NO326423B1 - Fremgangsmate for a bestemme funksjonaliteten av en PTH forbindelse samt celle egnet for bruk i en slik fremgangsmate - Google Patents
Fremgangsmate for a bestemme funksjonaliteten av en PTH forbindelse samt celle egnet for bruk i en slik fremgangsmate Download PDFInfo
- Publication number
- NO326423B1 NO326423B1 NO20011118A NO20011118A NO326423B1 NO 326423 B1 NO326423 B1 NO 326423B1 NO 20011118 A NO20011118 A NO 20011118A NO 20011118 A NO20011118 A NO 20011118A NO 326423 B1 NO326423 B1 NO 326423B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- parathyroid hormone
- dna
- reporter gene
- cell
- camp
- Prior art date
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 25
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 claims abstract description 15
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 102000006461 Parathyroid Hormone Receptors Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108010058828 Parathyroid Hormone Receptors Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 52
- 101001135770 Homo sapiens Parathyroid hormone Proteins 0.000 claims description 35
- 101001135995 Homo sapiens Probable peptidyl-tRNA hydrolase Proteins 0.000 claims description 35
- 102000058004 human PTH Human genes 0.000 claims description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 33
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 31
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 29
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 26
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 24
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 24
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 23
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 22
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 claims description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 abstract description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 41
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 19
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 18
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 18
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 15
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 102100036893 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 8
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101001135738 Homo sapiens Parathyroid hormone-related protein Proteins 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 206010049088 Osteopenia Diseases 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 3
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000002961 luciferase induction Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000849 parathyroid Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- QFVODVAZJVCZIQ-INNSVFCQSA-N 51257-86-4 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1N=CN=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)OC(=O)CC[C@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1N=CN=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)OC(=O)CC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)OC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC1N=CN=C1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 QFVODVAZJVCZIQ-INNSVFCQSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000029725 Metabolic bone disease Diseases 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 2
- 101710123753 Parathyroid hormone-related protein Proteins 0.000 description 2
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 2
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 2
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 2
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 2
- -1 phosphate ester Chemical class 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 2'‐deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000010392 Bone Fractures Diseases 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- 208000014311 Cushing syndrome Diseases 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N Deoxycytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1OC(CO)C(O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 201000002980 Hyperparathyroidism Diseases 0.000 description 1
- 208000013038 Hypocalcemia Diseases 0.000 description 1
- 208000000038 Hypoparathyroidism Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 102000016349 Myosin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010067385 Myosin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940116372 Parathyroid hormone receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 102000043299 Parathyroid hormone-related Human genes 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 108010006886 Vitrogen Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011948 assay development Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003491 cAMP production Effects 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004094 calcium homeostasis Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000000705 hypocalcaemia Effects 0.000 description 1
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 238000003468 luciferase reporter gene assay Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 201000009395 primary hyperaldosteronism Diseases 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Secondary Cells (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en bioanalyse for å bestemme funksjonaliteten av en paratyroidhormon forbindelse. Videre vedrører foreliggende oppfinnelse en celle som er egnet til bruk i nevnte fremgangsmåte.
Humant paratyroidea hormon (hPTH) er et 84 aminosyreprotein som er en hovedregulator for kalsiumhomøostase. Paratyroidea hormonbeslektet protein (hPTHrP) er et 139 til 171 aminosyreprotein med N-terminal homologi til hPTH. De N-terminale fragmentene av hPTH og hPTHrP, særlig de som består av aminosyrer 1-34, bibeholder den fullstendige biologiske aktivitet til moderhormonet.
Den biologiske aktivitet av hPTH ble avspeilet i aktiviteringen av to sekundære messengersystemer: G-proteinkoblet adenylylsyklase (AC) og proteinkinase C (PKC)-aktivitet. De N-terminale fragmentene hPTH(l-34) og hPTH(l-31)NH2 har vist seg å være anaboliske med hensyn til bendannelse hos henholdsvis mennesker og ovarieektomiserte rotter. Denne økning i bendannelse har vist seg å ha sammenheng med stimuleringen av adenylylcyklaseaktiviteten. Analoger av disse Af-terminale fragmentene har betydelig terapeutisk potensiale for behandlingen av fysiologiske tilstander som er knyttet til reguleringen av bencellekalsium, og omfatter hypokalsemi; osteoporose; osteopenia og sykdommer som er knyttet til osteoporose og osteopenia slik som hyperparatyroidisme, hypoparatyroidisme og Cushings syndrom; glukokortikoid-og immunosuppressiv-fremkalt osteopaenia; og benfraktur og benrefrakturreparasjon.
For lettere å finne virksomme hPTH-analoger, er det et behov for fremgangsmåter for å bestemme funksjonaliteten av disse analogene. En slik metode bør være enkel, følsom og lar seg bruke ved automatisering slik at man hurtig kan screene et stort antall forbindelser.
Flunmann et al, Molecular and Cellular Endocrinology, 139:89-98 beskriver en studie som viser PTH regulert ekspresjon av tre distinkte stabilt transfekterte luciferase reporter gen i UMR-106 celler. Videre er det i US5854004 beskrevet en fremgangsmåte for å bestemme den modulerende effekt av en testsubstans på en reseptor-avhengig signalvei, hvor anvendelsen av et reportergen som er under kontroll av cAMP-responsive elementer blir spesielt nevnt.
Et første aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å bestemme funksjonaliteten av en paratyroidea hormonforbindelse som innbefatter (a) å tilsette forbindelsen til en kultur av paratyroidhormonreseptor utrykkende celler som bærer et reportergen under transkripsjonen kontroll av flere cAMP-responsive elementer og omfatter en heterolog nukleinsyre som koder for paratyroidhormonreseptoren; og
(b) å måle forandringen i ekspresjonen av reportergenet.
Fortrinnsvis blir forandringen i reportergenekspresjon sammenlignet med egnede kontrollnivåer av reportergenekspresjon. Egnede kontroller som kan bli målt omfatter, men er ikke begrenset til, ekspresjon i fravær av paratyroidea hormonforbindelsen og/eller ekspresjon i nærvær av en kjent paratyroidea hormonreseptoragonist. Paratyroidea hormonreseptoragonister omfatter, men er ikke begrenset til, hPTH(l-34)OHog hPTH(l-31)NH2.
Et andre aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en celle som er kjennetegnet ved at den uttrykker en paratyroidhormonreseptor på dens overflate og omfatter et reportergen under transkripsjonen kontroll av flere cAMP-responsive elementer og en heterolog nukleinsyre som koder for paratyroidhormonreseptoren.
Cellene kan være prokaryote eller eukaryote celler. Fortrinnsvis er cellene pattedyrceller.
Antallet cAMP-responsive bestanddeler bør være tilstrekkelig for å drive ekspresjonen i cellen til reportergenet i nærvær av cAMP. Fortrinnsvis er antallet av cAMP-responsive bestanddeler større enn ca. 10. Fortrinnsvis er antallet av cAMP-responsive bestanddeler ca. 16.
Reportergenet kan kode for et protein valgt fra, men ikke begrenset til, (3-galaktosidase, kloramfenikol-acetyltransferase, P-glukuronidase og luciferase. Et foretrukket reportergen koder for luciferase.
KORT OMTALE AV FIGURENE
Figur 1 er et diagram av luciferaseinduksjon i hPTH-reseptor-uttrykkende HEK-293-celler som bærer luciferasereportergenet, etter induksjon i 8 timer med hPTH(l-34), som betyr "filled-in" romber, hPTH(l-27) som betyr "filled-in" kvadrater og hPTH(l-28) som betyr "filled-in" trekanter. Figur 2 er et diagram av luciferaseinduksjon i hPTH-reseptor-uttrykkende HEK-293 celler som bærer luciferasereportergenet, etter induksjon natten over (ca. 16 timer) med hPTH(l-34) som betyr "filled-in" romber, hPTH(l-31) betyr "filled-in" kvadrater, hPTH(l-27) som betyr "filled-in" trekanter og hPTH(3-34) betyr symbolet "X".
De forskjellige trekk ved oppfinnelsen vil fremgå mer detaljert i de følgende avsnitt. Denne inndeling i forskjellige avsnitt er ment å lette forståelsen av oppfinnelsen, og er ikke på noen måte ment å begrense denne.
Definisjoner
De følgende nærmere angitte betegnelser ble anvendt gjennom foreliggende beskrivelse, og bør være til hjelp for å forstå omfanget og utførelsen av foreliggende oppfinnelse.
Ved en særlig utførelsesform betyr betegnelsen "ca." eller "omtrent" innenfor 20%, foretrukket innenfor 10%, eller mer foretrukket innenfor 5% av en gitt verdi eller område.
En "nukleinsyre" er en polymerforbindelse som innbefatter kovalent bundne subenheter som betegnes nukleotider. Nukleinsyre innbefatter polyribonukleinsyre (RNA) og polydeoksyribonukleinsyre (DNA), hvor begge kan være enkelttrådet eller dobbelttrådet. DNA inkluderes i cDNA, genomisk DNA, syntetisk DNA og halv-syntetisk DNA.
Et "gen" betyr en gruppe av nukleotider som koder for et polypeptid, og inkluderer cDNA og genomiske DNA-nukleinsyrer.
Et "rekombinant DNA-molekyl" er et DNA-molekyl som har gjennomgått en molekylær biologisk manipulasjon.
En "vektor" er ethvert middel for overføringen av en nukleinsyre inn i en vertscelle. En vektor er en vertscelle til hvilket kan være tilknyttet annet DNA-segment slik at man bevirker replikasjonen av den tilknyttede bestanddelen. Et "replikon" er en hvilken som helst bestanddel (f.eks. plasmid, fag, kosmid, kromosom, virus) som fungerer som en autonom enhet av DNA-replikasjon in vivo, dvs. er i stand til replikasjon under sin egen kontroll.
Betegnelsen "vektor" inkluderer både virale og ikke-virale midler for å innføre nukleinsyren inn i en celle in vitro, ex vivo eller in vivo. Virale vektorer inkluderer retrovirus, adeno-assosiert virus, kopper, baculovirus, vaccinia, herpes simplex, Epstein-Barr og adenovirus-vektorer, som fremgår mer detaljert nedenfor. Ikke-virale vektorer inkluderer plasmider, liposomer, elektrisk ladede lipider (cytofektiner), DNA-protein-komplekser og biopolymerer. I tillegg til en nukleinsyre kan en vektor også inneholde en eller flere regulatoriske områder, og/eller selekterbare markører som er nyttige når det gjelder å utvelge, måle og undersøke nukleinsyre overføringsresultater (overføring til hvilke vev, varighet av ekspresjon, etc).
En "kloningsvektor" er et replikon, slik som plasmid, fag eller cosmid, til hvilket et annet DNA-segment kan være tilknyttet slik at man bevirker replikasjon av det tilknyttede segment. Kloningsvektorer kan være i stand til replikasjon i en celletype, og ekspresjon i en annen ("shuttle vector").
En "kassett" betyr et segment av DNA som kan bli insertert inn i en vektor ved bestemte restriksjonsseter. Segmentet av DNA innkoder et polypeptid av interesse og kassetten og restriksjonssetene er fremstilt for å sikre insersjon av kassetten i den egnede leserammen for transkripsjon og translasjon.
En celle er blitt "transfektert" av eksogen eller heterolog DNA når slikt DNA er blitt innført inn i cellen. En celle er blitt "transformert" av eksogene og heterologe DNA når transfektert DNA bevirker en fenotypisk forandring. Transformerende DNA kan integreres (kovalent bundet) inn i kromosomal DNA og utgjør cellegenomet.
Et "nukleinsyremolekyl" betyr fosfatesterpolymerformen av ribonukleosider (adenosin, guanosin, uridin eller cytidin; "RNA-molekyler") eller deoksyribonukleosider (deoksyadenosin, deoksyguanosin, deoksythymidin eller deoksycytidin; "DNA-molekyler"), eller hvilke som helst fosforesteranaloger av disse, slik som fosforotioater og tioestere, i enten enkelttrådet form eller en dobbelttrådet helix. Det finnes dobbelttrådete DNA-DNA, DNA-RNA og RNA-RNA helixer. Betegnelsen nukleinsyremolekylet, og særlig DNA- eller RNA-molekyl, betyr den primære og sekundære strukturen av molekylet, og begrenser det ikke til noen spesielle tertiære former. Denne betegnelsen inkluderer således dobbelttrådet DNA funnet, blant annet, i lineære eller sirkulære DNA-molekyler (f.eks. restriksjonsfragmenter), plasmider og kromosomer. Ved redegjørelse for strukturen av bestemte dobbelttrådete DNA-molekyler, kan frekvensene her bli angitt ifølge vanlig praksis ved bare å angi sekvensen i 5'- eller 3'-retningen langs den ikke-transkriberte DNA-tråden (dvs. tråden har en sekvenshomolog til mRNA). Et "rekombinant DNA-molekyl" er et DNA-molekyl som har gjennomgått en molekylærbiologisk manipulasjon.
Et nukleinsyremolekyl er "hybridiserbar" til et annet nukleinsyremolekyl, slik som en cDNA, genomisk DNA eller RNA, når en enkelttrådet form av nukleinsyremolekylet kan annealere til det andre nukleinsyremolekylet under egnede betingelser av temperatur og løsningsionestyrke (se Sambrook et al., supra). Betingelsene av temperatur og ionestyrke bestemmer "stringensen" til hybridiseringen. For preliminær screening for homologe nukleinsyrer, kan det anvendes lavstringente hybridiseringsbetingelser som tilsvarer en Tm på 55°, f.eks. 5x SSC, 0,1% SDS, 0,25% melk, og ikke noe formamid, eller 30% formamid, 5x SSC, 0,5% SDS. Moderate stringente hybridiseringsbetingelser tilsvarer en høyere Tm, f.eks. 40% formamid med 5x eller 6x SCC. Høy stringenshybridiseringsbetingelser tilsvarer den høyeste Tm, f.eks. 40%) formamid med 5x eller 6x SCC. Hybridiseringen har behov for to nukleinsyrer som inneholder komplementære sekvenser, skjønt avhengig av stringensen av hybridiseringen er det mulig med mismatcher mellom baser. Den egnede stringensen for å hybridisere nukleinsyrer avhenger av lengden av nukleinsyrene og graden av komplementering, variabler som er kjent på området. Jo større grad av likhet eller homologi mellom to nukleotidsekvenser, jo større er verdien av Tm for hybrider av nukleinsyrer som har disse sekvenser. Den relative stabilitet (som tilsvarer høyere Tm) av nukleinsyrehybridiseringer reduseres i den følgende rekkefølge: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. For hybrider som er større enn 100 nukleotider i lengde, er det blitt utledet ligninger for å beregne Tm (se Sambrook et al., supra, 9.50 - 0,51). For hybridisering med kortere nukleinsyrer, f.eks. oligonukleotider, blir posisjonens matcher viktigere, og lengden av oligomereren bestemmer dens spesifisitet (ses Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, andre opplag
(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 11.7-11.8). Fortrinnsvis er en minimumslengde for en hybridiserbar nukleinsyre minst ca. 10 nukleotider, foretrukket minst ca. 15 nukleotider, og mer foretrukket er lengden minst ca. 20 nukleotider.
Ved en bestemt utførelsesform betyr betegnelsen "standard hybridiseringsbetingelser" en Tm på 55°C, og anvender betingelser som fremgår nedenfor. Ved en foretrukket utførelsesform er Tm lik 60°C, i en mer foretrukket utførelsesform er Tm 65°C.
En DNA "kodende sekvens" er en dobbelttrådet DNA sekvens som er transkribert og translatert inn i et polypeptid i en celle in vitro eller in vivo når den er plassert under kontroll av egnede regulatoriske sekvenser. Omgivelsene til den kodende sekvensen blir bestemt av et startkodon ved 5'-(amino)-terminus og en translasjons stoppkodon ved 3'-(karboksyl)-terminus. En kodende sekvens kan inkludere, men er ikke begrenset til, prokaryote sekvenser, cDNA fra eukaryot mRNA, genomisk DNA-sekvenser fra eukaryot (f.eks. pattedyr-)DNA og til og med syntetiske DNA sekvenser. Dersom den kodende sekvens er ment for ekspresjon i en eukaryot celle, vil en polyadenyleringssignalsekvens- og transkripsjonsterminator være lokalisert 3' i forhold til den kodende sekvensen.
Transkripsjonene og translasjonelle kontrollsekvenser er DNA-regulatoriske sekvenser, slik som promotorer, enhancere, terminatorer og lignende som tilveiebringer ekspresjonen av den kodende sekvens i en vertscelle. I eukaryote celler er polyadenyleirngssignalene kontrollsekvenser.
En "promotorsekvens" er et DNA-regulatorisk område som er i stand til å binde DNA-polymerase i en celle og å initiere transkripsjonen av en nedstrøms (3'-retning) kodende sekvens. Hva angår å definere foreliggende oppfinnelse, er promotorsekvensen bundet ved sin 3'-terminus av transkripsjonsinitieringssetet og strekker seg oppstrøms (5'-retning) for å inkludere det minste antallet av baser eller bestanddeler som er nødvendig for å initiere transkripsjon ved nivåer som er påvisbare over bakgrunn. Inne i promotorsekvensen finnes et transkripsjonsinitieringssete (som bekvemt kan nærmere bestemmes ved å kartlegge med nuklease Sl), så vel som proteinbindingsdomener (consensus sekvenser) som er årsaken til bindingen av RNA-polymerase.
En kodende sekvens er "under kontroll" av transkripsjonene og translasjonelle kontrollsekvenser i en celle når RNA-polymerase transkriberer den kodede sekvensen inn i mRNA, som deretter blir trans-RNA-spleiset (dersom den kodende sekvensen inneholder introner) og translatert inn i proteinet innkodet av den kodende sekvensen.
Som anvendt her, betyr betegnelsen "homolog" i alle sine grammatikalske former og bokstaveringsvariasjoner forholdet mellom proteiner som har en "vanlig evolusjonær opprinnelse", og omfatter proteiner fra superfamilier (f.eks. immunoglobulin superfamilie) og homologe proteiner av forskjellige spesier (f.eks. myosin lett kjede, etc.) (Reeck et al., 1987, Cell 50: 667). Slike proteiner (og deres innkodede gener) har sekvenshomologi som blir gjenspeilet i deres høye grad av sekvenslikhet.
Følgelig betyr betegnelsen "sekvenslikhet" i alle sine grammatiske former, graden av identitet eller overensstemmelse mellom nukleinsyre eller aminosyresekvenser av proteiner som kan eller ikke kan ha en felles evalusjonær opprinnelse (se Reeck et al., supra). I vanlig bruk og ifølge foreliggende søknad kan betegnelsen "homolog" imidlertid, når den blir modifisert med et adverb slik som "meget" bety sekvenslikhet og ikke en vanlig evolusjonær opprinnelse.
Ved en bestemt utførelsesform er to DNA-sekvenser "i alt vesentlig homolog" eller "i alt vesentlig lik" når minst ca. 50% (foretrukket minst ca. 75% og mest foretrukket minst ca. 90 eller 95%) av nukleotidene svarer til den angitte lengde av DNA-sekvensene. Sekvensene som i alt vesentlig er homologe, kan identifiseres ved å sammenligne sekvensene ved å anvende standard programvare som er tilgjengelig i sekvensdatabank, eller i et Southern hybridiseringseksperiment ved f.eks. stringente betingelser som er nærmere angitt for det bestemte systemet. Å definere egnede hybridiseringsbetingelser er kjent på området. Se f.eks. Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; (2. opplag 1989).
En "signalsekvens" kan bli tilsatt ved begynnelsen av den kodende sekvens av et protein for å bli uttrykt på overflaten av en celle. Denne sekvensen innkoder et signalpeptid, N-terminal til det modne polypeptidet, som styrer vertscellen til å translokere polypeptidet. Betegnelsen "translokasjonssignalsekvens" som anvendt her, betyr denne type av signalsekvens. Translokasjonssignalsekvensene kan finnes tilknyttet til en rekke proteiner som er native til karyoter og prokaryoter, og er ofte funksjonelle i begge typer av organismer.
"Regulatorisk område" betyr en nukleinsyresekvens som regulerer ekspresjonen av en andre nukleinsyresekvens. Et regulatorisk område kan inkludere sekvenser som ifølge sin natur er årsaken til å uttrykke en bestemt nukleinsyre (et homologt område) eller kan inkludere sekvenser av en forskjellig opprinnelse som er årsaken til å uttrykke forskjellige proteiner eller selv syntetiske proteiner (et heterologt område). Sekvensene kan spesielt være sekvenser av karyote eller virale gener eller avledede sekvenser som stimulerer eller undertrykker transkripsjonen av et gen på en spesifikk eller ikke-spesifikk måte og på en induserbar eller ikke-induserbar måte. Regulatoriske områder inkluderer replikasjonsstartområde, RNA-spleiseseter, promotor, enhancere,
transkripsjonene terminatorer, signalsekvenser som retter polypeptidet til de sekretoriske "pathways" av målcellen og promotorer.
Et regulatorisk område fra en "heterolog kilde" er et regulatorisk område som ikke er naturlig knyttet til den uttrykte nukleinsyren. De heterologe regulatoriske områdene omfatter regulatoriske områder fra forskjellige spesier, regulatoriske områder fra en forskjellig gen, hybridregulatoriske sekvenser, og regulatoriske sekvenser som ikke foregår i naturen, men som er syntetisert av fagmannen.
"Heterolog" DNA betyr DNA som ikke er naturlig lokalisert i cellen eller i et kromosomalt cellesete. Den heterologe DNA omfatter fortrinnsvis et gen som er fremmed for cellen.
Et "polypeptid" er en polymer forbindelse som innbefatter kovalent bundne aminosyrerester. Aminosyrene har den følgende generelle strukturen:
Aminosyrer blir klassifisert i syv grupper på basis av sidekjeden R: (1) alifatiske sidekjeder, (2) sidekjeder som inneholder en hydroksyl (OH) gruppe, (3) sidekjeder som inneholder svovelatomer, (4) sidekjeder som inneholder en sur gruppe eller amidgruppe, (5) sidekjeder som inneholder en basisk gruppe, (6) sidekjeder som inneholder en aromatisk ring og (7) prolin, en iminosyre hvor sidekjeden er kondensert til aminogruppen. Et polypeptid ifølge oppfinnelsen innbefatter fortrinnsvis minst ca. 14 aminosyrer.
Et "protein" er et polypeptid som spiller en strukturell eller funksjonell rolle i en levende celle.
Betegnelsene "paratyroideahormon" og "PTH" betyr humant paratyroideahormon (hPTH) og humant paratyroideahormonbeslektet protein (hPTHrP).
En "variant" av et PTH- eller hPTHrP-polypeptid eller protein er en hvilken som helst analog, fragment, derivat eller mutant som er avledet fra et polypeptid eller protein og som bibeholder minst en biologisk egenskap av polypeptidet eller proteinet. Forskjellige varianter av polypeptidet eller proteinet kan forekomme i naturen. Disse varianter kan være alleliske variasjoner som er kjennetegnet ved forskjeller i nukleotidsekvensene av strukturgenet som koder for proteinet, eller kan involvere forskjellig spleising eller post-translasjonell modifikasjon. Det kan produseres varianter som har en eller flere aminosyresubstitusjoner, delesjoner, addisjoner eller substitusjoner. Disse varianter kan inkludere bl.a.: (a) varianter hvor en eller flere aminosyrerester er substituert med konservative eller ikke-konservative aminosyrer, (b) varianter hvor en eller flere aminosyrer er tilsatt til polypeptidet eller proteinet, (c) varianter hvor en eller flere av aminosyrene omfatter en substituentgruppe og (d) varianter hvor polypeptidet eller proteinet er kondensert med et annet polypeptid slik som serumalbumin. Teknikker for å oppnå disse variantene omfatter kjente genetiske (suppresjoner, delesjoner, mutasjoner, etc.), kjemiske og enzymatiske teknikker.
Dersom slike alleliske variasjoner, analoger, fragmenter, derivater, mutanter og modifikasjoner, omfatter alternative mRNA-spleisingsformer og alternative post-translasjonelle modifikasjonsformer, resulterer i derivater av polypeptider som bibeholder noen av de biologiske egenskapene til polypeptidet, er de ment å omfattes av omfanget av foreliggende oppfinnelse.
Et "heterologt protein" betyr et protein som ikke naturlig blir produsert i cellen.
To aminosyresekvenser er "i alt vesentlig homologe" eller "i alt vesentlig lignende" når mer enn ca. 40% av aminosyrene er identiske, eller mer enn 60% er lignende (funksjonell identiske). Lignende eller homologe sekvenser blir fortrinnsvis identifisert ved å anvende oppstilling, f.eks. GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin) "pileup program".
Betegnelsen "som tilsvarer" som ble anvendt her, betyr lignende eller homologe
sekvenser, enten den eksakte posisjonen er identisk eller forskjellig fra molekylet hvor likheten eller homologien blir målt. En nukleinsyre eller aminosyresekvensoppstilling kan omfatte mellomrom. Betegnelsen "som tilsvarer" betyr således sekvenslikheten, og ikke renummereringen av aminosyreresidene eller nukleotidbasene.
Betegnelsen "paratyroideahormonforbindelsen" betyr paratyroideahormon som er nærmere angitt her eller fragmenter, varianter eller analoger av denne. Betegnelsen "analog" betyr en hvilken som helst forbindelse som er i stand til å binde seg til en paratyroideareseptor. Paratyroideahormonforbidelser kan være derivater av humant moderparatyroideahormon eller humant paratyroideahormonbeslektet protein. Slike derivater blir angitt ved å anvende tall i parentes som refererer seg til antallet av aminosyrerester i peptidforbindelsen, og begynner ved N-terminusen. hPTH(l-34) er f.eks. en paratyroideahormonforbindelse som innbefatter de første 34 aminosyrene av humant paratyroideahormon.
Betegnelsene "paratyroideareseptor" og "PTH-reseptor" betyr den naturlig forekommende eller "villtypen" eller kognat human paratyroidea hormonreseptor eller operasjonelt modifisert eller genetisk fremstilte homologer av den tilsvarende naturlig forekommende kognatreseptor.
Betegnelsen "operasjonell" når den anvendes i forbindelse med modifiserte eller genetisk fremstilte homologer av paratyroideareseptor, betyr at den modifiserte eller genetisk fremstilte reseptor arbeider som tiltenkt.
"Funksjonalitet" av en paratyroidea hormonforbindelse relaterer seg til dens evne til å binde paratyroidea hormonreseptor og stimulere eller inhibere produksjonen av intracellulær cAMP. Funksjonaliteten er fortrinnsvis stimulering av cAMP-produksjon.
Betegnelsen "reportergen" betyr en kodende sekvens knyttet til heterolog promotor eller enhancerbestanddel, og hvilket produkt er lett å kvantitativt bestemmelig analysert når konstrusjonen ble innført i cellen. Ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter den heterologe promotor flere cAMP-responsive bestanddeler, som ved binding av cAMP, driver ekspresjonen av genet. Innføringen av reportergener inn i celler er omtalt i US patent 5.298.429. Eksempler på reportergener omfatter bakteriegener som innkoder p-galaktosidase (lacZ), kloramfenikol acetyltransferase (eat), (3-glucuronidase (GUS) og lignende og luciferase. Et foretrukket reportergen er luciferase. Anvendelse av luciferase som et reportergen er beskrevet i de følgende publikasjoner. 1. -Babichuk, et al., 1996, Journal of Biological Chemistry, 1996,271(28), 16485-16493. 2. Castanon, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 1994, 198 (2), 626-631. 3. Gao, et al., Journal of Immunology, 1993,150(10), 4376-4385; 4. Germain, et al., Biochemical Journal, 1996, 316,107-113; 5. Ghozi, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 1996, 93,1935-1940; 6. Himmler, et al., Journal of Receptor Research, 1993,13(1-4), 79-94; 7. Midgeon, et al., Journal of Biological Chemistry, 1994, 269(46), 29146-29152. 8. Pei, et al., Molecular Endocrinology, 1991, 5(4), 521-534; 9. Stachowiak, et al., Brain Research.Molecular Brain Research, 1994, 22(1-4), 309-319;
og
10. Tilly, et al., Endocrinology, 1992, 131(2), 799-806.
Bioanalysen ifølge foreliggende oppfinnelse ble utformet ved å innføre et reportergen inn i celler som uttrykker en PTH-reseptor. Reportergenet innbefatter i sitt promotorområde flere cAMP-responsive bestanddeler som binding av cAMP driver genekspresjonen. Graden av reportergenekspresjon vil således variere som en funksjon av cAMP-nivået i stedet. Ved bindingen av en paratyroideahormonforbindelse stimulerer PTH-reseptoren produksjonen av intracellulær cAMP, graden av denne er avhengig av størrelsen av reseptoraktiveringen av paratyroideahormonforbindelsen. Reseptor-mediert økning i cAMP er derfor koblet til økningen i ekspresjonen av reportergenet. Ved å måle ekspresjonen av reportergenet, kan måles aktiveringen av PTH-reseptoren av paratyroideahormonforbindelser.
Man vil lett forstå at foreliggende oppfinnelse er godt egnet til å utføre det som er tilsiktet ifølge oppfinnelsen å oppnå de resultatene og fordelene som er nevnt, så vel som de som er implisitt rettet. Eksemplene, som er beskrevet nedenfor, er angitt som typiske eksempler på foretrukne utførelsesformer, eller er ment å tjene som eksempler og er ikke ment å begrense omfanget av foreliggende oppfinnelse.
EKSEMPLER
Vanlige molekylærbiologiske teknikker
Fremgangsmåtene som vanligvis anvendes i molekylærbiologi, slik som preparativ ekstraksjon av plasmid-DNA, sentrifugering av plasmid-DNA i en cesiumkloirdgradient, agarose eller akrylamidgelelektroforese, rensing av DNA-fragmenter ved elektroeluering, proteinekstraksjon med fenol eller fenol/kloroform, etanol eller isopropanolutvinning av DNA i et saltmedium, transformasjon i Escherichia coli og lignende, er kjent på området og er uttømmende beskrevet i litteraturen [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; (2. opplag 1989); Ausubel F.M. Et al.
(eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Vanlige kloningskjedemidler omfatter plasmider av pBR322 og pUC-type og fager av M13-seriene. Disse kan oppnås kommersielt (Bethesda Research Laboratories).
For ligering kan DNA-fragmenter adskilles etter sin størrelse ved hjelp av agarose eller akrylamid gelelektroforese, ekstrahert med fenol eller med en fenol/kloroformblanding, utfelt med etanol og deretter inkubert i nærvær av fag T4 DNA-ligase (Biolabs) etter leverandørens instruksjoner.
Å fylle inn ("filling in") 5'-utstående ender kan utføres med Klenow-fragmentet av E. coli DNA-polymerase I (Biolabs) etter leverandørens spesifikasjoner. Nedbrytningen av 3'-utstående ender ble utført i nærvær av fag T4 DNA-polymerase (Biolabs) anvendt etter leverandørens instruksjoner. Nedbrytingen av 5'-utstående ender ble utført ved hjelp av en kontrollert behandling med Sj-nuklease.
Mutagenese rettet in vi tro ved hjelp av syntetiske oligodeoksynukleotider kan bli utført etter fremgangsmåten utviklet av Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] ved å anvende kiten distribuert av Amersham.
Den enzymatiske amplikasjon av DNA-fragmenter av PCR [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. og Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] teknikk kan utføres ved å anvende en "DNA thermal cycler" (Perkin Eimer) ifølge leverandørens spesifikasjoner.
Verifisering av nukleotidsekvensene kan utføres ved fremgangsmåten utviklet av Sanger et al., [Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74 (1977) 5463-5467] ved å anvende kiten distribuert av Amersham.
Plasmid-DNA'er kan renses ved hjelp av "Qiagen Plasmid Purification System" etter leverandørens instruksjoner.
Humane PTH- reseptor- uttrvkkende HEK- 293 celler;
Denne cellelinjen ble oppnådd som angitt av Pines et al., Endocrinology, 1994, 135(4), 1713-1716.
Luciferase- reportergen:
Ildflue luciferase-reportergen som bærer cAMP-responsive bestanddeler blir mangfoldiggjort ved hjelp av PCR fra pDMCi6LUC-vektoren ved å anvende fremgangsmåten av Spengler et al., Nature, 1993, 365: 170-175. PCR-produktet som inneholder MMTV-promotoren, seksten cAMP-responsive bestanddeler og luciferasegenet blir insertert inn i den zeocinresistente vektoren (pUTSVi fra In Vitrogen). Den resulterende vektor, betegnet pMCI^zeo, blir deretter innført inn i PTH-reseptor-uttrykkende HEK-293-celler ved å anvende lipofektamin-metoden (reagenser og fremgangsmåte oppnådd fra Gibco/BRL). Celler som inkorporerer luciferasereportergenet, blir valgt ved å inkludere zeocin i kulturmediet. Ved begrenset fortynning blir forskjellige cellekloner isolert og ekspandert. Disse klonene ble analysert på deres reaksjonsevne i forhold til PTH uttrykt ved luciferaseekspresjon. Kloner som utviser 5-6 ganger luciferaseinduksjon av PTH, ble anvendt for analyse-utvikling.
Luciferase- reporteranalvsefremgangsmåte
hPTH-reseptor-uttrykkende HEK-293 celler som bærer luciferase reportergenet ble dyrket til 80 - 90% konfluens. For å bestemme et middels emne til gjensidig å påvirke PTH-reseptoren, ble forsøksforbindelsen tilsatt til kulturmediet ved passende fortynning. hPTH(l-34) ble anvendt som positiv kontroll. Induksjon av luciferaseekspresjon ble utført ved 37°C. Etter induksjonen ble kulturmediet fjernet og cellen ble lysert ved tilsetning av lysebufferen ("Luciferase assay kit" fra Promega Corp.). Lysatet ble tilsatt i aliquote deler til en sort 96-brønners plate. Luciferaseaktiviteten i lysatene ble målt ved tilsetning av luciferinsubstrat ("Promega assay kit") for å bevirke lysproduksjon. Lysproduksjonen ble målt i en "Wallac Trilux microbeta plate reader".
Luciferaseaktiviteten av hPTH-reseptor-uttrykkende HEK-293 celler som bærer luciferasereportergenet etter induksjon i 8 timer med hPTH(l-34), hPTH(l-27) og hPTH(l-28) er vist i figur 1.
Luciferaseaktiviteten av hPTH-reseptor-uttrykkende HEK-293 celler som bærer luciferasereportergenet etter induksjon natten over (ca. 16 timer) med hPTH(l-31), hPTH(l-27) og hPTH(3-34) er vist i figur 2.
Omfanget av foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset av de spesifikke utførelseseksempler som er angitt. Forskjellige modifikasjoner av oppfinnelsen i tillegg til de som er angitt, vil være åpenbare for fagmannen ut fra beskrivelsen og kravene. Slike modifikasjoner er ment å omfattes av omfanget av kravene.
Det vil dessuten forstås at alle basestørrelser eller aminosyrestørrelser og alle molekylvekter eller molekylmasseverdier som er gitt for nukleinsyre eller polypeptider er approksimative, og er angitt for å klargjøre.
Claims (14)
1.
Fremgangsmåte for å bestemme funksjonaliteten av en paratyroidhormon forbindelse, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter: (c) å tilsette forbindelsen til en kultur av paratyroidhormonreseptor utrykkende celler som bærer et reportergen under transkripsjonen kontroll av flere cAMP-responsive elementer og omfatter en heterolog nukleinsyre som koder for paratyroidhormonreseptoren; og (d) å måle forandringen i ekspresjonen av reportergenet.
2.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at cellene er pattedyrceller.
3.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at antallet cAMP-responsive elementer er større enn 10.
4.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at antallet av cAMP-responsive elementer er 16.
5.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at reportergenet koder for et protein valgt fra gruppen som består av Ø-galaktosidase, kloramfenikol-acetyltransferase, P-glucuronidase og luciferase.
6.
Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at reportergenet koder for luciferase.
7.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at paratyroidhormonreseptoren er human paratyroidhormonreseptor.
8.
Celle, karakterisert ved at den uttrykker en paratyroidhormonreseptor på dens overflate og omfatter et reportergen under transkripsjonen kontroll av flere cAMP-responsive elementer og en heterolog nukleinsyre som koder for paratyroidhormonreseptoren.
9.
Celle ifølge krav 8, karakterisert ved at cellen er en pattedyrcelle.
10.
Celle ifølge krav 8, karakterisert ved at antallet cAMP-responsive elementer er større enn 10.
11.
Celle ifølge krav 10, karakterisert ved at antallet cAMP-responsive elementer er 16.
12.
Celle ifølge krav 8, karakterisert ved at reportergenet koder for et protein valgt fra gruppen som består av (5-galaktosidase, kloramfenikol-acetyltransferase, (3-glukuronidase og luciferase.
13.
Celle ifølge krav 12, karakterisert ved at reportergenet koder for luciferase.
14.
Celle ifølge krav 9, karakterisert ved at paratyroidhormonreseptoren er human paratyroidhormonreseptor.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US9918898P | 1998-09-04 | 1998-09-04 | |
| PCT/US1999/019952 WO2000013651A2 (en) | 1998-09-04 | 1999-08-31 | Luciferase reporter bioassay of parathyroid hormone compounds |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20011118D0 NO20011118D0 (no) | 2001-03-05 |
| NO20011118L NO20011118L (no) | 2001-04-30 |
| NO326423B1 true NO326423B1 (no) | 2008-12-01 |
Family
ID=22273414
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20011118A NO326423B1 (no) | 1998-09-04 | 2001-03-05 | Fremgangsmate for a bestemme funksjonaliteten av en PTH forbindelse samt celle egnet for bruk i en slik fremgangsmate |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1151156B1 (no) |
| JP (1) | JP2002524065A (no) |
| AT (1) | ATE290214T1 (no) |
| AU (1) | AU749288B2 (no) |
| CA (1) | CA2342926C (no) |
| DE (1) | DE69924027T2 (no) |
| ES (1) | ES2235547T3 (no) |
| NO (1) | NO326423B1 (no) |
| WO (1) | WO2000013651A2 (no) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6852546B1 (en) * | 2000-03-30 | 2005-02-08 | Diagnostic Hybrids, Inc. | Diagnosis of autoimmune disease |
| US8293879B2 (en) | 2000-03-30 | 2012-10-23 | Diagnostic Hybrids, Inc. | Methods of using chimeric receptors to identify autoimmune disease |
| US6756480B2 (en) | 2000-04-27 | 2004-06-29 | Amgen Inc. | Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein |
| AU2001292905A1 (en) * | 2000-09-19 | 2002-04-02 | Curagen Corporation | Method of identifying osteoregenerative agents using differential gene expression |
| GB0119438D0 (en) * | 2001-02-16 | 2001-10-03 | Aventis Pharm Prod Inc | Gap junction permeability assay |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4508828A (en) * | 1983-03-21 | 1985-04-02 | Immuno Nuclear Corporation | Bioassay of parathyroid hormone |
| JP3464796B2 (ja) * | 1991-04-05 | 2003-11-10 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション | 副甲状腺ホルモンのレセプターとそれをコードしているｄｎａ |
| DE4138621A1 (de) * | 1991-11-25 | 1993-06-17 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren zum screenen von substanzen mit modulierender wirkung auf einen rezeptorabhaengigen zellulaeren signaluebertragungsweg |
| US5578569A (en) * | 1993-03-12 | 1996-11-26 | Tam; Cherk S. | Method of increasing bone growth |
| US5750336A (en) * | 1994-02-10 | 1998-05-12 | The Salk Institute For Biological Studies | Assays for the identification of compounds which inhibit activation of cAMP and mitogen responsive genes |
| US5747456A (en) * | 1994-12-19 | 1998-05-05 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Continuous low-dose administration of parathyroid hormone or its agonist |
| US5914233A (en) * | 1996-08-23 | 1999-06-22 | Osteo Screen | Screening assay for the identification of agents which alter expression of PTH-rP |
-
1999
- 1999-08-31 CA CA002342926A patent/CA2342926C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-08-31 ES ES99968623T patent/ES2235547T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-31 AT AT99968623T patent/ATE290214T1/de active
- 1999-08-31 EP EP99968623A patent/EP1151156B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-31 WO PCT/US1999/019952 patent/WO2000013651A2/en active IP Right Grant
- 1999-08-31 AU AU60237/99A patent/AU749288B2/en not_active Ceased
- 1999-08-31 JP JP2000568460A patent/JP2002524065A/ja active Pending
- 1999-08-31 DE DE69924027T patent/DE69924027T2/de not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-03-05 NO NO20011118A patent/NO326423B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU749288B2 (en) | 2002-06-20 |
| NO20011118L (no) | 2001-04-30 |
| WO2000013651A3 (en) | 2000-09-08 |
| EP1151156A4 (en) | 2001-12-12 |
| WO2000013651A2 (en) | 2000-03-16 |
| JP2002524065A (ja) | 2002-08-06 |
| CA2342926C (en) | 2006-10-31 |
| DE69924027T2 (de) | 2005-07-21 |
| AU6023799A (en) | 2000-03-27 |
| ATE290214T1 (de) | 2005-03-15 |
| EP1151156B1 (en) | 2005-03-02 |
| DE69924027D1 (de) | 2005-04-07 |
| EP1151156A2 (en) | 2001-11-07 |
| NO20011118D0 (no) | 2001-03-05 |
| ES2235547T3 (es) | 2005-07-01 |
| CA2342926A1 (en) | 2000-03-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Creemers et al. | Coactivation of MEF2 by the SAP domain proteins myocardin and MASTR | |
| Johnson et al. | Casein kinase II increases the transcriptional activities of MRF4 and MyoD independently of their direct phosphorylation | |
| Tajima et al. | PCR detection of DNAs of animal origin in feed by primers based on sequences of short and long interspersed repetitive elements | |
| CHENG et al. | Identification and characterization of BC1 RNP particles | |
| Liu et al. | Structure, mRNA expression and linkage mapping of the brain‐type fatty acid‐binding protein gene (fabp7) from zebrafish (Danio rerio) | |
| Ivanov et al. | Human ribosomal protein S26 suppresses the splicing of its pre-mRNA | |
| NO326423B1 (no) | Fremgangsmate for a bestemme funksjonaliteten av en PTH forbindelse samt celle egnet for bruk i en slik fremgangsmate | |
| Kille et al. | Analysis of regulatory elements flanking metallothionein genes in Cd-tolerant fish (pike and stone loach) | |
| Schuster et al. | Two distinct domains in Staf to selectively activate small nuclear RNA-type and mRNA promoters | |
| Showalter et al. | Differential conservation of transcriptional domains of mammalian Prophet of Pit-1 proteins revealed by structural studies of the bovine gene and comparative functional analysis of the protein | |
| US6720153B1 (en) | Luciferase reporter bioassay of parathyroid hormone compounds | |
| Thomas et al. | Characterisation and gene expression profiling of a stable cell line expressing a cell cycle GFP sensor | |
| Yu et al. | Alternative 3′ UTR polyadenylation of Bzw1 transcripts display differential translation efficiency and tissue-specific expression | |
| Klenke et al. | The GRK 2 Promoter Is Regulated by Early‐Growth Response Transcription Factor EGR‐1 | |
| JP4853898B2 (ja) | Ｄｎａ標準物質 | |
| US7226744B2 (en) | Assays for TERT promoter modulatory agents using a telomerase structural RNA component | |
| Dhar et al. | An aminophospholipid translocase associated with body fat and type 2 diabetes phenotypes | |
| US20060269950A1 (en) | Method of identifying compounds that modulate interaction of androgen receptor with beta-catenin | |
| Morin et al. | The binding site for Xenopus glucocorticoid receptor accessory factor and a single adjacent half-GRE form an independent glucocorticoid response unit | |
| Westermann et al. | Cloning and recombinant expression of the La RNA-binding protein from Trypanosoma brucei | |
| EP2398914B1 (en) | Method of cell-line identification | |
| Hämäläinen et al. | Characterisation of the mulibrey nanism-associated TRIM37 gene: transcription initiation, promoter region and alternative splicing | |
| Quinn | Multiple protein binding sites within the rat preprotachykinin promoter: demonstration of a site with neuronal specificity that is 3′ of the major transcriptional start | |
| Miyake et al. | Analysis of the structure and expression of the chicken gene encoding a homolog of the human RREB-1 transcription factor | |
| Anderson et al. | The human DNA-activated protein kinase, DNA-PK: substrate specificity |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |