NO338606B1

NO338606B1 - Farmasøytisk sammensetning som omfatter primære dyrkede pre-adipocytter som stabilt opprettholder et fremmed gen som koder for lecitin-kolesterol-acyltransferase (LCAT); de primære dyrkede pre-adipocyttene for anvendelse i genterapi; en in vitro fremgangsmåte for fremstilling av dem; en implantat-sammensetning som omfatter dem og et ikke-humant dyr som er implantert med dem.

Info

Publication number: NO338606B1
Application number: NO20050248A
Authority: NO
Inventors: Yasushi Saito; Masashi Ito
Original assignee: Eisai R&D Man Co Ltd
Priority date: 2002-06-18
Filing date: 2005-01-17
Publication date: 2016-09-12
Also published as: NO20050248L; NO20160498L; NO340167B1

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse gjelder primære, dyrkede adipocytter for genterapi til hvilke ett eller flere fremmede gener er blitt overført.

Teknikkens stand

Dagens genterapi (Toyooka et al., Folia Pharmacol. Jpn. 116:158-162, 2000) kan klassefiseres i to grupper: (1) fremgangsmåter for overføring av terapeutiske gener til pasienter ved direkte administrering av virale vektorer, nakne plasmider eller lignende som koder for genet { in vivo), og (2) fremgangsmåter for midlertidig fjerning av celler fra pasienter, overføring av et gen til disse cellene og så tilbakeføring av disse cellene til pasienten (ex vivo). 1 in wVo-fremgangsmåtene gjenstår det fortsatt viktige problemer som må løses, slik som overføringseffektivitet, kontinuerlig ekspresjon og selektiv genoverføring til målceller. Ex v/Vo-fremgangsmåter kan, på den andre siden, potensielt overvinne disse problemene. Hovedmengden av eksempler på ex wVo-fremgangsmåter er blitt utført ved anvendelse av celler fra blodsystemet (perifere lymfocytter og benmargsceller), i og med at oppsamling og transplantasjon av disse er relativt enkelt og byrden på pasientene reduseres (Tani et al., Saishin Igaku, 56:258-267, 2001). Når det gjelder andre celler enn celler fra blodsystemet har fremgangsmåter som overfører gener til hepatocytter og så tilbakefører disse cellene til pasienten blitt utført (Raper, S.E. et al., Cell Transplant 2 (5): 381-400, 1993), men de fleste av disse fremgangsmåtene fokuserer på bedring, vedlikehold og forsterking av funksjonen til de transfekterte cellene selv. WO00/31267-A1 omhandler innføringen av insulingenet inn i muskelcellene ved anvendelse av retrovirus in vitro, og re-implementering av cellene i kroppen, som en behandling for diabetes. Nagamatsu S., et al, FEBS Lett. 2001, vol. 509, no 1, side 106-110 omtaler adeno-virus-mediert preproinsulin genoverføring til fettvev i mus. Hertzel AV, et al, J. Lipid Res. 2000, vol. 41, no. 7, side 1082-1086 omtaler adenovirus-mediert genoverføring til primære murine adipocytter. Ito M., et al., Diabetologia. 2005, vol. 48, no. 8, side 1614-1620 omtaler implantasjon av primære dyrkede adipocytter som skiller ut insulin.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Mens de foreliggende oppfinnere søkte etter celler som var egnede for ex vivo-genterapi utviklet de idéen om å anvende primære, dyrkede adipocytter. Bruk av adipocytter har følgende fordeler: (1) det foreligger mange rapporter om humorale faktorer som utskilles fra adipocytter, og adipocytter omfatter funksjonene som er forbundet med hormondannelse og kan fungere som sekretoriske organer (Bradley R.D., et al., Recent Prog. Horm. Res., 2001, 56, 329-358), (2) adipocytter kan lett samles opp, siden de også foreligger subkutant, og teknikker forbundet med ekstirpasjon av dem er blitt utviklet innen feltene plastisk og kosmetisk kirurgi, dessuten er disse cellene ikke heterotrope selv når de transplanteres til subkutant vev, noe som lett tillater implantering, i og med at de opprinnelig tilhørte dette område, (3) i og med at isolerte, primære, dyrkede adipocytter prolifererer aktivt, selv in vitro, er de egnede for fremgangsmåter slik som genoverføring, (4) i og med at adipocytter sannsynligvis vil forbli i et begrenset område etter implanteringen kan de transplanterte cellene om ønskelig ekstirperes etter implantasjonen (spesielt når man ønsker å eliminere gen-ekspresjonen), (5) i og med at adipocytter selv danner angiogene faktorer (Mick, G.J., et al., Endocrinology 2002, 143 (3): 948-53), kan en høy grad av innpoding forventes etter implanteringen, (6) ekstirpasjon eller implantering av adipocytter har liten virkning på den humane kroppen, siden vekten av dette organet varierer i stor grad hos voksne, og (7) adipocytter er viden om oppfattet som overflødige og obstruktive, og godkjenning av oppsamling av disse kan lett fremskaffes.

Selv om undersøkelser med lignende formål for tiden er i gang ved anvendelse av keratinocytter (J. Gene. Med. 2001 jan-febr, 3(1) : 21-31; Histochem. Cell. Biol. 2001 jan, 115 (1) : 73-82), så er det å fjerne den biologiske barriere som huden utgjør i prosessen med å isolere primærkulturen problematisk sett i lys av infeksjonsfaren. Smerten for pasienten under ekstirpasjonen og implantasjonen forventes å være alvorlig, og re-ekstirpasjon (4, nevnt ovenfor) for å fjerne ekspresjonen er ikke lett. Ved anvendelse av keratinocytter eller hud, som bare kan transplanteres todimensjonalt, kan mengden transplantat dessuten bare økes ved å øke overflatearealet av transplantatet. Av den grunn anses adipocytter, som tillater tredimensjonal transplantasjon, som mer anvendbare.

De foreliggende oppfinnere utformet fremgangsmåter for effektiv overføring av gener inn i primære, dyrkede adipocytter. De bekreftet også at de overførte genene er funksjonelle etter implantering og fant at adipocytter effektivt kan anvendes i genterapi. Dessuten kan adipocytter som stabilt uttrykker det overførte fremmede genet in vivo over lengre tidsrom fremskaffes ved fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse. De implanterte, modne adipocyttene kan fortsette å uttrykke fremmede gener i ett år eller lenger. Dersom ekspresjon av det fremmede genet blir unødvendig etter implantering av adipocytter kan dessuten ekspresjonen stoppes ved å fjerne transplantatet.

Den foreliggende oppfinnelsen vedrører følgende elementer:

1. Farmasøytisk sammensetning som omfatter en primær dyrket pre-adipocytt kjennetegnet ved at pre-adipocytten stabilt opprettholder et fremmed gen som koder for et protein som utskilles til cellens omgivelser, og hvor genet har blitt satt inn i en retrovirusvektor og har blitt overført til cellen av retrovirusvektoren, for anvendelse i genterapi, hvor proteinet er lecitin-kolesterol-acyltransferase (LCAT). 2. En primær dyrket pre-adipocytt kjennetegnet ved at at pre-adipocytten stabilt opprettholder et fremmed gen som koder for et protein som utskilles til cellens omgivelser, og hvor genet har blitt satt inn i en retrovirusvektor og har blitt overført til cellen av retrovirusvektoren, for anvendelse i genterapi, hvor proteinet

er LCAT.

3. Den farmasøytiske sammensetning ifølge element 1, eller pre-adipocytt ifølge element 2, hvor pre-adipocytten har evnen til signifikant å utrykke proteinet in

vivo i minst 20 dager.

4. Den farmasøytiske sammensetning ifølge element leller 3, eller pre-adipocytt ifølge element 2 eller 3, hvor pre-adipocytten anvendes for å frigi proteinet til

blodstrømmen.

5. En In vitro fremgangsmåte for fremstilling av en pre-adipocytt for anvendelse i genterapi, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter trinnene:

(1) primærdyrking av en pre-adipocytt, og

(2) overføring, og så stabilt bære et fremmed gen som koder for et protein som utskilles til cellens omgivelser,

hvor proteinet er LCAT.

6. Fremgangsmåten ifølge element 5, hvor det fremmede genet er overført ved hjelp av en retrovirusvektor. 7. Pre-adipocytt for anvendelse ifølge element 2, hvor den er fremstilt ved fremgangs-måten ifølge element 5 eller 6. 8. En implantat sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter en primær dyrket pre-adipocytt som stabilt bærer et fremmed gen som koder for et protein som utskilles til cellens omgivelser og hvor genet har blitt satt inn i en retrovirusvektor og har blitt overført til cellen av retrovirusvektoren, og et farmasøytisk

aksepterbart bærestoff, for anvendelse i genterapi, hvor proteinet er LCAT.

9. Implantat sammensetningen for anvendelse ifølge element 8, eller den farmasøytiske sammensetningen ifølge et hvilket som helst av elementene 1, 3, og

4, hvor det videre omfatter en ekstracellulær matriks komponent.

10. Implantat sammensetningen for anvendelse ifølge element 8 eller 9, eller den farmasøytiske sammensetningen ifølge et hvilket som helst av elementene 1, 3, 4

og 9 hvor det videre omfatter en angiogenese-faktor.

11. Et ikke-humant dyr kjennetegnet ved at dets kropp har blitt implantert med den primære dyrkede pre-adipocytten ifølge element 2.

I det påfølgende vil utførelsen av foreliggende oppfinnelse beskrives.

For det første tilveiebringer foreliggende oppfinnelse primære, dyrkede adipocytter for genterapi hvor adipocyttene stabilt bærer ett eller flere fremmede gener som koder for ett eller flere proteiner som utskilles til cellens omgivelser.

Her refererer et fremmed gen til et lecitin kolesterol asetyltransferase (LCAT) gen som er overført til primære, dyrkede adipocytter fra utsiden. Videre refererer primære, dyrkede celler til ikke-etablerte celler som dyrkes fra vev som er fjernet fra en levende kropp. Adipocytter refererer til modne adipocytter og celler som har evnen til å differensiere til fettvev, slik som pre-adipocytter. Mer spesifikt inkluderer begrepet, med mindre adipocyttene spesifikt sies å være "modne" adipocytter, også preadipocytter. Modne adipocytter er sfæriske celler som lagrer fett og inneholder lipiddråper. Fett som lagres i modne adipocytter kan påvises ved farging med "oil red 0". Modne adipocytter utskiller vanligvis leptin som respons på insulin. Preadipocytter foreligger normalt som stromalceller som ennå ikke har differensiert til modne adipocytter. Preadipocytter kan isoleres ved å behandle fettvev med kollagenase, eller kan isoleres som følge av deling av modne adipocytter ved anvendelse av "tak"-dyrkningsfremgangsmåten beskrivet nedenfor (Sugihara, et al. Nippon Rinsho 1995, 53, 115-120; Sugihara, H., et al. J. Lipid Res. 1987, 28, 1038-1045; Zhang H.H., et al. J. Endcriniol. 2000, 164, 119-128). Selv om forekomsten av adipocyttspesifikke overflateantigener ikke har blitt bekreftet så har et høyt nivå av CD36-ekspresjon og lignende blitt funnet i modne adipocytter (Abumrad N.A., et al., J. Biol. Chem. 1993 aug. 25, 268 (24): 17665-8). Av den grunn kan ekstremt rene adipocytter oppsamles ved anvendelse av slike molekyler som markører. Ved å indusere differensiering som beskrevet nedenfor kan preadipocytter differensiere til modne adipocytter i løpet av noen få dager til noen få uker (Hauner H., et al., J. Clin. Invest. 84, 1663-1670, 1989; Marko, et al., Endocrinology 136, 4582-4588, 1994). Primære, dyrkede adipocytter kan isoleres fra et ønsket vev, for eksempel subkutant fettvev eller visceralt fettvev, for eksempel vev som omgir epididymis eller mesenterialt vev.

Uttrykket "for genterapi" refererer til anvendelse av in wVo-ekspresjon av ett eller flere proteiner som kodes av ett eller flere fremmede gener i forventning om en terapeutisk virkning. Videre refererer celler for genterapi til celler som bærer ett eller flere fremmede gener, hvor cellene anvendes for administrering av det fremmede genet til et legeme ved ex wVo-tilførsel og hvor cellene har evnen til å uttrykke proteinet i legemet. Ex vivo-administrering refererer til å fjerne fettvev eller adipocytter fra et individ, utføre gen-overføring in vitro og så implantere cellene til det samme eller et annet individ.

Celler for genterapi referer fortrinnsvis til celler som anvendes for behandling av forstyrrelser, som er celler som er implantert slik at et spesifikt protein dannes. Fortrinnsvis omfatter behandling med et spesifikt protein erstatningsterapi, som benytter et protein hvis fysiske eller funksjonelle mangel eller fravær gir en forstyrrelse, eller nøytraliseringsterapi, som benytter et protein som har en virkning som kan nøytralisere faktorer som er årsaken til utløsning og forverring av en gitt sykdomsutvikling. Det spesifikke proteinet er LCAT som viser aktivitet i blodstrømmen eller som føres til et målvev via blodstrømmen og som fungerer på celleoverflaten i dette vevet. En kontinuerlig tilførsel av det spesifikke proteinet kreves også fortrinnsvis over et gitt tidsrom (for eksempel fra noen få dager til noen få uker eller mer). Faktorer eller forstyrrelser for hvilke proteinerstatningsbehandling allerede utføres eller hvor slik behandling forventes å være effektiv kan alle være mål.

I det påfølgende er representative mål listet opp ut ifra klassifiseringen av dem, men deres anvendelse skal ikke forstås å være begrenset til disse eksemplene, og anvendelse av lignende faktorer for lignende formål omfattes av oppfinnelsen.

Erstatningsterapi omfatter supplering mot forstyrrelser som utvikles eller forverres grunnet mangel på eller redusert funksjon av et hormon, supplering mot forstyrrelser som skyldes en medfødt genetisk defekt og supplering av en faktor for forbedring av en sykdomstilstand:

lecitinkolesterolacyl-transferase (LCAT)/LCAT-mangel

Videre er adipocyttene ifølge foreliggende oppfinnelse ikke begrenset til adipocytter anvendt for såkalt "terapi", men inkluderer celler som anvendes for in vivo-ekspresjon av et ønsket sekretorisk protein. For eksempel tillater fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilling av modelldyr ved a poster/on-ekspresjon av et gitt protein. Ved anvendelse av disse fremgangsmåtene kan sykdomsmodelldyr med a poster/ori-ekspresjon av patogenesefaktorer eller forverrende faktorer fremstilles, og disse dyrene kan anvendes for medikament-screening. Ved ekspresjon av sykdomsforbedrende faktorer kan disse fremgangsmåtene dessuten anvendes som bevis for arbeidshypoteser for oppdagelse av nye medikamenter hvor en gitt faktor forbedrer en patologisk tilstand. Dyrene som anvendes inkluderer ønskede, ikke humane dyr, og fortrinnsvis ikke-humane pattedyr (innbefattet gnagere og primater).

De primære, dyrkede adipocyttene for genterapi ifølge foreliggende oppfinnelse bærer stabilt ett eller flere LCAT-gener som koder for ett eller flere LCAT-proteiner som utskilles fra cellen. Uttrykket "bærer stabilt" betyr at det fremmede gen overføres til datterceller under celledelingen, og uttrykket refererer mer spesifikt til innføring av det fremmede genet i et kromosom i en celle. Adipocyttene for genterapi ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter ett eller flere LCAT-gener som er stabilt overført ved hjelp av en kromosomintegrerende virusvektor. LCAT-genet er overført med en retrovirusvektor.

Retrovirusvektoren integreres stabilt i et cellekromosom og har evnen til å uttrykke et overført gen i en lang periode. Vektorens overføringseffektivitet og fortsatt ekspresjon av det overførte genet avhenger av celletypen. For eksempel kan et gen overført med en retrovirusvektor vise fortsatt ekspresjon så lenge som cellene vokser, men ekspresjonen kan stoppe når celleveksten stopper (Lund, A.H., et al., J. Biomed. Sei. 1996, 3:365-378; Niwa, O. et al., 1983, Cell, 32:1105-1113). Ekspresjonen av fremmede gener observeres ofte å undertrykkes, særlig etter innføring av genet i et legeme ved in vivo- eller ex wVo-fremgangsmåter. Denne undertrykkelsen av ekspresjonen sies å omfatte de novo-metylering av promoteren eller den kodende sekvensen i det overførte genet (Jahner, D. og Jaenisch, R., Nature 315:594-597, 1985; Challita, P.-M. og Kohn, D.B., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 91:2567-2571, 1994; Hoeben, R.C. et al., J. Virol. 65:904-912, 1991). Dessuten er deacetylering av histoner involvert i slukkingen av det overførte genet (Chen, W.Y. et

al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 97:377-382, 2000; Chen, W.Y. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 94:5798-5803, 1997). Da de foreliggende oppfinnere overførte et fremmed gen til primære, dyrkede adipocytter ved anvendelse av en retrovirusvektor ble imidlertid overraskende nok, ekspresjonen av det overførte genet funnet å vedvare på en ekstremt stabil måte, både in vitro og in vivo. Ekspresjonen av overførte gener er stabil i adipocytter før differensiering, og også i modne adipocytter. Ekspresjonen av det overførte genet ble bekreftet å vedvare gjennom hele eksperimentets varighet for in vitro-kulturer (80 dager eller mer) og for hele eksperimentets varighet ved implantering i kroppen (360 dager eller mer). Primære, dyrkede adipocytter til hvilke ett eller flere fremmede gener er blitt stabilt overført kan derfor anvendes som implantater som stabilt uttrykker ett eller flere gener i en lang periode.

Adipocyttene for genterapi ifølge foreliggende oppfinnelse har evnen til signifikant ekspresjon av ett eller flere LCAT-proteiner som kodes av ett eller flere LCAT-gener i minst 20 dager eller mer in vitro, mer foretrukket in vivo. Begrepet "signifikant ekspresjon" betyr for eksempel at ekspresjon påvises i et statistisk signifikant nivå, sammenlignet med situasjonen når det fremmede genet ikke er overført (for eksempel med et signifikansnivå på 5 % eller med høyere signifikans). Mer foretrukket har adipocyttene ifølge foreliggende oppfinnelse når de transplanteres inn i et legeme evnen til signifikant ekspresjon av ett eller flere LCAT-proteiner som kodes av ett eller flere LCAT-gener i kroppen i minst 30 dager eller mer, fortrinnsvis 40 dager eller mer, mer foretrukket 50 dager eller mer, enda mer foretrukket 60 dager eller mer, ytterligere mer foretrukket 80 dager eller mer, enda mer foretrukket 100 dager eller mer, nok mer foretrukket 150 dager eller mer, ytterligere mer foretrukket 200 dager eller mer, enda mer foretrukket 250 dager eller mer, ytterligere mer foretrukket 300 dager eller mer og ytterligere mer foretrukket 350 dager eller mer.

Adipocyttene for genterapi ifølge foreliggende oppfinnelse er spesielt nyttige som celler for frigjøring av LCAT-proteiner, som kodes av LCAT-gener som bæres av cellene til blodstrømmen. LCAT-protein ene som frigis i blodstrømmer er ønskede sekretoriske proteiner som viser aktivitet i blodstrømmen eller på overflaten av celler i målvev,

Foreliggende oppfinnelse gjelder også fremgangsmåter for fremstilling av adipocytter for genterapi, hvor fremgangsmåtene omfatter trinnene:

(1) primær dyrkning av adipocytter, og

(2) overføring til cellene av ett eller flere LCAT-gener som koder for ett eller flere LCAT-proteiner som utskilles til cellens omgivelser, fortrinnsvis ved anvendelse av en retrovirusvektor eller en adenoassosiert virusvektor, slik at genet opprettholdes stabilt.

Foreliggende oppfinnelse gjelder også adipocyttene for genterapi som fremstilles ved denne fremgangsmåte. "Opprettholdes stabilt" betyr overføring av ett eller flere fremmede gener slik at det overføres til datterceller når cellen deler seg, og viser mer spesifikt til integrering av det fremmede genet i et kromosom i cellene. Southern-blotting eller PCR med genomisk DNA kan molekylær-biologisk påvise at det fremmede genet har oppnådd stabil ekspresjon ved at det er integrert i et kromosom. For oppkonsentrering av de stabilt transfekterte cellene kan dessuten for eksempel en fremgangsmåte som anvender fluorescensaktivert cellesortering (FACS), som oppkonsentrerer celler ved å gjenkjenne GFP som uttrykkes av cellene sammen med målgenet, anvendes.

1. Fremgangsmåter for oppsamling av primære, dyrkede adipocytter.

Primære, dyrkede adipocytter kan samles opp ved fremgangsmåter som er beskrevet i rapporten til Sugihara et al. (Sugihara, H. et al., Differentiation, 31:42-49, 1986). Nærmere bestemt ekstirperes fettvev, fortrinnsvis subkutant fettvev eller visceralt fettvev, for eksempel vev som omgir epididymis eller mesenteralt vev, fra implantat-mottageren og finfordeles så ved anvendelse av for eksempel en saks eller en skalpell etter vask med PBS. Dette finfordelte vevet behandles så ved omrysting ved 37 °C i et medium som omfatter en egnet mengde kollagenase, fortrinnsvis fra 1 til 3 mg/ml, over et egnet tidsrom, fortrinnsvis fra 20 til 60 minutter, og separeres så til et presipitert restmateriale og et flytende lag ved sentrifugering.

Det flytende laget vaskes fortrinnsvis én eller to ganger videre ved sentrifugering og overføres så til en dyrkningsflaske fylt med medium. Bobler fjernes og flasken inkuberes i en C02-inkubator for dyrking av cellene, slik at den konvensjonelle dyrkningsoverflaten er et tak ("tak"-kultur). Etter dyrking over et egnet tidsrom, fortrinnsvis fra 10 til 14 dager, samles celler som adhererer til takoverflaten ved trypsinbehandling. Disse cellene dyrkes så videre i et konvensjonelt dyrkningssystem.

Primære, dyrkede adipocytter kan lagres ved nedfrysning før eller etter genoverføring. Denne fremgangsmåten tillater flere gangers bruk av adipocytter etter en enkelt oppsamling.

2. Genoverføring til adipocytter

Genoverføring kan utføres ved anvendelse av genoverføringsreagenser (Fugene 6, Roche; Lipofectamin, Invitrogen; Cellphect transfeksjonssett (kalsiumfosfatfremgangs-måten), Amersham osv.), elektroporeringsfremgangsmåter (Chen, H. et al., J. Biol. Chem. 1997, 272(12), 8026-31), eller virusvektorer (Kay, M.A., et al., Nat. Med. 2001, 7, 33-40). Overføringen utføres fortrinnsvis ved anvendelse av virusvektorer, mer foretrukket ved anvendelse av retrovirusvektorer (se f.eks. Arai, T. et al., J. Virol., 1998, 72, s. 1115-21).

Dersom genoverføring utføres ved anvendelse av et plasmid transfekteres plasmidet inn i adipocytter, og de adipocytter som opprettholder det overførte, fremmede gen på stabil måte kan selekteres. Slike adipocytter kan for eksempel selekteres ved å uttrykke plasmidet som koder for det fremmede gen med et medikamentresistensgen eller ved å utføre transfeksjonen sammen med et plasmid som bærer et medikamentresistensgen, og så selektere de transfekterte cellene ved anvendelse av dette medikamentet. Ellers kan cellene fremskaffes ved å klone de transfekterte cellene ved begrenset fortynning-teknikker. Når genoverføring utføres ved anvendelse av et plasmid kan dessuten en fremgangsmåte for transient ekspresjon av en fag-avledet integrase anvendes for å øke effektiviteten av kromosomal insersjon (Mol. Cell Biol. 2001 juni, 21 (12) : 3926-34).

I foreliggende oppfinnelse er LCAT-genet overført til adipocytter ved anvendelse av en retrovirusvektor. Retrovirus refererer til virus som tilhører Retroviridae-familien og inkluderer oncovirus, skummende virus (Russell, D.W. og Miller, A. D., J. Virol. 1996, 70: 217-222; Wu, M. et al., J. Virol. 1999, 73:4498-4501), og lentivirus (foreksempel, HIV-1 (Naldini, L. et al., Science 1996, 272:263-267; Poeschla, E. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 1996, 93:11395-11399; Srinvasakumar, N. et al., J. Virol. 1997, 71:5841-5848; Zufferey, R., et al. Nat. Biotechnol. 1997, 15:871-875; Kim, V.N., et al., J. Virol. 1998, 72:811-816) og katte-immundefisiensvirus (Johnston, J.C. et al., J. Virol. 1999, 73:4991-5000; Johnston, J. og Power, C, J. Virol. 1999, 73-2491-2498; Poeschla, E.M. et al., Nat. Med. 1998, 4: 354-357)). En foretrukket retrovirusvektor for anvendelse i foreliggende oppfinnelse er en Moloney museleukemivirus (MoMLV)-vektor (T. M. Shinnick, R.A. Lerner og J.G. Sutcliffe, Nature 293, 543-548, 1981).

Retrovirusene kan være selvinaktiverende vektorer (SIN)-vektorer. En SIN-vektor kan fremstilles ved å fjerne en del av den 3' LTR under pakkingen av viruset (Yu S.F. et al.

(1986) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:3194; Yee, J.K. et al., 1987, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:5197-5201; Zufferey, R. et al., 1998, J. Virology, 72, 9873-9880). Det fremmede genet i retroviruset kan transkriberes med LTR som promoter, eller det kan uttrykkes fra en annen promoter inne i vektoren. Foreksempel kan en konstitutiv ekspresjonspromoter som CMV-promoteren, EF-la-promoteren eller CAG-promoteren eller en ønsket induserbar promoter anvendes. Videre kan en kimær promoter i hvilken en del av LTR er erstattet med en annen promoter anvendes.

For overføring av gener ved anvendelse av retrovirus overføres spesielt et plasmid som bærer et gen som skal overføres, slik som pBabe CL-SEAP-IRES-GFP, gen-overføres til pakkeceller, slik som 293-EBNA-celler (Invitrogen) ved anvendelse av et genoverførings-reagens eller lignende. Disse dyrkes så i et passende tidsrom, fortrinnsvis én til tre dager, og de dannede rekombinante virus i supernatanten samles opp. Disse virus anvendes så til infeksjon av adipocyttene som skal transfekteres.

Retrovirusvektorene omfatter fortrinnsvis et kappeprotein med bred tropisme slik at de kan infisere et bredt utvalg av pattedyrsadipocytter, innbefattet adipocytter fra mennesker. For eksempel kan amfotropisk kappeprotein anvendes (for eksempel 4070A)

(aksesjon K02729; Sorge, J. et al., Mol. Cell. Biol. 4 (9), 1730-1737 (1984)). I foreliggende oppfinnelse er retrovirusene fortrinnsvis pseudotypede (Emi, T. Friedman og J.K. Yee, J. Virol., 65 (3), 1202-1207 (1991); Yee, J.K. et al. (1994) Methods Cell Biol. 43 43:99-112; Burns, J.C. et al. (1993) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90 90:8033-8037) med vesikulært stomatittvirus G-protein (VSV-G) (Rose, J.K. og Gallione, C.J., J. Virol. 39 (2), 519-528

(1981)). Pseudotyping med VSV-G tillater svært effektiv overføring av gener til adipocytter. VSV-G-pseudotypet vektor kan fremstilles ved å uttrykke VSV-G i pakkeceller. Nærmere bestemt kan for eksempel pakkeceller som kan induseres til å uttrykke VSV-G med fordel anvendes (for eksempel Arai T. et al., J. Virol., 1998: 72, s. 1115-21).

Titeret av de dannede virusene kan bestemmes ved å infisere celler med virusløsninger som er blitt trinnvis fortynnet og å telle antall kolonier av infiserte celler (for detaljer, se Ausubel et al). (Ausubel, F.M. et al. red. (1995) Current Protocols in Molecular Biology. (John Wiley & Sons, NY)). Alternativt kan titeret bestemmes ved fremgangsmåten til Byun et al., (Byun, J. et al. (1996) Gene Ther. 33333:1018-1020), Tafuro et al. (Tafuro, S. et al. (1996) Gene Ther. 33333:679-684). Miyao et al. (Miyao, Y. et al (1995) Cell Struct. Funct. 20 20:177-183), Claudio et al. (Claudio, P.P. et al. (2001) Anal Biochem. 291: 96-101) eller Cashion et al. (Cashion, LM. et al. (1999) Biotechniques 26: 924-930).

Primære, dyrkede adipocytter kan tilføres virusvektorer ved å sette vektorene i kontakt med cellene. For eksempel inkuberes primære, dyrkede adipocytter i en dyrknings-løsning som omfatter virusvektorer. Adipocytter infiseres fortrinnsvis i form av preadipocytter. Infeksjonseffektiviteten kan økes ved å tilsette 0,5 til 8^g/ml eller så av polybren. Infeksjonsmultiplisitet (MOI) er ikke spesielt begrenset, men kan på egnet vis justeres innenfor området fra 0,1 til 100. Gen-tilførte celler kan selekteres ved anvendelse av for eksempel et markørgen. Men hvis infeksjonen utføres ved en MOI på tilnærmet 2 eller mer, mer foretrukket tilnærmet 3, 4, 5 eller mer, kan genet overføres til de fleste celler, selv uten seleksjon. De gen-tilførte adipocyttene kan anvendes for implantering uten ytterligere behandling, eller de kan i visse tilfeller overdannes til modne adipocytter ved dyrking i et medium som omfatter 3-isobutyl-l-metylxantin (IBMX), deksametason og insulin. In slike tilfeller, siden IBMX og deksametason hovedsakelig anvendes for aktivering av adipocyttenes peroksisom-proliferatoraktiverte reseptor-y (PPAR-y), kan medikamenter som direkte aktiverer denne reseptoren (for eksempel tiazolidinderivatene, pioglitazon/Takeda Pharmaceutical Company Limited og rosiglitazon/GlaxoSmithKline) tilsettes samtidig.

De primære, dyrkede adipocyttene ifølge foreliggende oppfinnelse som bærer et ønsket terapeutisk LCAT-gen kan implanteres i kroppen til en immunologisk matchet mottaker, slik at genterapi muligjøres ved in wVo-ekspresjon av det sekretoriske proteinet som kodes av det terapeutiske genet. De primære, dyrkede adipocyttene som skal implanteres er fortrinnsvis celler fra den samme verten som mottaker. Genterapifremgangs-måtene i hvilke de primære, dyrkede adipocyttene ifølge foreliggende oppfinnelse implanteres kan benyttes for ekspresjon av et ønsket LCAT sekretorisk protein i et legeme i forventning om det proteinets virkninger. For eksempel kan en forstyrrelse behandles eller forebygges ved å implantere adipocyttene ifølge foreliggende oppfinnelse som opprettholder ett eller flere fremmede LCAT-geners som koder for ett eller flere LCAT-proteiner som har en terapeutisk eller forebyggende virkning på forstyrrelsen. Dessuten angår foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter for frigivelse av proteiner i blodstrømmen hvor fremgangs-måtene omfatter trinnet å administrere de primære, dyrkede adipocyttene ifølge foreliggende oppfinnelse til et legeme. Ved anvendelse av disse fremgangsmåtene kan LCAT-protein et som kodes av et LCAT-gen i signifikant grad utskilles i blodstrømmen i minst 20 dager eller mer, fortrinnsvis 30 dager eller mer, mer foretrukket 40 dager eller mer, enda mer foretrukket 50 dager eller mer, ytterligere mer foretrukket 60 dager eller mer, enda mer foretrukket 80 dager eller mer, ytterligere mer foretrukket 100 dager eller mer enda mer foretrukket 150 dager eller mer, ytterligere mer foretrukket 200 dager eller mer, enda mer foretrukket 250 dager eller mer, ytterligere mer foretrukket 300 dager eller mer og enda mer foretrukket 350 dager eller mer. Det fremmede LCAT-genet som uttrykkes i kroppen kan påvises og/eller kvantifiseres ved for eksempel immunanalyser slik som EIA. Fjerning av de transplanterte cellene kan stanse ekspresjonen av det administrerte fremmede LCAT-genet når som helst. I visse tilfeller kan, ved overføring av et induserbart selvmords-gen (f. eks. HSV-tk) til de transplanterte cellene, de transplanterte cellene elimineres ved administrering av for eksempel ganciclovir.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også implantat sammensetninger for genterapi hvor sammensetningene omfatter primære, dyrkede adipocytter som stabilt bærer ett eller flere LCAT-gener som koder for ett eller flere LCAT-proteiner som utskilles til cellens omgivelser og farmasøytisk aksepterbare bærestoffer. Eksempler på slike bærestoffer er fysiologisk saltvann, fosfatbuffer, dyrkningsløsninger, serum og kroppsvæsker. Disse kan også kombineres med et fast eller gelformet støttemiddel som blir en plattform for cellene.

Implantat-sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter fortrinnsvis en ekstracellulær matriks (ECM) komponent. En ekstracellulær matriks komponent refererer til en komponent slik som et protein eller mucopolysakkarid, som inngår i et uløselig nettverk eller en fibrøs struktur som akkumuleres mellom celler. De kan isoleres fra organismer eller kunstig rekonstrueres. ECM-komponenter som fortrinnsvis anvendes i foreliggende oppfinnelse er kollagen, fibronektin, vitronektin, laminin, heparan-susulfat, proteoglykan, glykosaminoglykan, kondroitinsulfat, hyaluronat, dermatansulfat, keratinsulfat, elastin, eller kombinasjoner av to eller flere av de oven nevnte. Disse ECM-komponentene er fortrinnsvis utformet til en gel og så blandet med adipocytter. ECM-geler som anvendes i foreliggende oppfinnelse er ikke spesielt begrenset så lenge som minst én eller flere av de ovenfor nevnte komponentene er omfattet, men de omfatter fortrinnsvis minst type IV kollagen, laminin og heparan-sulfat. Slike ECM inkluderer et substrat ekstrahert fra Engelbreth-Holm-Swarm musetumor ("Matrigel") (Becton Dickinson Labware) (US patentskrift nr. 4,829,000). Strukturen av sammensetningene som omfatter ECM-komponenten og adipocyttene som anvendes i foreliggende oppfinnelse er ikke spesielt begrenset og kan for eksempel være en gel- eller pasta nettverksstruktur, en fibrøs struktur, en flat (disk) struktur, en bikakestruktur og en svamplignende struktur. ECM-komponentene kan overføres til geler ved anvendelse av konvensjonelle fremgangsmåter. Geldannelsen kan for eksempel utføres ved å inkubere en vandig løsning som omfatter tilnærmet 0,3 til 0,5 % kollagen ved 37 °C i ti til 30 minutter. Ellers kan ECM-komponenter overføres til geler ved anvendelse av et geldanningsmiddel.

Dessuten omfatter implantat-sammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse fortrinnsvis en angiogenesefaktor. Implantat-sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse som omfatter en angiogenese-faktor forårsaker at blodkar dannes rundt dem etter implanteringen og kan skille ut et fremmed protein i blodstrømmen ved høyere effektivitet. Angiogenesefaktorene er ikke spesielt begrenset så lenge som de er faktorer som kan induserer angiogenes in vivo, og eksempler er vaskulær endotelcellevekstfaktor (VEGF), basisk fibroblastvekstfaktor (bFGF), sur fibroblastvekstfaktor (aFGF), blodplate-avledet vekstfaktor, transformerende vekstfaktor-(3 (TGF-p), osteonektin, angiopoietin og hepatocyttvekstfaktor (HGF). Det mest foretrukne eksempel er bFGF. bFGFer, som også kalles FGF2, er ikke bare fibroblastvekstfaktorer, men har også aktivitet som fremmer veksten av flere celler som vaskulære endotelceller, brusk, osteoblaster og epidermceller (Abraham et al., EMBO J., 5, 2523-2528, 1986; Prats et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 86, 1836-1840, 1989). De bFGFer som anvendes i foreliggende oppfinnelse er ikke bare naturlige proteiner, men kan også være fremstilt ved gen-sløyd ved rekombinant DNA-teknologi og modifiserte former av disse. Eksempler på bFGFer er de som beskrives i WO87/01728, WO89/04832, WO86/07595, WO87/03885, europeiske patentsøknader med publikasjonsnr. 237966, 281822, 326907, 394951 og 493737. Alternativt kan en annen ekspresjonsvektor som transient uttrykker en angiogenese-faktor innføres i adipocyttene (se W097/49827). Hovedformålet med angiogenesefaktorer anvendt på denne måte er å danne blodkar rundt de transplanterte cellene slik at det fremmede protein effektivt kan utskilles i blodstrømmen fra adipocyttene ifølge foreliggende oppfinnelse. Ved anvendelse av en vektor som koder for en vaskulaturinduserende faktor for ekspresjon av denne vaskulær-induserende faktor fra adipocytter foretrekkes derfor anvendelse av en transient ekspresjonsvektor (mer spesifikt en vektor som ikke inkorporeres i kromosomet). Når adipocyttene uttrykker en vaskulær-induserende faktor i en lang periode dannes overskudds mengder av blodkar rundt de implanterte adipocyttene, noe som kan gi systemiske bivirkninger. Det foretrekkes derfor at det fremmede gen som koder for en angiogenese-faktor ikke overføres stabilt til de primære, dyrkede adipocyttene ifølge foreliggende oppfinnelse.

3. Implantasjon av adipocytter

Gen-tilførte adipocytter fremstilles i en egnet cellekonsentrasjon, fortrinnsvis 0,2 x IO<7>til 2 x IO7 celler/ml eller 0,2 x IO6 til 5 x 106 celler/ml dersom de er transfektert med et retrovirus. De infuseres så i det subkutane vevet eller fettvevet, fortrinnsvis det subkutane vevet, eller ved blanding med et effektivt medium, fortrinnsvis en løsning som omfatter en ekstracellulær matriks slik som kollagen. Injeksjon i fettvev kan utføres ved å lage et snitt og eksponere fettvevet. Celler som har differensiert terminalt til modne adipocytter vil ikke proliferere etter transplantasjonen og vil uttrykke det fremmede gen i en lang periode ved et konstant nivå. Ekspresjonsnivået av et fremmed gen i et legeme som mottar et implantat er proporsjonalt med antall implanterte celler. Ved utføring av en implantasjon kan derfor et ønsket ekspresjonsnivå opprettholdes i en lang periode i et legeme som mottar et implantat ved å justere mengden av adipocytter som implanteres, for å tilpasses til et forhånds-målt ekspresjonsnivå in vitro av det fremmede gen.

Kort beskrivelse av fi<g>urene

Fig. 1 er et sett med mikrofotografier av primære, dyrkede adipocytter isolert fra subkutant fett fra tre uker gamle ICR-mus. (A) viser adipocytter som adhererte til tak-sidedyrkningsoverflaten etter 14 dagers "tak"-dyrkning, (B) viser primære, dyrkede adipocytter dyrket i normal kultur, (C) viser modne adipocytter som har lagret lipiddråper grunnet induksjon av differensiering, og (D) viser et "oil red 0"-farget bilde av celler indusert til differensiering. Fig. 2 viser aktiviteten av alkalisk fosfatase (AP) i plasma oppnådd ved å implantere ICR nakenmus med primære, dyrkede adipocytter (avledet fra subkutant fett fra ICR-mus) som er transient transfektert med AP-uttrykkende plasmid pcDNA3.1-SEAPmh. Fig. 3 viser en sammenligning av genoverføringseffektiviteten når retrovirus vektor MLV(VSV)/pBabeCL (PLAP) IP transduseres til primære, dyrkede adipocytter avledet fra forskjellige fettvev. Fig. 4 er et sett med mikrofotografier som viser bilder av induksjonen av differensiering av primære, dyrkede adipocytter transdusert med MLV(VSV)/pBabeCL (GFP)IP. (A) og (B) viser henholdsvis et lysmikrofotografi og et GFP-fluorescens-fotografi av det samme synsfelt. Fig. 5 viser varigheten av AP-ekspresjon i subkulturer av primære, dyrkede adipocytter transdusert med en AP-uttrykkende virusvektor. (A) viser resultatet av overføring av SEAP-gen (MLV/VSV)/pBabeCL (SEAPmh) I2G) eller PLAP-gen (MLV(VSV)/pBabeCL(PLAP)IP til celler avledet fra subkutant fett fra C57BL/6-mus. (B) viser resultatet av overføring av PLAP-gen (MLV(VSV)/pBabeCL (PLAP)IP) eller GFP-gen (MLV(VSV)/pBabeCL (GFP) IP) til adipocytter avledet fra ICR-mus. Fig. 6 er et sett med fotografier og en kurve som viser endringen i ekspresjon i differensieringsinduserte gen-tilførte adipocytter. (A) viser et GFP-lysmikroskopbilde av primære, dyrkede adipocytter under ikke-differensieringsinduserende betingelser hvor adipocyttene, som er transfektert med MLV(VSV)/pBabeCL (GFP) IP, er avledet fra ICR subkutant fett. (B) viser et tilsvarende GFP-mikroskopbilde tatt under differensieringsinduserende betingelser. (C) viser AP-dannelsen fra MLV(VSV)/pBabeCL (PLAP) IP-transfekterte primære, dyrkede adipocytter (avledet fra ICR subkutant fett) under ikke-differensieringsinduserende betingelser (ikke-differensiering) og

differensieringsinduserende betingelser (differensiering).

Fig. 7 viser (pro)-insulinproduksjonen ved plasmidtransfeksjon inn i primære, dyrkede adipocytter. Fig. 8 viser den stabile ekspresjon av AP i primære, dyrkede adipocytter (avledet fra subkutant fett fra C57BL/6-mus) transfektert med AP-uttrykkende AAV. Fig. 9 viser insulinekspresjonen på tidspunktet for induksjon av differensiering i primære, dyrkede adipocytter transfektert med den insulinuttrykkende retrovirusvektoren sls2B10. (A) viser resultatene ved anvendelse av en EIA produsert av Morinaga og (B) viser resultatene ved anvendelse av en EIA produsert av IBL. Fig. 10 viser ekspresjonen av GLP-1 (7-37) i primære, dyrkede adipocytter transfektert med en GLP-1 (7-37)-uttrykkende retrovirusvektor. Målingene ble gjort i triplikat, og deres gjennomsnittsverdier og standardavviket er vist. Fig. 11 viser virkningen av nærvær eller fravær av stimulering av induksjon av differensiering før implantasjonen på AP-ekspresjonen in vivo ved implantasjon av AP-uttrykkende primære, dyrkede adipocytter. Fig. 12 er et sett med grafer og et fotografi. (A) viser endringen i AP-aktivitet i plasma når AP-uttrykkende primære, dyrkede adipocytter implanteres i nærvær av stimulering av differensiering ved anvendelse av en basisk FGF-supplert Matrigel. (B) viser tap av AP-aktivitet i plasma etter ekstirpasjon av den implanterte Matrigel (individ A). (C) viser et GFP-lysmikroskopibilde av Matrigel ekstirpert fra kontrollgruppen, som ble tilført GFP-transfekterte celler. For den PLAP-implanterte gruppen som er vist i (A) er de viste verdier gjennomsnittet for gruppen og standardavviket for verdier målt for hvert individ opp til dag 32. De gjenværende verdier er gjennomsnittsverdier. Fig. 13 viser resultatene av lang-tids-undersøkelsen av AP-aktiviteten i blod hos mus tilført et implantat ved fremgangsmåten ifølge Fig. 12 (A) og ved en rekke andre fremgangsmåter. Fig. 14 viser resultatene av utførelse av en ekstirpasjonstest tilsvarende den i Fig.

12 (B) i sent stadium av transplantasjonen.

Fig. 15 viser avhengigheten av blod AP-aktivitet på antall implanterte celler ved implantasjon av AP-uttrykkende adipocytter. De angitte verdier er gjennomsnittsverdien for gruppen og standardavvik for målingene i hvert individ. Fig. 16 viser virkningen av implantasjon av sls2B10-insulinuttrykkende adipocytter til STZ-induserte diabetiske mus. (A) viser virkningen på glukosenivået i fastende plasma, og (B) viser virkningen på kroppsvekt. De angitte verdier er gjennomsnittet for gruppen og standardavvik for målingene i hvert individ.

Den beste måten for utførelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse vil nå beskrives i detalj nedenfor ved henvisning til eksempler.

[Eksempel 1] Primærdyrking av museadipocytter

[Metoder]

Tre uker gamle ICR-hannmus eller fire til fem uker gamle C57BL/6-hannmus (begge fra Charles River) ble bedøvet med dietyleter og avlivet ved oppsamling av helblod fra hjertet. Deretter ble ingvinalt subkutant fett eller fett som lå rundt epididymis og mesenterisk fettvev ekstirpert individuelt under sterile betingelser. De ekstirperte vevene ble vasket med PBS og så finfordelt ved anvendelse av en saks eller en skalpell. Dette finfordelte vevet ble fordøyet under omrysting ved 37 °C i 20 til 60 minutter i normalmedium (DMEM-høy glukose/SIGMA, 10 % FCS) tilsatt 1 mg/ml kollagenase (Si-fra ksj on/N itta gelatin) og så separert i presipitert materiale og suspendert lag ved sentrifugering (300 g, fem minutter).

Det flytende laget ble ytterligere sentrifugert én eller to ganger for å fjerne kollagenasen ved fortynning, og så overført til en T-25-flaske (IWAKI) fylt med medium. Bobler ble fjernet, og cellene ble dyrket under en 5 % C02-atmosfære i en C02-inkubator ved 37 °C slik at den konvensjonelle dyrkningsoverflate var overside ("tak"-kultur). Etter ti til 14 dagers dyrkning ble cellene som adhererte til takoverflaten samlet opp ved trypsinbehandling og overført til et normalt dyrkningssystem. Subdyrking ble så utført i en ratio på 1:3 til 1:10.

For å indusere differensiering ble medium med celler dyrket til konfluens i en 6-brønners plate overført til et induksjonsmedium (normalmedium supplert med 0,5 mM IBMX, 0,25^M deksametason, og 10^g/ml insulin). Denne stimuleringen fortsatte i 48 timer. Deretter ble cellene differensiert i et modningsmedium (normalmedium tilsatt 10 \ ig/ m\ insulin). Modningsmediet ble byttet hver tredje dag.

"Oil red 0"-fargeløsning ble fremstilt ved å blande en stamløsning, fremstilt ved å løse 0,3 g "oil red O" i 100 ml isopropanol (99 %), med destillert vann i et 3:2 ratio like før bruk. Cellene ble vasket med PBS og så fiksert med en 10 % nøytral formalinløsning (WAKO). Etter ny vask med PBS ble cellene farget med "oil red 0"-fargeløsning ved romtemperatur i ti minutter. Cellene ble igjen vasket med PBS og så undersøkt med mikroskop.

[Resultater]

Fig. 1 er et sett med mikrofotografier av primære, dyrkede adipocytter isolert fra subkutant fett fra tre uker gamle ICR-mus. Etter 14 dager med "tak"-dyrking ble adhesjon av adipocytter som inneholdt lipiddråper observert på tak-siden av dyrkningsoverflaten (A). Når disse cellene ble overført til et normalt dyrkningssystem viste de fibroblastlignende vekst, som vist i (B). Men når differensiering ble indusert med IBMX, deksametason, og insulin differensierte cellene igjen til modne adipocytter som inneholdt lipiddråper (C). Lagret fett ble farget rødt med "oil red 0"-farging (D). Celler isolert ved denne fremgangsmåten ble vist å være primære, dyrkede adipocytter med evnen til å differensiere.

[Eksempel 2] Transient overføring av et gen for varmestabil, sekretorisk alkalisk fosfatase (AP) til primære, dyrkede adipocytter og implantering av transfekterte adipocytter i mus.

Som et modellsystem for genekspresjon ble AP-genet, nærmere bestemt SEAP-genet (Clontech) eller PLAP-genet (Goto, M. et al. Mol. Pharmacol, bind 49860-873 (1996)) overført til primære, dyrkede adipocytter, og endringer i AP-aktiviteten ble undersøkt.

(Begge AP-genprodukter er varmestabile og kan lett skilles fra endogene alkaliske fosfataser ved varmebehandling).

[Fremgangsmåter]

(1) Fremstilling av primære, dyrkede adipocytter som er transient transfekter med SEAP-genet

Det AP-uttrykkende plasmidet (pcDNA3.1-SEAPmh) ble konstruert ved å innsette SEAP-sekvensen, oppnådd ved dobbeltkutting av pSEAP2-basisvektor (Clontech) med restriksjonsenzymene Hindlll - Xbal, inn i Hindlll- Xbal- setet i pcDNA3.1Myc-HisA (Invitrogen), som er en vektor for ekspresjon i pattedyrceller.

For hver genoverføring ble 500^1 FCS-fritt DMEM-medium og 15^1 Fugene 6-reagens (Roche) blandet i en 10 cm skål, hvoretter 5^g pcDNA3.1-SEAPmh ble tilsatt. Denne blandingen ble etterlatt ved romtemperatur i 15 minutter. Denne blanding ble tilsatt til primære, dyrkede celler (avledet fra ICR-subkutant fett) dyrket til 70 til 80 % konfluens i en 10 cm skål. Dette ble så dyrket i 24 timer i en C02-inkubator.

(2) Implantering av mus med primære, dyrkede adipocytter tilført genet for alkalisk fosfatase

Gen-tilførte celler ble oppsamlet ved trypsinbehandling og vasket to ganger med PBS ved sentrifugering. Cellene ble så suspendert i PBS som 1 x IO<7>celler/ml. Dyrene (ICR nakenmus, fem uker gamle på operasjonstidspunktet) ble bedøvet ved intraperitoneal tilførsel av 50 mg/kg natriumpentobarbital (Nembutal; Dainippon Pharmaceutical). Etter desinfeksjon av området som skulle opereres med fortynnet Hibitan-løsning (Sumitomo Pharmaceuticals) ble et tilnærmet 3 mm til 5 mm snitt lagd i huden nær roten av høyre bakben, og det ingvinale subkutane fettet ble eksponert. 0,55 ml av den fremstilte cellesuspensjon (5,5 x IO<6>celler/hode) ble overført til en 1 ml sprøyte og injisert i det subkutane fettet ved anvendelse av en 22 G injeksjonskanyle. Som kontroll ble PBS injisert i samme sete. For å sammenligne dette med proteinsupplerings-fremgangsmåten ble 1^g renset AP (Roche) løst i PBS under sterile betingelser og dette ble injisert på tilsvarende måte. Snittet i huden ble sydd sammen og operasjonssetet desinfisert med kirurgisk Isodine (Meiji Seika).

Blod ble oppsamlet fra den postorbitale pleksusvenen ved anvendelse av et heparinbelagt kapillar (Dramond) før implanteringen (dag 0) og på forskjellige tidspunkter etter implantasjonen. Plasma ble fremskaffet fra helblod ved sentrifugering ved 2000 g i 15 minutter. AP-aktiviteten i dette plasma ble målt ved anvendelse av et analysesett (analysesett for SEAP-rapportergen, Roche) ved å følge de vedlagte instruksjoner.

[Resultater]

Fig. 2 viser AP-aktiviteten i plasma oppnådd ved implantering av mus med primære, dyrkede celler som var trasient transfektert med alkalisk fosfatase (AP)-uttrykkende plasmid pcDNA3.1-SEAPmh. For sammenligningsformål ble mus administrert med 1^g renset AP-protein (Roche) ved injeksjon. Syv dager etter administrering hadde AP-aktiviteten i blodet hos disse musene gått ned til kontrollnivået. På den andre siden ble AP-aktiviteten i blod hos mus som var gitt et implantat av celler som var transient transfektert med gener vist å nå en topp på dag 4 etter implantering, og varigheten av ekspresjonen var 14 dager. Varigheten av ekspresjon in vivo ved implanteringen av celler som inneholdt transient transfekterte gener var kort, og konsentrasjonen i blodet ble funnet å variere stort, selv om aktiviteten varte lenger enn ved injeksjon av protein.

[Eksempel 3] Fremstilling av adipocytter som stabilt uttrykker AP ved anvendelse av en virusvektor

[Fremgangsmåter]

(1) Konstruksjon av AP- ekspresjonsvektorer og kontroll-GFP-ekspresjonsvektorer

PLAP-genet ble kuttet ut av pTK-PLAP ved anvendelse av Hindlll og Bglll, som beskrevet i litteraturen (Goto, M. et al. Mol. Pharmacol. vol. 49, 860-873 (1996)). SEAP- genet ble fremskaffet ved kutting av pcDNA 3.1.SEAPmh med Hindlll/ Pmel. GFP-genet ble kuttet ut av pEGFP-N2 ved anvendelse av Notl- Ncol.

Plasmidet, pBabeCLXI2G, som ble anvendt for virusvektorfremstilling, ble fremstilt basert på pBabePuro (Morgenstern, J.P. et al. Nucleic Acids Res. bind 18, 3587-3596

(1990)), ved å kutte ut SV40-promoteren og neomycinresistensgenene ved anvendelse av Sall- Clal, buttende disse endene med Klenow-fragmenter og så erstatte disse med det interne ribosomgjenbindingssete (IRES) fra encefalomyokardittvirus (EMCV), som var kuttet ut fra pIRES2-EGFP ved Hincll- Hincll, og det grønne fluorescerende proteinet (GFP), og så erstatte delen fra den lange enderepetisjon (LTR) til innsettingssetet for det fremmede gen (flerkloningssetet) ( Sspl- BamHl) med en sekvens som tilsvarer ( Sspl-BamHl) fra pCLXSN (IMGENEX). Dessuten ble pBabeCLXIP, hvor IRES-GFP-delen av pBabeCLXI2G var erstattet med IRES-puromycinresistensgenet, også anvendt.

Hver av DNA-f rag mentene med de ovenfor nevnte PLAP, SEAP, og GFP ble gjort buttendet med Klenow-fragmenter og så innsatt i vektoren pBabeCLXIP eller pBabeCLXI2G kuttet med Hpa I, for erholdelse av pBabeCL (PLAP) IP, pBabeCL (SEAPmh) I2G, og pBabeCL (GFP) IP.

(2) Fremstilling av virusvektorer

Hver genoverføring til en 10 cm skål ble utført som følger: 30^1 plasmidtransfeksjonsreagens TransIT (MIRUS) ble blandet med 500^1 FCS-fritt DMEM-medium og etterlatt ved romtemperatur i fem minutter (blandet DMEM/TransIT-løsning). I et separat rør ble 3,3^g av en vektor som kodet for VSV-G (pCALG, modifisert ifølge Arai, T. et al., J. Virol., 1998, 72, s. 1115-21), 3,3^g av en vektor som kodet for Gag-Pol (pCLAmpho/RetroMax system (IMGENEX)), og 3.3^g av en vektor som omfatter et pakkesignal og genet som skulle overføres (pBabeCL (PLAP) IP, pBabeCL (SEAPmh)I2G eller pBabeCL (GFP) IP, ble blandet sammen, i alt 9,9^g (plasmidløsning). Plasmidløsningen ble tilsatt til den blandede DMEM/TransIT-løsningen, grundig blandet sammen og så etterlatt ved romtemperatur i 15 minutter. Dette ble så tilsatt til 293-EBNA-celler (Invitrogen), dyrket over natten fra 2x 10<6>celler/10 cm skål fra foregående dag.

Mediet ble byttet åtte timer etter tilsetning, og kultursupernatanten ble samlet opp etter ytterligere to dagers dyrking. Den oppsamlede kultursupernatanten ble sentrifugert (300 g, 5 minutter) eller filtrert gjennom et 0,45^1 sprøytefilter (Millipore) for fjerning av kontaminanter, og denne supernatanten ble benyttet som virus løsning for henholdsvis (MLV(VSV)/pBabeCL (PLAP) IP, MLV(VSV)/pBabeCL (SEAPmh)I2G, og MLV(VSV)/pBabeCL (GFP/ IP. Noe av virussuspensjonen ble oppkonsentrert ved ultrasentrifugering (19500 rpm, 100 minutter) og så anvendt.

(3) Genoverføring til og dyrking av primære, dyrkede adipocytter.

Adipocytter som skulle anvendes for genoverføring (avledet fra subkutant fett, fett som omgir epididymis og mesenterisk fett fra ICR-mus og subkutant fett fra C57BL/6-mus) ble dyrket i 6-brønners eller 96-brønners plater slik at de var 50 til 80 % konfluente dagen før transfeksjonen. Mediet ble fjernet, og like mengder av 4^g/ml Polybrene (SIGMA)-løsning og virussuspensjon ble tilsatt til cellene for transduksjon av virusvektoren. Åtte timer etter transduksjonen ble mediet byttet med normalmedium, og videre dyrking og subdyrking ble utført. AP-aktiviteten i en porsjon av cellene ble målt ved å oppsamle den 24-timers kultursupernatanten på dag fire etter transfeksjonen (Fig. 3).

Subdyrkingen ble utført ifølge fremgangsmåten i Eksempel 1 i 10 cm skål-skala. Cellene ble dyrket i fire til syv dager, og mediet ble byttet når de nådde konfluens. AP-aktiviteten ble målt i kultursupernatanten 17 timer senere. Disse cellene ble kontinuerlig sub-kultivert, og ved å utføre tilsvarende manipuleringer på egnet vis ble opprettholdelsen av ekspresjonen undersøkt (Fig. 5 og 6). AP-aktiviteten ble ikke målt hver gang cellene ble sub-kultivert.

Differensiering ble indusert i 6-brønners plater ifølge fremgangsmåten i Eksempel 1. Behandlingen ble imidlertid utført over tre dager med induksjonsmedium som ble erstattet med modningsmedium hver tredje dag etter dette. AP-aktiviteten i kultursupernatanten ble målt ved anvendelse av kultursupernatant oppnådd hver tredje dag, og x-aksene i figurene viser hvilken dag supernatanten var oppsamlet på. For de GFP-transfekterte cellene ble mikrofotografier tatt under egnet GFP-lys (Fig. 4 og 6). Ikke-differensieringsinduserende betingelser viser til betingelser hvor dyrkingen fortsettes i normalmedium istedenfor i induksjonsmedium eller modningsmedium.

[Resultater]

Fig. 3 er en sammenligning av genoverføringseffektiviteten for hver type vevs-avledet celle ved anvendelse av retrovirusvektoren AP-aktivitet ble bekreftet i kultur-supernatanten for alle celler når genoverføringen ble utført på de primære, dyrkede adipocytter isolert fra hvert av fettvevene som foreligger i det ingvinale, subkutane vevet, området rundt epididymis og mesenterium hos ICR-mus. Dette viste at retrovirusvektorene kan overføre gener uavhengig av stedet for cellenes opprinnelse. Fig. 4 er et sett med mikrofotografier som viser bilder fra induksjonen av differensiering av celler transdusert med en GFP-uttrykkende retrovirusvektor. Induksjon av differensiering ble innledet 13 dager etter genoverføringen, og fotografiene ble tatt tre uker senere. GFP-fluorescens ble observert i celler som inneholdt lipiddråper, noe som viser at virusvektoren kan overføre gener til preadipocytter som har evnen til å differensiere og at genoverføring ved vektoren ikke påvirker cellenes evne til å differensiere. Fig. 5 viser ekspresjonsforløpet i subkulturene av primære, dyrkede adipocytter transfektert med en AP-uttrykkende virusvektor. AP-aktiviteten ble målt i kultursupernatant tatt 17 timer etter at cellene nådde konfluens i en 10 cm skål. Kontinuerlig AP-produksjon ble bekreftet over de 87 dagene hvor primære, dyrkede adipocytter avledet fra subkutant fett fra C57BL/6-mus ble undersøkt (A), og over de 63 dagene hvor primære, dyrkede adipocytter avledet fra subkutant fett fra ICR-mus ble undersøkt (B). Disse resultatene viste at transduksjon av virusvektoren til primære, dyrkede adipocytter kan gi celler med stabil ekspresjon som kan opprettholde de fremmede genene i dattercellene som dannes etter celledeling.

Fig. 6 er et sett med fotografier og en graf som viser endringer i ekspresjonen i differensieringsinduserte adipocytter med tilførte gener. GFP-uttrykkende adipocytter avledet fra subkutant fett fra ICR-mus viste kraftig GFP-ekspresjon under både normale dyrkningsbetingelser (A) og differensieringsinduserende betingelser (B). Videre viste AP-uttrykkende adipocytter avledet fra subkutant fett fra ICR-mus kontinuerlig ekspresjon av AP under både ikke-differensieringsinduserende betingelser (ikke-differensiering) og differensieringsinduserende betingelser (differensiering) (C). De primære, dyrkede adipocyttene som hadde fått tilført gener via virusvektorene ble funnet å stabilt uttrykke gener i enhver fase, ikke bare under proliferasjonsbetingelsene som beskrives i Fig. 5, men også under ikke-differensieringsinduserende betingelser, eller nærmere bestemt under ikke-proliferative betingelser eller modne betingelser.

[Eksempel 4] Fremstilling ved anvendelse av en plasmidvektor av adipocytter som stabilt uttrykker insulin.

Fremgangsmåtene for genoverføring omfatter fremgangsmåter som anvender plasmidvektorer.

[Fremgangsmåter]

(1) Isolering og modifisering av det humane insulingen

PCR ble utført på et humant cDNA-bibliotek fra bukspyttkjertel (Stratagene) ved anvendelse av primerne som er vist i Tabell 1 (Insulin Fw og Rv). Et fragment av det humane insulingen ble erholdt. Nukleotidsekvensen til dette erholdte fragment på 354 bp ble bestemt og fragmentet ble subklonet i vektoren pCR2.1TOPO (Invitrogen) som nativt insulin.

(Uthevede bokstaver angir initieringskodonet i Fw og "antisens"-sekvensen til stoppkodonet 1 Rv. Understrekede bokstaver angir muterte deler).

For å uttrykke modent insulin i adipocyttene ble genetisk modifisering deretter utført basert på litteraturen (JBC, 1994, 269 (8), 6241-). Nærmere bestemt ble primere i begge retninger syntetisert hver for seg slik at de inneholdt mutasjoner i hvert overgangs-sete mellom den humane insulin B-kjeden og C-peptidet (sete 1), mellom C-peptidet og A-kjeden (sete 2) og histidinrest nr. 10 i B-kjeden B10) (Tabell 1). Mutantene ble oppnådd ved anvendelse av et "Quickchange" mutagenesesett (Stratagene). Utførelse av denne reaksjonen på sete 1 og sete 2 ga sls2-mutanten. Utførelse av reaksjonen på sete 1, sete 2 og B10 ga sls2B10-mutanten av insulin. Etter bekreftelse av nukleotidsekvensen til det oppnådde, modifiserte humane insulingen, ble genet innført i vektoren pcDNA3.1 og så anvendt for genoverføring.

(2) Gen-overføring til primære, dyrkede adipocytter

Etter blanding av 500^1 FCS-fritt DMEM-medium og 15^1 Fugene 6-reagens (Roche), ble 5^g transfeksjonsplasmid tilsatt, og blandingen ble etterlatt ved romtemperatur i 15 minutter. Den blandede løsningen ble tilsatt til primære, dyrkede adipocytter (avledet fra fettvev rundt epididymis hos C57BL/6-mus) som var dyrket til 70 til 80 % konfluens i en 10 cm skål. Dette ble dyrket i 24 timer i en C02-inkubator. Fire dager etter genoverføringen ble cellene subkultivert i en T225-flaske og dyrket over natten. Mediet ble så byttet med et medium som omfattet 0,2 mgU/ml G418 (SIGMA), og dyrkningen ble fortsatt i tre uker, hvoretter gen-tilførte celler ble selektert. De oppnådde G418-resistente cellene ble sådd ut i en 10 cm skål, og mengden insulin i kultur-supernatanten ble målt ved anvendelse av et ultrafølsomt insulin-EIA-sett (Morinaga). Dette EIA-sett påviser både proinsulin som ennå ikke er blitt prosessert og modent insulin.

[Resultater]

Fig. 7 viser (pro)insulinproduksjonen ved plasmidtransfeksjon av primære, dyrkede adipocytter. Både pcDNA3.1Myc-His-vektorer som inneholdt det native humane insulingen (nativt), den setel/sete2/B10-modifiserte form (sls2B10) og tom vektor (mock- transfeksjon) ble transfektert inn i adipocytter avledet fra fettvev som omgir epididymis hos C57BL/6-mus. Humant (pro)insulin ble påvist i kultur-supernatanten fra resistente celler oppnådd ved G418-seleksjon. Dette viste at stabil genoverføring til primære, dyrkede adipocytter også er mulig ved anvendelse av en plasmidvektor.

[Eksempel 5] Fremstilling av adipocytter som stabilt uttrykker AP ved anvendelse av adenoassosiert virus

Fremgangsmåter for genoverføring omfatter fremgangsmåter som anvender adenoassosiert virus (AAV).

[Fremgangsmåter]

Undersøkelsen ble utført ved anvendelse av AAV Helper-Free System (Stratagene). PLAP-fragmentet fra Eksempel 2 (et fragment utkuttet ved anvendelse av Hindlll og Sg/II) ble innsatt i det samme restriksjonsenzymsete i vektoren pAAV-MCS for oppnåelse av

pAAV-PLAP.

AAV-vektorproduksjon ble utført som følger: 1,75 ml OPTI-MEM (Invitrogen) ble blandet med 220^1 av plasmid-transfeksjonsreagenset Fugene, deretter ble 25^g av hver av pAAV-PLAP, pAAV-RC, og pHelper blandet inn, og disse ble etterlatt ved romtemperatur i 15 minutter (Fugene/plasmidløsninger). I mellomtiden ble 293-EBNA-celler dyrket til 60 til 70 % konfluens i en 15 cm skål forberedt. Dyrkningsmediet ble endret til FCS-fritt DMEM, hvoretter Fugene/plasmidløsning ble dryppet inn jevnt, og denne ble dyrket i to til tre timer. FCS ble så tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 10 %, og denne ble dyrket i ytterligere to dager. Cellene ble høstet ved trypsinbehandling og sentrifugering, og så suspendert i 50 mM tris-HCI og 150 mM NaCI-løsning slik at sluttvolumet var 3 ml. Cellene ble oppbrutt ved å utføre tre sykluser bestående av frysing i tørris-etanol og opptining ved 37 °C av denne suspensjonsløsningen. Etter nedbryting av vertens genomiske DNA ved anvendelse av Benzonase (SIGMA), ble deretter virusløsningen fremstilt ved sentrifugering ved 9000 rpm i 30 minutter, etterfulgt av filtrering av supernatanten.

Primære, dyrkede adipocytter (avledet fra subkutant fett fra C57BL/6-mus) ble sådd ut i en 12-brønners plate med lx IO<4>celler/brønn dagen før genoverføringen og ble dyrket. De ble så behandlet i seks timer i et medium som inneholdt 40 mM hydroksyurea og 1 mM smørsyre (begge fra SIGMA). Etter fjerning av dette mediet ble det tilsatt 0,5 ml/brønn av virusløsningen fortynnet 1/100 med FCS-fritt DMEM. Etter dyrking i én time ble FCS-holdig medium tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 10 % og denne ble dyrket over natten. Deretter ble mediet skiftet på normal måte, og videreføring av kulturen ble utført på dag 24.

Mediet ble skiftet på den første, syvende og 25. dag av overføringen, og kultur-supernatanten høstet to dager etter hvert skifte ble anvendt for AP-analysene. 10^1 supernatanten, som ble fortynnet ved behov, ble varmet til 65 °C i 20 minutter, deretter ble 50^1 analysebuffer (16 mM NaHC03, 12 mM Na2C03, 0,8 mM MgS04), og 50^1 luminiscensfargereagens (CDP-Star Ready to Use med Sapphire II, TROPIX), tilsatt, fikk reagere i mørke i 30 minutter og deretter målt med et luminometer.

[Resultater]

Fig. 8 viser stabil ekspresjon av AP i primære, dyrkede adipocytter (avledet fra subkutant fett fra C57BL/6-mus) transfektert med AP-uttrykkende AAV. AP-aktivitet ble påvist i kultursupernatanten gjennom hele undersøkelsesperioden. Dette viste at stabil genoverføring til primære, dyrkede adipocytter kan oppnås ved anvendelse av en AAV-vektor.

[Eksempel 6] Fremstilling av en retrovirusvektor som uttrykker humant insulin og transduksjon av denne inn i adipocytter

[Fremgangsmåter]

Det modifiserte humane insulin-gen som ble fremstilt i Eksempel 4 (sls2B10Ins) ble satt inn i vektoren pBabeCLXI2G ved å følge fremgangsmåten i Eksempel 3 (pBabeCI (sls2B10Ins) I2G). Dette plasmidet ble, sammen med en VSV-G-kodende vektor (pVPack-VSV-G/Stratagene), og en Gag-Pol-kodende vektor (modifisert fra pVPack-gp/Stratagene) satt inn i 293-EBNA-celler ifølge fremgangsmåten i Eksempel 3 for å oppnå den modifiserte, insulinuttrykkende retrovirusvektor (MLV(VSV)/pBabeCL (sls2B10Ins) I2G). Kultur-supernatanten (tilnærmet 200 ml) fra 293-EBNA-celler fra tjueto 10 cm skåler ble oppsamlet, uløselig materiale ble fjernet ved sentrifugering/filtrerings behandling og deretter ble en konsentrert virusløsningen oppnådd ved ultrasentrifugering (19 500 rpm, 100 minutter). Denne ble overført til primære, dyrkede adipocytter (avledet fra subkutant fett fra C57BL/6-mus) som hadde blitt utsådd i en 6-brønners plate dagen før.

De gentilførte cellene ble overført til en 6-brønners plate, og differensiering ble indusert ifølge fremgangsmåten i Eksempel 1. Kultursupernatanter ble oppsamlet i tre dager, fra tre dager før induksjonen til dagen for induksjons oppstart (pre-induksjon) og i tre dager fra dag 14 til dag 17 av induksjonen (post-induksjon). Mengden av insulin ble analysert ved samme fremgangsmåte som i Eksempel 4. For å bekrefte at prosessering skjedde i de ønskede seter og at modent insulin ble fremstilt ble ytterligere målinger utført ved anvendelse av et insulin-EIA-sett (IBL) som kun gjenkjenner modent insulin. Kultur-supernatanten fra ikke-gen-tilførte celler, som samtidig ble utsatt for differensierings induksjon, ble anvendt som kontroll.

[Resultater]

Fig. 9 viser insulinekspresjonen på tidspunktet for induksjon av differensiering i primære, dyrkede adipocytter transdusert med retrovirusvektor som uttrykte sls2B10-insulin. (A) viser resultatene ved anvendelse av EIA-settet produsert av Morinaga, og (B) viser resultatene ved anvendelse av EIA-settet produsert av IBL. Disse resultatene viser at insulin utskilles stabilt både før og etter induksjon av differensiering og at overføring av mutant insulin-gen kan gi dannelse av modent insulin fra adipocytter.

[Eksempel 7] Konstruksjon av en retrovirusvektor som uttrykker humant glukagonlignende peptid-1 (GLP-1) og transduksjon av denne inn i adipocytter.

GLP-1 er et peptid som dannes fra små L-celler i tarmen under inntak av føde og omfatter evnen til å stimulere insulinsekresjonen ved at det virker på pankreatiske p-celler. GLP-1 vites også å ha en rekke andre antidiabetiske virkninger og anti-fedmevirkninger, for eksempel regenererende virkning på pankreatiske p-celler, apetittundertrykkende virkning og inhiberende virkning på gastrisk tømming (Meier, J. J. et al. Eur. J. Pharmacol. 2002, 12; 440 (2-3) : 269-79; Drucker, D.J. Gastroenterology 2002; 122 (2) : 531-544. Et peptid som omfatter sekvensen posisjon 7 til 37 i aminosyresekvensen til GLP-1 (eller opp til posisjon 36 i amidformen) dannes ved vevsspesifikk prosessering av polypeptidet som dannes fra preproglukagon-genet og vites å besitte den viktigste farmakologiske aktivitet (Drucker, D. J. et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 1987 mai; 84 (10) : 3434-3438; Kreymann, B. et al. Lancet. 1987, 5; 2 (8571): 1300-1304; Mojsov, S. et al. J. Clin. Invest. 1987 febr. 79 (2): 616-619). Den etterfølgende undersøkelsen ble utført for å fremstille denne faktoren fra adipocytter.

[Fremgangsmåter]

En nukleotidsekvens med i alt 156 basepar ble utformet som omfattet en sekvens (SEQ ID NO: 10 viser den kodende sekvensen) hvor humant GLP-1 (7-37) og et stoppkodon er koblet til signalpeptidet (17 aminosyrer) fra PLAP-genet som ble anvendt i Eksempel 3. Nukleotider ble syntetisert slik at en 22-mer overlapp forelå i midten (sPL-GLP-lFw og sPL-GLP-lRv i Tabell 1). Disse ble hybridisert og en dobbelttråd ble dannet ved anvendelse av Pfu polymerase (Stratagene). Målfragmentet ble deretter amplifisert ved PCR ved anvendelse av 5'-ende- og 3'-endeprimere (GLP-5' og GLP-3' i Tabell 1). Dette fragment ble subklonet inn i vektoren pCR2.1, kuttet ut med restriksjonsenzymer og så satt inn i vektoren pBabeCLXI2G på samme måte som i Eksempel 3 (pBabeCL (sPL-GLPl) I2G). Dette plasmid ble transfektert inn i 293-EBNA-celler ved en fremgangsmåte som tilsvarer den i Eksempel 6 for fremstilling av den GLP-l-uttrykkende retrovirusvektor (MLV(VSV)/pBabeCL (sPL-GLP-1) I2G). Tilnærmet 90 ml kultursupernatant fra 293-EBNA-celler fra ni 10 cm skåler ble oppsamlet. Uløselig materiale ble fjernet ved sentrifugering/filtrering, og supernatanten ble så ultrasentrifugert (19500 rpm, 100 minutter) for oppnåelse av en konsentrert virusløsning. Denne ble transdusert inn i primære, dyrkede adipocytter (avledet fra subkutant fett fra C57BL/6-celler) som dagen før hadde blitt sådd ut i en 6-brønners plate. De transfekterte adipocyttene ble igjen sådd ut i en tolv-brønners plate, og induksjon av differensiering ble utført ifølge fremgangsmåten i Eksempel 1. "Ikke-indusert" refererer til en betingelse i hvilken kulturen ble fortsatt i normalmedium istedenfor i induksjonsmedium eller modningsmedium. Syv dager senere ble mediet byttet med FCS-fritt DMEM-medium tilsatt 1 mM Valin-pyrrolidin (GLP-1- degraderingsenzyminhibitor syntetisert ved Eisai). Kultursupernatanten ble oppsamlet 18 timer senere, og mengden aktivt GLP-1 (7-37) ble målt ved anvendelse av ELISA (LINCO).

[Resultater]

Fig. 10 viser ekspresjonsnivået i primære, dyrkede adipocytter transfektert med retrovirusvektor som uttrykker GLP-1 (7-37). Ekspresjon av den aktive form GLP-1 (7-37) ble observert i kultursupernatant fra både ikke-differensieringsinduserte og differensierings-induserte adipocytter. Dette viste at selv om en faktor dannes som en prepro-type og så kuttes ut ved prosessering så tillater denne fremgangsmåten fremstilling av kun den faktoren fra adipocytter.

[Eksempel 8] Implantering av mus med celler som stabilt uttrykker AP (Analyse 1)

[Fremgangsmåter]

Etter dyrking av de AP-uttrykkende adipocyttene (transdusert med MLV(VSV)/pBabeCL (PLAP) IP; avledet fra subkutant fett fra C57BL/6-celler), fremstilt ved fremgangsmåten i Eksempel 3, til konfluens ble cellene oppsamlet ved trypsinbehandling, vasket med PBS og suspendert med 5x IO<6>celler/ml i iskald Matrigel (Becton Dickinson). Implanteringen ble utført ved å injisere denne i det dorsale, subkutane område (Sc) på C57BL/6-mus (åtte uker gamle på behandlingstidspunktet, Charles River) i en dose på 0,2 ml pr. mus (lx IO<6>celler/dyr) (uten induksjon av differensiering). På den annen side ble de samme cellene dyrket til konfluens og så dyrket i tre dager i induksjonsmedium ifølge Eksempel 1, og så implantert ved tilsvarende fremgangsmåter (med induksjon av differensiering). Blod ble oppsamlet over tid ved fremgangsmåten som er angitt i Eksempel 2, og AP-aktiviteten i plasma ble målt.

[Resultater]

Fig. 11 viser endringen av AP-aktivitet i plasma fra mus implantert med AP-uttrykkende primære, dyrkede adipocytter. Individer som ble gitt et implantat av celler som hadde blitt underkastet differensieringsinduserende stimulering i tre dager før implantering ("med induksjon av differensiering") viste mindre svingninger i den fortsatte ekspresjonen enn individer som ble gitt et implantat av celler som ikke var indusert. Begge implantasjonsfremgangsmåter viste imidlertid kontinuerlig ekspresjon over alle de 50 dagene eller der omkring av undersøkelsen. Dette viser at overlevelsesfrekvensen av celler etter transplantasjonen kan forbedres ved å gi differensieringsinduserende stimulering.

[Eksempel 9] Implantering av mus med celler som stabilt uttrykker AP (Analyse 2)

[Fremgangsmåter]

(1) Implantering

De AP-uttrykkende adipocyttene (transdusert med MLV(VSV)/pBabe(PLAP)IP; avledet fra subkutant fett fra ICR-mus) fremstilt i Eksempel 3 ble dyrket til konfluens. Cellene ble oppsamlet ved trypsinbehandling, vasket med PBS og suspendert med 5x IO<6>celler/ml i iskald Matrigel (Becton Dickinson) som var tilsatt 1^g/ml bFGF (Genzyme Techne). Implanteringen ble utført ved å injisere dette i en dose på 0,2 ml pr. mus (lx IO<6>celler/dyr) i hvert sete (det dorsale, subkutane område (Sc), ingvinalt subkutant fett (fett) og det intraperitoneale område (ip)) i ICR nakenmus (seks uker gamle på operasjonstidspunktet, Charles River). Som kontroll ble GFP-uttrykkende adipocytter behandlet på tilsvarende måte og implantert i det subkutane vev.

Noen av de AP-uttrykkende cellene ble dyrket i tre dager i induksjonsmediet ifølge Eksempel 1 og så oppsamlet og implantert på samme måte (Dif). Etter anvendelse av induksjonsmediet ble noen av disse cellene dyrket i 4 dager i et modningsmedium og så oppsamlet og implantert på samme måte (Mat).

Videre ble noen av de AP-uttrykkende cellene sådd ut i et 8-brønners Labteck-kammer (Nunc) under de samme betingelser som ble anvendt for implantasjonen (x 10<6>/0,2 ml Matrigel tilsatt bFGF), og cellene ble stivnet ved oppvarming til 37 °C. Implantering ble oppnådd ved å innsette denne stivnede gelen i det subkutane område hos musen. Celler som er dyrket i normalmedium etter stivning refereres her til som prefiksede (pf)/gr, og celler dyrket i et differensieringsinduserende medium refereres til som pf/dif. Implanteringen ble utført etter syv dagers dyrkning.

AP-aktiviteten i plasma ble målt over tid, før implanteringen (dag 0) og etter implanteringen ifølge fremgangsmåten i Eksempel 2.

(2) Ekstirpasjon

I gruppen som ble implantert etter induksjon av differensiering (Dif/Sc) ble den implanterte cellemasse ekstirpert sammen med Matrigel fra individene A og B fem henholdsvis 43 uker etter implantering. Ekstirpasjonen ble utført på kontroll prøven i den femte uke etter implantering. Hvert individ ble intraperitonealt administrert med 50 mg/kg Nembutal som anestesi. Et snitt ble så laget i huden deres, og et visuelt bekreftet implantert Matrigel-stykke ble ekstirpert. Operasjonssetet ble sydd og desinfisert med Isodine (Meiji). Dyrene ble så oppstallet på samme måte, og blod ble oppsamlet overtid.

[Resultater]

Fig. 12 (A) viser resultatet av undersøkelsen av endringen i AP-aktivitet i plasma over 50 dager etter implantering av AP-uttrykkende primære, dyrkede adipocytter ved anvendelse av Matrigel tilsatt basisk FGF i nærvær av differensieringstimulering (Dif/Sc-gruppen). Endringen av AP-aktiviteten i blod var stabil i 49 dager over et område på omtrent 5 ganger. Dette viste av tilsetning av bFGF på implanteringstidspunktet ytterligere kan forbedre innpodningsfrekvensen etter implantering. (B) viser nedgangen i AP-aktivitet i plasma grunnet ekstirpasjon av den implanterte Matrigel (individ A) over det samme

tidsrommet. AP-aktiviteten i de ekstirperte individer ble signifikant redusert sammenlignet med gjennomsnittsverdien for den PLAP-transduserte gruppen. Dette viste at AP i blodet er avledet fra de implanterte cellene og at ekstirpasjon av transplantatet hurtig kan fjerne gen-ekspresjonen. På dette tidspunkt ble ekstirpasjon også utført på dyr fra

kontrollgruppen som var implantert med GFP-transfekterte celler. GFP-positive celler ble funnet i den ekstirperte Matrigel, og mange av disse viste et vakuolært bilde (C) som tilsvarte det vist i Fig. 6 (B). Dette viste at primære, dyrkede adipocytter implantert ved denne fremgangsmåten kan innpodes som modent fettvev in vivo. Fig. 13 viser resultatet fra en langtidsundersøkelse av AP-aktiviteten i blod fra de implanterte musene ifølge Fig. 12 (A) og i mus som ble gitt et implantat ved en rekke av andre fremgangsmåter. I gruppen implantert med PLAP-transfekterte celler ble en klar økning av AP-aktiviteten i blod bekreftet for alle implanteringsseter og implanteringsfrem-gangsmåter. AP-aktiviteten i blodet holdt seg over et langt tidsrom, og nærmere bestemt ble stabil AP-ekspresjon observert over ett år ved analyse av Dif/Sc-gruppen (gruppen som beskrives i Fig. 12 (A)). Kontinuerlig AP-produksjon ble også bekreftet for de andre implanteringsfremgangsmåtene over det tidsrom undersøkelsen foregikk (316 dager for ip-gruppen, 54 dager for fettgruppen, 225 for Sc-gruppen, 317 dager for Mat/Sc-gruppen og 314 dager for de to prefiks-gruppene). Aktivitetstoppen som ble observert i løpet av én ukes implantering var høyest i ip-gruppen. De høyeste verdiene hadde da rekkefølgen Sc>fat>Dif/Sc~pf-dif>pf-gr~Mat/Sc. Variasjonsområdet etter implanteringen ble observert som forholdet mellom aktiviteten etter 13 uker og toppaktiviteten, et forhold som kan sammenlignes i alle grupper. Variansen var lavest, tilnærmet tre ganger, i de to prefiks-gruppene, tilnærmet fem ganger i ip-gruppen, Dif/Sc-gruppen og Mat/Sc-gruppen og tilnærmet ti ganger i Sc-gruppen og fettgruppen. Toppverdien umiddelbart etter implantering og variasjonsområdet etter implanteringen varierte for hver implanterings-fremgangsmåte. En hvilken som helst av disse fremgangsmåtene kan således anvendes ut i fra egenskapene til det anvendte genprodukt, sykdomstilstandens egenskaper og hvor enkel teknikken er å utføre. Dette viste at implantering av primære, dyrkede adipocytter i hvilke gener var stabilt innført ex vivo kan utføres ved en rekke fremgangsmåter og at lang-tids stabil in v/Vo-genekspresjon er mulig etter implanteringen. Fig. 14 viser resultatet fra utførelse av et ekstripasjonseksperiment tilsvarende det beskrevet i Fig. 12 (B) i implanteringens senere stadier. AP-aktiviteten i blodet etter ekstirpasjonen ble bekreftet å forsvinne hurtig, ikke bare i individer hvor ekstirpasjonen ble utført i implanteringens tidlige stadier (individ A), men også i individer hvor ekstirpasjonen ble utført i implanteringens senere stadier (individ B). Dette viste at adipocyttene som implanteres ved denne fremgangsmåte forblir i implanteringssetet i en lang periode etter implanteringen og at ekstirpasjon av dem etter behov kan fjerne gen-ekspresjonen uavhengig av tidspunktet.

[Eksempel 10] Transplantasjon av mus med celler som stabilt uttrykker AP (Analyse 3)

De etterfølgende undersøkelsene ble utført for å bekrefte "dose"-avhengigheten av antallet av implanterte celler

[Fremgangsmåter]

De AP-uttrykkende adipocyttene som ble fremstilt i Eksempel 3 (transfektert med MLV(VSV)/pBabeCL(PLAP)IP; avledet fra subkutant fett fra ICR-mus) ble dyrket til konfluens. Cellene ble dyrket i tre dager i induksjonsmediet angitt i Eksempel 1 og så oppsamlet ved trypsinbehandling. Etter vask med PBS ble cellene suspendert med 5x IO<6>celler/ml i Matrigel. En fem gangers trinnvis fortynning ble utført på AP-cellesuspensjonen ved anvendelse av Matrigel, og suspensjoner med lx IO<6>celler/ml og 2x IO<5>celler/ml ble fremstilt. bFGF ble tilsatt til disse løsningene i en sluttkonsentrasjon p 1\ig/m\, og løsningene ble så transplantert i det dorsale, subkutane område hos ICR nakenmus i en dose på 0,2 ml pr. mus (den høye dose: lx IO<6>celler/dyr, middels dose: 2x IO<5>celler/dyr, lav dose: 4x 10<4>celler/dyr). Som kontroll ble GFP-uttrykkende adipocytter behandlet på tilsvarende måte og implantert i det subkutane vev under de samme betingelser som for høydosebetingelsene (lx IO<6>celler/dyr).

[Resultater]

Fig. 15 viser hvordan AP-aktiviteten i blodet avhenger av antall implanterte celler ved implantasjon av AP-uttrykkende adipocytter. En doseavhengig AP-aktivitet i blodet ble observert når antall implanterte celler ble endret, og dette ble ikke påvirket av varigheten. Nærmere bestemt viste gruppene med middels eller lav dose ingen topp i implanteringens tidligere stadium, noe som ble observert for høydosegruppen, og variasjonsområdet var smalere. Dette viste at in wVo-ekspresjonsnivået lett kan justeres ved å anvende antall implanterte celler og at ved å justere det optimale celletall kan blodkonsentrasjonen (ekspresjonsnivået) etter implanteringen stabiliseres.

[Eksempel 11] Hypoglykemisk virkning i en musemodell for diabetes ved implantering av insulin-uttrykkende adipocytter

[Fremgangsmåter]

Diabetiske mus ble fremstilt ved intravenøs administrering til åtte uker gamle C57BL/6-hannmus av 10 ml/kg av 170 mg/kg streptozotocin (STZ, SIGMA). Fastende glukosenivået i blodet (FBG) ble målt individuelt én og to uker etter STZ-tilførselen, og individer med en FBG på 300 mg/dl eller mer ble fastslått å ha diabetes. Blodsukkernivået ble målt ved utførelse av en perkloratbehandling umiddelbart etter oppsamling av fullblod og så anvende Glykosetest-II (WAKO).

MLV(VSV)/pBabeCL (sls2B10Ins)I2G-transfekterte adipocytter fremstilt i Eksempel 6 ble underkastet differensieringsinduksjons stimulering ved anvendelse av den samme fremgangsmåte som i Eksempel 10 og så suspendert med 5x IO<6>celler/ml i Matrigel som var tilsatt 1 \ ig/ m\ bFGF. Denne suspensjonsløsningen ble implantert i det dorsale, subkutane område hos de diabetiske musene med 0,2 ml pr. sete til i alt 4 seter (4x 10<6>/dyr). For kontrollgruppen ble ikke-gentiIførte adipocytter implantert ved den samme fremgangsmåten. Implantasjonen ble utført 19 dager etter STZ-behandlingen, og etter dette ble FBG-nivået målt over tid. Statistisk analyse ble utført ved sammenligning med kontroll-gruppen (uparet t-test).

[Resultater]

Fig. 16 viser effekten av implantering av sls2B10-insulinuttrykkende adipocytter i STZ-induserte diabetiske mus. Ikke-gentilførte-celler ble implantert som kontroll. Blod-glukosenivået hos gruppen som ble implantert med insulin-uttrykkende celler hadde en tendens til å avta fra implanteringens dag syv, og en signifikant hypoglykemisk virkning kunne observeres på den 13. og 21. dag av implantering (A). Kroppsvekten 20 dager etter implantering var signifikant høyere i gruppen som var implantert med insulin-uttrykkende celler enn i kontrollgruppen, og vekttapet grunnet diabetes var derfor forbedret (B). Resultatene av undersøkelsen med AP tyder på at denne hypoglykemiske virkningen vil opprettholdes i en lang periode. Det fremmede genproduktet som dannes fra de implanterte primære, dyrkede adipocyttene ble derfor vist å kunne bidra til endring av sykdoms-tilstanden hos mottakeren, noe som tyder på at denne fremgangsmåten kan anvendes for behandling av diabetes.

Industriell anvendbarhet

Foreliggende oppfinnelse etablerte fremgangsmåter for ex wVo-overføring av et fremmed gen til primære, dyrkede adipocytter som er egnede for genterapi og etablerte primære, dyrkede adipocytter som stabilt opprettholdt et fremmed gen.

Claims

1. Farmasøytisk sammensetning som omfatter en primær dyrket pre-adipocyttkarakterisert vedat pre-adipocytten stabilt opprettholder et fremmed gen som koder for et protein som utskilles til cellens omgivelser, og hvor genet har blitt satt inn i en retrovirusvektor og har blitt overført til cellen av retrovirusvektoren, for anvendelse i genterapi, hvor proteinet er lecitin-kolesterol-acyltransferase (LCAT).

2. Primær dyrket pre-adipocytt karakterisert vedat pre-adipocytten stabilt opprettholder et fremmed gen som koder for et protein som utskilles til cellens omgivelser, og hvor genet har blitt satt inn i en retrovirusvektor og har blitt overført til cellen av retrovirusvektoren, for anvendelse i genterapi, hvor proteinet er LCAT.

3. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 1, eller pre-adipocytt ifølge krav 2, hvor pre-adipocytten har evnen til signifikant å utrykke proteinet in vivo i minst 20 dager.

4. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 1 eller 3, eller pre-adipocytt ifølge krav 2 eller 3, hvor pre-adipocytten anvendes for å frigi proteinet til blodstrømmen.

5. In vitro fremgangsmåte for fremstilling av en pre-adipocytt for anvendelse i genterapi, karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter trinnene:

(1) primærdyrking av en pre-adipocytt, og

(2) overføring, og så stabilt bære et fremmed gen som koder for et protein som utskilles til cellens omgivelser, hvor proteinet er LCAT.

6. Fremgangsmåten ifølge krav 5, hvor det fremmede genet er overført ved hjelp av en retrovirusvektor.

7. Pre-adipocytt for anvendelse ifølge krav 2, hvor den er fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 5 eller 6.

8. Implantat-sammensetning, karakterisert vedat det omfatter en primær dyrket pre-adipocytt som stabilt bærer et fremmed gen som koder for et protein som utskilles til cellens omgivelser og hvor genet har blitt satt inn i en retrovirusvektor og har blitt overført til cellen av retrovirusvektoren, og et farmasøytisk aksepterbart bærestoff, for anvendelse i genterapi, hvor proteinet er LCAT.

9. Implantat-sammensetning for anvendelse ifølge krav 8, eller den farmasøytiske sammensetningen ifølge et hvilket som helst av kravene 1, 3, og 4, hvor det videre omfatter en ekstracellulær matriks komponent.

10. Implantat-sammensetning for anvendelse ifølge krav 8 eller 9, eller den farmasøytiske sammensetningen ifølge et hvilket som helst av kravene 1, 3, 4 og 9 hvor det videre omfatter en angiogenese-faktor.

11. Ikke-humant dyr, karakterisert vedat dets kropp er implantert med den primære dyrkede pre-adipocytten ifølge krav 2.