NO334841B1 - Pyrimidinderivater, fremgangsmåte for deres fremstilling, farmasøytisk preparater omfattende slike samt slike forbindelser for behandling av unormal cellevekst - Google Patents

Abstract

Foreliggende oppfinnelse angår en forbindelse med formel (I) hvor R1-R4 er som definert her. Slike nye pyrimidinderivater er anvendelige ved behandling av unormal cellevekst, så som kreft, hos pattedyr. Foreliggende oppfinnelse angår også en metode for anvendelse av slike forbindelser ved behandling av unormal cellevekst hos pattedyr, spesielt mennesker og farmasøytiske preparater inneholdende slike forbindelser.

Description

Bakgrunn for oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår pyrimidinderivater, fremgangsmåte for deres fremstilling, farmasøytisk preparater omfattende slike samt slike forbindelser for behandling av unormal cellevekst.

Det er kjent at en celle kan bli cancerøs ved transformasjon av en del av dens DNA til et onkogen (dvs. et gen som, ved aktivering, fører til dannelse av ondartede tumorceller). Mange onkogener koder for proteiner som er avvikende tyrosinkinaser som er i stand til å forårsake celle-transformasjon. Alternativt kan overekspresjonen av en normal protoonkogen tyrosinkinase også resultere i proliferative lidelser, som noen ganger resulterer i en ondartet fenotype.

Reseptor-tyrosinkinaser er enzymer som spenner over cellemembranen og har et ekstracellulært bindingsdomene for vekstfaktorer så som epidermal vekstfaktor, et transmembran-domene og en intracellulær del som fungerer som en kinase for å fosforylere spesifikke tyrosinrester i proteiner og således innvirker på celleproliferasjon. Andre reseptor-tyrosinkinaser omfatter c-erbB-2, c-met, tie-2, PDGFr, FGFr og VEGFR. Det er kjent at slike kinaser ofte er avvikende uttrykt ved vanlig human kreft så som brystkreft, gastrointestinal kreft så som kolon-, rektal- eller magekreft, leukemi og eggstokk-, bronkial eller pankreatisk kreft. Det har også vært vist at epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR), som har tyrosinkinase-aktivitet, er mutert og/eller overuttrykt ved mange humane kreftformer så som hjerne-, lunge-, platecelle-, blære-, mage-, bryst-, hode- og hals-, øsofageal, gynekologisk og thyroide tumorer.

Følgelig har det vært kjent at inhibitorer av reseptor-tyrosinkinaser er anvendelige som selektive inhibitorer av vekst av pattedyr-kreftceller. For eksempel svekker erbstatin, en tyrosinkinase-inhibitor, selektivt vekst i atymiske nakne mus av et transplantert humant bryst-karsinom som uttrykker epidermal vekstfaktor reseptor-tyrosinkinase (EGFR), men er uten effekt på vekst av et annet karsinom som ikke uttrykker EGF-reseptor. Således er selektive inhibitorer av visse reseptor-tyrosinkinaser anvendelige ved behandling av unormal cellevekst, spesielt kreft, hos pattedyr. I tillegg til reseptor-tyrosin kinaser, er selektive inhibitorer av visse ikke-reseptor-tyrosinkinaser, så som FAK (fokal adhesjon-kinase), lek, src, abl eller serin/treonin-kinaser (f.eks.: cyklin-avhengige kinaser, anvendelige ved behandling av unormal cellevekst, spesielt kreft, hos pattedyr. FAK er også kjent som protein-tyrosinkinase 2, PTK2.

Overbevisende bevis indikerer at FAK, en cytoplasmatisk, ikke-reseptor-tyrosinkinase, spiller en essensiell rolle i celle-matriks signaltransduksjonsbaner (Clark og Brugge 1995, Science 268: 233-239) og at dens avvikende aktivering er forbundet med en økning i metastasisk potensiale av tumorer (Owens et al. 1995, Cancer Research 55: 2752-2755). FAK ble opprinnelig identifisert som et 125 kDa protein meget tyrosin-fosforylert i celler omdannet ved v-Src. FAK ble deretter funnet å være en tyrosinkinase som lokaliserer til fokale adhesjoner, som er kontaktpunkter mellom dyrkede celler og deres underliggende substratum og seter med intens tyrosin-fosforylering. FAK blir fosforylert og, således, aktivert som respons på ekstracellulær matriks- (ECM) binding til integriner. Nylig har undersøkelser demonstrert at en økning i FAK mRNA-nivåer ledsaget av invasiv transformasjon av tumorer og svekking av ekspresjon av FAK (gjennom anvendelse av antisense oligonukleotider) fremkaller apoptose i tumorceller (Xu et al. 1996, Cell Growth and Piff. 7: 413-418). I tillegg til å være uttrykt i de fleste vevtyper er FAK funnet i forhøyede nivåer ved de fleste humane kreftformer, spesielt i meget invasive metastaser.

Forskjellige forbindelser, så som styrenderivater, er også vist å ha tyrosinkinase-hemmende egenskaper. Fem europeiske patentpublikasjoner, dvs. EP 0 566 226 A1 (publisert 20. oktober 1993), EP 0 602 851 A1 (publisert 22. juni 1994), EP 0 635 507 A1 (publisert 25. januar 1995), EP 0 635 498 A1 (publisert 25. januar 1995) og EP 0 520 722 A1 (publisert 30. desember 1992), refererer til visse bicykliske derivater, spesielt kinazolinderivater, som har anti-kreft egenskaper som er et resultat av deres tyrosinkinase-hemmende egenskaper.

WO patentsøknad WO 92/20642 (publisert 26. november 1992) angir også visse bis-mono- og bicykliske aryl- og heteroarylforbindelser som tyrosinkinase-inhibitorer som er anvendelige for å hemme unormal celleproliferasjon. WO patentsøknader W096/16960 (publisert 6. juni 1996), WO 96/09294 (publisert 6. mars 1996), WO 97/30034 (publisert 21. august 1997), WO 98/02434 (publisert 22. januar 1998), WO 98/02437 (publisert 22. januar 1998) og WO 98/02438 (publisert 22. januar 1998) refererer også til substituerte bicykliske heteroaromatiske derivater som tyrosinkinase-inhibitorer som er anvendelige for samme formål.

U.S. patentsøknad nr. 60/435,670, innlevert 20. desember 2002 (Attorney Docket nr. PC25339) angår en bred klasse av nye pyrimidinderivater som er selektive inhibitorer av FAK. Som sådanne er disse forbindelser anvendelige ved behandling av unormal cellevekst.

Følgelig eksisterer et behov for ytterligere selektive inhibitorer av visse reseptor- og ikke-reseptor-tyrosinkinaser, anvendelige ved behandling av unormal cellevekst, så som kreft, hos pattedyr. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer pyrimidinderivater, fremgangsmåte for deres fremstilling, farmasøytisk preparater omfattende slike samt slike forbindelser for behandling av unormal cellevekst.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår en forbindelse med formel 1

hvor

R<1>og R2 er hver et hydrogenatom, eller R<1>og R<2>tatt sammen med karbonatomet de er bundet til danner en 2-hydroksy-indan-1-yl ring;

R3 er valgt fra

(a) et hydrogenatom når R<1>og R<2>sammen danner en indanylring som angitt ovenfor, (b) -(C6-Cio)aryl eventuelt substituert med fra én til tre grupper valgt fra

-S02(Ci-C6)alkyl, S02NH2, -N((Ci-C6)alkyl)(S02(Ci-C6)alkyl) og halogen,

(c) en heteroarylgruppe valgt fra kromanyl eller furanyl, hver eventuelt substituert med -(Ci-C6)alkyl, (d) -(C3-Ci0)cykloalkyl eller -(C3-Ci0)cykloalkenyl, begge eventuelt substituert med hydroksy, (e) morfolinyl, pyrrolidinyl eller pyridinyl, hver eventuelt substituert med

-S02(CrC6)alkyl eller -N((CrC6)alkyl)(S02(CrC6)alkyl, eller

(f) (Ci-Ce)alkyl substituert med en gruppe valgt fra -N((Ci-C6)alkyl)(S02(Ci-C6)alkyl) og 0(Ci-C6)alkyl,

n er et helt tall fra 1 til 3.

eller et farmasøytisk akseptabelt salt, solvat eller hydrat derav.

Fortrukket er forbindelse med formel 1 over hvor R<1>og R<1>er hydrogen og n er 1.

Foretrukket er videre forbindelse med formel 1 over hvor R3 er -(C6-Cio)aryl, eventuelt substituert med én til tre grupper uavhengig valgt fra gruppen bestående av -S02(Ci-C6)alkyl, -S02NH2,-N((Ci.C6)alkyl)(S02(Ci-C6)alkyl) og halogen; eller en heteroarylgruppe valgt fra kromanyl eller furanyl, hver eventuelt substituert med -(CrC6)alkyl.

Ytterligere foretrukket er forbindelse med formel 1 over, hvor R3 er valgt fra gruppen bestående av

(d) -(C3-Cio)cykloalkyl eller-(C3-Cio)cykloalkenyl, begge eventuelt substituert med hydroksy, (e) morfolinyl, pyrrolidinyl eller pyridinyl, hver eventuelt substituert med - S02(Ci-C6)alkyl eller-N((Ci-C6)alkyl)(S02(Ci-C6)alkyl, og (f) (CrC6)alkyl substituert med en gruppe valgt fra -N((Ci-C6)alkyl)(S02(Ci-C6)alkyl) og 0(CrC6)alkyl.

Også ytterligere foretrukket er forbindelse med formel 1 over, hvor R<3>er -(Ci-Ce)alkyl substituert med én gruppe valgt fra gruppen bestående av

-N((Ci-C6)alkyl)(S02(Ci-C6)alkyl) og -0(Ci-C6)alkyl.

Enda ytterligere foretrukket er forbindelse som beskrevet over med formel 2

hvor A er valgt fra gruppen bestående av: hvor m er et helt tall fra 0-3 og R<13>er en substituent valgt fra gruppen bestående av (b) -S02(CrC6)alkyl, S02NH2, -N((CrC6)alkyl)(S02(CrC6)alkyl) og halogen når A er -(C6-Cio)aryl;

(c) -(CrC6)alkyl når A er en en heteroarylgruppe; og

(e) -S02(Ci-C6)alkyl eller -N((Ci-C6)alkyl)(S02(Ci-C6)alkyl) når A er en pyridylgruppe. Også enda ytterligere foretrukket er forbindelse som beskrevet over med formel 3

hvor B er valgt fra gruppen bestående av:

hvor m er et heltall fra 0-6 og R<13>er en hydroksygruppe.

Også enda ytterligere foretrukket er forbindelse som beskrevet over med formel 4

hvor D er valgt fra gruppen bestående av:

hvor q er et helt tall fra 1-2, m er et heltall fra 0-5 og R<13>er

(c) -(Ci-C6>alkyl når D er en heteroarylgruppe,

(d) hydroksy når D er-(C3-Cio)cykloalkyl eller-(C3-Cio)cykloalkenyl, (e) -S02(Ci-C6)alkyl eller-N((Ci-C6)alkyl)(S02(Ci-C6)alkyl når D er morfolinyl, pyrrolidinyl eller pyridinyl.

Enda ytterligere foretrukket er forbindelse med formel 1, valgt fra gruppen bestående av: 5-[4-(3-metansulfonyl-benzylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino]-1,3-dihydro-indol-2-on;

Etansulfonsyre-metyl-{3-[2-(2-okso-2,3-dihydro-1H-indol-5-ylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-4-ylamino]-propyl}-amid;

5-{4-[(isokroman-1-ylmetyl)-amino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on;

5-{4-[2-(pyridin-3-yloksy)-propylamino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on;

3-{[2-(2-okso-2,3-dihydro-1H-indol-5-ylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-4-ylamino]-metyl}-benzensulfonamid;

5-{4-[(1-metansulfonyl-piperidin-3-ylmetyl)-amino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on;

N-(3-{[2-(2-okso-2,3-dihydro-1H-indol-5-ylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-4-ylamino]-metyl}-fenyl)-metansulfonamid;

N-metyl-N-{2-[2-(2-okso-2,3-dihydro-1H-indol-5-ylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-4-ylamino]-etyl}-metansulfonamid;

5-{4-[(4-metansulfonyl-morfolin-2-ylmetyl)-amino]-5-trifluormety^ pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on;

5-[4-(3-metansulfonylmetyl-benzylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino]-1,3-dihydro-indol-2-on;

5-{4-[(1-metansulfonyl-pyrrolidin-3-ylmetyl)-amino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on;

N-metyl-N-{3-[2-(2-okso-2,3-dihydro-1H-indol-5-ylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-4-ylamino]-propyl}-metansulfonamid;

5-{4-[2-(1-metansulfonyl-piperidin-2-yl)-etylamino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on;

5-{4-[(4-metansulfonyl-pyridin-2-ylmetyl)-amino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on;

5-[4-(3-isopropoksy-propylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino]-1,3-dihydro-indol-2-on;

5-{4-[(5-metyl-furan-2-ylmetyl)-amino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on;

5-{4-[(bicyklo[2,2,1]hept-5-en-2-ylmetyl)-amino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on;

N-(4-fluor-3-{[2-(2-okso-2,3-dihydro-1H-indol-5-ylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-4-ylamino]-metyl}-fenyl)-N-metyl-metansulfonamid;

5-{4-[(1-metansulfonyl-piperidin-3-ylmetyl)-amino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on;

5-{4-[(6-metansulfonyl-pyridin-2-ylmetyl)-amino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on;

5-{4-[(5-metansulfonyl-pyridin-3-ylmetyl)-amino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on;

5-[4-(2-metansulfonyl-benzylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino]-1,3-dihydro-indol-2-on;

5-{4-[(1-pyrimidin-2-yl-piperidin-3-ylmetyl)-amino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on;

5-{4-[2-(1-metansulfonyl-piperidin-2-yl)-etylamino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on;

5-{4-[2-(1-metansulfonyl-piperidin-2-yl)-etylamino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on;

N-(2-{[2-(2-okso-2,3-dihydro-1H-indol-5-ylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-4-ylamino]-metyl}-fenyl)-metansulfonamid;

5-{4-[(1-metansulfonyl-pyrrolidin-2-ylmetyl)-amino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on;

N-metyl-N-(2-{[2-(2-okso-2,3-dihydro-1H-indol-5-ylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-4-ylamino]-metyl}-fenyl)-metansulfonamid;

N-metyl-N-(2-metyl-6-{[2-(2-okso-2,3-dihydro-1H-indol-5-ylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-4-ylamino]-metyl}-fenyl)-metansulfonamid;

5-[4-(2-hydroksy-indan-1-ylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino]-1,3-dihydro-indol-2-on;

5-{4-[(1-hydroksy-cyklopentylmetyl)-amino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on;

5-{4-[2-hydroksy-2-(1-metansulfonyl-piperidin-2-yl)-etylamino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on; og

N-metyl-N-(3-{[2-(2-okso-2,3-dihydro-1H-indol-5-ylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-4-ylamino]-metyl}-pyridin-2-yl)-metansulfonamid

Omfattet er også fremgangsmåte for fremstilling av forbindelse med formel 1

hvor

R<1>og R<2>er hver et hydrogenatom, eller R<1>og R2 tatt sammen med karbonatomet de er bundet til danner en 2-hydroksy-indan-1-yl ring;

R3 er valgt fra

(a) et hydrogenatom når R<1>og R<2>sammen danner en indanylring som angitt ovenfor, (b) -(C6-Cio)aryl eventuelt substituert med fra én til tre grupper valgt fra -S02(Ci-C6)alkyl, S02NH2, -N((Ci-C6)alkyl)(S02(Ci-C6)alkyl) og halogen, (c) en heteroarylgruppe valgt fra kromanyl eller furanyl, hver eventuelt substituert med -(Ci-C6)alkyl, (d) -(C3-Cio)cykloalkyl eller -(C3-Cio)cykloalkenyl, begge eventuelt substituert med hydroksy, (e) morfolinyl, pyrrolidinyl eller pyridinyl, hver eventuelt substituert med

-S02(CrC6)alkyl eller -N((CrC6)alkyl)(S02(CrC6)alkyl, eller

(f) (CrC6)alkyl substituert med en gruppe valgt fra -N((d-C6)alkyl)(S02(Ci-C6)alkyl) og 0(Ci-C6)alkyl,

n er et helt tall fra 1 til 3.

eller et farmasøytisk akseptabelt salt, solvat eller hydrat derav;

hvor fremgangsmåten omfatter trinnene

(a) reagere 5-amino-oksindol, 2 med dikloropyrimidin 3 I nærvær av en Lewis-syre og en egnet base for å fremstille en 2-substituert pyrimidin 4; (b) reagere pyrimidin 4 med NH2-(CR<1>R2)nR<3>I nærvær av en egnet base hvilket gir en forbindelse med formel 1.

Oppfinnelsen angår også forbindelse ifølge krav 1, for behandling av unormal cellevekst hos et pattedyr.

Oppfinnelsen angår videre farmasøytisk preparat for behandling av unormal cellevekst hos et pattedyr omfattende en mengde av en forbindelse ifølge krav 1 som er effektiv for behandling av unormal cellevekst, og en farmasøytisk akseptabel bærer.

Den unormale cellevekst kan være kreft, omfattende lungekreft, benkreft, pankreatisk kreft, hudkreft, kreft i hode eller hals, hud- eller intraokulært melanom, uterin kreft, eggstokk-kreft, rektal kreft, kreft i analregionen, magekreft, kolonkreft, brystkreft, uterin kreft, karsinom i eggleder, karsinom i endometrium, karsinom i livmorhals, karsinom i vagina, karsinom i vulva, Hodgkin's sykdom, kreft i spiserør, kreft i tynntarm, kreft i det endokrine system, kreft i skjoldbruskkjertelen, kreft i biskjoldbruskkjertelen, kreft i binyre, sarkom i mykvev, kreft i urinrør, kreft i penis, prostatakreft, kronisk eller akutt leukemi, lymfocyttiske lymfomer, kreft i blæren, kreft i nyre eller urinrør, nyrecelle- karsinom, karsinom i nyre-bekken, neoplasmer i sentralnervesystemet (CNS), primært CNS-lymfom, ryggmarg-tumorer, hjernestamme-gliom, hypofyse- adenom eller en kombinasjon av én eller flere av de foregående kreftformer.

Den unormale cellevekst kan være faste krefttumor som bryst-, lunge-, kolon-, hjerne-, prostata-, mage-, bukspyttkjertel-, eggstokk-, hud- (melanom), endokrin, uterin, testikkel- og blære-kreft.

Den unormale cellevekst kan også være en godartet proliferativ sykdom, omfattende psoriasis, godartet prostatisk hypertrofi eller restinose.

Anti-angiogenese-midler, så som MMP-2- (matriks-metalloprotienase 2) inhibitorer, MMP-9- (matriks-metalloprotienase 9) inhibitorer og COX-II-

(cyklooksygenase II) inhibitorer, kan anvendes sammen med en forbindelse med formel 1 ved metodene og de farmasøytiske preparater beskrevet her. Eksempler på anvendelige COX-ll-inhibitorer omfatter CELEBREX™

(alecoxib), valdecoxib og rofecoxib. Eksempler på anvendelige matriks-metalloproteinase-inhibitorer er beskrevet i WO 96/33172 (publisert 24. oktober 1996), WO 96/27583 (publisert 7. mars 1996), europeisk patentsøknad nr. 97304971,1 (innlevert 8. juli 1997), europeisk patentsøknad nr. 99308617.2 (innlevert 29. oktober 1999), WO 98/07697 (publisert 26. februar 1998), WO 98/03516 (publisert 29. januar 1998), WO 98/34918 (publisert 13. august 1998) , WO 98/34915 (publisert 13. august 1998), WO 98/33768 (publisert 6. august 1998), WO 98/30566 (publisert 16, juli 1998), europeisk patentpublikasjon 606,046 (publisert 13. juli 1994), europeisk patentpublikasjon 931,788 (publisert 28. juli 1999), WO 90/05719 (publisert 31. mai 1990), WO 99/52910 (publisert 21. oktober 1999), WO 99/52889 (publisert 21. oktober 1999) , WO 99/29667 (publisert 17. juni 1999), PCT internasjonal søknad nr. PCT/IB98/01113 (innlevert 21. juli 1998), europeisk patentsøknad nr. 99302232,1 (innlevert 25. mars 1999), britisk patent søknadsnummer 9912961,1 (innlevert 3. juni 1999), US provisional søknad nr. 60/148,464 (innlevert 12. august 1999), US-patent 5,863,949 (bevilget 26. januar 1999), US-patent 5,861,510 (bevilget 19. januar 1999) og europeisk patentpublikasjon 780,386 (publisert 25. juni 1997). Foretrukne MMP-2- og MMP-9-inhibitorer er de som har liten eller ingen aktivitet for hemning av MMP-1. Mer foretrukket er de som selektivt hemmer MMP-2 og/eller MMP-9 i forhold til de andre matriks-metalloproteinaser (dvs. MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 og MMP-13).

Noen spesifikke eksempler på MMP-inhibitorer anvendelige i kombinasjon med forbindelsene over er AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830 og forbindelsene angitt i den følgende liste: 3-[[4-(4-fluor-fenoksy)-benzensulfonyl]-(1-hydroksykarbamoyl-cyklopentyl)-amino]-propionsyre;

3- exo-3-[4-(4-fluor-fenoksy)-benzensulfonylamino]-8-oksa-bicyklo[3.2.1 ]oktan-3-karboksylsyre-hyd roksya m id;

(2R,3R)-1-[4-(2-klor-4-fluor-benzyloksy)-benzensulfonyl]-3-hydroksy-3-metyl-piperidin-2-karboksylsyre-hydroksyamid;

4- [4-(4-fluor-fenoksy)-benzensulfonylamino]-tetrahydro-pyran-4-karboksylsyre-hydroksyamid;

3- [[4-(4-fluor-fenoksy)-benzensulfonyl]-(1-hydroksykarbamoyl-cyklobutyl)-amino]-propionsyre;

4- [4-(4-klor-fenoksy)-benzensulfonylamino]-tetrahydro-pyran-4-karboksylsyre-hydroksyamid;

3-[4-(4-klor-fenoksy)-benzensulfonylamino]-tetrahydro-pyran-3-karboksylsyre-hydroksyamid;

(2R,3R)-1-[4-(4-fluor-2-metyl-benzyloksy)-benzensulfonyl]-3-hydroksy-3-metyl-piperidin-2-karboksylsyre-hydroksyamid;

3-[[4-(4-fluor-fenoksy)-benzensulfonyl]-(1-hydroksykarbamoyl-1-metyl-etyl)-amino]-propionsyre;

3-[[4-(4-fluor-fenoksy)-benzensulfonyl]-(4-hydroksykarbamoyl-tetrahydro-pyran-4-yl)-amino]-propionsyre;

3-exo-3-[4-(4-klor-fenoksy)-benzensulfonylamino]-8-oksa-bicyklo[3.2.1 ]oktan-3-karboksylsyre-hyd roksya m id;

3-endo-3-[4-(4-fluor-fenoksy)-benzensulfonylamino]-8-oksa-bicyklo[3, 2,1 ]oktan-3-karboksylsyre-hydroksyamid; og

3-[4-(4-fluor-fenoksy)-benzensulfonylamino]-tetrahydro-furan-3-karboksylsyre-hydroksyamid;

og farmasøytisk akseptable salter, solvater og prodrug av nevnte forbindelser.

Forbindelsene med formel 1 og de farmasøytisk akseptable salter, solvater og prodrug derav, kan også anvendes i kombinasjon med signaltransduksjon-inhibitorer, så som midler som kan hemme EGFR-(epidermal vekstfaktor reseptor) responser, så som EGFR-antistoffer, EGF-antistoffer og molekyler som er EGFR-inhibitorer; VEGF- (vaskulær endotel- vekstfaktor) inhibitorer; og erbB2-resept.or-inhibit.orer, så som organiske molekyler eller antistoffer som binder til erbB2-reseptoren, for eksempel HERCEPTIN™ (Genentech, Inc. i South San Francisco, California, USA).

EGFR-inhibitorer er beskrevet i for eksempel WO 95/19970 (publisert 27. juli 1995), WO 98/14451 (publisert 9. april 1998), WO 98/02434 (publisert 22. januar 1998) og US-patent 5,747,498 (bevilget 5. mai 1998). EGFR-hemmende midler omfatter CI-1033 (Pfizer Inc.), de monoklonale antistoffene C225 og anti-EGFR 22Mab (ImClone Systems Incorporated i New York, New York, USA), forbindelsene ZD-1839 (AstraZeneca), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), MDX-447 (Medarex Inc. i Annandale, New Jersey, USA) og OLX-103 (Merck & Co. Whitehouse Station, New Jersey, USA), VRCTC-310 (Ventech Research) og EGF- fusjonstoksin (Seragen Inc. i Hopkinton, Massachusettes).

VEGF-inhibitorer, for eksempel CP-547,632 og AG-13736 (Pfizer, Inc.), SU-5416 og SU-6668 (Sugen Inc. i South San Francisco, California, USA), kan også kombineres med en forbindelse med formel 1. VEGF-inhibitorer er beskrevet i for eksempel WO 99/24440 (publisert 20. mai 1999), PCT internasjonal søknad PCT/IB99/00797 (innlevert 3. mai 1999), i WO 95/21613 (publisert 17. august 1995), WO 99/61422 (publisert 2. desember 1999), US-patent 5,834,504 (bevilget 10. november 1998), WO 98/50356 (publisert 12. november 1998), US-patent 5,883,113 (bevilget 16. mars 1999), US-patent 5,886,020 (bevilget 23. mars 1999), US-patent 5,792,783 (bevilget 11. august 1998), WO 99/10349 (publisert 4. mars 1999), WO 97/32856 (publisert 12. september 1997), WO 97/22596 (publisert 26. juni 1997), WO 98/54093 (publisert 3. desember 1998), WO 98/02438 (publisert 22. januar 1998), WO 99/16755 (publisert 8. april 1999) og WO 98/02437 (publisert 22. januar 1998). Andre eksempler på noen spesifikke VEGF-inhibitorer er IM862 (Cytran Inc. i Kirkland, Washington, USA); anti-VEGF monoklonalt antistoff fra Genentech, Inc. i South San Francisco, California; og angiozym, et syntetisk ribozym fra Ribozyme (Boulder, Colorado) og Chiron (Emeryville, California).

ErbB2-reseptor-inhibitorer, så som CP-724,714 (Pfizer, Inc.), GW-282974 (Glaxo Wellcome plc) og de monoklonale antistoffene AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc. i The Woodlands, Texas, USA) og 2B-1 (Chiron), kan administreres i kombinasjon med en forbindelse med formel 1. Slike erbB2-inhibitorer omfatter de beskrevet i WO 98/02434 (publisert 22. januar 1998), WO 99/35146 (publisert 15. juli 1999), WO 99/35132 (publisert 15. juli 1999), WO 98/02437 (publisert 22. januar 1998), WO 97/13760 (publisert 17. april 1997), WO 95/19970 (publisert 27. juli 1995), US-patent 5,587,458 (bevilget 24. desember 1996) og US-patent 5,877,305 (bevilget 2. mars 1999). ErbB2-resept.or-inhibit.orer anvendelige ved foreliggende oppfinnelse er også beskrevet i US Provisional søknad nr. 60/117,341, innlevert 27. januar 1999 og i US Provisional søknad nr. 60/117,346, innlevert 27. januar 1999.

Andre antiproliferative midler som kan anvendes med forbindelsene over omfatter inhibitorer av HDI (CI-994, Pfizer Inc.), MEK (CI-1040, Pfizer Inc.), enzymet farnesyl-protein-transferase og reseptoren tyrosinkinase-PDGFr, omfattende forbindelsene beskrevet og krevet i de følgende US-patentsøknader: 09/221946 (innlevert 28. desember 1998); 09/454058 (innlevert 2. desember 1999); 09/501163 (innlevert 9. februar 2000); 09/539930 (innlevert 31. mars 2000); 09/202796 (innlevert 22. mai 1997); 09/384339 (innlevert 26. august 1999); og 09/383755 (innlevert 26. august 1999) ; og forbindelsene beskrevet og krevet i de følgende US provisional patentsøknader: 60/168207 (innlevert 30. november 1999); 60/170119 (innlevert 10. desember 1999); 60/177718 (innlevert 21. januar 2000); 60/168217 (innlevert 30. november 1999) og 60/200834 (innlevert 1. mai 2000) . Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan også anvendes i kombinasjon med inhibitorer av topoisomerase I, f.eks. irinotecan (Camptosar®) og edotecarin. En forbindelse med formel 1 kan også anvendes med andre midler anvendelige for behandling av unormal cellevekst eller kreft, omfattende midler som er i stand til å forbedre antitumor- immunresponser, så som CTLA4 (cytotoksisk lymfocytt antigen 4) antistoffer og andre midler som er i stand til å blokkere CTLA4; og anti-proliferative midler så som andre farnesyl-protein-transferase-inhibitorer, for eksempel farnesyl-protein-transferase-inhibitorene beskrevet i referansene angitt i avsnittet "Bakgrunn", supra. Spesifikke CTLA4-antistoffer som kan anvendes ved foreliggende oppfinnelse omfatter de beskrevet i US Provisional søknad 60/113,647 (innlevert 23. desember 1998).

"Unormal cellevekst", som anvendt her, hvis ikke annet er angitt, angir cellevekst som er uavhengig av normale regulatoriske mekanismer (f.eks. tap av kontakt hemning). Dette omfatter unormal vekst av: (1) tumorceller (tumorer) som prolifererer ved ekspresjon av en mutert tyrosinkinase eller overekspresjon av en reseptor-tyrosinkinase; (2) godartede og ondartede celler ved andre proliferative sykdommer hvor avvikende tyrosinkinase-aktivering forekommer; (4) hvilke som helst tumorer som prolifererer ved reseptor-tyrosinkinaser; (5) hvilke som helst tumorer som prolifererer ved avvikende serin/treonin-kinaseaktivering; og (6) godartede og ondartede celler ved andre proliferative sykdommer hvor avvikende serin/treonin-kinaseaktivering forekommer.

Forbindelsene over er kraftige inhibitorer av FAK-proteintyrosinkinaser og er således alle tilpasset terapeutisk anvendelse som antiproliferative midler (f.eks. anticancer-midler), antitumor-midler (f.eks. effektive mot faste tumorer), antiangiogenese-midler (f.eks. for stans eller forhindring av proliferasjon av blodkar) hos pattedyr, spesielt hos mennesker. Spesielt er forbindelsene over anvendelige for forebygging og behandling av en rekke humane hyperproliferative lidelser så som ondartede og godartede tumorer i lever, nyre, blære, bryst, mage, eggstokk, kolorektum, prostata, pankreas, lunge, vulva, thyroidea, hepatiske karsinomer, sarkomer, glioblastomer, hode- og hals- og andre hyperplastiske lidelser så som godartet hyperplasi i huden (f.eks. psoriasis) og godartet hyperplasi i prostata (f.eks. BPH). Det er i tillegg forventet at en forbindelse som definert over kan ha aktivitet mot en rekke leukemier og lymfoide ondartede sykdommer.

I én foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er kreft valgt fra lungekreft, benkreft, pankreatisk kreft, gastrisk kreft, hudkreft, kreft i hode eller hals, hud- eller intraokulært melanom, uterin kreft, eggstokk-kreft, gynekologisk, rektal kreft, kreft i analregionen, magekreft, kolonkreft, brystkreft, uterin kreft, karsinom i egglederen, karsinom i endometrium, karsinom i livmorhalsen, karsinom i vagina, karsinom i vulva, Hodgkin's sykdom, kreft i spiserøret, kreft i tynntarmen, kreft i det endokrine system, kreft i skjoldbruskkjertelen, kreft i biskjoldbruskkjertelen, kreft i binyrene, sarkom i mykvev, kreft i urinrøret, kreft i penis, platecelle, prostatakreft, kronisk eller akutt leukemi, lymfocyttiske lymfomer, kreft i blæren, kreft i nyrene eller urinrøret, nyrecelle-karsinom, karsinom i nyre-bekken, neoplasmer i sentralnervesystemet (CNS), primært CNS-lymfom, ryggmarg-tumorer, hjerne, hypofyse-adenom eller en kombinasjon av én eller flere av de foregående kreftformer.

I en mer foretrukket utførelsesform er kreft valgt fra en fast tumor, så som i bryst, lunge, kolon, hjerne, prostata, mage, pankreas, eggstokk, hud (melanom), endokrin-systemet, livmor, testikkel og blære.

Forbindelsene over kan også være anvendelige ved behandling av ytterligere lidelser hvor avvikende ekspresjon av ligand/reseptor-interaksjoner eller aktiverings- eller signaliserings-hendelser relatert til forskjellige proteintyrosinkinaser, er involvert. Slike lidelser kan omfatte de av neuronal, glial, astrocytal, hypothalamisk og annen glandulær, makrofagal, epitelial, stromal og blastocoelisk natur hvor avvikende funksjon, ekspresjon, aktivering eller signalisering av erbB tyrosinkinaser er involvert. I tillegg kan forbindelsene over ha terapeutisk nytte ved inflammatoriske, angiogene og immunologiske lidelser som involverer både identifiserte og hittil uidentifiserte tyrosinkinaser som blir hemmet av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Betegnelsen "behandling av", som anvendt her, hvis ikke annet er angitt, betyr reversering, lindring, hemning av utvikling av eller forhindring av lidelsen eller tilstanden for hvilken dette uttrykk blir anvendt eller én eller flere symptomer på en slik lidelse eller tilstand. Betegnelsen "behandling", som anvendt her, hvis ikke annet er angitt, angir virkning av behandling som "behandling av" er definert umiddelbart ovenfor.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også et farmasøytisk preparat omfattende en forbindelse med formel (I) eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat derav, som ovenfor definert, sammen med et farmasøytisk akseptabelt adjuvans, fortynningsmiddel eller bærer.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk preparat ifølge oppfinnelsen som omfatter blanding av en forbindelse med formel (I) eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat derav, som ovenfor definert, med et farmasøytisk akseptabelt adjuvans, fortynningsmiddel eller bærer.

For ovennevnte terapeutiske anvendelser vil dosen administrert selvfølgelig variere med forbindelsen anvendt, administreringsmetoden, behandlingen ønsket og lidelsen indikert. Den daglige dosen av forbindelsen med formel (l)/salt/solvat (aktiv bestanddel) kan være i området fra 1 mg til 1 gram, fortrinnsvis 1 mg til 250 mg, mer foretrukket 10 mg til 100 mg.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Forbindelsene med formel 1 kan fremstilles ved anvendelse av synteseveien beskrevet i Skjema 1. Substituentene i Skjema 1 har samme betydning som substituentene definert for formel 1. R<4>er hydrogen.

Forbindelser med formel 1 kan fremstilles ved å starte fra 5-amino-oksindol (2) og pyrimidin (3). Kombinasjon av 3 med en ekvimolar mengde av en Lewis-syre ved temperaturer i området fra -15 til 45°C i et tidsrom på 10-60 minutter i et inert løsningsmiddel (eller løsningsmiddelblanding) fulgt av tilsetning av 2 og en egnet base tilveiebringer etter en periode på 1-24 timer mellomproduktet 4-klorpyrimidin (4) i høye utbytter. Eksempler på inerte løsningsmidler omfatter THF, 1,4-dioksan, n-BuOH, i-PrOH, diklormetan og 1,2-dikloretan. Eksempler på egnede baser anvendt kan omfatte (i) ikke-nukleofile organiske baser, for eksempel trietylamin eller diisopropyletylamin (ii) uorganiske baser så som kaliumkarbonat eller cesiumkarbonat eller (iii) harpiks-bundede baser så som MP-karbonat.

Eksempler på Lewis-syrer omfatter halogenid-salter av magnesium, kobber, sink, tinn eller titan. I neste reaksjon blir mellomprodukt 4 omsatt med et amin med formel 5 enten rent eller i nærvær av et inert løsningsmiddel (eller løsningsmiddelblanding) ved temperaturer i området fra 0 til 150°C for å gi forbindelsene med formel 1. Eventuelt kan denne reaksjonen utføres i nærvær av en egnet base. Eksempler på egnede løsningsmidler for denne reaksjonen omfatter THF, 1,4-dioksan, DMF, N-metyl-pyrrolidinon, EtOH, n-BuOH, i-PrOH, diklormetan, 1,2-dikloretan, DMSO eller acetonitril. Egnede baser er som beskrevet ovenfor.

Forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse kan syntetisk omdannes til andre forbindelser ifølge oppfinnelsen ved teknikker kjent for fagfolk på området. For illustrative formål og uten begrensning, omfatter slike metoder: a) fjerning av en beskyttelsesgruppe ved metoder beskrevet i T. W. Greene og P.G.M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", andre utgave, John Wiley and Sons, New York, 1991; f.eks. fjerning av en BOC beskyttelsesgruppe med en syre-kilde så som HCI eller trifluoreddiksyre.

b) fortrengning av en utgående gruppe (halogenid, mesylat, tosylat, etc) med funksjonelle grupper så som et primært eller sekundært amin, tiol

eller alkohol for å danne henholdsvis et sekundært eller tertiært amin, tioeter eller eter.

c) behandling av fenyl- (eller substituert fenyl) karbamater med primære eller sekundære aminer for å danne de tilsvarende urinstoffer som i

Thavonekham, B et. al. Synthesis (1997), 10, s.1189;

d) reduksjon av propargyl- eller homopropargylalkoholer eller N-BOC-beskyttede primære aminer til de tilsvarende E-allyliske eller E-homoallyliske

derivater ved behandling med natrium-bis(2-metoksyetoksy)aluminium-hydrid (Red-AI) som i Denmark, S. E.; Jones, T. K. J. Org. Chem. (1982) 47, 4595-4597 eller van Benthem, R. A. T. M.; Michels, J. J.; Speckamp, W. N. Synlett

(1994), 368-370; e) reduksjon av alkyner til de tilsvarende Z-alkenderivater ved behandling med hydrogengass og en Pd-katalysator som i Tomassy, B. et. al.

Synth. Commun. (1998), 28, s. 1201

f) behandling av primære og sekundære aminer med et isocyanat, syreklorid (eller annet aktivert karboksylsyrederivat), alkyl/arylklorformiat eller

suIfonylklorid for å gi det tilsvarende urinstoff, amid, karbamat eller sulfonamid; g) reduktiv aminering av et primært eller sekundært amin ved anvendelse av et aldehyd eller keton og et passende reduserende reagens. h) behandling av alkoholer med et isocyanat, syreklorid (eller annet aktivert karboksylsyrederivat), alkyl/arylklorformiat eller sulfonylklorid for å gi det

tilsvarende karbamat, ester, karbonat eller sulfonsyreester.

Aminer med formel 5 kan anskaffes og anvendes direkte eller alternativt fremstilles av fagfolk på området ved anvendelse av vanlige kjemiske omdannelser. For eksempel kan arylalkylaminer eller heteroarylalkylaminer fremstilles fra det tilsvarende nitril ved katalytisk hydrogenering ved anvendelse av katalysatorer så som Pd/C eller Raney-nikkel eller ved litiumaluminiumhydrid-reduksjon, (se Rylander, Catalytic Hydrogenation in Organic Synthesis, Academic Press, 1979).

Nitril-utgangsmaterialene kan enten kjøpes eller fremstilles fra det tilsvarende aryl/heteroarylbromid, -jodid eller -triflat og Zn(CN)2ved anvendelse av Pd-koblings-betingelser funnet i Tschaen, D. M., et. al Synthetic Communications (1994), 24, 6, s. 887-890.

Alternativt kan benzylaminer eller heteroarylmetylaminer fremstilles ved omsetning av det passende arylalkyl- eller heteroarylalkylhalogenid og kaliumsaltet av (BOC^NH (referanse) og påfølgende fjerning av Boc-gruppene med syre.

Aminer, beskyttede former av aminer, forløpere til aminer og forløpere til de beskyttede former av aminer med formel 5 kan fremstilles ved å kombinere det passende alkyn eller alkenyl-stannan, alkenyl-boran, alkenyl-boronsyre, boronsyreester med det passende aryl- eller heteroarylbromid, -jodid eller -triflat ved anvendelse av Pd koblings-betingelser som funnet i Tsuji, J.; Palladium Reagents and Catalysis, John Wiley and Sons 1999 og referanser angitt der.

Passende beskyttede aminer med formel 5 kan omdannes til forskjellige aminer med formel 5 i henhold til metoder kjent for fagfolk på området for eksempel som: (a) oksidasjon av en tioeter til sulfoksid eller sulfon. (b) N-alkylering av et sulfanilid kan oppnås under faseove rf øring ved anvendelse av betingelser beskrevet av Brehme, R. "Synthesis", (1976), s.113-114.

Som forstått av fagfolk på området kan kjemisk omdannelse for å omdanne et arylhalogenid eller -triflat eller heteroarylhalogenid eller -triflat til et aromatisk eller heteroaromatisk amin utføres ved anvendelse av betingelser for tiden beskrevet i litteraturen, se Hartwig, J. F.: "Angew. Chem. Int. Ed." (1998), 37, s. 2046-2067, Wolfe, J. P.; Wagaw, S.; Marcoux, J. F.; Buchwald, S.L.; "Acc. Chem. Res.", (1998), 31, s. 805-818, Wolfe, J. P.; Buchwald, S.L.; "J. Org. Chem.", (2000), 65, s. 1144-1157, Muci, A. R.; Buchwald, S. L; "Topics in Current Chemistry" (2002), s. 131-209 og referanser angitt der. Videre, som forstått av fagfolk på området, kan disse samme kjemiske aryl- eller heteroaryl-aminerings-omdannelser alternativt utføres på nitril- (eller primært amid) forløpere som gir aminer med formel 5 etter nitril- (eller amid) reduksjon. Beskyttede aminer med formel 5 kan videre omdannes til forskjellige aminer med formel 5 i henhold til metoder kjent for fagfolk på området.

In vitro aktivitet av forbindelsene med formel 1 kan bestemmes ved den følgende prosedyre. Mer spesielt tilveiebringer de følgende forsøk en metode for å bestemme hvorvidt forbindelser med formel 1 hemmer tyrosinkinase-aktivitet til den katalytiske konstruksjon FAK(410-689). Forsøket er et ELISA-basert format, som måler hemning av poly-glu-tyr fosforylering av FAK(410-689).

Forsøksprotokollen har tre deler:

I. Rensning og spaltning av His-FAK(410-689)

II. FAK410-689- (også kjent som FAKcd) aktivering

III. FAKcd kinase ELISA

Materialer:

-Ni-NTA agarose (Qiagen)

-XK-16 kolonne (Amersham-Pharmacia)

-300 mM Imidizol

-Superdex 200 HiLoad 16/60 prep kvalitet kolonne (Amersham Biotech.) -Antistoff: Anti-fosfotyrosin HRP-konjugert Py20 (Transduction labs).

-FAKcd: Renset og aktivert internt

-TMB Microwell Peroksidase Substrat (Oncogene Research Products #CL07)

-BSA: Sigma #A3294

-Tween-20: Sigma #P1379

-DMSO: Sigma #D-5879

-D-PBS: Gibco #14190-037.

Reagenser for rensning:

-Buffer A: 50 mM HEPES pH 7,0,

500 mM NaCI,

0,1 mMTCEP

Komplette TM proteaseinhibitor-cocktail tabletter (Roche)

-Buffer B: 25 mM HEPES pH 7,0,

400 mM NaCI

0,1 mM TCEP.

-Buffer C: 10 mM HEPES pH 7,5,

200 mM ammoniumsulfat

0,1 mM TCEP.

Reagenser for aktivering

-FAK(410-689): 3 rør av frosne aliquoter med 150ul/rør totalt 450 ul med 1,48 mg/ml (660ug) -His-Src(249-524): -0,74 mg/ml lager i 10mM HEPES, 200 mM (NH4)2S04-Src reaksjonsbuffer (Upstate Biotech):

100mMTris-HCI pH7,2,

125 mM MgCI2,

25 mM MnCI2,

2 mM EDTA,

250 uM Na3V04,

2 mM DTT

-Mn2+/ATP cocktail (Upstate Biotech)

75 mM MnCI2

500 uM ATP

20 mM MOPS pH 7,2

1 mM Na3V04

25 mM -glycerolfosfat

5 mM EGTA

1 mM DTT

-ATP: 150 mM lager

-MgCI2: 1 M lager

-DTT: 1M lager

Reagenser for FAKcd kinase ELISA

-Fosforyleringsbuffer:

50 mM HEPES, pH 7,5,

125 mM NaCI,

48 mM MgCI2

-Vaskebuffer: TBS + 0,1% Tween-20.

-Blokkeringsbuffer:

Tris buffer saltløsning,

3% BSA,

0,05% Tween-20, filtrert.

-Platebelegg-buffer:

50 mg/ml Poly-Glu-Tyr (Sigma #P0275) i fosfatbufret saltløsning

(DPBS).

-ATP: 0,1 M ATP i H20 eller HEPES, pH 7.

Merk: ATP forsøksbuffer:

Fremstill som 75 uM ATP i PBS, slik at 80 ul i

120 ul reaksjonsvolum=50uM endelig ATP-konsentrasjon.

I. Rensning av His-FAKcd(410-689)

1. Resuspender 130 g baculovirus cellepasta inneholdende det overuttrykte His-FAKcd410-689 rekombinante protein i 3 volumer (400 ml) av Buffer A,

2. Lyse celler med én passering på en mikrofluidisator

3. Fjern celle-debris ved sentrifugering ved 40C i 35 minutter ved 14,000 rpm i en Sorval SLA-1500 rotor. 4. Overfør supernatanten til et rent rør og tilsett 6,0 ml Ni-NTA agarose (Qiagen) 5. Inkuber suspensjonen med forsiktig vugging ved 40C i 1 time 6. Sentrifuger suspensjonen ved 700 x g i en "swinging bucket" rotor. 7. Kast supernatanten og resuspender agarosekulene i 20,0 ml av Buffer A 8. Overfør kulene til en XK-16 kolonne (Amersham-Pharmacia) forbundet med FPLCTM. 9. Vask agarose-kulene med 5 kolonne-volumer av Buffer A og eluer kolonnen med en trinn-gradient av Buffer A inneholdende 300 mM Imidizol. 10. Utfør en buffer-utveksling av de eluerte fraksjoner til Buffer B 11. Etter buffer-utveksling, samle fraksjonene og tilsett trombin i et 1:300 (vekt/vekt) forhold og inkuber natten over ved 13°C for å fjerne det N-terminale His-merke (His-FAK410-698 FAK410-689 (også kjent som FAKcd)). 12. Tilsett reaksjonsblandingen tilbake på Ni-NTA kolonnen ekvilibrert med Buffer A og samle opp gjennomstrømmingen. 13. Konsentrer gjennomstrømmingen ned til 1,7 ml og fyll direkte på en Superdex 200 HiLoad 16/60 prep kvalitet kolonne ekvilibrert med Buffer C. Det ønskede protein eluerer mellom 85 - 95 ml.

14. Aliquot FAKcd-proteinet og lagre frosset ved -80°C

II. FAK-aktivering

1. Til 450 ul av FAK(410-689) med 1,48 mg/ml (660ug) tilsett de følgende:

30ul av 0,037 mg/ml (1uM) His-Src(249-524)

30ul av 7,5 mM ATP

12ul av 20 mM MgCI2

10ul Mn2+/ATP cocktail (UpState Biotech.)

4ul av 6,7mM DTT

60ul Src reaksjonsbuffer (UpState Biotech.)

2. Inkuber reaksjonen i minst 3 timer ved romtemperatur

På tid to, er nesten all FAK(410-689) enkeltfosforylert. Den andre fosforylering er langsom. Ved ti2o(t = 120 minutter), tilsett 10ul av 150 mM

ATP.

To = (Start) 90% enkelt fosforylert FAK(410-689) (1 P04)

T43= (43 min) 65% enkelt fosforylert (1 P04), 35% dobbelt fosforylert

(2 P04)

T90= (90 min) 45% 1 P04, 55% 2 P04

T150= 15% 1 P04, 85% 2 P04

T210= <10% 1 P04, >90% 2 P04 avsaltet prøve

3. Tilsett 180 ul aliquoter av det avsaltede materiale til NiNTA spinn-kolonne og inkuber på spinnkolonne 4. Spinn ved 10k rpm (mikrofuge), i 5 min for å isolere og oppsamle gjennomstrømmingen (Aktivert FAK(410-689)) og fjern His-Src

(oppfanget på kolonnen)

III. FAKcd kinase ELISA

1. Belegg 96-brønn Nunc MaxiSorp plater med poly-glu-tyr (pGT) med 10 ug/brønn: Fremstill 10 ug/ml pGT i PBS og aliquoter 100 ul/brønn. Inkuber platene ved 37°C natten over, aspirer supernatanten, vask platene 3 ganger med vaskebuffer og klapp til tørt før lagring ved 4°C. 2. Fremstill forbindelse-stamløsninger av 2,5 mM i 100% DMSO. Lagrene blir deretter fortynnet til 60X av den endelige konsentrasjon i 100% DMSO og fortynnet 1:5 i kinase-fosforyleringsbuffer. 3. Fremstill en 75 uM arbeids ATP-løsning i kinase-fosforyleringsbuffer. Tilsett 80 ul til hver brønn for en endelig ATP-konsentrasjon på 50 uM. 4. Overfør 10 ul av de fortynnede forbindelser (0,5 log serie-fortynninger) til hver brønn av pGT forsøksplaten, ved å kjøre hver forbindelse in triplo på samme plate. 5. Fortynn på is, FAKcd protein til 1:1000 i kinase fosforyleringsbuffer. Tilsett 30 ul pr. brønn. 6. Merk: Linearitet og den passende fortynning må være forhånds-bestemt for hver porsjon av protein. Enzym-konsentrasjonen valgt må være slik at kvantifisering av forsøkssignalet vil være omtrent 0,8-1,0 ved OD450 og i det lineære området for reaksjonshastigheten. 7. Fremstill både en Ingen ATP-kontroll (støy) og en Ingen Forbindelse Kontroll (Signal): 8. (Støy) Én blank rad av brønner mottar 10 ul av 1:5 fortynnede forbindelser i DMSO, 80ul av fosforyleringsbuffer (minus ATP) og 30 ul FAKcd-løsning. 9. (Siganl) Kontroll-brønner mottar 10 ul av 1:5 fortynnet DMSO (minus forbindelse) i kinase fosforyleringsbuffer, 80 ul av 75 uM ATP og 30 ul av 1:1000 FAKcd-enzym. 10. Inkuber reaksjonen ved romtemperatur i 15 minutter med forsiktig risting på en plate-shaker. 11. Avslutt reaksjonen ved aspirering av reaksjonsblandingen og vasking 3 ganger med vaskebuffer. 12. Fortynn fosfo-tyrosin HRP-konjugert (pY20HRP) antistoff til 0,250ug/ml (1:1000 av lager) i blokkeringsbuffer. Tilsett 100 ul pr. brønn og inkuber med risting i 30 min. ved romtemperatur 13. Aspirer supernatanten og vask platen 3 ganger med vaskebuffer. 14. Tilsett 100 ul pr. brønn av romtemperatur TMB-løsning for å initiere fargeutvikling. Fargeutvikling blir avsluttet etter omtrent 15-30 sek. ved tilsetning av 100ul av 0.09M H2SO4pr. brønn. 15. Signalet blir kvantifisert ved måling av absorbans ved 450 nm på BioRad mikroplateleser eller en mikroplateleser som er i stand til å lese ved OD450. 16. Hemning av tyrosinkinase-aktivitet ville resultere i et redusert absorbans-signal. Signalet er typisk 0,8-1,0 OD-enheter. Verdiene er angitt som IC50, uM konsentrasjon.

FAK-induserbar celle-basert ELISA: Endelig protokoll

Materialer:

Reacti-Bind geit anti-kanin plater 96-brønn (Pierce Product#15135ZZ @115,00 USD)

FAKpY397 kanin polyklonalt antistoff (Biosource #44624 @315,00

USD)

ChromePure Kanin IgG, hel-molekyl (Jackson Laboratories #001-000-003 @60/25 mg USD)

UBI aFAK klon 2A7 mus monoklonalt antistoff (Upstate #05-182 @ 289,00 USD)

Peroksidase-konjugert AffiniPure geit anti-mus IgG (Jackson Labs #115-035-146 @95/1,5 ml USD)

SuperBlock TBS (Pierce Product #37535ZZ @99 USD)

Bovint serumalbumin (Sigma #A-9647 @117,95/100 g USD)

TMB peroksidase-substrat (Oncogene Research Products #CL07-100 ml @40,00 USD)

Na3V04Natrium-ortovanadat (Sigma #S6508 @43,95/50 g USD) MTT-substrat (Sigma # M-2128 @25,95/500 mg USD)

Vekstmedia: DMEM+10%FBS, P/S, Glu, 750 ug/ml Zeocin og 50 ug/ml Hygromycin (Zeocin InVitrogen #R250-05 @ 725 USD og Hygromycon InVitrogen #R220-05 @ 150 USD)

Mifepriston InVitrogen # H110-01 @ 125 USD

Komplett TM EDTA-fri proteaseinhibitor-pellet, Boehringer Mannheim #1873580

FAK celle-basert protokoll for selektivitet av kinase-avhengig fosfoFAKY397

Prosedyre:

Et induserbart FAK celle-basert forsøk i ELISA-format for screening av kjemisk stoff for å identifisere tyrosinkinase-spesifikke inhibitorer ble utviklet. Det cellebaserte forsøk utnytter mekanismen til GeneSwitchTM system (InVitrogen) for eksogent å kontrollere ekspresjon og fosforylering av FAK og det kinase-avhengige autofosforyleringssete ved resten Y397.

Hemning av kinase-avhengig autofosforylering ved Y397 resulterer i et redusert absorbanssignal ved OD450. Signalet er typisk 0,9 til 1,5 OD450 enheter med støy som faller i området 0,08 til 0,1 OD450-enheter. Verdiene er angitt som IC50, uM konsentrasjon.

På dag 1, dyrk A431 «FAKwt i T175 kolber. På dagen før kjøring av FAK celle-forsøk, pode A431«FAKwt celler i vekstmedia på 96-brønn U-bunn-plater. Tillat celler å stå ved 37°C, 5% C02i 6 til 8 timer før FAK-induksjon. Fremstill Mifepriston stamløsning av 10 uM i 100% etanol. Lagerløsningen blir deretter fortynnet til 10 X av den endelige konsentrasjon i vekstmedia. Overfør 10 ul av denne fortynning (endelig konsentrasjon på 0,1 nM Mifepriston) til hver brønn. Tillat celler å stå ved 37°C, 5% C02natten over (12 til 16 timer). Fremstill også kontroll-brønner uten Mifepriston-induksjon av FAK-ekspresjon og fosforylering.

På dag 2, belegg Geit Anti-Kanin plate(r) med 3,5 ug/ml fosfospesifikk FAKpY397 polyklonalt antistoff fremstilt i SuperBlock TBS-buffer og tillat plate(r) å riste på en plate-rister ved romtemperatur i 2 timer. Eventuelt kan kontrollbrønner belegges med 3,5 ug/ml kontroll Capture antistoff (Hele Kanin IgG molekyler) fremstilt i SuperBlock TBS. Vask vekk overskudd av FAKpY397 antistoff 3 ganger ved anvendelse av buffer. Blokker Anti-FAKpY397 belagte plate(r) med 200 ul pr. brønn av 3%BSA/0,5%Tween blokkeringsbuffer i 1 time ved romtemperatur på plateristeren. Mens platen(e) blir blokkert, fremstill forbindelse-stamløsninger av 5 mM i 100% DMSO. Stamløsningene blir deretter serielt fortynnet til 100X av den endelige konsentrasjon i 100% DMSO. Fremstill en 1:10 fortynning ved anvendelse av 100X løsning i vekstmedia og overfør 10 ul av de passende forbindelse-fortynninger til hver brønn inneholdende enten FAK-indusert eller uindusert kontroll A431 celler i 30 minutter ved 37°C, 5% C02- Fremstill RIPA lyse-buffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 1% NP-40, 0,25% Na-deoksycholat, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM Na3V04, 1 mM NaF og én komplett TM EDTA-fri proteaseinhibitor-pellet pr. 50 ml løsning). Ved slutten av 30 minutters forbindelse-behandling, vask vekk forbindelse 3 ganger ved anvendelse av TBS-T vaskebuffer. Lyse celler med 100 ul/brønn av RIPA buffer.

På den belagte plate, fjern blokkeringsbuffer og vask 3 ganger ved anvendelse av TBS-T vaskebuffer. Ved anvendelse av en 96-brønn automatisert mikrodispenser, overfør 100 ul av helcelle-lysat (fra trinn 6) til de Geit Anti-Kanin FAKpY397 belagte plate(r) for å oppfange fosfoFAKY397 proteiner. Rist ved romtemperatur i 2 timer. Vask vekk ubundede proteiner 3 ganger ved anvendelse av TBS-T vaskebuffer. Fremstill 0,5 ug/ml (1:2000 fortynning) av UBI aFAK-deteksjon antistoff i 3%BSA/0,5% Tween blokkeringsbuffer. Tilsett 100 ul av UBI aFAK-løsning pr. brønn og rist i 30 minutter ved romtemperatur. Vask vekk overskudd av UBI aFAK antistoff 3 ganger ved anvendelse av TBS-T vaskebuffer. Fremstill 0,08 ug/ml (1:5000 fortynning) av sekundær Anti-Mus Peroksidase (Anti-2MHRP) konjugert antistoff. Tilsett 100 ul pr. brønn av Anti-2MHRP-løsningen og rist i 30 minutter ved romtemperatur. Vask vekk overskudd av Anti-2MHRP antistoff 3 ganger ved anvendelse av TBS-T vaskebuffer. Tilsett 100 ul pr. brønn av romtemperatur TMB substratløsning for å tillate fargeutvikling. Avslutt TMB-reaksjon med 100 ul pr. brønn av TMB stoppløsning (0.09M H2S04) og kvantifiser signalet ved måling av absorbans ved 450 nm på BioRad mikroplateleser.

I en foretrukket utførelsesform har forbindelsene over en in vivo aktivitet som bestemt ved et kinase-forsøk, f.eks. så som det beskrevet her, på mindre enn 100 nM. Fortrinnsvis har forbindelsene en IC50på mindre enn 25 nM i kinaseforsøket og mer foretrukket mindre enn 10 nM. I en ytterligere foretrukket utførelsesform viser forbindelsene en IC50i et FAK-celle-basert forsøk, f.eks. så som det beskrevet her, på mindre enn 1 M, mer foretrukket mindre enn 100 nM og mest foretrukket mindre enn 25 nM.

Administrering av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse (nedenfor den (de) "aktive forbindelse(r)") kan utføres ved hvilken som helst metode som medfører levering av forbindelsene til virkningsstedet. Disse metoder omfatter orale ruter, intraduodenale ruter, parenteral injeksjon (omfattende intravenøs, subkutan, intramuskulær, intravaskulær eller infusjon), topisk og rektal administrering.

Mengden av den aktive forbindelse administrert vil være avhengig av individet som behandles, alvorlighetsgraden av lidelsen eller tilstanden, administreringshyppigheten, disposisjonen av forbindelsen og skjønnet til foreskrivende lege. Imidlertid er en effektiv dose i området ca. 0,001 til ca. 100 mg pr. kg kroppsvekt pr. dag, fortrinnsvis ca. 1 til ca. 35 mg/kg/dag, i enkle eller oppdelte doser. For et menneske på 70 kg, vil dette gi en mengde på ca. 0,05 til ca. 7 g/dag, fortrinnsvis ca. 0,2 til ca. 2,5 g/dag. I noen tilfeller kan dosenivåer under den nedre grensen av ovennevnte område være mer enn tilstrekkelig, mens i andre tilfeller kan enda større doser anvendes uten å forårsake noen skadelig bivirkning, forutsatt at slike større doser først blir delt opp i mange små doser for administrering i løpet av dagen.

Den aktive forbindelse kan anvendes som eneste terapi eller kan involvere én eller flere andre anti-tumor-substanser, for eksempel de valgt fra, for eksempel mitotiske inhibitorer, for eksempel vinblastin; alkyleringsmidler, for eksempel cis-platin, karboplatin og cyklofosfamid; anti-metabolitter, for eksempel 5-fluoruracil, cytosin-arabinosid og hydroksyurinstoff, eller for eksempel én av de foretrukne anti-metabolitter beskrevet i europeisk patentsøknad nr. 239362 så som N-(5-[N-(3,4-dihydro-2-metyl-4-oksokinazolin-6-ylmetyl)-N-metylamino]-2-thenoyl)-L-glutaminsyre; vekstfaktor-inhibitorer; cellecyklus-inhibitorer; interkalerende antibiotika, for eksempel adriamycin og bleomycin; enzymer, for eksempel interferon; og anti-hormoner, for eksempel anti-østrogener så som Nolvadex<®>(tamoxifen) eller, for eksempel anti-androgener så som Casodex<®>(4'-cyano-3-(4-fluorfenylsulfonyl)-2-hydroksy-2-metyl-3'-(trifluormetyl)propionanilid). Slik kombinert behandling kan oppnås ved samtidig, sekvensiell eller separat dosering av de individuelle komponenter av behandlingen.

Det farmasøytiske preparatet kan for eksempel være i en form egnet for oral administrering så som en tablett, kapsel, pille, pulver, formuleringer med forlenget frigjøring, løsning, suspensjon, for parenteral injeksjon som en steril løsning, suspensjon eller emulsjon, for topisk administrering som en salve eller krem eller for rektal administrering som et suppositorium. Det farmasøytiske preparatet kan være i enhetsdoseformer egnet for enkel administrering av nøyaktige doser. Det farmasøytiske preparatet vil omfatte en konvensjonell farmasøytisk bærer eller tilsetningsmiddel og en forbindelse ifølge oppfinnelsen som aktiv bestanddel. I tillegg kan det omfatte andre medisinske eller farmasøytiske midler, bærere, adjuvantia, etc.

Eksempler på parenterale administreringsformer omfatter løsninger eller suspensjoner av aktive forbindelser i sterile vandige løsninger, for eksempel vandig propylenglykol eller dekstrose-løsninger. Slike doseformer kan om ønsket være hensiktsmessig bufret.

Egnede farmasøytiske bærere omfatter inerte fortynningsmidler eller fyllmidler, vann og forskjellige organiske løsningsmidler. De farmasøytiske preparater kan, om ønsket, inneholde ytterligere bestanddeler så som smaksmidler, bindemidler, tilsetningsmidler og lignende. Således, for oral administrering kan tabletter inneholdende forskjellige tilsetningsmidler, så som sitronsyre anvendes sammen med forskjellige desintegreringsmidler så som stivelse, alginsyre og visse kompleks silikater og med bindemidler så som sukrose, gelatin og akasie. I tillegg er glattemidler så som magnesiumstearat, natriumlaurylsulfat og talk ofte anvendelige for tabletteringsformål. Faste preparater av en lignende type kan også anvendes i myke og harde fylte gelatinkapsler. Foretrukne materialer for dette omfatter laktose eller melkesukker og høymolekylære polyetylenglykoler. Når vandige suspensjoner eller eliksirer er ønsket for oral administrering kan den aktive forbindelse kombineres med forskjellige søtningsmidler eller smaksgivende midler, fargestoffer eller fargemidler og, om ønsket, emulgeringsmidler eller suspenderingsmidler, sammen med fortynningsmidler så som vann, etanol, propylenglykol, glycerin eller kombinasjoner derav.

Metoder for fremstilling av forskjellige farmasøytiske preparater med en spesifikk mengde av aktiv forbindelse er kjente eller vil være klare for fagfolk på området. For eksempler, se Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easter, Pa., 15. Utgave (1975).

Eksemplene og Fremstillingene gitt nedenfor illustrerer og eksemplifiserer ytterligere forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse og metoder for fremstilling av slike forbindelser. I de følgende eksempler kan molekyler med et enkelt chiralt senter, hvis ikke på annen måte angitt, eksistere som en racemisk blanding. Molekyler med to eller flere chirale sentere, hvis ikke på annen måte angitt, eksisterer som en racemisk blanding av diastereomerene. Enkle enantiomerer/diastereomerer kan oppnås ved metoder kjent for fagfolk på området.

Når HPLC-kromatografi er referert til ved fremstillingene og eksemplene nedenfor, er de generelle betingelser anvendt, hvis ikke annet er angitt, som følger. Kolonnen anvendt er en ZORBAX® RXC18 kolonne (fremstilt av Hewlett Packard) med 150 mm lengde og 4,6 mm indre diameter. Prøvene er kjørt på et Hewlett Packard-1100 system. En gradient-løsningsmiddel-metode blir anvendt som kjører 100 prosent ammoniumacetat / eddiksyrebuffer (0,2 M) til 100 prosent acetonitril over 10 minutter. Systemet løper deretter på en vaskecyklus med 100 prosent acetonitril i 1,5 minutter og deretter 100 prosent bufferløsning i 3 minutter. Strømningshastigheten over denne perioden er konstant 3 ml / minutt.

I de følgende eksempler og fremstillinger betyr "Et" etyl, "Ac" betyr acetyl, "Me" betyr metyl og "Bu" betyr butyl.

Eksempler

Generelle metoder:

Fremstilling av 5- nitro- oksindol:

Til en løsning av oksindol (26 g) i 100 ml konsentrert svovelsyre ved -15°C ble satt rykende salpetersyre (8,4 ml) dråpevis. Det ble nøye passet på å holde reaksjonstemperaturen ved -15°C. Etter at tilsetningen var fullstendig ble reaksjonsblandingen omrørt i 30 minutter og deretter hellet i isvann. Et gult presipitat ble dannet som ble isolert ved filtrering for å gi 34 gram (98%) av 5-nitro-oksindol.

Fremstilling av 5- amino- oksindol ( 2) :

Til en løsning av 5-nitro-oksindol (25 g) i 120 ml dimetylacetamid i en Parr-flaske ble satt 10% Pd/C (0,5 g). Blandingen ble hydrogenert (2,8 kg/cm<2>H2) i 16 timer. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering og filtratet ble fortynnet med eter (2L) for å gi 5-amino-oksindol (10,5 g; 50%).

Fremstilling av 2, 4- diklor- 5- trifluormetvlpvrimidin ( 3) : 5-trifluormetyluraciI (250 g, 1,39 mol) og fosforoksyklorid (655 ml, 6,94 mol, 5 ekv.) ble fylt på 3L 4-halset kolbe utstyrt med overliggende rører, en tilbakeløpskjøler, en tilsetningstrakt og et indre teromoelement. Innholdet ble

holdt under en nitrogen-atmosfære ettersom konsentrert fosforsyre (85 vekt%, 9,5 ml, 0,1 ekv.) ble tilsatt i én porsjon til oppslemningen, hvilket resulterte i en moderat eksoterm reaksjon. Diisopropyletylamin (245 ml, 1,39 mol, 1 ekv.) ble deretter tilsatt dråpevis over 15 min med en slik hastighet at den indre

temperatur i reaksjonsblandingen nådde 85-90°C ved slutten av tilsetningen. Ved slutten av amin-tilsetningen ble reaksjonsblandingen en homogen lys-oransje løsning. Oppvarmning ble initiert og den oransje løsningen ble holdt ved 100°C i 20 timer, på hvilket tidspunkt HPLC-analyse av reaksjonsblandingen viste at utgangsmaterialet var oppbrukt. Ytre oppvarmning ble fjernet og innholdet av kolben ble avkjølt til 40°C og deretter satt dråpevis til en avkjølt blanding av 3N HCI (5 L, 10 ekv.) og dietyleter (2L) mens temperaturen i kjølekaret ble holdt mellom 10 og 15°C. Lagene ble separert og det vandige laget ble ekstrahert én gang med eter (1L). De samlede organiske lag ble samlet, vasket med vann inntil vaskevæskene var nøytrale (5 x 1,5L vaskevæsker), tørket med MgSO\4 og konsentrert for å gi 288 g (95% utbytte) av en lys gul-oransje olje med 96% renhet (HPLC). Dette materialet kan renses ytterligere ved destillering (kp 109°C ved 79 mmHg).

Fremstilling av 5-( 4- klor- 5- trifluormetvl- pyrimidin- 2- vlamino)- 1, 3-dihydro- indol- 2- on ( 4) : Til en løsning av 5-trifluormetyl-2,4-diklorpyrimidin (214,8 g; 0,921 mol) i 1:1 DCE/tBuOH (1,240 L) ble satt sinkklorid 1M løsning i eter (1 ekv; 0,921 L). Etter 0,5 time ble 5-amino-oksindol (124 g; 0,837 mol) tilsatt fulgt av trietylamin (129,4 ml; 0,921 mol) mens temperaturen ble holdt ved 25°C. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur natten over, ble deretter konsentrert og produktet utgnidd fra metanol som et gult, fast stoff (224,3 g; 82%).<1>H NMR (DMSO-de, 400 MHz) 5 3,29 (s, 2H), 6,76 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 7,39 (d, J = 8,3 Hz), 7,51 (br s, 1H), 8,71 (s, 1H), 10,33 (s, 1H), 10,49 (s, 1H). <13>C NMR (DMSO-de, 100 MHz) 5 177,0, 161,3, 158,7 (br), 140,7, 132,8, 126,9, 123,7 (q, J = 268 Hz), 121,0, 118,7, 111,2 (q, J = 32 Hz), 109,6, 36,7; HPLC ret. time: 5,759 min. LRMS (M+) 329,1, 331,1. Eksempel 1 5-[4-(R-1-fenyl-etylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino]-1,3-dihydro-indol-2-on

Til en løsning av 1:1 DCE/t-BuOH alkohol (1:1 forhold, 4 ml) og 5-(4-klor-5-trifluormetyl-pyrimdin-2-ylamino)-1,3-dihydro-indol-2-on (0,15 g; 0,456 mmol) ble satt (R)(+) alfa-fenetylamin (0,071 ml; 0,547 mmol) og diisopropyletylamin (0,081 ml, 0,456 mmol). Den resulterende løsningen ble omrørt under nitrogen og oppvarmet til 80°C i 16 timer. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur, fortynnet med -10 ml av en 1:1 blanding av diklormetan og metanol fulgt av tilsetning av 0,5 g MP-karbonat. Den resulterende blandingen ble omrørt, filtrert, konsentrert og renset ved silikagel-kromatografi (97:2,8:0,3 forhold av kloroform/metanol/konsentrert ammoniumhydroksid). De ønskede tittelforbindelser ble oppnådd som et hvitt, fast stoff (0,021 g; 11%). HPLC ret. tid: 6,46 min. LRMS (M+) 413,4

De følgende forbindelser ifølge oppfinnelsen ble fremstilt ved oppvarmning av klorpyrimidin (4) med et passende amin som i Eksempel 1. Aminer anvendt i disse reaksjoner ble enten oppnådd kommersielt og anvendt som mottatt eller alternativt ble de fremstilt ved vanlige syntese-metoder for aminer kjent for fagfolk på området. Hvis ikke på annen måte angitt, ble forbindelser som har chirale sentere fremstilt som racemiske blandinger.

Claims (12)

1. Forbindelse med formel 1

hvor R<1>og R<2>er hver et hydrogenatom, eller R<1>og R<2>tatt sammen med karbonatomet de er bundet til danner en 2-hydroksy-indan-1-yl ring; R3 er valgt fra (a) et hydrogenatom når R<1>og R2 sammen danner en indanylring som angitt ovenfor, (b) -(C6-Cio)aryl eventuelt substituert med fra én til tre grupper valgt fra -S02(Ci-C6)alkyl, S02NH2, -N((CrC6)alkyl)(S02(Ci-C6)alkyl) og halogen, (c) en heteroarylgruppe valgt fra kromanyl eller furanyl, hver eventuelt substituert med -(Ci-C6)alkyl, (d) -(C3-Cio)cykloalkyl eller -(C3-Cio)cykloalkenyl, begge eventuelt substituert med hydroksy, (e) morfolinyl, pyrrolidinyl eller pyridinyl, hver eventuelt substituert med -S02(CrC6)alkyl eller -N((CrC6)alkyl)(S02(CrC6)alkyl, eller (f) (CrC6)alkyl substituert med en gruppe valgt fra -N((d-C6)alkyl)(S02(Ci-C6)alkyl) og 0(Ci-C6)alkyl, n er et helt tall fra 1 til 3. eller et farmasøytisk akseptabelt salt, solvat eller hydrat derav.

2. Forbindelse ifølge krav 1 hvor R<1>og R<1>er hydrogen og n er 1.

3. Forbindelse ifølge hvilket som helst av de foregående krav hvor R3 er -(C6-Cio)aryl, eventuelt substituert med én til tre grupper uavhengig valgt fra gruppen bestående av -S02(Ci-C6)alkyl, -S02NH2,-N((Ci.C6)alkyl)(S02(Ci-C6)alkyl) og halogen; eller en heteroarylgruppe valgt fra kromanyl eller furanyl, hver eventuelt substituert med -(Ci-C6)alkyl.

4. Forbindelse ifølge krav 1 eller 2, hvor R<3>er valgt fra gruppen bestående av (d) -(C3-Ci0)cykloalkyl eller-(C3-Ci0)cykloalkenyl, begge eventuelt substituert med hydroksy, (e) morfolinyl, pyrrolidinyl eller pyridinyl, hver eventuelt substituert med - 802(0!-C6)alkyl eller-N((C1-C6)alkyl)(S02(C1-C6)alkyl, og (f) (Ci-C6)alkyl substituert med en gruppe valgt fra -N((Ci-C6)alkyl)(S02(Ci-C6)alkyl) og 0(Ci-C6)alkyl.

5. Forbindelse ifølge krav 1 eller 2, hvor R<3>er -(Ci-Ce)alkyl substituert med én gruppe valgt fra gruppen bestående av -N((CrC6)alkyl)(S02(CrC6)alkyl) og -0(Ci-C6)alkyl.

6. Forbindelse ifølge hvilket som helst av de foregående krav med formel 2

hvor A er valgt fra gruppen bestående av:

hvor m er et helt tall fra 0-3 og R<13>er en substituent valgt fra gruppen bestående av (b) -S02(Ci-C6)alkyl, S02NH2, -N((Ci-C6)alkyl)(S02(Ci-C6)alkyl) og halogen når A er -(Ce-Cio)aryl; (c) -(CrC6)alkyl når A er en en heteroarylgruppe; og (e) -S02(Ci-C6)alkyl eller -N((Ci-C6)alkyl)(S02(CrC6)alkyl) når A er en pyridylgruppe.

7. Forbindelse ifølge hvilket som helst av de foregående krav med formel 3

hvor B er valgt fra gruppen bestående av:

hvor m er et heltall fra 0-6 og R<13>er en hydroksygruppe.

8. Forbindelse ifølge hvilket som helst av de foregående krav med formel 4

hvor D er valgt fra gruppen bestående av:

hvor q er et helt tall fra 1-2, m er et heltall fra 0-5 og R<13>er (c) -(CrC6)alkyl når D er en heteroarylgruppe, (d) hydroksy når D er-(C3-Cio)cykloalkyl eller-(C3-Cio)cykloalkenyl, (e) -S02(CrC6)alkyl eller-N((C1-C6)alkyl)(S02(C1-C6)alkyl når D er morfolinyl, pyrrolidinyl eller pyridinyl.

9. Forbindelse ifølge krav 1, valgt fra gruppen bestående av: 5-[4-(3-metansulfonyl-benzylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino]-1,3-dihydro-indol-2-on; Etansulfonsyre-metyl-{3-[2-(2-okso-2,3-dihydro-1H-indol-5-ylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-4-ylamino]-propyl}-amid; 5-{4-[(isokroman-1-ylmetyl)-amino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on; 5-{4-[2-(pyridin-3-yloksy)-propylamino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on; 3-{[2-(2-okso-2,3-dihydro-1H-indol-5-ylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-4-ylamino]-metyl}-benzensulfonamid; 5-{4-[(1-metansulfonyl-piperidin-3-ylmetyl)-amino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on; N-(3-{[2-(2-okso-2,3-dihydro-1H-indol-5-ylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-4-ylamino]-metyl}-fenyl)-metansulfonamid; N-metyl-N-{2-[2-(2-okso-2,3-dihydro-1H-indol-5-ylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-4-ylamino]-etyl}-metansulfonamid; 5-{4-[(4-metansulfonyl-morfolin-2-ylmetyl)-amino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on; 5-[4-(3-metansulfonylmetyl-benzylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino]-1,3-dihydro-indol-2-on; 5-{4-[(1-metansulfonyl-pyrrolidin-3-ylmetyl)-amino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on; N-metyl-N-{3-[2-(2-okso-2,3-dihydro-1H-indol-5-ylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-4-ylamino]-propyl}-metansulfonamid; 5-{4-[2-(1-metansulfonyl-piperidin-2-yl)-etylamino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on; 5-{4-[(4-metansulfonyl-pyridin-2-ylmetyl)-amino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on; 5-[4-(3-isopropoksy-propylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino]-1,3-dihydro-indol-2-on; 5-{4-[(5-metyl-furan-2-ylmetyl)-amino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on; 5-{4-[(bicyklo[2,2,1]hept-5-en-2-ylmetyl)-amino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on; N-(4-fluor-3-{[2-(2-okso-2,3-dihydro-1H-indol-5-ylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-4-ylamino]-metyl}-fenyl)-N-metyl-metansulfonamid; 5-{4-[(1-metansulfonyl-piperidin-3-ylmetyl)-amino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on; 5-{4-[(6-metansulfonyl-pyridin-2-ylmetyl)-amino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on; 5-{4-[(5-metansulfonyl-pyridin-3-ylmetyl)-amino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on; 5-[4-(2-metansulfonyl-benzylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino]-1,3-dihydro-indol-2-on; 5-{4-[(1-pyrimidin-2-yl-piperidin-3-ylmetyl)-amino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on; 5-{4-[2-(1-metansulfonyl-piperidin-2-yl)-etylamino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on; 5-{4-[2-(1-metansulfonyl-piperidin-2-yl)-etylamino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on; N-(2-{[2-(2-okso-2,3-dihydro-1H-indol-5-ylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-4-ylamino]-metyl}-fenyl)-metansulfonamid; 5-{4-[(1-metansulfonyl-pyrrolidin-2-ylmetyl)-amino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on; N-metyl-N-(2-{[2-(2-okso-2,3-dihydro-1H-indol-5-ylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-4-ylamino]-metyl}-fenyl)-metansulfonamid; N-metyl-N-(2-metyl-6-{[2-(2-okso-2,3-dihydro-1H-indol-5-ylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-4-ylamino]-metyl}-fenyl)-metansulfonamid; 5-[4-(2-hydroksy-indan-1-ylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamin 1,3-dihydro-indol-2-on; 5-{4-[(1-hydroksy-cyklopentylmetyl)-amino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on; 5-{4-[2-hydroksy-2-(1-metansulfonyl-piperidin-2-yl)-etylamino]-5-trifluormetyl-pyrimidin-2-ylamino}-1,3-dihydro-indol-2-on; og N-metyl-N-(3-{[2-(2-okso-2,3-dihydro-1H-indol-5-ylamino)-5-trifluormetyl-pyrimidin-4-ylamino]-metyl}-pyridin-2-yl)-metansulfonam

10. Fremgangsmåte for fremstilling av forbindelse med formel 1

hvor R<1>og R2 er hver et hydrogenatom, eller R<1>og R2 tatt sammen med karbonatomet de er bundet til danner en 2-hydroksy-indan-1-yl ring; R3 er valgt fra (a) et hydrogenatom når R<1>og R<2>sammen danner en indanylring som angitt ovenfor, (b) -(C6-Ci0)aryl eventuelt substituert med fra én til tre grupper valgt fra -S02(CrC6)alkyl, S02NH2, -N((CrC6)alkyl)(S02(CrC6)alkyl) og halogen, (c) en heteroarylgruppe valgt fra kromanyl eller furanyl, hver eventuelt substituert med -(Ci-C6)alkyl, (d) -(C3-Cio)cykloalkyl eller -(C3-Cio)cykloalkenyl, begge eventuelt substituert med hydroksy, (e) morfolinyl, pyrrolidinyl eller pyridinyl, hver eventuelt substituert med -S02(Ci-C6)alkyl eller-N((Ci-C6)alkyl)(S02(Ci-C6)alkyl, eller (f) (CrC6)alkyl substituert med en gruppe valgt fra -N((d-C6)alkyl)(S02(CrC6)alkyl) og 0(CrC6)alkyl, n er et helt tall fra 1 til 3. eller et farmasøytisk akseptabelt salt, solvat eller hydrat derav; hvor fremgangsmåten omfatter trinnene (a) reagere 5-amino-oksindol, 2 med dikloropyrimidin 3 I nærvær av en Lewis-syre og en egnet base for å fremstille en 2-substituert pyrimidin 4; (b) reagere pyrimidin 4 med NH2-(CR<1>R2)nR<3>I nærvær av en egnet base hvilket gir en forbindelse med formel 1.

11. Forbindelse ifølge krav 1, for behandling av unormal cellevekst hos et pattedyr.

12. Farmasøytisk preparat for behandling av unormal cellevekst hos et pattedyr omfattende en mengde av en forbindelse ifølge krav 1 som er effektiv for behandling av unormal cellevekst, og en farmasøytisk akseptabel bærer.