ES2235547T3 - Ensayo biologico de compuestos de la hormona paratiroidea con un gen informador de la luciferasa. - Google Patents
Ensayo biologico de compuestos de la hormona paratiroidea con un gen informador de la luciferasa.Info
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Abstract
Un método para determinar la funcionalidad de un compuesto de hormona paratiroidea, cuyo método comprende: (a) añadir el compuesto a un cultivo de células que expresan el receptor de la hormona paratiroidea, que son portadoras de un gen informador, bajo el control de la transcripción de múltiples elementos que responden a cAMP y que comprenden un ácido nucleico heterólogo que codifica el receptor de la hormona paratiroidea; y (b) medir el cambio en la expresión del gen informador.
Description
Ensayo biológico de compuestos de la hormona
paratiroidea con un gen informador de la luciferasa.
Esta invención se refiere a un ensayo biológico
para determinar la funcionalidad de compuestos de hormona
paratiroidea. Más particularmente, esta invención se refiere a un
ensayo biológico en el que el compuesto que ha de ser ensayado se
añade a un cultivo de células que expresan el receptor de la
hormona paratiroidea, que son portadoras de un gen informador bajo
el control de la transcripción de múltiples elementos que responden
a cAMP. Todavía más particularmente, esta invención se refiere a un
ensayo biológico en el que el compuesto que ha de ser ensayado se
añade a un cultivo de células que expresan el receptor de la
hormona paratiroidea, que son portadoras de un gen informador de
luciferasa, bajo el control de la transcripción de múltiples
elementos que responden al cAMP:
La hormona paratiroidea humana (hPTH) es una
proteína de 84 aminoácidos que es el regulador principal de la
homeostasis cálcica. La proteína relacionada con la hormona
paratiroidea (hPTHrP) es una proteína de 139 a 171 aminoácidos con
homología en el extremo N terminal con la hPTH. Los fragmentos del
extremo N terminal de la hPTH y de la hPTHrP, en particular los que
están constituidos por los aminoácidos 1-34,
retienen la actividad biológica total de la hormona parental.
La actividad biológica de la hPTH se refleja en
la activación de dos sistemas mensajeros secundarios: la actividad
de la adenilil-ciclasa (AC) y de la proteína quinasa
C (PKC) asociada a la proteína G.. Se ha demostrado que los
fragmentos del extremo N-terminal
hPTH(1-34)OH y
hPTH(1-31)NH_{2} son anabólicos con
respecto a la formación ósea en los seres humanos y en la rata
ovariotomizada, respectivamente. Se ha demostrado que este aumento
del crecimiento óseo está asociado con la estimulación de la
actividad de la adenilil ciclasa. Análogos de estos fragmento del
extremo N-terminal poseen un potencial terapéutico
importante para el tratamiento de estados fisiológicos asociados con
la regulación del calcio de las células óseas incluyendo
hipocalcemia, osteoporosis, osteopenia y trastornos asociados con la
osteoporosis y la osteopenia tales como hiperparatiroidismo,
hipoparatiroidismo y síndrome de Cushings, osteopenia inducida por
glucocorticoides e inmunosupresores, y fractura de huesos y
reparación de refracturas de huesos.
Para facilitar el descubrimiento de análogos de
hPTH eficaces, existe la necesidad de métodos de determinación de la
funcionalidad de estos análogos. Un método tal debe ser sencillo,
sensible y tender por sí mismo a la automatización de modo que pueda
examinarse rápidamente una multiplicidad de compuestos.
Flühmann et al., Molecular and Cellular
Endocrinology, 139, 1-2, 89-98
(1998) describen la regulación mediante la hormona paratiroidea de
la expresión tres genes informadores de luciferasa diferentes,
transfectados de modo estable, que responden al cAMP, suero, y éster
de forbol en células UMR-106 semejantes a los
osteoblastos de la rata.
La invención se refiere a un ensayo biológico
para determinar la funcionalidad de un compuesto de hormona
paratiroidea, que comprende:
(a) añadir el compuesto a un cultivo de células
que expresan el receptor de la hormona paratiroidea, que son
portadoras de un gen informador, bajo el control de la transcripción
de múltiples elementos que responden al cAMP y que comprenden un
ácido nucleico heterólogo que codifica el receptor de la hormona
paratiroidea; y
(b) medir el cambio en la expresión del gen
informador.
Preferiblemente, el cambio en la expresión del
gen informador se compara con niveles de testigos apropiados de
expresión del gen informador. Los testigos apropiados que pueden ser
medidos incluyen, aun cuando no se limitan a ellos, expresión en
ausencia del compuesto de la hormona paratiroidea y/o expresión en
presencia de un agonista conocido del receptor de la hormona
paratiroidea. Los agonistas del receptor de la hormona paratiroidea
incluyen, aun cuando no se limitan a ellos,
hPTH(1-34)OH y
hPTH(1031)NH_{2}.
Las células pueden ser células procarióticas o
células eucarióticas. Preferiblemente, las células son células de
mamífero.
El número de elementos que responden al cAMP debe
ser suficiente para conducir la expresión dentro de la célula del
gen informador en presencia de cAMP. Preferiblemente, el número de
elementos que responden al cAMP es mayor que 10, aproximadamente.
Más preferiblemente, el número de elementos que responden al cAMP es
16, aproximadamente.
El gen informador puede codificar una proteína
seleccionada entre, aunque no limitada a ellas,
\beta-galactosidasa,
cloranfenicol-acetiltransferasa,
\beta-glucuronidasa y luciferasa. El gen
informador preferido codifica la luciferasa.
La Figura 1 es una representación gráfica de la
inducción de luciferasa en células HEK-293 que
expresan el receptor de la hPTH, que son portadoras del gen
informador de la luciferasa, después de inducción durante 8 horas
con hPTH(1-34), representada por los puntos
con rombos, hPTH(1-27), representada por los
puntos con cuadrados y hPTH (1-28), representada por
los puntos con triángulos.
La Figura 2 es una representación gráfica de la
inducción de luciferasa en células HEK-293 que
expresan el receptor de la hPTH, que son portadoras del gen
informador de la luciferasa. después de inducción durante la noche
(aproximadamente 16 horas) con hPTH(1-34),
representada por los puntos con rombos,
hPTH(1-31) representada por los puntos con
cuadrados, hPTH (1-27) representada por los puntos
con triángulos y hPTH (3-34), representada por el
símbolo "X".
Los diversos aspectos de la invención serán
expuestos con mayor detalle en las secciones que figuran a
continuación. Esta organización en varas secciones está destinada a
facilitar una compresión de la invención y no puede interpretarse en
modo alguno como limitación de la misma.
Se utilizan en toda la memoria descriptiva
presente los términos y expresiones que siguen, que deben ser de
ayuda para comprender el alcance y la práctica de la presente
invención.
En una realización específica, el término
"alrededor" o "aproximadamente" significa dentro de 20%,
preferiblemente dentro de 10% y más preferiblemente dentro del 5%,
de un valor o intervalo dado.
Un "ácido nucleico" es un compuesto
polimérico constituido por subunidades enlazadas covalentemente
denominadas nucleótidos. El ácido nucleico incluye ácido
polirribonucleico (RNA) y ácido polidesoxirribonucleico (DNA) ambos
de los cuales pueden ser de una sola cadena o de doble cadena. DNA
incluye cDNA, DNA genómico, DNA sintético, y DNA semisintético.
Un "gen" se refiere a un conjunto de
nucleótidos que codifica un polipéptido, e incluye ácidos nucleicos
de cDNA y de DNA genómico.
Una "molécula de DNA recombinante" es una
molécula de DNA que ha experimentado una manipulación biológica
molecular.
Un "vector" es cualquier medio utilizado
para la transferencia de un ácido nucleico a una célula huésped. El
vector puede ser un replicón al que puede unirse otro segmento de
DNA produciendo de este modo la replicación del segmento unido. Un
"replicón" es cualquier elemento genético (por ejemplo,
plásmido, fago, cósmido, cromosoma, virus) que actúa como una unidad
autónoma de replicación de DNA in vivo, es decir, capaz de
replicación bajo su propio control. El término "vector" incluye
tanto medios virales como no virales, para introducir el ácido
nucleico en una célula in vitro, ex vivo o in vivo.
Los vectores virales incluyen retrovirus, virus
adeno-asociados, poxvirus, baculovirus, vacunas,
herpes simplex, y vectores de virus de Epstein-Barr
y adenovirus, como se expone con mayor detalle más adelante. Los
vectores no virales incluyen plásmidos, liposomas, lípidos cargados
eléctricamente (citofectinas), complejos de
DNA-proteína, y biopolímeros. Además de un ácido
nucleico, un vector puede contener también una o más regiones
reguladoras y/o marcadores seleccionables útiles para seleccionar,
medir y monitorizar los resultados de las transferencias de ácidos
nucleicos (transferencia a qué tejidos, duración de la expresión,
etc.).
Un "vector de clonación" es un replicón, tal
como un plásmido, un fago o un cósmido, al que puede unirse otro
segmento de DNA originando de este modo la replicación del segmento
unido. Los vectores de clonación pueden ser capaces de replicación
en un tipo de células y de expresión en otro ("vector
lanzadera").
Una "casete" alude a un segmento de DNA que
puede ser insertado en un vector en sitios de restricción
específicos. El segmento de DNA codifica un polipéptido de interés,
y la casete y los sitios de restricción están destinados a asegurar
la inserción de la casete en el marco de lectura apropiado para la
transcripción y la traducción.
Una célula ha sido "transfectada" por un DNA
exógeno o heterólogo cuando tal DNA ha sido introducido en el
interior de la célula. Una célula ha sido "transformada"
mediante un DNA exógeno o heterólogo cuando el DNA transfectado
efectúa un cambio fenotípico. El DNA de transformación puede estar
integrado (enlazado covalentemente) en el DNA cromosómico que
constituye el genoma de la célula.
Una "molécula de ácido nucleico" se refiere
a una forma polimérica de éster fosfato de ribonucleósidos
(adenosina, guanosina, uridina o citidina; "moléculas de RNA")
o desoxirribonucleósidos (desoxiadenosina, desoxiguanosina,
desoxitimidina o desoxicitidina; "moléculas de DNA"), o
cualquiera de sus análogos de ésteres fosfóricos, tales como
fosforotioatos y tioésteres, en forma de hélice de una sola cadena o
de doble cadena. Son posibles hélices de doble cadena de
DNA-DNA, DNA-RNA y
RNA-RNA. La expresión "molécula de ácido
nucleico" y en particular "molécula de DNA o RNA", se
refiere solamente a la estructura primaria y secundaria de la
molécula y no limita ésta a cualquier forma terciaria particular.
Así, esta expresión incluye DNA de doble cadena encontrado, entre
otros lugares, en moléculas de DNA lineales o circulares (por
ejemplo, fragmentos de restricción), plásmidos y cromosomas. En la
discusión de la estructura de moléculas particulares de DNA de doble
cadena pueden describirse aquí secuencias según la convención normal
de proporcionar solamente la secuencia en la dirección de 5' a 3'
junto con la cadena de DNA sin transcribir (es decir, la cadena que
posee una secuencia homóloga al mRNA). Una "molécula de DNA
recombinante" es una molécula de DNA que ha sido sometida a una
manipulación biológica molecular.
Una molécula de ácido nucleico es "capaz de
hibridación" respecto a otra molécula de ácido nucleico tal como
un cDNA, un DNA genómico o RNA, cuando una forma de una sola cadena
de la molécula de ácido nucleico puede reasociarse con la otra
molécula de ácido nucleico en las condiciones apropiadas de
temperatura y fuerza iónica de la solución (véase Sambrock et
al., supra). Las condiciones de temperatura y de fuerza
iónica determinan la "restricción" de la hibridación. Para una
selección preliminar de ácidos nucleicos homólogos, pueden usarse
condiciones de hibridación de baja restricción correspondientes a
una T_{m} de 55º, por ejemplo, 5x SSC, SDS al 0,1%, leche al 0,25%
y sin formamida; o formamida al 30%, 5x SSC, SDS al 0,5%). Las
condiciones de hibridación de restricción moderada corresponden a
una T_{m} más alta, por ejemplo, formamida al 40%, con 5x ó 6x
SCC. Las condiciones de hibridación de alta restricción
corresponden a la máxima T_{m}, por ejemplo, formamida al 50%, 5x
ó 6x SCC. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos
contengan secuencias complementarias, aun cuando, dependiendo de la
restricción de la hibridación, son posibles desigualdades entre las
bases. Las condiciones de restricción apropiadas para la hibridación
de ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y
del grado de complementación, variables bien conocidas en la
técnica. Cuanto mayor es el grado de semejanza u homología entre dos
secuencias de nucleótidos, mayor será el valor de T_{m} para los
híbridos de ácido nucleico que tengan esas secuencias. La
estabilidad relativa (que corresponde a mayor T_{m}) de
hibridaciones de ácidos nucleicos disminuye en orden siguiente:
RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Para híbridos de una longitud superior a
100 nucleótidos, han sido deducidas ecuaciones para calcular T_{m}
(véase Sambrook et al., referencia anterior,
9.50-0.51). Para hibridación con ácidos nucleicos
más cortos es decir, oligonucleótidos, la posición de las
desigualdades se hace más importante, y la longitud de los
oligonucleótidos determina su especificidad (véase Sambrook, Fritsch
and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda
edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, Nueva York, 11.7-11.8). Preferiblemente, la
longitud mínima para un ácido nucleico capaz de hibridación es, por
lo menos, de aproximadamente 10 nucleótidos, preferiblemente al
menos de aproximadamente 15 nucleótidos, y más preferiblemente la
longitud es al menos de aproximadamente 20 nucleótidos.
En una realización específica, la expresión
"condiciones normales de hibridación" se refiere a una T_{m}
de 55ºC y utiliza condiciones tales como las anteriormente
expuestas. En una realización preferida, la T_{m} es 60ºC; en una
realización más preferida, la T_{m} es 65ºC.
Una "secuencia codificante" de DNA es una
secuencia de DNA de doble cadena que está transcrita y traducida en
un polipéptido en una célula in vitro o in vivo cuando
se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los
límites de la secuencia codificante vienen determinados por un codón
de iniciación en el termino 5' (amino) y un codón de terminación de
la traducción en el término 3' (carboxilo). Una secuencia
codificante puede incluir, aun cuando no se limita a ellas,
secuencias procarióticas, cDNA procedente de mRNA eucariótico,
secuencias de DNA genómico procedentes de DNA eucariótico (por
ejemplo, de mamífero), e incluso secuencias de DNA sintético. Si la
secuencia codificante está destinada para expresión en una célula
eucariótica, una señal de poliadenilación y la secuencia de
terminación de la transcripción están situadas, habitualmente, en 3'
con respecto a la secuencia
codificante.
codificante.
Las secuencias del control de la transcripción y
la traducción son secuencias reguladoras de DNA, tales como
promotores, intensificadores, terminadores, y semejantes, que
proporcionan la expresión de una secuencia codificante en una célula
huésped. En las células eucarióticas, las señales de poliadenilación
son secuencias de control.
Una "secuencia de promotor" es una región
reguladora de DNA capaz de fijar RNA polimerasa en una célula e
iniciar la transcripción de una secuencia codificante de la línea de
salida (dirección 3'). Para la finalidad de definir la presente
invención, la secuencia de promotor está unida en su extremo 3' por
el sitio de iniciación de la transcripción y se extiende aguas
arriba (dirección 5') incluyendo el número mínimo de bases o
elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles
detectables por encima del ruido de fondo. Dentro de la secuencia de
promotor puede encontrarse un sitio de iniciación de la
transcripción (definido convenientemente, por ejemplo, por
elaboración de mapas con nucleasa S1), así como también dominios de
unión de proteína (secuencias de consenso) responsables de la unión
de RNA polimerasa.
Una secuencia codificante está "bajo el
control" de secuencias de control de la transcripción y la
traducción en una célula, cuando la RNA polimeerasa transcribe la
secuencia codificante a mRNA, que después es cortada y empalmada
trans-RNA (si la secuencia codificante contiene
intrones) y traducida en la proteína codificada por la secuencia
codificante.
Tal como se usa en esta memoria, el término
"homólogo" en todas sus formas gramaticales y variaciones
ortográficas, se refiere a la relación existente entre proteínas que
poseen un erigen evolutivo común'' incluyendo proteínas procedentes
de superfamilias (por ejemplo, la superfamilia de las
inmunoglobulinas) y proteínas homólogas procedentes de especies
diferentes (por ejemplo, la cadena ligera de la miosina, etc.)
(Reeck et al., 1987, Cell 50:667). Tales proteínas (y sus
genes codificantes) poseen homología de secuencias, como refleja el
elevado grado de semejanza de secuencias.
Por consiguiente, la expresión "semejanza de
secuencias" en todas sus formas gramaticales, se refiere al
grado de identidad o de correspondencia existente entre secuencias
de ácidos nucleicos o secuencias de aminoácidos de proteínas que
pueden compartir o no un origen evolutivo común (véase Reeck et
al, supra). Sin embargo, en el uso común y en la
solicitud de patente presente, el término "homólogo" cuando
está modificado con un adverbio tal como "altamente" puede
referirse a semejanza de secuencias y no a un origen evolutivo
común.
En una realización específica, dos secuencias de
DNA son "sustancialmente homólogas" o "sustancialmente
similares" cuando por lo menos el 50%, aproximadamente, (de
preferencia por lo menos aproximadamente el 75% y lo más preferible,
por lo menos aproximadamente el 90 ó el 95%) de los nucleótidos se
igualan a lo largo de la longitud definida de las secuencias de DNA.
Las secuencias que son sustancialmente homólogas pueden ser
identificadas comparando las secuencias usando soporte lógico
(software) estándar obtenible en bancos de datos de secuencias, o en
un experimento de hibridación southern bajo, por ejemplo,
condiciones restrictivas según se defina para el sistema particular.
La definición de condiciones de hibridación apropiadas se encuentra
dentro de la capacidad de la técnica. Véase, por ejemplo, Maniatis
T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual",
Cold Spring Harbor, Nueva York, 1982 (2ª edición, 1989).
Una "secuencia señal" puede estar incluida
en el comienzo de la secuencia codificante de una proteína que ha de
expresarse sobre la superficie de una célula. Esta secuencia
codifica un péptido señal, N-terminal respecto al
polipéptido maduro, que dirige la célula huésped para translocar el
polipéptido. La expresión "secuencia señal de translocación" se
usa en esta memoria refiriéndose a esta clase de secuencia señal.
Las secuencias señal de translocación pueden encontrarse asociadas
con una diversidad de proteínas nativas de eucariotas y procariotas,
y son frecuentemente funcionales en ambos tipos de organismos.
"Región reguladora" significa una secuencia
de ácidos nucleicos que regula la expresión de una segunda secuencia
de ácidos nucleicos. La región reguladora puede incluir secuencias
que son responsable, de modo natural, de expresar un ácido nucleico
particular (una región homóloga) o puede incluir secuencias de un
origen diferente que son responsables de expresar proteínas
diferentes o incluso proteínas sintéticas (una región heteróloga).
En particular las secuencias pueden ser secuencias de genes
eucarióticos o virales o secuencias derivadas que estimulan o
reprimen la transcripción de un gen de un modo específico o
inespecífico y de un modo inducible o no inducible. Las regiones
reguladoras incluyen orígenes de replicación, sitios de corte y
empalme de RNA, promotores, intensificadores, secuencias de
terminación de la transcripción, secuencias señal que dirigen el
polipéptido a los caminos secretores de la célula diana, y
promotores.
Una región reguladora procedente de una "fuente
heteróloga" es una región reguladora que no está asociada de modo
natural con el ácido nucleico expresado. Están incluidas entre las
regiones reguladoras heterólogas regiones reguladoras procedentes de
especies diferentes, regiones reguladoras procedentes de un gen
diferente, secuencias reguladoras híbridas y secuencias reguladoras
que no se presentan en la naturaleza pero que han sido diseñadas por
un experto en la técnica.
DNA "heterólogo" alude a DNA no situado de
modo natural en la célula o en un sitio cromosómico de la célula.
Preferiblemente, el DNA heterólogo incluye un gen extraño a la
célula.
Un "polipéptido" es un compuesto polímerico
que comprende restos de aminoácidos enlazados covalentemente. Los
aminoácidos tienen la estructura general siguiente:
R-
\melm{\delm{\para}{NH _{2} }}{C}{\uelm{\para}{H}}-COOH
Los aminoácidos se clasifican en siete grupos
sobre la base de la cadena lateral R: (1) cadenas laterales
alifáticas, (2) cadenas laterales que contienen un grupo hidroxilo
(OH), (3) cadenas laterales que contienen átomos de azufre, (4)
cadenas laterales que contienen un grupo ácido o amida, (5) cadenas
laterales que contienen un grupo básico, (6) cadenas laterales que
contienen un anillo aromático, y (7) prolina, un iminoácido en el
que la cadena lateral está fusionada al grupo amino. Un polipéptido
de la invención comprende, preferiblemente, por lo menos 14
aminoácidos, aproximadamente.
Una "proteína" es un polipéptido que
desempeña un papel estructural o funcional en una célula viva.
Las expresiones "hormona paratiroidea" y
"PTH" significan hormona paratiroidea humana (hPTH) y proteína
relacionada con la hormona paratiroidea humana (hPTHrP).
Una "variante" de un polipéptido o proteína
de PTH o hPTHrP es un análogo, fragmento, derivado o mutante que ha
sido derivado de un polipéptido o una proteína y que retiene al
menos una propiedad biológica del polipéptido o la proteína. Pueden
existir en la naturaleza variantes diferentes del polipéptido o de
la proteína. Estas variantes pueden ser variaciones alélicas
caracterizadas por diferencias en las secuencias de nucleótidos del
gen estructural que codifica la proteína, o pueden implicar corte y
empalme o modificación posterior a la traducción, diferenciales. Los
expertos en la técnica puede producir variantes que posean una sola
o múltiples sustituciones, supresiones, adiciones o reemplazos de
aminoácidos. Estas variantes pueden incluir, entre otras: (a)
variantes en las que uno o más restos de aminoácidos han sido
sustituidos con aminoácidos conservativos o no conservativos, (b)
variantes en las que uno o más aminoácidos han sido añadidos al
polipéptido o la proteína, (c) variantes en las que uno o más de los
aminoácidos incluye un grupo sustituyente, y (d) variantes en las
que el polipéptido o la proteína está fusionado con otro polipéptido
tal como albúmina sérica. Las técnicas para la obtención de estas
variantes, incluyendo técnicas genéticas (supresiones, deleciones,
mutaciones, etc.), químicas y enzimáticas, son conocidas por las
personas que poseen una habilidad ordinaria en la técnica.
Si tales variaciones alélicas, análogos,
fragmentos, derivados, mutantes y modificaciones, que incluyen
formas alternativas de corte y empalme de mRNA y formas alternativas
de modificaciones posteriores a la traducción, dan como resultado
derivados del polipéptido que retienen algunas de las propiedades
biológicas del polipéptido, están destinadas a quedar incluidas
dentro del alcance de esta invención.
Una "proteína heteróloga" se refiere a una
proteína no producida en la célula de modo natural..
Dos secuencias de aminoácidos son
"sustancialmente homólogas" o "sustancialmente similares"
cuando más del 40%, aproximadamente, de los aminoácidos son
idénticos, o más del 60% son similares (funcionalmente idénticos).
Preferiblemente, las secuencias similares u homólogas son
identificadas por alineación usando, por ejemplo el programa de
apilonar GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG
Package, Versión 7, Maduson, Wisconsin).
La expresión "correspondiente a" se emplea
en esta memoria para referirse a secuencias similares u homólogas,
tanto si la posición exacta es idéntico como si es diferente de la
molécula respecto a la que es medida la semejanza u homología. Una
alineación de secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos puede
incluir espacios. Así pues, la expresión "correspondiente a"
alude a la semejanza de secuencias y no a la numeración de los
restos de aminoácidos o de bases de nucleótidos.
La expresión "compuesto de hormona
paratiroidea" significa hormona paratiroidea según se ha definido
en esta memoria o fragmentos, variantes o análogos de la misma. El
término "análogo" significa cualquier compuesto capaz de
fijarse a un receptor paratiroideo. Los compuestos de hormona
paratiroidea pueden ser derivados de la hormona paratiroidea humana
parental o proteína relacionada con la hormona paratiroidea humana.
Tales derivados son denotados usando números entre paréntesis que se
refieren al número de restos de aminoácidos del compuesto peptídico,
comenzando por el extremo N-terminal. Por
ejemplo, hPTH(1-34) es un compuesto de
hormona paratiroidea que comprende los primeros 34 aminoácidos de la
hormona paratiroidea humana.
Las expresiones "receptor paratiroideo" y
"receptor de PTH" significan el receptor de la hormona
paratiroidea humana que se presenta de modo natural o "tipo
salvaje" o cognado, u homólogos modificados operacionalmente u
obtenidos por ingeniería genética, del receptor cognado
correspondiente que se presenta de modo natural. El término
"operacional" cuando se emplea en relación con homólogos de
receptores paratiroideos modificados u obtenidos por ingeniería
genética, significa que el receptor modificado u obtenido por
ingeniería genética actúa para su finalidad pretendida.
"Funcionalidad" de un compuesto de hormona
paratiroidea hace referencia a su aptitud para fijar el receptor de
hormona paratiroidea y estimular o inhibir la producción de cAMP
intracelular. Preferiblemente, la funcionalidad es la de
estimular la producción de cAMP.
La expresión "gen informador" ("reporter
gen") significa una secuencia codificante unida a elementos
heterólogos del promotor o el intensificador, y cuyo producto es
analizado fácil y cuantificablemente cuando la construcción es
introducida en células. Según la presente invención, el promotor
heterólogo comprende múltiples elementos que responden a cAMP, que
por unión del cAMP, conduce la expresión del gen. La introducción
de genes informadores en células figura descrita en la patente de
EE.UU. No. 5.298.429.
Los genes informadores representativos incluyen
genes bacterianos que codifican
\beta-galactosidasa (lacZ),
cloranfenicol-acetiltransferasa (cat),
\beta-glucuronidasa (GUS) y semejantes, y
luciferasa. El gen informador preferido es la luciferasa. El uso de
luciferasa como gen informador está descrito en las publicaciones
siguientes:
1. Babichuk, et al., 1996,
Journal of Biological Chemistry, 1996, 271
(28),16485-16493.
2. Castanon et al., Biochemical
and Biophysical Research Communications, 1994, 198 (2),
626-631.
3. Gao, et al., Journal of
Immunology, 1993, 150(10),
4376-4385;
4. Germain, et al., Biochemical
Journal, 1996, 316, 107-113;
5. Ghozi, et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1996, 93, 1935-1940;
6. Himmler, et al., Journal of
Receptor Research, 1993, 13 (1-4),
79-94;
7. Midgeon, et al., Journal of
Biological Chemistry, 1994, 269 (46),
29146-29152;
8. Pei, et al., Molecular
Endocrinology, 1991, 5(4),
521-534;
9. Stachowiak, et al., Brain
Research. Molecular Brain Research, 1994, 22
(1-4), 309-319; y
10. Tilly et al.,
Endocrinology, 1992, 131 (2),
799-806.
El ensayo biológico de la presente invención se
realiza introduciendo un gen informador en células que expresan un
receptor de PTH. El gen informador contiene en su región del
promotor múltiples elementos que responden al cAMP que por fijación
de cAMP conduce la expresión del gen. Por tanto, la extensión de la
expresión del gen informador puede variar en función del nivel de
cAMP en la célula. Por fijación de un compuesto de hormona
paratiroidea, el receptor de PTH estimula la producción de cAMP
intracelular, cuya extensión depende de la magnitud de la activación
del receptor por el compuesto de la hormona paratiroidea. El
aumento de cAMP obtenido por mediación del receptor está asociado,
por tanto, al aumento de la expresión del gen informador. Midiendo
la expresión del gen informador, puede medirse con facilidad la
activación del receptor de PHT por compuestos de la hormona
paratiroidea.
Los expertos en la técnica podrán apreciar
fácilmente que la presente invención está bien adaptada para llevar
a cabo los objetos de la invención y obtener los fines y ventajas
citados, así como aquellos inherentes a ella. Los ejemplos que se
describen seguidamente se presentan como representativos de las
realizaciones preferidas o se pretende que sirvan de ejemplo y no
están destinados a ser limitaciones del alcance de la presente
invención.
Los métodos usados tradicionalmente en biología
molecular, tales como extracciones preparativas de DNA plasmídico,
centrifugación de DNA plasmídico en un gradiente de cloruro de
cesio, electroforesis en geles de agarosa o acrilamida,
purificación de fragmentos de DNA mediante electroelución,
extracción de proteínas con fenol o fenol/cloroformo. precipitación
de DNA en un medio salino con etanol o isopropanol, transformación
en Escherichia coli, y semejantes, son bien conocidos por los
expertos en la técnica y están descritos ampliamente en la
bibliografía científica [Maniatis T. et al., "Molecular
Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; (2ª Edición, 1989); Asubel F.M.
et al (compiladores), "Current Protocols in Molecular
Biology", John Wiley and Sons, Nueva York, 1987].
Los vehículos de clonación convencionales
incluyen los plásmidos de tipo pBR322 y pUC, y los fagos de la serie
M13. Estos vehículos pueden ser obtenidos en el comercio (Bethesda
Research Laboratories).
Para la ligación pueden separarse fragmentos de
DNA conforme a su tamaño, mediante electroforesis en geles de
agarosa o de acrilamida, extraerse con fenol o con una mezcla de
fenol/cloroformo, precipitarse con etanol e incubarse luego en
presencia de DNA ligasa de fago T4 (Biolabs) según las
recomendaciones del proveedor.
El relleno de los extremos 5' que sobresalen
puede llevarse a cabo con el fragmento de Klenow de DNA polimerasa
I de E.coli (Biolabs) según las especificaciones del
proveedor. La destrucción de extremos 3' que sobresalen se lleva a
cabo en presencia de DNA polimerasa de fago T4 (Biolabs) utilizada
según las recomendaciones del fabricante. La destrucción de extremos
5' que sobresalen se lleva a cabo mediante un tratamiento controlado
con nucleasa.S1.
La mutagénesis dirigida in vitro mediante
oligodesoxinucleótidos sintéticos puede llevarse a cabo según el
método desarrollado por Taylor et al., [Nucleic Acids Res.
13 (1985) 8749-8764] usando el kit
distribuido por Amersham.
La amplificación enzimática de fragmentos de DNA
por la técnica de PCR [Polymerase-catalized
Chain Reactión, Saiki R.K. et al., Science
230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. y Faloona
F.A., Meth. Enzym, 155 (1987) 335-350, puede
llevarse a cabo usando un "ciclador térmico de DNA" (Perkin
Elmer), según las especificaciones del fabricante.
La verificación de secuencias de nucleótidos
puede llevarse a cabo mediante el método desarrollado por Sanger
et al., [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977)
5463-5467] usando el kit distribuido por
Amersham.
Los DNAs plasmídicos pueden purificarse mediante
el Qiagen Plasmid Purification System, según las instrucciones del
fabricante.
La línea celular se obtiene según ha sido
descrito Por Pines et al., Endocrinology, 1994,
135(4), 1713-1716.
El gen informador de la luciferasa de la
luciérnaga que es portador de elementos que responden al cAMP es
amplificado mediante la técnica de PCR partiendo del vector
pDMC16LUC usando el método de Spengler et al., Nature,
1993, 365:170-175.
El producto de la PCR que contiene el promotor
MMTV, dieciséis elementos que responden al cAMP y el gen de la
luciferasa, se inserta en el vector resistente a la zeocina (pUTSVI
de InVitrogen). El vector final, denominado pMCL3zeo se introduce
después en células HEK-293 que expresan el receptor
de PTH usando el método de la lipofectamina (reactivos y método
obtenidos de Gibco/BRL). Se seleccionan las células que incorporan
el gen informador de la luciferasa incluyendo zeocina en el medio de
cultivo. Mediante dilución limitada se aislan y expanden diferentes
clones de las células. Estos clones se ensayan para determinar su
respuesta a la PTH en términos de expresión de luciferasa. Se usan
para el desarrollo del ensayo los clones que ponían de manifiesto
una inducción de luciferasa 5-6 veces mayor.
Células HEK-293 que expresan el
receptor de hPTH, que son portadoras del gen informador de la
luciferasa, se cultivan a una confluencia de 80-90%.
Para verificar la aptitud de un agente para interaccionar con el
receptor de PTH, el compuesto en ensayo se añade a los medios de
cultivo en la dilución apropiada. Se usa
hPTH(1-34) como el testigo positivo. La
inducción de la expresión de la luciferasa se lleva a cabo a 37ºC.
Después de la inducción, se separa el medio de cultivo y las
células se someten a lisis añadiendo la solución tampón de lisis
(kit de ensayo de la luciferasa, de Promega Corp.). Los lisados son
distribuidos en partes alícuotas en una placa negra de 96 pocillos.
La actividad de luciferasa en los lisados se mide por la adición del
sustrato de luciferina (kit de ensayo de Promega) para llevar a
efecto la producción de luz. La producción de luz se mide en un
lector de placas microbeta de Wallac Trilux.
La actividad de luciferasa de células
HEK-293 que expresan el receptor de hPTH, que son
portadoras del gen informador de la luciferasa, después de inducción
durante 8 horas con hPTH(1-34),
hPTH(1-27) y hPTH (1-28) se
muestra en la Figura 1.
La actividad de luciferasa de células
HEK-293 que expresan el receptor de hPTH, que son
portadoras del gen informador de la luciferasa después de inducción
durante la noche (aproximadamente 16 horas) con
hPTH(1-34),
hPTH(1-31),
h(PTH(1-27) y
hPTH(3-34), se muestra en la Figura 2.
La presente invención no ha de estar limitada en
su alcance por las realizaciones específicas indicadas en esta
memoria descriptiva. Sin duda, diversas modificaciones de la
invención además de las aquí descritas, se harán evidentes para los
expertos en la técnica, partiendo de la descripción anterior y las
figuras que se acompañan. Se entiende que tales modificaciones caen
dentro del alcance de las reivindicaciones que se incluyen.
Ha de entenderse, además, que todos los tamaños
de las bases o de los aminoácidos, y todos los valores de los pesos
moleculares o de las masas moleculares, dados para los ácidos
nucleicos o los polipéptidos, son aproximados, y se proporcionan
para su descripción.
Claims (14)
1. Un método para determinar la funcionalidad de
un compuesto de hormona paratiroidea, cuyo método comprende:
(a) añadir el compuesto a un cultivo de células
que expresan el receptor de la hormona paratiroidea, que son
portadoras de un gen informador, bajo el control de la transcripción
de múltiples elementos que responden a cAMP y que comprenden un
ácido nucleico heterólogo que codifica el receptor de la hormona
paratiroidea; y
(b) medir el cambio en la expresión del gen
informador.
2. El método según la reivindicación 1, en el que
las células son células de mamífero.
3. El método según la reivindicación 1, en el que
el número de elementos que responden al cAMP es mayor que 10.
4. El método según la reivindicación 1, en el
que el número de elementos que responden al cAMP es 16.
5. El método según la reivindicación 1, en el que
el gen informador codifica una proteína seleccionada entre el grupo
que consiste en \beta-galactosidasa,
cloranfenicol-acetiltransferasa,
\beta-glucuronidasa y luciferasa.
6. El método según la reivindicación 5, en el que
el gen informador codifica luciferasa.
7. El método según la reivindicación 1, en el que
el receptor de la hormona paratiroidea es el receptor de la hormona
paratiroidea humana.
8. Una célula que expresa sobre su superficie un
receptor de la hormona paratiroidea, y que comprende un gen
informador bajo el control de la transcripción de múltiples
elementos que responden al cAMP y ácido nucleico heterólogo que
codifica el receptor de la hormona paratiroidea.
9. La célula según la reivindicación 8, en la que
la célula es una célula de mamífero.
10. La célula según la reivindicación 8, en la
que el número de elementos que responden al cAMP es mayor que
10.
11. La célula según la reivindicación 10, en la
que el número de elementos que responden al cAMP es 16.
12. La célula según la reivindicación 8, en la
que el gen informador codifica una proteína seleccionada entre el
grupo que consiste en \beta-galactosidasa,
cloranfenicol-acetiltransferasa,
\beta-glucuronidasa, y luciferasa.
13. La célula según la reivindicación 12, en la
que el gen informador codifica luciferasa.
14. La célula según la reivindicación 9, en la
que el receptor de la hormona paratiroidea es el receptor de la
hormona paratiroidea humana.
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