NO311219B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av et preparat med forbedret vitamin C-aktivitet - Google Patents

Abstract

Det beskrives en fremgangsmåte ved fremstilling av et preparat med forbedret vitamin C-aktivitet. Vitamin C-salter overføres partielt i tilsvarende aldonsyresalter (L-treonater, L-xylonater og L-lyxonater) ved oppvarming mellom 40 og 80°C under oksyderende betingelser.

Description

Denne oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for fremstilling av et preparat med forbedret vitamin C-aktivitet.

Mer spesielt vedrører oppfinnelsen fremgangsmåte for fremstilling av en blanding for forbedring av effektiviteten av visse terapeutisk aktive forbindelser. 1 preventiv eller helbredende medikamentterapi ønsker man vanligvis å etablere til å begynne med et fysiologisk effektivt nivå av et medikament eller annen terapeutisk aktiv forbindelse i det humane eller animalske vertslegeme, og deretter opprettholde dette effektive nivået i en lengre tidsperiode, ettersom det er nødvendig for å oppnå det ønskede fysiologiske resultat. En forbedring i enten absorbsjons-hastigheten ("opptakshastigheten") eller retensjonen (nedsettelse av ekskresjons-hastigheten) eller begge gir vanligvis viktige fysiologiske og terapeutiske fordeler. Det er også svært fordelaktig dersom uønskede bivirkninger av den terapeutisk aktive forbindelsen kan reduseres eller elimineres.

For til å begynne med å illustrere utførelse av og prinsipper for oppfinnelsen for spesialister på området, vil oppfinnelsen nå bli beskrevet med referanse til anvendelse av oppfinnelsen til forbedring av vitamin C terapien.

Tidligere forskere har identifisert over 300 forskjellige metaboliske meka-nismer hvori vitamin C er involvert i fysiologiske reaksjoner. Disse mekanismene rangerer fra den antiscorbutiske virkningen som først ble observert av Dr. Robert Lind i 1740 til de mer nylig oppdagede antioksydant friradikal eliminerende omsetningene, til ko-reaksjon med enzymer ved dannelse av kollagen, understreking av energimetabolismen i de polynukleære leucocyttene og befordring av jern-absorbsjonen.

De kliniske virkningene av slike metaboliske reaksjoner er blitt bredt aner-kjent og rapportert. For eksempel antas den friradikal eliminerende virkningen å gjøre kroppen i stand til å omdanne carcinogener til ikke-toksiske derivater som elimineres i urinen, og derfor å forbedre virkningene av røyking og eksponering for andre miljømessige forurensninger og temperaturekstremer. Dyrestudier har vist at kroppsenzymer omdanner askorbater til oksydasjonsprodukter som har demonstrert inhibering av tumorvekst.

Det er derfor liten vitenskapelig tvil om at etablering og vedlikehold av et effektivt nivå av vitamin C og dets derivater i menneskekroppen gir viktige helse-fordeler. Tilstedeværelsen av vitamin C i betydelig konsentrasjon er blitt observert i binyrene, ovariene, hjernen, hypofysen, leveren, milten, blodlegemer, blodserum, og ekstracellulære lungevæsker.

De fleste dyr har et leverenzym som setter dem i stand til virkelig å fremstille vitamin C in situ ved omdanning av blodsukker til askorbinsyre. Mennesket har imidlertid ikke dette enzymet. Som en konsekvens må det vitamin C som kreves av menneskekroppen for de ulike metaboliske reaksjoner diskutert ovenfor, tas inn med menneskets føde. Videre har det menneskelige legemet ikke evnen til å lagre vitamin C. Dersom det er umetabolisert, blir det skilt ut igjen. Et lavt nivå av vitamin C og dets derivater i det menneskelige legemet frembringer forskjellige uønskede fysiologiske responser, og et ekstremt lavt nivå frembringer ekstreme responser som kan føre til død, f.eks. fra skjørbuk. Helt bortsett fra disse "normale" behovene for vitamin C, er det viktig i noen terapeutiske tilfeller å etablere og opprettholde høyere enn normalt vitamin C nivå i kroppen. Disse overnormale konsentrasjonene er vanskelig å etablere og oppretthold fordi det menneskelige legeme har bare en viss toleranse for vitamin C (askorbinsyre) med resulterende diaré og andre sidereaksjoner, så som mageirritasjon og betennelse dersom disse toleransene overskrides.

Det er nå oppdaget fremgangsmåter for fremstilling av et preparat med forbedret vitamin C-aktivitet. Preparatet forbedrer av effektiviteten, dvs. etablering og/eller vedlikehold av kroppens nivå av terapeutisk aktive forbindelser som vanligvis blir eliminert fra kroppen uten metabolisme via nyrenes tubulære sekre-sjonsmekanisme for organiske anioner. Slike terapeutisk aktive forbindelser har en molekylvekt under omlag 5.000, har en syre funksjonell gruppe og en pKa på 6 ved fysiologisk pH = 7,4. Blandingene som fremstilles ifølge oppfinnelsen omfatter slike terapeutisk aktive forbindelser og i det minste en forbindelse valgt fra gruppen bestående av L-threonin-, L-xylonin- og L-lyxoninsyre, og de ikke-toksiske spiselige saltene, aldon-laktonene og aldon-laktidene derav.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig fremgangsmåte ved fremstilling av et preparat med forbedret vitamin C-aktivitet, kjennetegnet ved at vitamin ek-salter partielt overføres til tilsvarende aldonsyresalter (L-treonater, L-xylonater og L-lyxonater) ved en oppvarming til mellom 40 og 98°C under oksyderende betingelser.

Reaksjonstemperaturen som anvendes er fortrinnsvis 60-80°C.

Det er mulig å administrere en fysiologisk effektiv dose av denne blandingen til et menneske eller et dyr.

Det er videre mulig at aldonforbindelsen administreres i et første trinn for å etablere et effektivt nivå derav i kroppen, og deretter administreres den terapeutisk aktive forbindelsen.

Som anvendt heri skal uttrykket "forbindelse som har vitamin C-aktivitet" bety vitamin C (L-askorbinsyre) og et hvilket som helst derivat derav som viser anti-scorbutisk aktivitet. Slike derivater omfatter f.eks. oksydasjonsprodukter så som dehydroaskorbinsyre og spiselige salter av askorbinsyre så som eksempelvis kalsium-, natrium-, magnesium-, kalium- og sinkaskorbater, estere av vitamin C med organiske og uorganiske syrer, f.eks. L-askorbinsyre 2-O-sulfat, L-askorbinsyre 2-O-fosfat, L-askorbinsyre 3-O-fosfat, L-askorbinsyre 6-heksadecanoat, L-askorbinsyre monostearat, L-askorbinsyre dipalmitat, o.l.

Metaboliter av askorbinsyre og dens derivater omfatter aldoninsyre, aldon-laktonene, aldonlaktidene og de spiselige saltene av aldoninsyrene. Som det vil fremgå karakteriseres blandingene som fremstilles ifølge den foreliggende oppfinnelse ved tilstedeværelse av i det minste en eller flere av disse metabolitene tilsvarende tre spesielle aldoninsyrer: L-threoninsyre, L-xyloninsyre og L-lyxoninsyre.

Aldon-laktonene har strukturformelen

hvori R er hydrogen eller -CH-OH og n = 1 til 3.

Tilstedeværelsen av en eller flere av disse metabolitene i blandingene som fremstilles ifølge oppfinnelsen er både en grei måte til å identifisere slike blandinger på, og er også nødvendig for å oppnå det ønskede resultat, forbedring i absorpsjon og/eller retensjon av vitamin C eller en annen terapeutisk aktiv forbindelse.

En egnet fremgangsmåte for fremstilling av den forbedrede vitamin C blandingen omfatter oppvarming av L-askorbinsyre med en ikke-toksisk metall-forbindelse, f.eks. kalsiumkarbonat, natriumhydrogenkarbonat o.l., under oksyderende betingelser ved forhøyet temperatur, f.eks. 40-89°C, for å omdanne en betydelig del av askorbinsyren til dens tilsvarende salt, f.eks. kalsium- eller natriumaskorbat og tørking av reaksjonsblandingen slik at det fremkommer et fast produkt med i alt vesentlig nøytral pH (f.eks. 6,0 - 7,5). Fortrinnsvis anvendes et svakt støkiometrisk overskudd av metallsaltreaktanten. Det resulterende produktet har en jodaskorbat analyse i området 50-480 mg/ 500 mg prøve avhengig av prosess-parametere, slik at den høyere askorbataktiviteten foretrekkes av praktiske grunner. Lengre oppvarming ved oksyderende betingelser frembringer lavere jodaskorbat-analyser.

Blandingene som fremstilles ifølge oppfinnelsen viser seg å kunne anvendes til administrering av vitamin C til pasienter som har lav askorbinsyretoleranse. Særlig er pasienter som har tendens til å danne nyrestein spesielt utsatt for vanske-ligheter ved inntak av askorbinsyre og deres vanlige derivat, kalsiumaskorbat, som gir forhøyet oksalat nivå i urinen. Det er indikasjoner på at blandingene som fremstilles ifølge den foreliggende oppfinnelse kan administreres uten å øke oksalatnivået i urinen til det nivået som er vanlig når det anvendes blandinger og fremgangsmåter ifølge tidligere teknologi. Disse blandingene er spesielt egnet som et middel til å etablere og opprettholde et adekvat askorbatnivå i kroppen hos slike subjekter som har tendens til nyrestein. Vitamin C blandingene som fremstilles ifølge oppfinnelsen kan også anvendes ved behandling av betennelsessykdommer, så som arthritis.

Effektiviteten av aldoninforbindelsene til å forbedre absorpsjonen, toleransen og/eller retensjonshastighetene for vitamin C forbindelser er også generelt anvendbar for forbedring av slike egenskaper hos terapeutisk aktive forbindelser som har en molekylvekt under omlag 5.000, og som har en syrefunksjonell gruppe og pKa< 6. De fysiologiske mekanismene som er ansvarlige for disse forbed-ringene, synes å være inhibering av normal eliminering av slike umetaboliserte terapeutisk aktive forbindelser fra kroppen via nyrenes tubulære sekresjons-mekanisme for organiske anioner og den forbedrede absorpsjon av disse komponentene gjennom celleveggene i kroppsvevet. Aldoninforbindelsene virker åpenbart slik at de gir både forbedret absorpsjon og inhibering av nyrenes utskillingseffekt. En generell beskrivelse av de forskjellige sekresjonsmekanismene i nyrene inne-holdes i artikkelen av Hirsch og Hook, Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics (vol. 171, p 103 (1970)).

Den mengden av aldoninforbindelsen som er nødvendig i blandingene som fremstilles ifølge oppfinnelsen er en terapeutisk effektiv andel. Den nøyaktige mengden vil variere noe avhengig av den presise karakteren av den terapeutisk aktive forbindelsen og andre faktorer som vil forekomme for spesialister på området. Vanligvis blir den reduserte nyresekresjonshastigheten og/eller økte absorpsjonshastigheten i kroppen noe forbedret ved endog svært små mengder av aldoninforbindelsene. Disse egenskapene vil bli forbedret ved å øke andelene av aldoninforbindelsen, og den øvre grensen blir fastsatt ved praktiske betraktninger så som å unngå utilbørlig fortynning av den terapeutisk aktive bestanddelen til det punktet at en tilfredstillende minimumdosering ikke blir administrert. Ifølge den beste aktuelle informasjon, kan andelen av aldoninforbindelsen i blandingene som fremstilles ifølge oppfinnelsen variere fra mindre enn 1 vekt% til 24 vekt%. Praktiske terapeutiske virkninger er blitt observert ved konsentrasjoner av aldoninforbindelsen i området omkring 0,10 vekt%, og det her foretrukne området er omlag 1 vekt% til omlag 7 vekt% av aldoninforbindelsen.

Blandingene kan fremstilles ved enkel fysisk sammenblanding av komponentene i blandingene. I tilfelle vitamin C kan blandingene alternativt fremstilles in situ ved de teknikkene som er illustrert i arbeidseksemplene.

I tegningene er:

Fig. 1 et histogram av eksperimentelle data som beskriver forbedringen i absorpsjon/retensjonshastighet for aspirin; Fig. 2 en tidsprofil for serum-salicylat, som illustrerer slike forbedringer; Fig. 3 en tidsprofil for plasma piroxicam som beskriver forbedring i absorpsjon/retensjon av piroxicam som skriver seg fra administrering av kombinasjonen piroxicam-adonin-blandingen; Fig. 4 en lignende tidsprofil for plasma piroxicam som beskriver forbedringen i absorpsjon/retensjon av piroxicam som skriver seg fra sekvensiell administrasjon av aldonin- og piroxicamkomponentene; Fig. 5 en beskrivelse av det forbedrede opptaket av askorbinsyre av 3T3 fibroblaster som skriver seg fra inklusjon av aldoninkomponenten.

De følgende eksemplene er gitt med det formål å illustrere praktiseringen av oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1

Til en 80 gallon (300 liter) dampoppvarmet reaksjonsbeholder av rustfritt stål ble tilsatt 60 Ibs (27 kg) varmt vann (44°C). Askorbinsyre - U.S.P., 110,23 Ibs (50,00 kg) ble tilsatt i en porsjon til det varme vannet. Den resulterende vellingen ble mekanisk omrørt og oppvarmet med damp (trykk 15 p.s.i = 103 kPa) inntil en temperatur på 70°C ble oppnådd.

Til den vandige vellingen av askorbinsyre ble tilsatt 23 Ibs (10,4 kg) kalsiumkarbonat. Den trinnvise tilsetningen av karbonatet krevde 3-4 minutter. Reaksjonsblandingen syntes grå i farge, og pga. utvikling av CO2 var det mye skumming. Etter 8 minutters omrøring, hadde det meste av skummingen opphørt og reaksjonsblandingen syntes rødbrun i farge. Temperaturen på løsningen var 80°C. Omrøring og oppvarming ble fortsatt i 15 minutter inntil temperaturen på reaksjonsblandingen nådde 98°C hvor den ble holdt i ytterligere 20 minutter, hvoretter ytterligere 8,25 Ibs (3,75 kg) kalsiumkarbonat ble tilsatt, under omrøring. Etter at skummingen opphørte ble reaksjonsblandingen deretter pumpet til en dampoppvarmet dobbelt trommel-tørker (overflatetemperatur omlag 250°F = 121°C). Pumpetørketrinnet krevde 35 minutter. Det tørkede produktet var lysebrunt av farge og utbyttet var omlag 120 Ibs (54,5 kg) av produktet.

Eventuelt kan luft bobles gjennom reaksjonsblandingen for å befordre omsetningen av askorbinsyren.

Analyser ble utført øyeblikkelig på 5,00 g prøver oppløst i 500 ml destillert vann.

Det materialet som ble oppsamlet under tørkeprosessen viste 400 mg vann-fritt kalsiumaskorbat pr. 500 mg ved standard jod-titreringsteknikk. Den samme vandige løsningen viste pH 7,0.

EKSEMPEL 2

Det følgende eksempel beskriver kliniske tester for sammenligning av produkter fra eksempel 1 (testmaterialet) med L-askorbinsyre og sitronsyre (placebo), ved måling av askorbat-nivået i serum og intracellulært, askorbat-utskillingen og oksalat-ekskresjonen i urinen på forskjellige tidspunkter etter inntak av standard doser av testen, L-askor-binsyre og placebo.

Sammendrag av protokollen

Tolv menn i alderen 27 til 45 ble studert.

Alle ble instruert om at de skulle være på en lav vitamin C diett i en uke før studien (ingen sitrusprodukter og ingen store mengder grønnsaker med grønne blad).

Etter faste over natten ble tatt blod- og 24 timers urinprøver. Askorbat- og oksalatnivået i hvite blodlegemer og 24 timers urin ble bestemt og korrelert med askorbatnivået i serum.

De 12 menn ble delt i tre grupper, og ble gitt følgende supplement:

(a) Testgruppe: 4000 mg<*> pr. dag av produktet eks. 1. ;(b) Askorbatgruppe: 3000 mg L-askorbinsyre pr. døgn (c) Sitronsyregruppe: 3000 mg sitronsyre pr. døgn. ;<*> 4000 mg er ekvivalent i askorbat (jodtest) med 3000 mg L-askorbinsyre.

Alle 12 fortsatte på lav vitamin C diett. Blodprøver ble tatt etter 0, 4, 8 og 24 timer etter morgeninntak av de angitte tilskuddene. Askorbat- og oksalatnivået ble bestemt i 24 timers urin.

Etter en utvaskingsperiode (varierende fra to døgn til flere døgn pga. arbeids-situasjonen for deltagerne), ble gruppene satt på andre tilskudd, som følger:

(a) Testgruppen til sitratgruppen.

(b) Sitratgruppen til askorbatgruppen.

(c) Askorbatgruppen til testgruppen.

Tilskuddene ble tatt på samme nivå (4000 mg av eks. 1 produkt, 3000 mg av L-askorbinsyre og 3000 mg sitronsyre) av alle tre gruppene. Blodprøvene ble igjen tatt etter 0, 4, 8 og 24 timer fra tiden for inntak. 24 timers urin ble også oppsamlet av alle 12 deltagerne ved slutten av perioden. Alle prøvene ble atter analysert på sine respektive konsentrasjoner av askorbat- og oksalatnivå.

Analytiske metoder

De analytiske metodene som ble anvendt er beskrevet i: Clinical Chemistry, Principles and Techniques, utgitt av Richard J. Henry, Donald D. Cannon og James W. Windelman, Harper og Row, 1974 p. 1393-1398.

Standard Method of Clinical Chemistry, J. S. Row, utgitt av Seligson D. New York, Academic Press, 1961, Vo. 3, p. 35.

For bestemmelse av oksalat i 24 timers urin blir en aliquot av urinen rystet med et adsorpsjonsmiddel som selektivt binder oksalatet. Den ekstraherte urinen blir kastet, og oksalatet eluert fra adsorpsjonsmiddelet med fortynnet alkali.

Oksalat oksyderes til hydrogenperoksyd og karbondioksyd av oksalat-oksydase. Hydrogenperoksydet reagerer med 3-metyl-2-benzotiozolinonhydrazon (MBTH) og 3 (dimetylamino)-benzosyre (DMAB) i nærvær av peroksidase for å gi et indaminfargestoff med en maksimum absorbans ved 590 nm.

Testen for oksalat i urin er videre beskrevet i følgende referanser: Hodgekinson, A.: Oxalic Acid in Biology and Medicin, Academic Press, New York, 1977.

Robertson, W.D.; Chrystowsky, G.A.: Urinary Oxalate Excretion by Main Following Ascorbine Acid Ingestion, Prog. Soc. Exp. Bil. Med. 85:190, 1954.

Costello, J.: The Effect of Ascorbic Acid on Oxalate Metabolism in Human Biochemistry and Clinical Pathology, utgitt av G.A. Rose, W.G. Robertson og R.W.E. Watts, proceedings fra et internasjonalt møte i London 1971, pp. 270-273.

Resultatene av denne kliniske studie er fremsatt nedenfor:

Konklusjonene som ble trukket av denne studien er:

Asknrhatnivå i serum:

Etter 4, 8 og 24 timer og 7 døgn senere hadde test-gruppene høyere askorbatnivå i serum enn sammenlignet med både sitratgruppen og L-askorbinsyregruppen. Asknrhatnivå i hvite blodlegemer: Selvom alle gruppene med askorbat i hvite blodlegemer etter 8 timer viste en gjennomsnittlig reduksjon, hadde testgruppen den minste prosentvise reduksjonen. Måling etter 4 timer og 24 timer pluss nivået på den 7. dagen viste at testgruppen var i stand til å beholde det høyeste askorbatnivået i hvite blodlegemer.

Askorhat i hvite blodlegemer etter 24 timer:

24 timer etter forskjellige belastninger av: sitrat, L-askorbinsyre og test gir lignende resultater. Både sitratgruppen og L-askorbinsyregruppen viste en reduksjon i askorbatnivået i hvite blodlegemer. Testgruppene beholdt et mye høyere nivå sammenlignet med basislinjen.

7 døgn etter belastning med T.- askorhinsyre og test:

Gjennomsnittlig prosentvis forandring av askorbat i hvite blodlegemer er fremdeles høyere i testgruppen enn i L-askorbinsyregruppen.

Askorbatutskilling i 74 timers urin:

Testgruppene hadde lavere askorbatutskilling enn sitrat- og L-askorbat-gruppene.

Askorbatutskilling i 7 døgns - 7. 4 timers urin

Testgruppene har lavere askorbatutskilling enn sitrat- og L-askorbat-gruppene.

Oksfllflt ntskilling i 74 timers urin

Oksalatutskillingen er svært redusert i testgruppen sammenlignet med askorbinsyregruppen. Dette betyr at når man tar testprodukt som tilskudd, har man mindre sjanse til å danne oksalatholdige nyresten enn når man tar L-askorbinsyre.

Oksalatntskilling etter 7 døgn og etter 7. 4 timer:

Forlenget supplementering med testprodukt fører til lavere ekskresjon av oksalat i urinen enn tilskudd med L-askorbinsyre.

EKSEMPEL 3

Til et 2-liters reaksjonskar utstyrt med rører og termometer blir tilsatt 30 ml destillert vann og 440 g (2,5 mol) L-askorbinsyre. Til denne omrørte vellingen tilsettes findelt kalsiumkarbonat porsjonsvis med en slik hastighet at det gir konstant utvikling av karbondioksyd (biprodukt av omsetningen), mens reaksjonstemperaturen holdes ved omlag 20°C. Tilsetningen av kalsiumkarbonat opphører etter at omlag 25 g til 37,5 g er blitt tilsatt (hvilket tilsvarer fra omlag 20 % til 30 % av det som er nødvendig for fullstendig omsetning med den tilsatte L-askorbinsyre).

På dette stadiet heves temperaturen til 80°C. Man begynner ytterligere tilsetning av kalsiumkarbonat idet temperaturen holdes i området 60 til omlag 70°C. Den totale mengden av kalsiumkarbonat som tilsettes er 125 g (1,25 mol).

Reaksjonsblandingen overføres til en grunn beholder som holdes ved en temperatur på mellom 60 og 80°C i en periode på fra 12 til 36 timer, hvorunder pH i blandingen stiger til et pH-område på 6,0 til 7,0. På dette stadium fjernes overskudd av vann under vakuum.

De tørre produktene er lyse brune av farge og løser seg lett i vann, med unntak av ureagert kalsiumkarbonat, og gir nøytrale løsninger.

EKSEMPEL 4

Kliniske studier ved bruk av produktet fra eks. 3 gir lignende resulater som dem som er fremsatt i eks. 2.

EKSEMPEL 5

Produktene fra eksemplene 1 og 3 blir underkastet kvalitativ analyse som følger: Etter frafiltrering av overskudd av uløselig kalsiumkarbonat, ble kalsiumaskorbat fjernet fra produktet ved kromatografi, og residuet ble underkastet kjerne-magnetisk resonans-spektroskopi. Det ble utformet sansynlige muligheter for komponentenes strukturer bestemt ved spektroskopi, og disse autentiske forbindelsene ble deretter syntetisert. Etter at nmr-spektra for disse autentiske forbindelsene var fremstilt, ble de sammenlignet med nmr-spektra for testprøvene. Sammenfall av disse spektra ble brukt til å identifisere komponentene i testprøvene.

De anvendte teknikkene var 1H og 13C nmr. De identifiserte saltene av aldoninsyren er kalsiumsaltene av L-threoninsyre, L-xyloninsyre og L-lyxoninsyre.

EKSEMPEL 6

Fremgangsmåtene fra eks. 1 blir gjentatt, med unntak av at den reaktanten som tilsettes til askorbinsyren, blir forandret for å gi tilsvarende forskjellige salter av askorbinsyre som er ikke-toksiske og spiselige i rimelige mengder.

Ke. aktant Sali

Natriumhydrogenkarbonat Natriumaskorbat Magnesiumkarbonat Magnesiumaskorbat Kaliumhydrogenkarbonat Kaliumaskorbat

Zinkoksyd Zinkaskorbat

Disse produktene inneholder aldoninsyresaltene tilsvarende dem som er identifisert i eks. 5.

EKSEMPEL 7

Det gjennomføres kvantitativ analyse av produktene fra eks. 1,4 og 6. Produktene har de viste sammensetningene:

Aldoninsyrederivatene omfatter derivater av den viste syren i de følgende omtrentlige mengdeforhold i residuet ovenfor.

Det er indikasjoner på at noen av en eller flere av disse aldoninsyrene kan bindes til hverandre eller til askorbater, eller at askorbater kan bindes sammen.

EKSEMPEL 8

Studier over dyreforing med produktet fra eks. 1 gir lignende resultater som studiene med mennesker i eks. 2.

EKSEMPEL 9

Fremgangsmåtene i eks. 2 blir gjentatt, med unntak av at testproduktet syntetiseres ved å blande kalsiumaskorbat av reagenskvalitet med:

Test A - threoninsyre (kalsiumsalt)

Test B - xyloninsyre (kalsiumsalt)

Test C - lyxoninsyre (kalsiumsalt)

i de samme vektforhold som komponentene funnet i eks. 7.

Man gjentar testene i eks. 2 ved anvendelse av disse testforbindelsene, og bruk av rent kalsiumaskorbat som ytterligere kontroll.

Disse testene bekrefter at den fysiologiske aktiviteten av det blandede askorbataldoninsyreproduktet skyldes aldoninkomponenten, og at hvilken som helst av disse aldoninkomponentene forårsaker den på samme måte forbedrede absorpsjon og retensjon av vitamin C komponenten.

EKSEMPEL 10

Dette eksempelet belyser praktiseringen av oppfinnelsen til å forbedre absorpsjonen/retensjonen av aspirin.

Seksten albinorotter av Wistarstammen, åtte hanner (242-333 g) og 8 hunner (295-345 g) ble aklimatisert i syv døgn før denne studien ble startet. I løpet av denne perioden ble rottene gitt Purina (R) Rodent Chow, fikk vann ad lih og levde i selvrensende bur av rustfritt stål. Dyrerommet ble holdt ved 70 ± 2°F (21 ±1°C), 60-80 % relativ fuktighet, og hadde en fotoperiode på 12 timer lys - 12 timer mørke.

Rottene ble vilkårlig uttatt til to grupper på 8 dyr hver (4 hanner og 4 hunner) og plassert i metabolismebur. Gruppe A fikk U.S.P. aspirin i 54 mg/kg i 2,0 ml destillert vann gjennom sonde. Gruppe AM fikk U.S.P. aspirin i 54 mg/kg + kalsiumthreonat, (en metabolit av askorbinsyre) i 15 mg/kg i 2,0 ml destillert vann, også gjennom sonde. Blodprøver ble tatt ved 1, 2, 3 og 4 timer etter dosering for salicylatanalyse i serum.

Urin ble oppsamlet dersom den var avgitt ved de samme tidspunktene, også for salicylatanalyse. I et forsøk på å maksimalisere urinproduksjonen ble rottene gitt ytterligere vann ved 1, 2, 3 og 4 timer gjennom sonde. (3 ml).

Blod og urin ble oppsamlet og analysert ifølge Natlesons metode (Natelson, S. Techniques of Clinical Chemistry, 3. utg. p. 649, Charles C. Thomas, utgiver

(1971)). Studien ble avsluttet etter tidspunktet for 4 timers oppsamlingen.

All statistikk ble beregnet ved hjelp av dataprogrammer fra Statistical Analysis System (SAS Institute, Inc., Box 8000, Cary, NC 27511). ANOVA prosedyren (repeated measures model) ble brukt til å bestemme forskjeller i salicylatkonsentrasjoner mellom grupper.

Tabell 1 viser de virkelige salicylatkonsentrasjonene i serum for hvert dyr i både gruppe A og AM, på hvert prøvetakingstidspunkt. Gjennomsnittsverdiene (X) og standard avviket (SD) er gitt for hver gruppe og tidspunkt. Figur 1 er et histogram av de data som er gitt i tabell 1. Signifikansnivået (P) for forskjellene mellom de to gruppene på hvert prøvetakingstidspunkt i salicylatkonsentrasjonen i serum er gitt etter hvert sett av histogrammer. Figur 2 er tidsprofilen for serumsalicylat for begge grupper av rotter, standardavviket er tatt med. Den initiale opptaksraten (gastrointestinal) blir beregnet ut ifra den lineariserte kurven i den første timen etter dosering. Data for salicylat i urinen er ikke gitt i detalj, men vil bli diskutert nedenfor. Gruppene er ikke brutt ned i hanner og hunner, fordi det ikke er noen signifikant forskjell i serumsalicylat i forhold til dyrets kjønn.

Det er åpenbart fra disse data at AM gruppen hadde et mye høyere initial-opptak eller absorpsjon av U.S.P. aspirin. Denne gruppen hadde en opptaksrate på 11,76 mg/time, mens A gruppen hadde en mye lavere opptaksrate på 4,40 mg/time. Kurven for AM-gruppen har to faser, hvilket indikerer to prosesser. Den første delen av kurven gjelder opptak eller absorpsjon i mage-tarmkanalen. Det er et aksellerert opptak i AM gruppen sammenlignet med A gruppen, og dette er åpenbart ut i fra de respektive serumprofilene. Den andre delen av kurven gjelder forde-lingen til andre legemsdeler og utskillingen i nyrene. Forskjellen mellom kurvene på dette punktet (to timer) skyldes mest sansynlig redusert salicylatekskresjon fra nyrene i AM gruppen (U.S.P. aspirin + aldonin). Denne gruppen synes å nærme seg en steady state konsentrasjon av salicylat ved et høyere nivå enn U.S.P. aspirin gruppen som er avtagende på dette tidspunktet.

Elimineringshastigheten for de to gruppene er signifikant forskjellig. Elimineringshastigheten for plasmakonsentrasjonen i A gruppen (beregnet ut i fra log til toppen) er 1,30 mg/time, mens AM gruppen har 0,05 mg/time. Denne elimineringshastigheten er omlag 26 ganger høyere når metabolitten ikke er tilstede.

Salicylatanalyser i urin har en tendens til å vise at mindre salicylat ble skilt ut over tid i AM gruppen i forhold til A gruppen. I den første timen etter dosering var inn-holdet i A gruppens urin omlag 9,1 mg% og i AM gruppen 5,0 mg%. Dette er overenstemmende med det høyere serum nivået i AM gruppen og lavere nivå i A gruppens serum.

Resultatene bekrefter at tilstedeværelse av metabolitten øker aspirin-absorpsjonen til å begynne med, idet den virker lokalt på epitelcellene i mage/tarmkanalen. Ettersom metabolitten selv blir absorbert og øker konsentrasjonen i blodet, vil den ha en inhiberende virkning på nyrene. Denne virkningen fører til den nedsatte utskillingen av aspirin ved nyremekanismene. Det ventes en forsinkelse inntil inhiberingen av nyreutski 11 ingen er etablert, og dette reflekteres i nedgangen i AM profilen ved 2 timer. Oppsvinget mellom 2-3 timer skyldes da inhiberingen av nyreutskillingsprosessen og fortsatt absorpsjon.

Det økte salicylat nivået i serum i AM gruppen er mer et resultat av redusert ekskresjon, heller enn øket opptak. Opptakshastigheten for AM var 2,67 ganger høyere enn opptakshastigheten for A. Elimineringshastigheten for AM var imidlertid 26 ganger mindre enn for A gruppen. Den reduserte nyreekskresjonen hadde derfor større betydning for å holde ved like salicylatnivået i serum over tiden, enn øket opptakshastighet.

De foregående testene viser at tilsetningen av aldoninforbindelsen ikke bare øker absorpsjonshastigheten for aspirin, men også inhiberer nyrenes transportsystem for organisk anion. Dette fører til at aspirin nivået i blod kan opprettholdes i en lengre tidsperiode ved å redusere elimineringshastigheten via den sekresjons-prosessen som foregår i nyrenes proksimale tubuli.

EKSEMPEL 11

180 hunder av varierende rase og alder ble gitt 3X30 mg/kg av produktet fra eks. 1. Alle disse hundene led av bevegelsesforstyrrelser.

Virkningen av tilskuddene ble målt ved forandringer i de virkelige symptomene, slik som de ble oppfattet ved ny klinisk evaluering samt eierens rapport om dyrenes tilstand. Virkningen ble målt 7 døgn etter at tilskuddet ble gitt, og deretter igjen etter 6 uker. Den siste evalueringen var etter mer enn 6 måneder.

Diagnosegrupper:

Flere forskjellige lidelser ble behandlet, både akutte og kroniske. Ved akutte sykdommer hvor symptomene forandrer seg raskt, er det vanskelig å skille mellom virkningene av de gitte tilskudd og andre faktorer. Denne testet studerte derfor bare lidelser som har en kjent årsak som blir permanent, hvor symptomene hadde vært stabile over en tidsperiode og hvor man ville anta at de ville fortsette uten at det ble gitt tilskudd. Det ble valgt dyr med følgende kroniske lidelser: leddskader med sekundære permanente forandringer, arthrose, spondylose, hoftedysplasi, eldre skiveprolaps med sekundære permanente forandringer, muskelatrofi som resultat av nedsatt funksjon og senile slitasjeforandringer i understøttelses- og bevegelses-ystemet. 100 hunder kvalifiserer under kriteriene ovenfor. Alder eller rase ble ikke tatt i betraktning i denne rapporten.

Spondylose og ryggprolaps:

Dette eksempelet viser at produktet fra eks. 1 gitt oralt, gir symptomatisk lindring av smerten ved kroniske deformerings-forandringer i ledd- og skjelett-systemet i de fleste tilfellene i denne gruppen av pasienter. Hverken kalsiumaskorbat alene eller L-askorbinsyre alene gir slik lindring.

EKSEMPEL 12

10 albinorotter av Wistarstammen, hanner (375-411 g), ble aklimatisert i

7 døgn før undersøkelsen ble påbegynt. Under denne perioden ble rottene foret med Purina (R) Rodent Chow, fikk vann ad lih og levde i selvrensende bur av rustfritt stål. Dyrerommet ble holdt ved 70 ± 2°F (21 ± 1°C), 60-80 % relativ fuktighet, og hadde en fotoperiode med 12 timer - 12 timer lys-mørke.

Rottene ble vilkårlig utplukket til to grupper på 5 hver og plassert i Nalgene (R) bur. Gruppe A fikk U.S.P. Piroxicam i 0,6 mg/kg, og gruppe AM fikk U.S.P. Piroxicam i 0,6 mg/kg pluss kalsium threonat i 15 mg/kg gjennom sonde. Plasma-prøver ble tatt ved 4, 6, 8 og 10 timer etter dosering for Piroxicam analyse i plasme.

Selektiv HPLC ble anvendt for å analysere Piroxicam, og disse data ble analysert via SAS. ANOVA repeated measures procedures ble brukt til å bestemme forskjellene i Piroxicam-konsentrasjonene i plasma mellom gruppene.

Tabell 4 viser de aktuelle plasmakonsentrasjonene for hvert dyr i gruppe A og AM ved hver prøvetakingstid. Gjennomsnittsverdiene (X) for hver gruppe og tid er gitt. Figur 3 er plasmaprofilen for de data som er gitt i tabell 4.

Den begynnende stigningen i plasmanivået for Piroxicam er betydelig større i AM gruppen sammenlignet med A gruppen. Det er en to gangers økning i topp-nivået for Piroxicam i plasma i AM gruppen ved 4 timer. Deretter begynte dette nivået å synke gjennom 6-timers punktet og nærme seg A gruppen ved 8 timer. AM nivået i plasma begynner imidlertid å stige igjen etter 8 timer. Det synes som det er en virkning av threonatet på Piroxicamnivået i plasma. Statistiske forskjeller ble funnet å være p.< ,07 over 10 timers perioden. Dette er en sterk indikasjon på at det finner sted en threonateffekt.

EKSEMPEL 13

Ti albinorotter av Wistarstammen, hanner (420-456 g), ble aklimatisert i

7 døgn før undersøkelsen ble begynt. Under denne perioden ble rottene foret med Purina (R) Rodent Chow, fikk vann ad lih og levde i selvrensende bur av rustfritt stål. Dyrerommet ble holdt ved 70 ± 2°F (21 ± 1°C), 60-80 % relativ fuktighet, og hadde en fotoperiode på 12 timer - 12 timer lys -mørke.

Rottene ble vilkårlig oppdelt i 2 grupper med 5 i hver. Rottene i gruppe A fikk daglig i 3 døgn 1,0 ml destillert vann gjennom sonde før undersøkelsen begynte. Rottene i gruppe AM fikk daglig gjennom sonde 15 mg/kg/ml kalsiumthreonat også i 3 døgn. Threonatdoseringene ble korrigert daglig for økning i kroppsvekten, for å sikre at dosen på 15 mg/kg ble opprettholdt.

På dag 4 fikk gruppe A rottene 0,6 mg/kg Piroxicam gjennom sonde, og gruppe AM rottene fikk 0,6 mg/kg Piroxicam og 15 mg/kg threonat. Plasmaprøver ble tatt ved 4, 6, 8 og 10 timer etter dosering for Piroxicamanalyse i plasma.

Selektiv HPLC ble brukt til å analysere Piroxicam. Disse data ble analysert statistisk ved SAS prosedyren. ANOVA repeated measures procedure ble anvendt til å bestemme forskjellene i Piroxicam-konsentrasjonen i plasma mellom gruppene.

Tabell 5 viser de aktuelle Piroxicam konsentrasjonene i plasma for hvert dyr i gruppene A og AM (metabolitt forbehandling). Gjennomsnittsverdiene (X) for hver gruppe er gitt for hver tidsperiode. Figur 4 er plasmaprofilen konstruert ut ifra de

data som er gitt i tabell 5.

Det viser seg ut i fra plasmaprofilene at AM forbehandlingsgruppen hadde signifikant høyere Piroxicam nivå i plasma enn ikke-behandlingsgruppen. AM gruppen hadde en høyere opptaks-hastighet og beholdt et høyere plasmanivå i løpet av 10 timers perioden. Forskjellen utgjør i gjennomsnitt omlag 60 % høyere plasmanivå i AM gruppen. Disse høyere nivåene er statistisk signifikante ved p.< 0,05.

Forbehandling med kalsiumthreonat økte signifikant og opprettholdt Piroxicamnivået i plasma (Feidene) over en ti-timers periode.

Gruppe A (ingen forbehandling), Dag 4-0,6 mg/kg U.S.P. Piroxicam Gruppe AM (forbehandling), Dag 1-3—15 mg/kg metabolitt;

Dag 4- 0,6 mg/kg

U.S.P. Piroxicam; 15 mg/kg threonat

EKSEMPEL 14

25 cm<3> T-flasker som inneholdt 3T3 fibroblaster fra mus ble inkubert med 100 mg% (1 mg/ml) kalsium L-threonat (pH 7,4) i 1 time ved 37°C. En kontroll-gruppe ble inkubert med Riner's som kontroll.

Inkuberingsfluidet ble fjernet, og 1,25 mg% askorbinsyre ble tilsatt til hver flaske. (5 ul av 14C-L askorbinsyre ble tilsatt, 10,0 mCi/mmol, 0,05 mCi/ml). pH ble justert til 7,62 og flaskene ble holdt ved 37°C i 20 minutter.

Flaskene ble deretter vasket med 4 ml HBSS(-), og ble deretter trypsinisert med 0,1 ml trypsin-EDTA i 5 minutter. Cellene ble oppslemmet igjen i 4 ml iskald HBSS(-) for å stanse den enzymatiske omsetningen. Cellene ble sentrifugert i 10 minutter ved 1000 G. Cellene ble deretter vasket og slemmet opp igjen i 4 ml HBSS(-). Cellene ble sentrifugert igjen (10 min., 1000 g), slemmet opp igjen i 1,0 ml destillert H2O og ultralydbehandlet i 90 sekunder.

0,5 ml av hver prøve ble brukt til telling av <14>C og 0,5 ml ble brukt for proteinanalyse ved anvendelse av Bradford-metoden.

Opptaket av <l4>C i cellene ble beregnet, og ga følgende resultater.

Opptaket av <l4>C-L-askorbinsyre var således 1,86 ganger større i cellene fra de flaskene som inneholdt threonatet enn i de cellene som inneholdt kontroll-løsningen. Disse resultatene er statistisk signifikante (Studenfs T-test, alfa = 0,05). Disse resultatene er vist grafisk i fig. 5.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av et preparat med forbedret vitamin C-aktivitet, karakterisert ved at vitamin C-salter partielt overføres til tilsvarende aldonsyresalter (L-treonater, L-xylonater og L-lyxonater) ved en oppvarming til mellom 40 og 98°C under oksyderende betingelser.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at reaksjonstemperaturen er 60-80°C.