NO317547B1

NO317547B1 - Fiskebukspyttkjertel-sykdomsvirus, fremgangsmate for diagnostisering av sykdom og for isolering av virus, samt vaksine og diagnostisk reagens.

Info

Publication number: NO317547B1
Application number: NO19954135A
Authority: NO
Inventors: Marian F Mcloughlin; Robert Thomas Nelson
Original assignee: Intervet Int Bv
Priority date: 1994-10-18
Filing date: 1995-10-17
Publication date: 2004-11-15
Also published as: JPH08228770A; JP3676449B2; NO954135L; US5939073A; EP0712926A3; PT712926E; NO2011024I1; NO2011024I2; US5914260A; DE69531891D1; ATE251667T1; CA2160764A1; CA2160764C; NO954135D0; DK0712926T3; EP0712926A2; EP0712926B1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fiskebukspyttkjertel-sykdomsvirus, fremgangs-

måte for diagnostisering av sykdom og for isolering av virus, samt vaksine og diagnostisk reagens.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således en ny virus som er årsaken til den

såkalte fiskepankreassykdommen. Nevnte virus kan brukes for å fremstille en vaksine og/eller en fremgangsmåte for å diagnostisere sykdommen.

Pankreassykdom (PD) er en meget alvorlig sykdom som påvirker atlantisk laks

(Salmon salar L). Sykdommen forårsaker sår i pankreas (bukspyttkjertelen), noe som forårsaker tap av det pankreatiske eksokrine vevet, foruten fibrose, hjerteproblemer og skjelettmuskelmyopatier. Man antar også at andre laksefisker såsom regnbueørret, vill atlantisk laks, også kan bli infisert av PD.

Utbrudd av PD er først beskrevet i 1984 av Munro et al, i Helgoland Meeres Untersuchungen 37:571-586 (1984), men PD var allerede kjent så tidlig som 1976. PD er

da også blitt rapportert fra alle større land hvor det drives oppdrett av laks, og heri inngår Norge, Irland, Frankrike, Spania og vestlige USA (se Kent et al., Bull. Eur. Ass. Fish Path. 7:29-31 (1987); Poppe et al., i Bull. Eur. Ass. Fish Path. 9(4):83-85 (1989); og Raynard et al i Proceedings of a European Commission Workshop, Scottish Office Aquaculture Report No. l,p. 2-4(1992)).

PD er kjent for å påvirke fisken i dens første år i saltvann og sprer seg raskt blant

fisk som holdes i innhegninger i saltvann. Ferguson et al (i Journal of Fish Diseases 9:95-

98 (1986)) angir at de angrepne fiskene blir tynne, anoreksiske og lethargiske med en tendens til å samle seg i hjørner og er ikke i stand til å opprettholde en horisontal posisjon.

I tillegg til de primære pankrease sårene, anga Ferguson et al supra fisken som var påvirket

av PD viste flere grader av degenererende kardiomyopati. Disse observasjoner ble bekref-

tet i senere undersøkelser av Murphy et al (se Journal of Fish Disease 15:401-408 (1992))

som fant at hjerte- og skjelettmyopati var forsterket i fisk som var infisert med PD.

I perioden 1988-1992 resulterte PD i Irland et tap på mellom 15 og 20% av alle

observerte dødsfall hos laksesmolt i deres første år i saltvann. Det beregnede tapet bare i den irske lakseindustrien med hensyn til tap av produksjon, anslås i dag til å være omkring 25 millioner pund pr. år. De hittil beste produksjonstallene for Norge, Skottland og Irland er som følger:

McVicar et al postulerte at PD skyldes en infeksjon. Dette forslaget var under-

støttet på bakgrunn av epidemiologiske undersøkelser og overføringsekpserimenter av

forskjellige vitenskapsmenn som antydet at sykdommen hadde en infeksiøs etiologi, (se McVicar i Aquaculture 67:71-78 (1987); McVicar i Bull. Eur. Ass. Fish Path. 10:84-87

(1990); Raynard et al, Dis. Aquat. Org. 15:123-128 (1993)); og Murphy et al (1992) supra). Nylig har Houghton (1994) 18: 109-118 rapportert at fisk blir resistent overfor re-infeksjon etter inokulering med PD, noe som understøtter teorien om at PD skyldes en infiserende organisme. Problemet er imidlertid at til dags dato har man ikke kunnet isolere noen infiserende organisme til tross for tallrike forsøk (se McVicar (1987) supra; Munro supra; og Murphy supra).

Mange mulige årsaker kan føre til skade av fiskepankreas. De viktigste er virale infeksjoner forårsaket av FPDV eller av infeksiøs pankreasnekrose-virus (IPNV). Videre er også ikke-infeksiøse årsaker som fysiologiske, toksiske og diettmessige årsaker blitt bekreftet å forårsake pankreas sykdom (Munro supra).

De viktigste vanskelighetene før foreliggende oppfinnelse når det gjelder å skjelne pankreas sykdom (dvs.: pankreas sykdom forårsaket av FPDV) fra beslektede påvirk-ninger, ble forårsaket av mangel på tilgjengelighet av spesifikt viralt materiale (protein-holdig eller nukleinsyrer) av FPDV og spesifikke antistoffer.

Spesifikk bestemmelse av pankreas sykdom i forhold til de andre årsakene av pankreas sykdom, var før bare mulig ved kliniske observasjoner, dyreadferd, mortalitets-mønstre, større patologiske lesjoner osv. og histopatologi (lys- og elektronmikroskopi). Patogno-moniske trekke (trekke som spesifikt karakteriserer en bestemt sykdom) som kan anvendes for å diagnostisere pankreas sykdom i forhold til IPNV eller andre sykdommer er: generalisert nekrose av eksokrin pankreas (Munro supra)

spesifikke lesjoner i hjertemuskler (Ferguson, H., et al., 1986, J. of Fish diseases,

vol. 20, s. 95-98) og

lesjoner i skjelettmuskler (Ferguson, H., et al., 1986, Veterinary record vol. 119. s.

297-299).

I større detalj kan de forskjellige trekkene ved pankreas sykdom i forhold til symptomer på IPNV oppsummeres som følger:

Med hensyn til kliniske tegn og patologi:

Med hensyn til histopatologi:

Ved hjelp av foreliggende oppfinnelse kan diagnostikk av FPDV fra andre årsaker av pankreas sykdom i fisk, og spesielt fra IPNV, nå bli utvetydig bekreftet ved anvendelse av vanlige teknikker som alle er velkjente innenfor fagområdet, f.eks.:

Serologi: Elisa, immunofluorescens, virusnøytralisering osv.

Biokjemi: Western-blot-teknikker

Fysisk-kjemisk karakterisering: tetthet, stabilitet (pH, temperatur, kloroform-resistens)

Molekulær biologi: hybridiseringsteknikker, restriksjons-spaltningskartlegging,

sekvensering osv.

Eksempler på flere av disse teknikker er beskrevet i foreliggende søknad: Eksemplene 2 og 3 beskriver forskjeller i sensitiviteten til henholdsvis kloroform

og pH verdier under 3 mellom IPNV og FPDV.

Eksempel 9 beskriver den manglende evne som kanin anti-IPNV serum har til å

nøytralisere FPDV.

Dette illustrerer følgelig de betydelige forskjeller i karaktertrekk mellom birnavirus IPNV og togavirus FPDV.

Foreliggende oppfinnelse rapporterer isoleringen av selve årsaken til PD for første gang. Man har nå funnet at årsaken er en rund virus 65,5 ± 4,3 nm i størrelse, og som i det etterfølgende er betegnet FPDV-virus. Uten projeksjonene har den en diameter på 46,8 2,5 nm, er kloroform og pH-følsom, resistent overfor hemming av BUDR, og ved en undersøkelse ved hjelp av elektronmikroskopet har man morfologisk kunnet se at nevnte virus har likheter til en art innenfor Togavirusgruppen. Togavirusfamilien består av 3 slekter, Alphavirus (27 arter), Rubivirus (1 art) og Arterivirus (1 art). Når den her presenterte virus inokuleres i ferskvannslaks og laks fra marint miljø, så forårsaker nevnte virus pankreassykdommer som er forbundet med morfologiske forandringer i pankreas-, hjerte- og skjelettmuskulaturen.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således som ett aspekt fiskepankreas-sykdomsvirus (FPDV).

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig virus som når injisert intraperitonealt i en titreringskonsentrasjon på IO<3,5> TCID50 inn i atlantisk laks postsmolt holdt i sjøvann ved 14°C forårsaker at fisken utvikler symptomer på pankreatisk sykdom, kjennetegnet ved at (a) nevnte virus er virusstammen som deponert ved ECACC under deponeringsnummer V94090731 eller nært beslektede stammer som har lignende genotypiske og/eller fenotypiske karaktertrekk som nevnte deponerte virusstamme, (b) nevnte virus reagerer serologisk med kovalescent anti-FPDV antiserum eller antiserum dannet mot deponert virusstamme V94090731.

FPDV er en toga-lignende virus. Den består av runde innelukkede partikler med en partikkelstørrelse på 64-66 nm slik det kan måles ved elektronmikroskopi og har en tetthet på 1,2 g/ml i cesiumklorid. Inokulering med 103,5 TCID50 intraperitonealt i atlantisk laks etter smoltperioden som holdes i sjøvann ved 14°C, gjør at fisken utvikler symptomer på pankreatisk sykdom, dvs. den blir uten appetitt og utvikler pankreatisk acinar cellenekrose, hjertenekrose og skjelettmyopati.

Med FPDV forstås en virus med ovennevnte egenskaper. Oppfinnelsen er imidlertid ikke begrenset til en spesiell virusrase av FPDV, dette til tross for at utførelser ifølge foreliggende oppfinnelse imidlertid er rettet inn mot spesifikke raser av FPDV som er isolert og nærstående raser. Med begrepet "nærstående raser" forstår man enhver rase som har tilsvarende genotypiske og/eller fenotypiske egenskaper til de isolerte raser. Mer spesielt innbefatter nevnte betegnelser svakt modifiserte former av nevnte virus som i alt vesentlig beholder de samme funksjonelle aktiviteter. Det har f.eks. vist seg at enkelte aminosyrer og nukleotidadderinger, utelatelser eller forandringer har meget liten effekt, hvis noen, på de funksjonelle aktivitetene til viruset.

Mer spesielt, betyr FPDV en fiskevirus som serologisk reagerer med sammen-løpende anti-FPDV-antiserum og antiserum som er gjort reaktivt mot den innleverte FPDV-prøven (ECACC nr. V94090731). Mer spesielt er en FPDV en fiskevirus som gir positiv reaksjon med begge disse to antisera i en indirekte fluorescensantistoffprøve (IFA).

Det er ønskelig at nevnte virus ifølge foreliggende oppfinnelse i alt vesentlig er fritt for andre typer virus eller mikrobielt materiale.

En prøve av FPDV er innlevert til den europeiske samling av dyrecellekulturer, Porton Down, Wilthsire, United Kingdom (ECACC) under innleveringsnr. V94090731 den 7. september 1994.

I et annet aspekt tilveiebringer således foreliggende oppfinnelse en vaksine mot PD.

Foreliggende oppfinnelse vedrører således vaksine for å bekjempe fiskepankreas-sykdom, kjennetegnet ved at nevnte vaksine omfatter et virus ifølge krav 1 eller 2.

Vaksinen kan således være en svekket eller inaktivert form av FPDV i seg selv. Inaktiverte former av FPDV kan fremstilles ved å oppvarme en prøve av FPDV, f.eks. ved Oppvarming over 50°C, ved behandling med kloroform, justering av pH eller på annen egnet måte. Svekkede former av FPDV kan fremstilles ved forlenget passasje av nevnte virus i en cellekultur, ofte av forskjellige arter, eller ved at man dyrker nevnte virus ved progressivt høyere temperaturer for derved å kunne velge populasjoner som er bedre tilpasset enn slik høyere temperatur. Utvikling av plakkrensingsmetoder for å kunne velge ut varianter ved hjelp av plakkstørrelse er blitt brukt i forbindelse med andre virus, og kan også være egnet her.

Vaksiner overfor andre togavirus er velkjente, og man kan således bruke den samme teknikk for fremstilling av en egnet vaksine i denne sammenheng. Nevnes kan Roerig et al i High Technology Route to Virus Vaccines, ed Driesman, Bronson & Kennedy 1985, side 142 og også til Leong et al i Annual Review of Fish Diseases (1993) sidene 225-240.

En egnet FPDV-vaksine eller ikke-FPDV-vaksine som bruker FPDV som en ekspresjonsvektor, kan fremstilles på en måte som er analog til det man bruker for fremstilling av Semiliki-skogvirus (SFV). Med SFV har produksjonen av en full-lengde cDNA-klon, fra hvilken infeksiøs RNA kunne transkriberes, og oppklaringen av SFV-molekylærbiologien, lettet separasjonen av cDNA-molekyler som koder for RNA-replikasjonsproteinene fra cDNA-molekyler som koder for capsidproteinene. Et sub-genomisk mRNA som koder for capsidproteiner kan isoleres fra infiserte celler. Denne separasjonen kan utnyttes for å produsere "ikke-replisernde" SFV-partikler som innbefatter det normale viruscapsidet som innelukker et RNA som koder bare RNA-replikasjonsproteinene. Disse partiklene kan produseres med samtransfekterende celler med 2 forskjellige RNA-molekyler som hver syntetiseres ved en in vitro transkripsjon fra distinkte cDNA-molekyler. Transkript 1 koder for de proteiner som er ansvarlige for RNA-replika-sjonen, mens transkript 2 koder for de proteiner som ugjør capsidet og kappen. Inne i de transfekterte cellene blir begge typer RNA oppformert og translatert. På grunn av pakkingssignalets plassering vil bare det RNA som koder for replikasjonsproteinene bli innkapslet. Inkorporeringen av fremmede gener i cDNA-molekylet som koder for RNA-replikasjons-evnen, har gjort det mulig å utnytte SFV som et meget effektivt ekspresjons-system. Celler som således er transfektert med et modifisert transkript 1 vil således uttrykke fremmede proteiner. Potensialet til SFV som en vektorvaksine oppnås når cellene blir samtransfektert med det modifisert transkript 1 og transkript 2. Resultatet i dette tilfellet er produksjonen av "ikke-formerende" SFV-partikler som vil infisere celler og effektivt produsere fremmede proteiner som er i stand til å frembringe en beskyttende immunreaksjon.

Vaksinen kan eventuelt tilføres unge fisk, f.eks. laks når den er i ferskvanns-tilstanden. Vaksinen kan f.eks. tilsettes direkte til det vann hvor fisken svømmer. Alternativt kan fisken (eller en prøve av stimen) inokuleres direkte. Når bare et mindre utvalg av fiskene inokuleres, så vil immuniteten kunne overføres til de andre fiskene pga. kontakt med vaksinert fisk.

I et annet aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en diagnostisk reagens for PD, hvor nevnte reagens omfatter diagnostisk reagens for fiskepankreassykdom, kjennetegnet ved at nevnte reagens omfatter et antistoff som er i stand til selektivt å binde seg til et virus ifølge krav 1 eller 2.

Eventuelt kan den diagnostiske reagensen også inneholde en markør, f.eks. en radioaktiv markør, en kromofor, fluorofor, tungmetall, enzymatisk markør, antistoffmarkør e.L Eventuelt kan den diagnostiske reagensen immobiliseres (f.eks. på en perle, stav, karoverflate eller membran) og den prøve som skal undersøkes kan så bringes i direkte kontakt med nevnte diagnostiske reagens. Ovennevnte antistoffer kan være monoklonale antistoffer.

I et annet aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for isolering av et virus. Denne fremgangsmåten innbefatter fremgangsmåte for isolering av et virus ifølge krav 1 eller 2, kjennetegnet ved at den omfatter:

(a) identifisering av fisk som lider av pankreassykdom,

(b) ko-dyrking av påvirkede vev med Chinook lakse-embroceller,

(c) føring av ko-dyrkede celler gjennom Chinook lakse-embroceller,

(d) isolering av viruspartiklene.

Man identifiserer fisk således som lider av PD, fortrinnsvis fisk i et akutt trinn av PD (slik dette er definert av Munro et al., supra). Påvirket vev (f.eks. pankreas eller leveren) blir dyrket sammen med Chinook lakseembro (CHSE-214) celler i et passende tidsrom, f.eks. opp til 35 dager, mer spesielt ca. 28 dager. De samkultiverte cellene blir så ført gjennom CHSE-celler.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for diagnostisering av PD, og hvor nevnte fremgangsmåte innbefatter følgende trinn: (a) kontakting av en testprøve med et diagnostisk reagens ifølge hvilket som helst av

kravene 5 til 7, for å produsere et reagenskompleks;

(b) et eventuelt vasketrinn; og

(c) bestemme nærværet, og eventuelt konsentrasjonen av nevnte reagenskompleks og dermed tilstedeværelse eller mengden av virus i testprøven.

Den diagnostiske prøven kan gjennomføres på enhver prøve som man mistenker å inneholde FPDV. F.eks. kan man undersøke vevsprøver (f.eks. nyrer, milt, hjerte, pankreas, lever, tarmkanal eller blod) i den fisken man skal utføre den diagnostiske prøven på. Vanligvis er det foretrukket å undersøke en blodprøve, noe som gir en ikke-fatal diagnose. Det er også mulig å utføre den diagnostiske prøven på en prøve av det vann hvor fisken har svømt.

De vedlagte figurer kan kort beskrives som følger:

Fig. 1 a: Uinfiserte CHSE-214 celler (forstørrelse x 750); Fig. 1 b: CHSE-214 celler, 8 dager etter inokulering med FPDV (forstørrelse x 750); Fig. 3: Transmisjonselektronmikrografer av glutaraldehydfikserte FPDV-infiserte CHSE-214 cellekulturvæske. Mesteparten av viruspartiklene har overlfate-projeksjoner, men det er liten indre strukturell detaljklarhet. Strek = 100 nm; Fig. 4: Signifikant pankreatisk acinart celletap, typisk for pankreassår som er indusert ved hjelp av FPDV 21 dager etter inokulering. Strek =50 um; Fig. 5: Multifokal kardiomyocytisk nekrose som opptrådte samtidig med de pankreatiske sår på 21. dag etter inokulering (-») Strek = 20 um; Fig. 6: Degenerering av aerobe (rød) skjelettmuskler som viser økende endomysialt bindevev, oppformering av sarkolemmale celler og hyalindegenerering av muskelfibrer på 21. dag etter inokuleringen. Strek = 50 um; og Fig. 7: Hyalindegenerering av anaerobe (hvite) skjelettmuskelfibrer som viser sentrali-sering av muskelfibernuklei og fagocytose av fiberinnholdet. Strek = 50 um

Fig. 8: Virusisolat x 100.000

Foreliggende oppfinnelse vil nå bli ytterligere beskrevet med henvisning til de følgende eksempler.

EKSEMPEL 1

Isolering og celledyrking av virus.

Cellekulturer

For virusisolering brukte man under hele undersøkelsen en chinook lakse-embryonisk cellelinje (CHSE-214, Nims et al, 1970). Andre cellelinjer man brukte innbefatter epithelioma papulosum cyprini (EPC), fathead ørekyte (FHM), bluegill Ieponis macrochirus (BF2), atlantisk laks (AS), regnbueørretgonade (RTG-2) og regnebueørret-fibroblast (RTF) celler. Cellene ble holdt i Eagles minimums essensielle medium (MEM) inneholdende Earles salter og natriumhydrogenkarbonat 2,2 g/l supplert med 200 mM L-glutamin, 1% ikke-essensielle aminosyrer, 0,01 M Hepes, penicillin 100 IU./ml, streptomycin 100 ug/ml og 10% storfefosterserum (FBS) Gibco, Skottland. Cellene ble oppformert enten i 150 cm2 kolber eller i 24 brønnsplater (Costar 3524) ved 20°C.

Platene ble inkubert i lukkede beholdere i 3% C02/97% luftatmosfære. For opprett-holdelse av celler under virusisoleringen brukte man et opprettholdende medium (MEMM) som bestod av MEM hvor antibiotika var tilsatt som følger; penicillin 500IU ml-l, streptomycinsulfat 500 [ig ml-l, amfotericin B 0,625 ug ml-l; og FBS ble redusert til 2%.

Opprinnelig virusisolering

Prøver av nyrer, milt, hjerte, lever, pankreas og tarmkanalen ble tatt ut fra 20 individuelle fisker under den akutte fase av et utbrydd av Pankreassykdommen i et lakse-oppdrettsanlegg på vestkysten av Irland. Prøvene fra hver fisk ble behandlet separat.

Sam-kultivering

For isolasjonsforsøk med sam-kultivering ble halvparten av hver nyre fragmentert ved at porsjoner ble plassert i en 2 ml sprøyte, hvoretter prøven ble presset gjennom en 16 gauge hypodermisk nål over i 10 ml av et opprettholdende medium (MEMM). Suspensjonen av vevsstykkene man fikk på denne måten ble inokulert i monolag av CHSE-214-celler som var preparert 24 timer tidligere. 1 ml av vevssupensjonen ble inokulert i hver brønn i en 24 brønnsplate og inkubert ved 15°C i 28 dager eller inntil man kunne observere en cytopatisk effekt (CPE), hvoretter man utførte en innføring i CHSE-cellene uten frysing og tining, og deretter utførte en inkubering i ytterligere 28 dager.

Vevshomogenater

De gjenværende nyredeler og andre vev fra hver fisk ble slått sammen og man fremstilte 10% homogenater med MEMM ved å bruke en pistill og morter. Prøvene ble sentrifugert ved 2500 g i 15 min. og 0,1 ml av supernatantene ble inokulert til slutt-fortynninger på 1:20, 1:50 og 1:100 i MEMM i 24 brønnsplater inneholdende CHSE-214-celler. Platene ble så inkubert i 15°C i 28 dager eller inntil man fikk en tilsynekomst av CPE, hvoretter man foretok en innføring i CHSE-cellene og inkuberte disse ved 15°C i ytterligere 28 dager.

Virusvckstkurve i CHSE-214 celler

Virusveksten i CHSE-214 cellene ble målt ved inokulering av 0,1 ml FPDV på CHSE-214 celler i 24 brønnsplater ved en rekke gjentatte infeksjoner (MOI) på 1 TCID50/ celle, og hvor man lot virus bli absorbert i 1 time ved 15°C. Inokulumet ble fjernet og cellene vasket tre ganger med MEMM, og så igjen tilsatt 1 ml MEMM. Prøver ble tatt ut for undersøkelse på 0,2,4, 6, 8,10,12,14,21 og 28 dager etter inokulering (PID) som følger. For ekstracellulære virusprøver ble halvparten av kulturmediet fjernet fra hver av 4 brønner, slått sammen og sentrifugert ved 800 x g i 5 min. for å fjerne cellene. Supernatanen inneholdt ekstra-cellulær virus. For totale virusprøver ble den gjenværende 0,5 ml delen av kulturmediet sammen med tilfestede celler fjernet ved skraping, ble slått sammen og frosset og tint én gang. Begge prøver ble undersøkt separat for virusinfeksjon ved utreiing i CHSE-214 celler som var inkubert i 14 dager ved 15°C. 50% sluttpunkter på denne og alle etterfølgende prøver ble beregnet ved hjelp av den fremgangsmåten, som er beskrevet av Reed og Muench (1938) Am. J. av Hygiene 27: 493-497.

Vekst av virus i cellekulturene

Undersøkelser med hensyn til cytopatiske effekter av FPDV i epithelioma papilloma cyprini (PEC), fathead ørekyte (FHM), bluegill leponis macrochirius (BF2), atlantisk laks (AS) (Flow, Skottland) regnbueørretgonade (RTG) celler og en regnbueørret-fibroblast-cellelinje (RTF) som var produsert av foreliggende søker, ble utført. Kulturene ble inokulert med tigangers fortynninger av en viruspool som inneholdt 107 TCID50 ml-l, inkubert ved 15°C og undersøkt for nærvær av CPE over 14 dager. Enhver forekomst av CPE ble notert, og kulturene ble undersøkt for virusvekst ved titrering av kulturvæskene i CHSE-214 celler. Alle kulturene ble gitt en ny gjennomgang i 14 dager i de samme cellene ved 15°C, og igjen undersøkt for virusvekst i CHSE-214 celler før de ble kastet.

RESULTATER

Virusisolering

Virus ble isolert fra to av de tyve nyreprøvene som ble undersøkt. Disse hadde blitt samkulturivert med CHSE-214-celler i 28 dager og så gitt en ytterligere gjennomgang i CHSE-214-celler. Ingen CPE kunne observeres i de opprinnelige samkultiveringskulturene. Ved gjennomgang kunne man imidlertid observere små diskrete grupper av celler som var pyknotiske, hadde fått hulrom og hadde et uregelmessig utseende etter 10 dagers inkubering. Etter fire ytterligere gjennomganger i CHSE-214-celler var CPE blitt meget vidt utbredt (se figur 1). Man kunne rutinemessig oppnå en virustitreringsverdi på 108,5TCID50/ml. Mesteparten av de utsatte cellene forble festet til monolagene. Man kunne ikke i noen av kulturene observere syncytia eller innelukkede legemer. Man kunne ikke isolere noen virus fra noen av de inokulerte vevshomogenater.

Beskrivelse av cytopatiske effekter i CHSE-214-celler

Ved de første gjenomgangene ble små diskrete grupper av celler pyknotiske, fikk hulrom og fikk et uregelmessig utseende. Dette økte over en tre ukers tid inntil ca. 3/4 av monolaget var infisert. Infiserte celler løsnet ikke fra overflaten på kulturplaten. Når viruset ble celletilpasset så kom CPE tilsyne så tidlig som på 4. dag og var fullstendig normalt i løpet av 14 dager.

Vekst i forskjellige cellekulturer

Veksten av virus i CHSE-214-cellene er vist på figur 2. Høyeste totale virusnivå man oppnådde var etter 6-8 dager etter inokuleringen, mens ekstra-cellulær virus nådde en topp ca. 11 dager etter inokulering og forble høy opp til ca. 14 dager etter inokuleringen. Man kunne ikke observere noen CPE i AS, BF2, FHM, EPC eller RTG-2-cellene og det var ingen bevis på vekst av FPDV i disse cellene. I RTF-cellelinjen så kunne man imidlertid, skjønt man ikke kunne observere noen CPE, nå en FPDV-titreringsverdi på 106 TCID50 ml-l både ved første og andre passasje i disse cellene.

EKSEMPEL 2

Kloroformfølsomhet

Følsomhet overfor kloroform ble bestemt ved å tilsette 0,05 ml kloroform til 1 ml virus. Blandingen ble ristet i 10 min. ved romtemperatur og så sentrifugert ved 400 x g i 5 min. for å fjerne kloroformen. Gjenværende infeksjons virus ble påvist ved titrering i CHSE-214-celler. En kontroll bestod av 0,05 ml MEMM tilsatt 1 ml virus istedenfor kloroform. Infiserende pankreatisk nekrosevirus (IPNV) og viral blødende septicaemia-virus (VHS) ble også tatt med som negative (ikke-følsomme) og positive (følsomme) viruskontroller hhv..

RESULTATER

Infeksjonsevnen til isolatet og VHS-virus ble redusert etter eksponering overfor

kloroform, noe som indikerer et nærvær av en kappe som inneholder vesentlige lipider.

I motsetning til dette ble IPNV-infeksjonen ikke påvirket når disse virus ble behandlet på samme måten.

EKSEMPEL 3

Stabilitet ved pH 3,0

Stabiliteten ved pH 3,0 ble bestemt ved å tilsette 0,1 ml virus til 0,9 ml MEM justert til pH 3,0, holde blandingen i 4 timer ved 4°C, og så undersøke hvorvidt det var gjenværende infiserende virus ved titrering i CHSE-214-celler ved 15°C i 14 dager. Eksperimentet ble gjentatt med FPDV tilsatt MEM ved pH 7,2 som en kontroll. IPNV ble tilsatt som en pH 3,0 stabil viruskontroll, og infeksiøs hematopoietisk nekrosevirus (IHN) ble brukt som en pH 3,0 følsom kontroll.

RESULTATER

Isolatets infiserende evne gikk tapt da det ble eksponert overfor pH 3,0. IPNV ble ikke påvirket.

EKSEMPEL 4

Temperaturstabilitet

Porsjoner av virussuspensjoner ble oppvarmet i 30 min. ved 15,25,37,45,50,55 eller 60°C og så avkjølt umiddelbart ved nedsenkning i isvann. Konsentrasjonen av infiserende virus som var igjen ble undersøkt ved titrering i CHSE-214-celler inkubert ved 15°Ci 14 dager.

RESULTATER

Infeksjonsevnen ble ikke påvirket ved 4,15,25°C, men ble redusert ved 37 og 45°C. Ingen infiserende virus kunne påvises etter 30 min. ved 50°C.

Tabell 3 Stabilitet for FPDV holdt på forskjellige temperaturer i 30 min.

Gjenværende virus ble undersøkt for infeksjonsevne i CHSE-214-celler, inkubert ved 15°C i 14 dager.

EKSEMPEL 5

Hemagglutinering

Prøver for hemagglutinering ble utført med erotrocytter fra kylling, marsvin, regnbueørret og atlantisk laks i 96-brønnsplater hvor brønnene hadde en U-formet bunn, ved å tilsette 0,1 ml av en 0,8% suspensjon av røde blodceller i fosfatbufret saltløsning (PBS) ved pH 7,2 til 0,1 ml av et FPDV-preparat fremstilt i CHSE-214-celler med en titreringsverdi på 107 TCID50/ml, hvoretter inkubering ble utført ved 4,15 og 37°C. Prøvene ble undersøkt etter 1, 3 og 18 timer.

RESULTATER

Ingen hemagglutingering kunne observeres ved noen av de angitte temperaturer, eller med noen av de valgte erytrocytter.

EKSEMPEL 6

Nukleinsyreinhiberingsprøve

Nukleinsyretypen i virusene ble bestemt ved å dyrke disse i nærvær av DNA-inhibitoren 5-brom-2'-deoksyuridin (BUDR) med og uten thymidin. Grupper på 4 brønner i hver av tre 24-brønnspIater inneholdende CHSE-214-celler ble inokulert med 0,1 ml av tigangers fortynning av virus, og disse ble hensatt for absorbsjon i 1 time ved 15°C. Til hver plate tilsatte man 1 ml MEMM alene, MEMM med 1 mM/ml BUDR eller MEMM med 1 mM/ml BUDR og 1 mM/ml thymidin. Platene ble inkubert ved 15°C i 14 dager og så undersøkt for CPE. En fiske RNA-virus (IPN) og en DNA-virus (lymfocystis) som var dyrket i BF2-celler ble inkludert som kontroller.

RESULTATER

Virustitreringen av isolatet og IPNV var ikke påvirket ved nærværet av BUDR i mediet, mens fiske-DNA-viruset ble hemmet. Dette indikerer at genomet i isolatet består av RNA.

EKSEMPEL 7

Negativ kontrast EM-undersøkelse

Virussuspensjoner for EM-undersøkelser bestod av enten FPDV-infiserte cellekulturmedia som ble brukt uten fiksering på forhånd, eller etter at man hadde tilsatt glutaraldehyd (2% sluttkons.) i 1 time ved 4°C, og deretter utført en ultrasentirfugering ved 100.000 x g i 4 timer, hvoretter den fremstilte pellet ble igjen suspendert i et par dråper destillert vann. Et karbonbelagt kobbernett ble plassert på toppen av en dråpe av virus-suspensjon og ble hensatt der i 10 min.. Overskudd av væske ble avsilt, og nettet ble farget med 2% fosfowolframsyre (PTA) (pH 7,2) i 1 min.. Nettet ble så undersøkt i et Hitachie H7000 transmisjon EM ved en forstørrelse på 50.000 ganger.

RESULTATER

Viriuspreparater som ikke var fiksert i glutaraldehyd før EM-undersøkelsen inneholdt for det meste partikler som var gått i stykker, noe som indikerer at en pre-fiksering er nødvenidg for å konservere hele virionet.

EM-undersøkelsen av glutaraldehydfiksert materiale viste nærvær av sirkulære partikler som målte 65,5 +/- 4,3 nm (fig. 3). Disse hadde en indre kjerne av udefinerbar struktur og var omgitt av en ytre krans av noe som synes å være klubbelignende fram-spring. Det var også tilstede mange delvis ødelagte partikler. I de ufikserte preparatene kunne man bare se noen få fullstendige partikler, og dette indikerer at det frie virionet er nokså skrøpelig og lett blir ødelagt under prepareringen for EM-undersøkelsen.

EKSEMPEL 8

Vekst og konsentrasjon av virus

Vekst av virus i CHSE-214-celler

Virusveksten i CHSE-214-cellene ble målt ved inokulering av 0,1 ml FPDV på CHSE-214-celler i en 24 brønnsplate i en rekke paralleller med 1,0 TCID50/celle, og hvor man lot viruspartiklene henstå for absorbsjon i 1 time ved 15°C. Viruset ble så fjernet, og cellene vasket to ganger med MEMM og deretter ble dette medium erstattet med 1 ml MEMM. Prøver ble tatt ut for undersøkelse på dag 0, 7,11,14, 21, 28 etter inokuleringen på følgende måte. Halvparten av kulturmediet ble fjernet fra hver av 4 brønner som ble slått sammen og sentrifugert ved 800 x g i 5 min. for å fjerne cellene. Den gjenværende 0,5 ml av kulturmediet sammen med de tilfestede cellene ble fjernet ved å skrape disse av, det hele ble slått sammen og så frosset og tint én gang. Begge prøvene ble undersøkt separat for virusinfeksjonsevnen ved titrering i CHSE-214-celler ved 15°C i 14 dager.

Caesiumkloridgradientsentrifugering

FPDV ble inokulert i CHSE-214-celler ved en MOI på 1. Celler og medium (400 ml) ble høstet 8 dager etter inokulering og frosset og tint én gang ved -70°C før man utførte en sentrifugering ved 10.000 x g i 30 min. i et Beckman Type 35 rotasjonsapparat for fjerning av celleavfall. Supematanten ble underkastet ultrasentrifugering ved 100.000 x g i 4 timer. Den resulterende pellet ble resuspendert i totalt 2 ml PBS pH 7,2 og lagt over en diskontinuerlig CsCl-gradient som bestod av 5 ml 1,3 g/ml CsCl og 4,5 ml av 1,22 g/ml CsCl. Dette ble så sentrifugert ved 100.000 x g i 19 timer ved 4°C. 20 fraksjoner ble oppsamlet og prøvet for infeksjonsevne i CHSE-214-celler inkubert ved 15°C i 14 dager. Tettheten av de fraksjoner som inneholdt infiserende virus ble bestemt ved hjelp av et refraktometer.

RESULTATER

Infeksjonsevne ble påvist i fraksjonene fra CsCl-gradientene med tettheter fra 1,08 til 1,26 g/ml. Maksimal infeksjonsevne ble observert ved en tetthet på 1,2 g/ml, og denne fraksjonen inneholdt også det største antall fullstendige viruspartikler slik dette kunne bedømmes ved en EM-undersøkelse.

EKSEMPEL 9

Serologiske prøver

FPDV ble undersøkt for nøytralisering ved hjelp av hyperimmunt kaninsera mot infeksiøs hematopoietisk virus (IHN), viral blødende septicaemia-virus (VHS), infeksiøs pankreatisk nekrosevirus, rase Sp, Ab og VR-299 (IPNV), hestearteritisvirus (EAV), storfeviraldiarévirus (BVD) og Rubellavirus. Like volumer 200 TCID50/0,1 ml av FPDV ble tilsatt 0,1 ml av to-gangers fortynninger av antisera og inkubert ved 15°C i 1 time. Blandingene ble så inokulert i CHSE-214-celler i 24 brønnsplater 0,1 ml pr. brønn, absorbsjonen ble så foretatt i 1 time, 1 ml MEMM ble tilsatt og platene ble inkubert ved 15°C i 14 dager, hvoretter kulturene ble undersøkt mikroskopisk på annenhver dag for nærvær av CPE. Titreringsverdiene ble beregnet ved hjelp av den fremgangsmåten, som er beskrevet av Reed og Meunch, 1938 i Amer. J. of Hygiene 27:493-497.

RESULTATER

FPDV ble ikke nøytralisert av antisera til IHNV, VHSV, IPNV, EAV, BVD eller Rubella, noe som indikerer at den ikke var beslektet med disse virusgrupper.

EKSEMPEL 10

TRANSMISJONSEKSPERIMENT

1) Materialer og metoder

a) Ferskvannsfisk

Atlantisk lakseyngel med en midlere vekt på 20 g ± 2,9 g ble holdt i sirkulære

tanker med en diameter på 1,2 m og inneholdende vanlig springvann ved 10-12°C. Fiskene ble holdt i disse tankene i 2 uker før inokuleringen for å utføre en akklimatisering, og ble på dette tidspunkt bare gitt en kommersiell fremstilt fSrblanding til metthet. Vev ble tatt ut fra 10 fisk og undersøkt for nærvær av infeksiøs pankreas nekrkosevirus (IPNV) og pankreassykdom. Før inokuleringen ble fiskene bedøvet

med 3-aminobenzosyreetylester (MS222).

b) Marin fisk

Atlantisk lakse med en vekt på 87 g etter smoltperioden ble holdt i 2 x 1,5 m tanker

inneholdende sjøvann i et gjennomstrømningssystem ved 12-15°C. Fisken ble holdt i disse tankene i to uker for akklimatisering før inokulering, og prøver fra 10 fisk ble dyrket i nærvær av IPNV og underøskt histologisk for nærvær av pankreassykdom.

2) Eksperimentelle fremgangsmåter

Inokulum 1

Et FPDV-preparat ble fremstilt ved å inokulere virus i CHSE-214-celler med en rekke infeksjoner og 1 TCID50 pr. celle og høstet etter 8 dagers inkubering ved 15°C. Cellene ble sprengt ved frysing og tining én gang ved -70°C, og celleavfall ble fjernet ved sentrifugering ved 10.000 x g i 30 min.. Det resulterende virus-preparatet med en titreringsverdi på 107,0 TCID50/ml ble filtrert gjenom et 0,22 mikrons porøst millipore-filter og 0,1 ml ble inokulert intraperitonealt i hver av 100 fisk. Femti finne-klippede uinokulerte fisk ble tilsatt hver av tankene i kontakt med førstnevnte inokulerte fisk.

Inokulum 2

Som kontroll ble 100 fisk inokulert med et lysat fra u-infiserte CHSE-214-celler fremstilt på nøyaktig samme måte som de visrusinfiserte cellene, og man tilsatte tankene ytterligere 50 totalt ubehandlede fisk.

Prøvetaking

På dag 6 eller 7,10,14 eller 15,21,28, 35 og 42 etter inokulering ble prøver av hjerte, milt, nyre, lever, caecae/pankreas og muskler tatt ut fra 10 prøvefisk og 10 kontroll-fisk for histologisk undersøkelse. Hjerte, milt, nyre og caecae/pankreas-prøvene ble også tatt fra den samme fisken for virusisolering inntil dag 28. På dag 14 eller 15,21,28,35 og 42 etter inokuleringen ble 5 ubehandlede fisk tatt ut og vev behandlet for histologisk undersøkelse. Slike kontaktfisker ble undersøkt for virusisolering bare på dag 14 eller 15 og 21 etter inokuleringen.

Histologi

Prøvene for histologisk undersøkelse ble fiksert i 10% formaldehyd i bufret saltløsning pH 7,0, og innleiret i parafinvoks og det ble deretter tatt 5 mikrosnitt på en Reichert Ultracut S microtome. Snittene ble farget med hematoksylin og eosin.

Virusisolering

Vev ble fremstilt som 10% homogenater i MEMM, idet man brukte en pistill og morter, sentrifugering ved 2.500 x g i 15 min. og så inokulert ved en sluttfortynning på 1:20 og 1:10 i hver av 2 brønner i en 24 brønnsplate inneholdende CHSE-214 celler og inkubert ved 15°C i 28 dager.

Prøvene som var uten CPE ble gitt én ny gjennomgang i CHSE-214-celler før de ble ansett å være negative.

RESULTATER

Kliniske og patologiske sår hos ungfisk av ferskvannslaks

Når viruset var inokulert i ungfisk av ferskvannslaks, så stoppet enkelte av ung-laksene å spise, og man kunne observere fekale oppgulp. Akutte pankreatiske acinare nekroser ble påvist fra 6-10 dager etter inokulering (p.i.). Nekrosen var fokal til diffus med hensyn til fordeling. Mellom dag 14 og 21 hadde mange av fiskene et signifikant acinart tap, men lommer av overlevende acinart vev kunne påvises, da spesielt rundt de Langerhanske øyer og i store intralobulare kanaler i enkelte fisk. Det var en mild fibrose i det periacinare vevet. Samtidig kunne multifokal myocytisk nekrose og degenerering påvises fra dag 6 etter inokuleringen i alle fiskene med pankreatiske sår. I uke 3 etter inokuleringen var hjertene begynt å bli hypercelluære med tydelig oppformering av myocytiske og sub-endokardiale celler med myocytisk kjerneforstørrelse. Milde skjelettmuskelsår kunne påvises 21 dager etter inokuleringen. I kontaktfiskene utviklet lignende sår seg etter en 2 ukers forsinkelse. Man kunne ikke påvise noen histologiske sår i de negative kontrollene.

Kliniske og patologiske sår i sjøvannstransmisjonseksperiment

På den 7. dagen ble de fisker som var inokulert med FPDV anoreksiske, og det var et økende antall fekale oppgulp i tanken. Fokal til alvorlig diffus acinar cellenekrose med samtidig multifokal kardiomyocytisk nekrose kunne konsistent bli observert fra dag 7. Skjelettmuskelfiberdegenerering ble påvist fra dag 1S, og dette påvirket både de røde og hvite skjelettmuskelfibrene. Disse muskelsårene økte i frekvens og grad på dag 35 og 42. Typiske sår som ble observert på dag 21 er vist på figurene 4 til 7. Alle de samlevende fiskene utviklet lignende sår etter en 2 ukers forsinkelse. Man kunne ikke påvise noen kliniske tegn eller sår i noen av kontrollfiskene.

Isolasjon av virus i transmisjonseksperimenter

Virus ble isolert fra alle vev i de inokulerte fiskene, men på forskjellige tidspunkter etter inokuleringen (tabell 5), hvor hjertevevet var det mest infiserte vevet.

Alle kontaktfiskene fra den samme tanken ble infisert med viruset, skjønt ingen av kontrollfiskene fant man inneholdt virus. Resultatene for sjøvannsfisk er gitt i tabell 6. Ingen IPN-virus ble påvist under noe trinn av transmisjonsundersøkelsen.

Sammendrag av histologiske resultater er vist i tabellene 7 og 8.

Ingen sår ble påvist i noen av de negative kontrollene.

EKSEMPEL 11

Eksperimentell protokoll for fremstilling av inaktivert fiskepankreas-sykdomsvirus-vaksine (FPDV)

Hensikten med undersøkelsen

Hensikten er å undersøke hvorvidt inaktivert FPDV med tilsatt fortynningsmiddel når dette ble inokulert i ungfisk av laks, kan beskytte fisken mot å bli infisert med levende

FPDV.

Materialer og fremgangsmåter

Virus som ble brukt under fremstillingen av vaksinene

FPDV med 11 passasjer ble dyrket i CHSE-celler og høstet 6 dager etter inokulering og sentrifugert ved 1000 x g i 15 min.. 600 ml av den resulterende supernatanten ble ført gjennom et Amiconfilter og ga 25 ml konsentrert FPDV med en titreringsverdi på 107,5TCID50ml-l.

Virusinaktiveringersmetode

A. 10 ml FPDV fremstilt som ovenfor + 0,2% betapropionlakton (BPL) + 2 dråper

NaOH

B. 10 ml FPDV fremstilt som ovenfor + 0,1% formalin (35 til 38%)

C. MEMM (opprettholdende medium).

Porsjoner av A, B og C ble lagret ved +4°C i 24 timer før tilsetningen av et egnet fortynningsmiddel. Forrynningsmidlet ble tilsatt etter at viruset var inaktivert, og både viruspreparatene og kontrollpreparatene ble inokulert i fiskene 8 dager etter den første inaktiveringen.

Vaksinasjonsprotokoll

FISK: Ungfisk av laks, midlere vekt 27 g, ble holdt i ferskvannsgjennom-strømningssystem i 1 til 2 uker før vaksinasjon. (Vanntemperatur variert fra 10-14°C).

Blod og vevsprøver ble tatt ut fra 5 fisk pr. gruppe før vaksinasjon.

0,1 ml av inaktivert fortynnet FPDV fremstilt som under A og B og forrynningsmidlet i gruppe C (MEMM pluss tilsetningsmiddel) ble inokulert intraperitonealt (VP) i 50 fisk pr. gruppe.

Prøvetaking

10 fisk fra hver gruppe ble samlet inn 1 uke før eksponering med FPDV.

Blod og histopatologiske prøver ble tatt og undersøkt for nærvær av pankreassykdom (PD).

Man fant ingen bevis på PD i histologiske undersøkelser eller ved virusisolering.

Eksponeringsprotokoll

0,1 ml levende 104,5 TCID50ml-l av FPDV med 9 passasjer ble inokulert l/P i hver fisk i 3 prøvegrupper 28 dager etter vaksinasjon.

En fjerde gruppe D på 50 uvaksinerte fisk ble også inokulert med UP med den samme mengden FPDV slik at man her fikk en positiv kontroll.

Etter 10 og 14 dager etter eksponeringen ble 5 fisk tatt ut fra hver gruppe.

Det ble tatt blodprøver for antistoffprøver, nyre og hjertevevsprøver for virusisolering og pylorisk caeca, hjerte og muskelprøver for histologi.

EKSEMPEL 12

Indirekt fluorescensantistoffprøve (ifa) for påvisning av FPDV-antigen I cellekulturer

Innføring

Denne prøven innbefatter at man tilsetter serum inneholdende FPDV-antistoff, til CHSE-celler som man mistenker for å være infisert med viruset. Hvis viruset er tilstede vil antistoffet binde seg til det tilstedeværende antigenet. Anti-lakse IgM fremstilt i kaniner ble så tilsatt, og vil eventuelt binde seg til antistoffet. Denne tilfestingen kan påvises ved å tilsette anti-kaninserum konjugert til fluoresceinisotiocyanat (FITC) som så kan observeres som en grønn fluorescering ved å bruke et fluorescerende mikroskop.

Materialer

CHSE-214-celler ble dyrket på 11 mm diameter dekkglass i 24 brønnsplater (Costar) som var tilsatt 45.000 celler i 0,5 ml vekstmedium (MEM+10% storfefosterserum) pr. dekkglass. Kulturene ble inkubert ved 20°C i en lukket beholder med 3% C02/luft-blanding i 48 timer før bruk.

Positivt serum - sammenløpende serum fra FPDV påvirket laks ble brukt i 1/50-fortynning i fosfatbufret saltløsning (PBS) pH 7,2.

Negativt kontrollserum - lakseserum uten noe antistoff til FPDV fortynnet 1/50 i

PBS.

Kanin anti-lakse IgM - oppnådd kommersielt fra Soren Schierbeck & Co., Helsingør, Danmark, fortynnet 1/50 i PBS.

Anti-kanin Ig/FITC - kjøpt kommersielt fra Nordic Imm. Labs., Berks, England, fortynnet 1/1000 i PBS.

Fremgangsmåte

Materiale man mistenkte å inneholde FPDV ble tilsatt dekkglassene i brønner inneholdende 1 ml MEMM (opprettholdende medium) og inkubert i 5 dager ved 15°C i en lukket beholder med 3% C02/luftblanding. Dekkglassene ble vasket to ganger i PBS og fiksert i aceton i 5 min. før de ble lagret ved +4°C inntil de skulle brukes. Negative kontrollkulturer uten mistenkte prøver så vel som positive kontrollkulturer som inneholdt FPDV, ble fremstilt på samme måten.

Både prøve og kontrolldekkglassene ble overlagt med 50 ul positiv og negativ sera og inkubert ved 35°C i 30 min. i en fuktet 100 mm kvadratisk petriskål. PBS ble tilsatt separate dekkglass som reagenskontroller. Alle dekkglassene ble så vasket med PBS i 6 min. (3 forandringer hver på 2 min.) og overskudd av PBS ble fjernet ved hjelp av filtrer-papir. 50 ul antilakse IgM ble tilsatt alle dekkglassene og inkubert i 30 min. ved 35°C. Ytterligere vasking ble utført i PBS i 6 min. og 50 ul anti-kanin/FITC ble tilsatt alle dekkglassene som ble inkubert i 30 min. ved 35°C. En avsluttende vasking ble utført i 6 min. i PBS, og dekkglassene ble undersøkt under 40 x objektiv på et Labophot 2 fluorescerende mikroskop hvor dekkglassene var plassert under en bufret glycerolsalttøsning pH 9,2. Grønn fluorescering som tilsvarer den man har i de positive kontrollene, med et fravær av fluorescering i de negative kontrollene, indikerer nærvær av FPDV-antigen i kulturene.

EKSEMPEL 13

Indirekte fluorescerende antistoffprøver (IFA) for påvisning av antistoff til FPDV i lakseserum

Innføring

Denne prøven innbefatter at man tilsetter lakseserum til FPDV-infiserte CHSE-214-celler. Hvis det er tilstede antistoff for FPDV i nevnte serum, så vil det binde seg til de virusinfiserte cellene. Anti-laks IgM fremstilt i kaniner ble så tilsatt preparatene og vil feste seg til et eventuelt bundet antistoff. Denne tilfestingen kan så påvises ved å tilsette anti-kaninserum konjugert til fluresceintiocyanat (FITC) som kan observeres som grønn fluorescering (FITC) under et fluorescensmikroskop.

Materialer

FPDV-infiserte celler ble fremstilt ved å tilsette virus til en CHSE-214-celle-suspensjon som inneholdt 200.000 celler pr. ml, idet man kjørte to paralleller og tilsatte 40 pl til hver brønn på en 12 brønns multispot objektglass (Hendley, Essex). Kulturene ble inkubert i en 3% C02/luftatmosfære i en lukket beholder ved 20°C i 24 timer. De ble så overført til en 15°C inkubator og inkubert ytterligere 3 dager før de ble vasket to ganger med fosfatbufret saltløsning (PBS) ved pH 7,2, fiksert med aceton i 5 min. og lagret ved +4°C inntil de skulle brukes. Kontroll CHSE-214-kulturer uten virus ble fremstilt på samme måten.

Prøveser - lakseserum for antistoffprøving.

Postivt kontrollserum - lakseserum som viste seg å ha nøytraliserende antistoff ved en senunnøytraliserende antistoffprøve (SNT).

Negativt kontrollserum - lakseserum uten noe antistoff ved SNT.

Kanin anti-lakse IgM - kjøpt kommersielt fra Soren Shierbeck & Co., Helsingør, Danmark.

Anti-kanin Ig/FITC - kjøpt kommersielt fra Nordic Imm. Labs. Berks, England.

Fremgangsmåte

FPDV-positive og negative flerpunktsbrønner ble overlagt med 30 ul lakseprøve-sera fortynnet 1/20 med PBS pH 7,2. Positive og negative sera i 1/20-fortynning i PBS ble også tilsatt separate brønner. To brønner på hvert objektglass hadde også tilsatt PBS som kontroller, og glassene ble inkubert ved 35°C i fuktede 100 mm2 petriskåler i 30 min.. Etter vasking i PBS (tre vaskinger hver på 2 min.) tilsatte man 30 ul anti-laks IgM i en 1/50 fortynning i PBS til alle brønner, og objektglasset ble inkubert i ytterligere 30 min. ved 35°C. Etter vasking i 6 min. i PBS tilsatte man 30 fil anti-kanin IgM i en 1/100 fortynning i PBS til hver brønn, og objektglassene ble inkubert i 30 min. ved 35°C. En avsluttende vasking i PBS i 6 min. ble så utført, og nærvær av fluorescering ble påvist ved å bruke et 40 x objektiv og et Labophot 2 fluorescerende mikroskop hvor objektglassene var plassert i en bufret glycerolsaltløsning pH 9,2. En distinkt grønn fluorescering i prøven og positive serumbrønner og ikke i kontrollbrønnene, indikerte nærvær av antistoff til FPDV i disse sera. Antistofftitreringer ble utført ved å bruke den samme fremgangsmåten.

EKSEMPEL 14

Virus RNA: 14C-uridin.

Skjønt den er mindre vanlig brukt enn tritium, ble denne markøren valgt fordi den lar seg påvise ved hjelp av røntgenfilm.

Merket, ekstracellulær virus ble pelletert ved høy hastighet og ekstrahert for analyse ved formaldehyd-gelelektroforese. I dette første eksperimentet hvor akt D var tilstede under merkeperioden (dag 2 til 5), kunne ingen markør påvises på gelen.

RNA-tilstede i akt D-behandlede infiserte celler ble også undersøkt. Etter ekstraksjon ved hjelp av NP40 lysismetoden hvor man utførte en utstrykning av merket RNA, så kunne man observere en økende intensitet etter hvert som molekylvekten avtok. Man kunne ikke påvise noen distinkte spesielle virale RNA-molekyler.

Større volumer av ekstracellulær virus merket med 14C og 3H-uridin i fraværet av akt D ble pelletert og ekstrahert ved hjelp av Gensys RNA-isolatormetoden. På en formaldehydgel som viste god oppløsning for merket ribosomal RNA (fra infiserte celler), så vandret høyhastighetpelletvirus RNA som en utsrnøring. Mesteparten av det påviste RNA hadde lav molekylvekt, og dette tilsvarer i mobilitet til tRNA eller noe større, men den utdradde sonen strakk seg i størrelse til mer enn 5000 nt (større rRNA-molekyler). Lang eksponering av denne gelen indikerte nærvær av 2 svake bånd, ett som tilsvarer i størrelse til 28S rRNA og det andre til en posisjon som tilsvarer ca. 10-15 kb. De større mrtlalrTrlønø h o-r on mrtKiliføf cnm tilcir^iwr sl^t man lriin«*=» Tnn/pntft - ff\ T triCrCkifit*iiC/flQ\/1 \MTl 1C

EKSEMPEL 15

Resultater av transfeksjonseksperimenter med ilskepankreassykdomsvirus (FPDV)

Transfeksjoner ble utført med godt resultat med (a) RNA ekstrahert fra infiserte CHSE-celler (intracellulær RNA), og (b) RNA ekstrahert fra vev som var tilstede i vevskultursupernatanten (ekstracellulært virus RNA).

RNA-preparering

(a) Intracellulært RNA

Monolag av CHSE-celler i 75 cm2 plastkolber ble infisert med FPDV (typisk 104 TCID50). Dette ble utført ved absorbsjon av virus som forefantes i 2 ml MEM-media 1 time og så tilsette 17 ml media uten serum. 7 dager etter infeksjonen ble media fjernet, og cellene skrapet av kolbene og over i iskald PBS. Cellepellets ble fremstilt ved sentrifugering ved 1500 g i 5 min., hvoretter de ble ekstrahert ved å bruke "RNA-isolator" (Genosys). Typisk ble cellene fra 2 kolber ekstrahert med 1 ml ekstraksjonsreagens.

(b) Ekstcellulær virus RNA

Supernatantmedium (vanligvis 700-900 ml volumer) fra infiserte CHSE-celler ble konsentrert 5 eller 6 ganger ved hjelp av Amicon-filtrering og ultrasentirfugering ved 35.000 rpm i 4 timer, idet man brukte et Beckmanapparat 8 x 70 ml med fast vinkelrotor, hvorved man fikk fremstilt urene viruspellets som viste seg å inneholde store mengder virus med høy infeksjonsevne. Typiske urene viruspellets fremstilt fra 300-450 ml supernatant ble ekstrahert med 1 ml "RNA-isolator"-reagens.

Transfeksjon

RNA-pellets ble sentrifugert etter lagring i EtOA ved -20°C ved 12.000 g i 10 min. og så oppløst i 20 ul vann uten RNAse. Typisk brukte man intracellulært RNA som var avledet fra cellene som forefantes i ca. 0,25 kolbemonolag og ekstracellulær virus RNA avledet fra 50-100 ml supernatant. Transfeksjon ble utført med "Lipofectin" (Gibco BRL) reagens, idet man brukte den fremgangsmåten som er anbefalt av fabrikanten. Kort beskrevet består denne fremgangsmåten i at man blander RNA-løsningene med vevskultur-media inneholdende Lipofectin og så inkuberer semisammenløpende CHSE-celler, dyrket på 24 brønns Costarplater, med blandingen (100 ^1/brønnkultur med en diameter på 1,5 cm) i fra 5 til 6 timer før man erstattet reagensetransfeksjonsblandingen med opprettholdende medium. Kulturene ble så undersøkt for nærvær av cpe hver dag. Av og til kunne man observere viral cpe etter 4 til 6 dager etter subdyrkingen av de transfekterte kulturene, idet denne subdyrkingsmetoden vanligvis ble utført 8 dager etter transfeksjonen.

Claims

1. Virus som når injisert intraperitonealt i en titreringskonsentrasjon på 10<3,5> TCID50 inn i atlantisk laks post- smolt holdt i sjøvann ved 14°C forårsaker at fisken utvikler symptomer på pankreatisk sykdom, karakterisert ved at (a) nevnte virus er virusstammen som deponert ved ECACC under deponeringsnummer V94090731 eller nært beslektede stammer som har lignende genotypiske og/eller fenotypiske karaktertrekk som nevnte deponerte virusstamme, (b) nevnte virus reagerer serologisk med kovalescent anti-FPDV antiserum eller antiserum dannet mot deponert virusstamme V94090731.

2. Virus ifølge krav 1,karakterisert ved å være i alt vesentlig fri for annet viralt eller mikrobielt materiale.

3. Vaksine for å bekjempe fiskepankreassykdom, karakterisert ved at nevnte vaksine omfatter et virus ifølge krav 1 eller 2.

4. Vaksine ifølge krav 3, karakterisert ved at den omfatter en svekket eller inaktivert form av nevnte virus ifølge krav 1 eller 2.

5. Diagnostisk reagens for fiskepankreassykdom, karakterisert ved at nevnte reagens omfatter et antistoff som er i stand til selektivt å binde seg til et virus ifølge krav 1 eller 2.

6. Diagnostisk reagens ifølge krav 5, karakterisert ved det inneholder en markør, en kromofor, en fluorofor, et tungmetall, en enzymatisk markør, eller en antistoff-markør.

7. Diagnostisk reagens ifølge ethvert av krav 5 eller 6, karakterisert ved at det er i immobilisert form.

8. Fremgangsmåte for isolering av et virus ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den omfatter: (a) identifisering av fisk som lider av pankreassykdom, (b) ko-dyrking av påvirkede vev med Chinook lakse-embroceller, (c) føring av ko-dyrkede celler gjennom Chinook lakse-embroceller, (d) isolering av viruspartiklene.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at påvirkede vev er pankreas eller nyre, og ko-dyrking med Chinook lakse-embroceller foregår i omtrent 28 dager.

10. Fremgangsmåte for diagnostisering av fiskepankreassykdom, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: (a) kontakting av en testprøve med et diagnostisk reagens ifølge hvilket som helst av kravene 5 til 7, for å produsere et reagenskompleks; (b) et eventuelt vasketrinn; og (c) bestemme nærværet, og eventuelt konsentrasjonen av nevnte reagenskompleks og dermed tilstedeværelse eller mengden av virus i testprøven.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at testprøven er en blodprøve eller en prøve av det vannet hvor fisken er blitt oppnådd fra.