de første fordypninger til de andre fordypninger, slik at væsken reagerer med væsken i de andre fordypninger for dannelse av minst ett reaksjonsprodukt, at (v) fordypningene og organene for adskillelse deretter settes i rotasjon med en hastighet for opprettelse av en tilstrekkelig sentrifugalkraft til overføring av væskeinnholdet i de andre fordypningene til organene for adskillelse av væskefaser, (vi) rotasjonen av organene for adskillelse fortsettes til fremkallelse av en tilstrekkelig sentrifugalkraft til å adskille væsken som er overført til organene i minst to faser og at (vii) minst, en egenskap av minst en av de nevnte faser måles.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, karakterisert ved at minst ett av de flytende materialer inneholder en radioaktiv bestanddel og at den målte egenskap i trinn (vii) er radioaktivitet.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, karakterisert ved at overføringen av innholdet i de andre fordypninger til organene for adskillelse av væskefaser skjer på et tidspunkt da økende mengder av i det minste ett reaksjonsprodukt dannes.

13. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, karakterisert ved at minst en av fasene som adskilles i organene for adskillelse av væskefaser, overføres fra nevnte organ ved sentrifugalkraft fremkalt ved rotasjon av det dreibare organ.

14. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, karakterisert ved at minst en av fasene som adskilles i organene for adskillelse av væskefaser, overføres ved sentrifugalkraft fra nevnte organ til en beholder som kommuniserer med dette.

15. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, karakterisert ved at en væske innføres i minst de andre fordypninger etter overføring av væske til organene for adskillelse av væskefaser og under rotasjon derav, for tilførsel av et elueringsmiddel til organene for adskillelse av væskefaser ved overføring til disse organer ved sentrifugalkraft.

16. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, karakterisert ved at minst en av de første fordyp ninger og en av de andre fordypninger inneholder flytende materiale som etter reaksjon gir en bestemt verdi av en målbar egenskap i- minst en av de fraskilte faser.

17. Fremgangsmåte for analyse av flere væskeprøver, karakterisert ved (i) at det anordnes et dreibart organ med flere, første og andre fordypninger som roterer med, idet hver fordypning er tilpasset for opptagelse av væske og fordypningene er anordnet i kommunikasjon med hverandre, slik at væske i en første fordypning etter opprettelse av tilstrekkelig sentrifugalkraft veåcl rotasjon av det dreibare organ overføres til en andre fordypning, og etter opprettelse av tilstrekkelig sentrifugalkraft ved rotasjon av det dreibare organ i' den andre fordypning overføres fra denne (ii) at det anbringes i det minste ett flytende materiale i flere første fordypninger som nevnt og minst ett annet flytende materiale i flere andre fordypninger, idet materialene er av en slik art at det ved kontakt mellom dem oppstår gjenåidig påvirkning, slik at det i de andre fordypninger oppstår en blanding som inneholder minst en fraskillbar bestanddel, som kan fraskilles fra blandingen ved organer for adskillelse av flytende faser, (iii) at det dreibare organ settes i rotasjon for utvikling av en sentrifugalkraft som er tilstrekkelig til å overføre væskeinnholdet i de første fordypninger til de andre fordypninger, slik at det dannes en blanding, tilbake-holdt i de andre fordypninger, som i det minste inneholder en fraskillbar bestanddel, som kan fraskilles fra blandingen ved organer for adskillelse av væskefaser, (iv) at det anordnes organer for adskillelse av væskefaser kommuniserende med de andre fordypningene og anordnet slik at de kan roteres med fordypningene og utsettes for sentrifugalkraft som opprettes ved rotasjon av det roterbare organ, (v) at det rbterbare organs hastighet på et tidspunkt etter dannelse av nevnte fraskillbare bestanddel i 'de andre fordypninger reguleres slik at det dannes tilstrekkelig stor sentrifugalkraft til å overføre blandingen i de andre fordypninger til organene for.adskillelse av væskefaser, (vi) at rotasjonen av det roterbare organ fortsettes for opprettelse av en sentrifugalkraft som påvirker blanp dingen som er overført til organene for adskillelse av væske*-faser, slik at blandingen adskilles i minst to faser, av hvilke en fase inneholder minst en av nevnte fraskillbare bestanddeler i blandingen og (vii) at minst en egenskap av nevnte fase som inneholder minst en av de fraskillbare komponenter måles.

18. Fremgangsmåte som angitt i krav 17, k a r a k-terisertvedat (i) nevnte væskemateriale som er anordnet i de første fordypninger inneholder minst en radioaktiv bestanddel, (ii) at nevnte væskemateriale som er anordnet i nevnte andre fordypninger inneholder minst en radioaktiv bestanddel, (iii) at de radioaktive bestanddeler etter over-føring av væskeinnholdet i de første fordypninger til de andre fordypninger reagerer i nevnte andre fordypning under dannelse av et reaksjonsprodukt, (iv) at en av de minst to faser som adskilles i nevnte organ for adskillelse av væskefaser inneholder i det vesentlige alt av i det minste en, men ikke alle nevnte reaksjonsdyktige bestanddeler i blandingen som ble overført til organene for adskillelse av væskefaser.

19. Fremgangsmåte som angitt i krav 17, karakterisert ved at minst en av væskene inneholder en radioaktiv bestanddel og at den egenskap som måles i trinn (vii) er radioaktivitet.

20. Fremgangsmåte som angitt i krav 18, karakterisert vedat minst en av de reaksjonsdyktige komponenter er radioaktiv.

21. Fremgangsmåte som angitt i krav 18, karakterisert ved at overføringen av innholdet i andre fordypninger til organene for adskillelse av væskefaser skjer på et tidspunkt da de reaksjonsdyktige komponenter reagerer under dannelse av økende reaksjonsprodukt-mengder.

22. Fremgangsmåte som angitt i krav 17, karakterisert ved at minst en av fasene som adskilles i nevnte organer for adskillelse av væskefaser overføres fra nevnte organ ved sentrifugalkraft som fremkalles ved rotasjon av det dreibare organ.

23. Fremgangsmåte som angitt i krav 17, karakterisert ved at minst en av de nevnte faser som adskilles i organene for adskillelse av væskefaser overføres fra nevnte organ til en beholder som kommuniserer med organet, ved hjelp av sentrifugalkraft som opprettes ved rotasjon av det dreibare organ.

24. Fremgansgmåte som angitt i krav 23, karakterisert ved at fasen som overføres til beholderen er radioaktiv.

25. Fremgangsmåte som angitt i krav 23, karakterisert ved at minst en egenskap av fasen som overføres til beholderen blir målt.

26. Fremgangsmåte som angitt i krav 17, karakterisert ved at minst en av de første fordypninger og en av de andre fordypninger inneholder flytende materiale som etter reaksjon gir en bestemt verdi av en målbar egenskap i minst en av de adskillfelare faser.

27. Fremgangsmåte som angitt i krav 17, karakterisert ved at en væske innføres i minst en av de andre fordypninger etter overføring av væsken til organet for adskillelse av væskefaser og under rotasjon derav for tilførsel av et elueringsmiddel i organet for adskillelse av væskefaser etter overføring dit ved sentrifugalkraft.

28. Analyseapparat, karakterisert ved (i) et dreibart organ med flere, i det vesentlige sirkulært anordnede, første fordypninger tilpasset til å oppta væske, og flere, i det vesentlige sirkulært anordnede, andre fordypninger tilpasset for opptagelse av væske, (ii) flere organer for adskillelse av væskefaser, i det vesentlige sirkulært anordnet og forbundet med det dreibare organ, idet de første og andre fordypninger og organene for adskillelse av væskefaser er anordnet i det vesentlige konsentrisk om en felles akse, med organene for adskillelse av væskefaser i større radial avstand fra aksen enn de andre fordypninger og disse i større radial avstand fra aksen enn de første fordypninger, og med organene for adskillelse av væskefaser i tandemforbindelse med de andre fordypninger som befinner seg i tandemforbindelse med de første fordypninger og (iii) samlebeholdere tilpasset for å oppta væske, forbundet med organene for adskillelse av væskefaser, slik at de mottar væske som er adskilt av nevnte organer.

29. Analyseapparat, karakterisert ved at det omfatter (i) dreibare organer (ii) et skiveformet organ tilpasset for rotasjon i et stort sett horisontalt plan om,sin midtakse av nevnte dreibare organ, idet det skiveformede organ omfatter en første rekke av fordypninger tilpasset til å oppta væske og anordnet i en felles, radial avstand fra skivens midtakse, og en andre rekke fordypninger, tilpasset for å oppta væske og anordnet i en annen og større radial avstand fra først-nevnte rekke, idet fordypningene i første rekke befinner seg i det vesentlige radialt i flukt med fordypningene i andre rekke, (iii) første traulignende organer med en oppad-rettet helling mellom fordypningene i første rekke som.befinner seg i flukt med fordypningene i annen rekke for opprettelse av forbindelse mellom dem for væske som strømmer over fra en fordypning i første rekke til en fordypning i annen rekke som er radialt i flukt med førstnevnte fordyp ning som følge av sentrifugalkraft, (iv) flere organer for adskillelse av væskefase i det vesentlige radialt i flukt med fordypninger i annen rekke og tilpasset for rotasjon av det dreibare organ, (v) andre trau-lignende organer med en oppad-skrånende helling mellom fordypninger i andre rekke og organer for adskillelse av væskefaser, som befinner seg radialt i flukt med fordypningene, slik at det opprettes forbindelse mellom dem for væske som strømmer over fra en fordypning i annen rekke ppå grunn av sentrifugalkraft, hvorved.de andre, trau-lignende organer har en brattere helling enn de først-nevnte traulignende organer, slik at den sentrifugalkraft som kreves for at væske skal strømme over fra fordypningene i annen rekke, er større enn den sentrifugalkraft som kreves for å bringe væske til å strømme over fra fordypningene i første rekke.

30. Apparat som angitt i krav 29, karakterisert ved at organene for adskillelse av væskefaser foreligger i form av individuelt dreibart monterte kolonner tilpasset til å bli forskutt av sentrifugalkraft til posi-sjoner, hvor lengdeaksen av nevnte kolonner forløper i det vesentlige radialt med henblikk på skivens midtakse.