NO20111275A1 - Fremgangsmate for a forbedre oljeutvinning fra et oljereservoar ved a anvende anriket anaerobt, stasjonaert mikrobielt konsortium - Google Patents
Fremgangsmate for a forbedre oljeutvinning fra et oljereservoar ved a anvende anriket anaerobt, stasjonaert mikrobielt konsortium Download PDFInfo
- Publication number
- NO20111275A1 NO20111275A1 NO20111275A NO20111275A NO20111275A1 NO 20111275 A1 NO20111275 A1 NO 20111275A1 NO 20111275 A NO20111275 A NO 20111275A NO 20111275 A NO20111275 A NO 20111275A NO 20111275 A1 NO20111275 A1 NO 20111275A1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- oil
- consortium
- stationary
- microbial
- reservoir
- Prior art date
Links
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 title claims abstract description 97
- 238000011084 recovery Methods 0.000 title claims abstract description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 76
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 10
- 239000003921 oil Substances 0.000 claims abstract description 208
- 239000010779 crude oil Substances 0.000 claims abstract description 68
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 68
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 claims description 67
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 claims description 65
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 62
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 40
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 31
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims description 30
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 30
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 claims description 28
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 241001464942 Thauera Species 0.000 claims description 21
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 19
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 17
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 14
- 239000003129 oil well Substances 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 11
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 11
- -1 iron ion Chemical class 0.000 claims description 11
- 241001277912 Rhodocyclaceae Species 0.000 claims description 10
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 claims description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 9
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 9
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 claims description 8
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 241001248479 Pseudomonadales Species 0.000 claims description 8
- 241000608961 Thauera aromatica Species 0.000 claims description 8
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims description 8
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 claims description 8
- 230000007797 corrosion Effects 0.000 claims description 8
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 claims description 8
- 241000249497 Brucellaceae Species 0.000 claims description 7
- 241000606126 Bacteroidaceae Species 0.000 claims description 6
- 241001430149 Clostridiaceae Species 0.000 claims description 6
- 241001425579 Deferribacterales Species 0.000 claims description 6
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 claims description 6
- 241000192735 Chloroflexaceae Species 0.000 claims description 5
- 241000589971 Spirochaetaceae Species 0.000 claims description 5
- 239000003876 biosurfactant Substances 0.000 claims description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 5
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 5
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 241000384514 Thauera chlorobenzoica Species 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 230000035699 permeability Effects 0.000 claims description 4
- 241001453268 Comamonas terrigena Species 0.000 claims description 3
- 241000212302 Marinobacterium georgiense Species 0.000 claims description 3
- 241000212300 Microbulbifer hydrolyticus Species 0.000 claims description 3
- 241001135642 Petrotoga miotherma Species 0.000 claims description 3
- 241000863432 Shewanella putrefaciens Species 0.000 claims description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 3
- DJHGAFSJWGLOIV-UHFFFAOYSA-K Arsenate3- Chemical compound [O-][As]([O-])([O-])=O DJHGAFSJWGLOIV-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- BZHJMEDXRYGGRV-UHFFFAOYSA-N Vinyl chloride Chemical class ClC=C BZHJMEDXRYGGRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229940000489 arsenate Drugs 0.000 claims description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 2
- 229940049920 malate Drugs 0.000 claims description 2
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000009736 wetting Methods 0.000 claims description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 claims 1
- 241001464944 Thauera selenatis Species 0.000 claims 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000008684 selective degradation Effects 0.000 claims 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 claims 1
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 64
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 61
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 60
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 51
- 101150037418 POG1 gene Proteins 0.000 description 47
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 42
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 31
- 108020001027 Ribosomal DNA Proteins 0.000 description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 26
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 25
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 22
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 21
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 20
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 18
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 17
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 16
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 16
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 15
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 14
- 241000192142 Proteobacteria Species 0.000 description 13
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 13
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 13
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 13
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 12
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 12
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 11
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 11
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 11
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 8
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 8
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 7
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 6
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 6
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 6
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 5
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 5
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 241000605059 Bacteroidetes Species 0.000 description 4
- 241001135755 Betaproteobacteria Species 0.000 description 4
- 241001142109 Chloroflexi Species 0.000 description 4
- 241001425580 Deferribacteraceae Species 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000425347 Phyla <beetle> Species 0.000 description 4
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 4
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 150000002826 nitrites Chemical class 0.000 description 4
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 4
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000000123 temperature gradient gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 4
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 3
- 101100310856 Drosophila melanogaster spri gene Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000589970 Spirochaetales Species 0.000 description 3
- 241001180364 Spirochaetes Species 0.000 description 3
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 3
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 238000003935 denaturing gradient gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 125000005575 polycyclic aromatic hydrocarbon group Chemical group 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000001847 surface plasmon resonance imaging Methods 0.000 description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 3
- PETRWTHZSKVLRE-UHFFFAOYSA-N 2-Methoxy-4-methylphenol Chemical compound COC1=CC(C)=CC=C1O PETRWTHZSKVLRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001558988 Anaerovorax Species 0.000 description 2
- 241000726110 Azoarcus Species 0.000 description 2
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002449 FKM Polymers 0.000 description 2
- 241001617393 Finegoldia Species 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000192128 Gammaproteobacteria Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589614 Pseudomonas stutzeri Species 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000012223 aqueous fraction Substances 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DIOQZVSQGTUSAI-UHFFFAOYSA-N decane Chemical compound CCCCCCCCCC DIOQZVSQGTUSAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- VCLJODPNBNEBKW-UHFFFAOYSA-N 2,2,4,4,6,8,8-heptamethylnonane Chemical compound CC(C)(C)CC(C)CC(C)(C)CC(C)(C)C VCLJODPNBNEBKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043268 2,2,4,4,6,8,8-heptamethylnonane Drugs 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091051 Arenine Natural products 0.000 description 1
- 241000606125 Bacteroides Species 0.000 description 1
- 241001674808 Biastes Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000191368 Chlorobi Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241001143296 Deferribacteres <phylum> Species 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 241000549556 Nanos Species 0.000 description 1
- 241000373064 Ochrobactrum oryzae Species 0.000 description 1
- 241000143294 Ochrobactrum sp. Species 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000206598 Synergistes Species 0.000 description 1
- 241000364021 Tulsa Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 241001148470 aerobic bacillus Species 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000004099 anaerobic respiration Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 230000032770 biofilm formation Effects 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000004098 cellular respiration Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 235000021321 essential mineral Nutrition 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000012526 feed medium Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000295 fuel oil Substances 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-L fumarate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)\C=C\C([O-])=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-L 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 239000006148 magnetic separator Substances 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-L malate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)C(O)CC([O-])=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007483 microbial process Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000006151 minimal media Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- JCXJVPUVTGWSNB-UHFFFAOYSA-N nitrogen dioxide Inorganic materials O=[N]=O JCXJVPUVTGWSNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 125000003367 polycyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 238000013442 quality metrics Methods 0.000 description 1
- JEGLJLCZRAWOBI-UHFFFAOYSA-N rac-1,2-di-O-dodecanylglycero-3-glutaric acid 6'-methylresorufin ester Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=C(C)C(OC(=O)CCCC(=O)OCC(COCCCCCCCCCCCC)OCCCCCCCCCCCC)=CC=C3N=C21 JEGLJLCZRAWOBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011946 reduction process Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 229940016590 sarkosyl Drugs 0.000 description 1
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 1
- 238000013515 script Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 150000003613 toluenes Chemical class 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 229930195735 unsaturated hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000002569 water oil cream Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K8/00—Compositions for drilling of boreholes or wells; Compositions for treating boreholes or wells, e.g. for completion or for remedial operations
- C09K8/58—Compositions for enhanced recovery methods for obtaining hydrocarbons, i.e. for improving the mobility of the oil, e.g. displacing fluids
- C09K8/582—Compositions for enhanced recovery methods for obtaining hydrocarbons, i.e. for improving the mobility of the oil, e.g. displacing fluids characterised by the use of bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P39/00—Processes involving microorganisms of different genera in the same process, simultaneously
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- General Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)
- Production Of Liquid Hydrocarbon Mixture For Refining Petroleum (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Foreliggende oppfinnelse vedrører utvikling av et steady state mikrobielt konsortium i stand til å modifisere råoljekomponenter fra et oljereservoar under anaerobe denitrifiserende betingelser. Steady state konsortiumet kan anvendes til å forbedre oljegjenvinningen.
Description
FREMGANGSMÅTE FOR Å FORBEDRE OLJEUTVINNING FRA ET OLJERESERVOAR VED Å ANVENDE ET ANRIKET ANAEROBT, STASJONÆRT MEKROBIELT KONSORTIUM
Beskrivelse
Denne søknaden krever fordelen av midlertidig amerikanske patentsøknad 61/154498 innlevert 23. februar 2009.
OPPFINNELSENS FAGOMRÅDE
Denne beskrivelsen gjelder fagområdet miljømikrobiologi og modifisering av tung råoljes egenskaper ved å anvende mikroorganismer som modifiserer råoljes og/eller et reservoarmiljøs fysiokjemiske egenskaper anaerobt, som resulterer i økt utvinning av råoljen.
OPPFINNELSENS BAKGRUNN
Utfordringen med å møte den stadig økende etterspørselen etter olje inkluderer å øke utvinning av råolje fra tungoljereservoarer. Denne utfordringen har resultert i tiltagende innsats for å utvikle alternative, kostnadseffektive oljeutvinningsprosesser ( Kianipey. S. A. and Donaldson, E. C. 61st Annual Ter.hni cal Conference and Exhibition. New Orleans. LA. USA. 5. - 8. okt. 19861 Tunge hydrokarboner i form av petroleumforekomster og oljereservoarer er fordelt over hele verden. Disse oljereservoarene måles i de hundrevis av milliarder utvinribare fatene. Fordi tung råolje har en relativt høy viskositet, er den i det vesentlige immobil og kan ikke utvinnes enkelt med konvensjonelle primære og sekundære midler.
Økt oljeutvinning ved hjelp av mikrober (Microbial Enhanced Oil Recovery (MEOR)) er en metodologi for å øke oljeutvinning med mikroorganismers handling ( Brown. L. R., et al. SPE 59306. SPE/ POE Improved Oil Recover<y>Symposium, Oklahoma. 3.- 5. april 200QY MEOR-forskning og -utvikling er en kontinuerlig innsats rettet mot å oppdage teknikker for å bruke mikroorganismer for å modifisere råoljes egenskaper til fordel for oljeutvinning ( Sunde. E.. et al.. SPE 24204. SPE/ POE 8th Symposium on enhanced Oil Recovery. Tulsa. OK. USA. 22. - 24. april. 199<2>1.
I MEOR-prosesser er nyttige mikrober typisk hydrokarbonutnyttende, ikke-patogene mikroorganismer, som anvender hydrokarboner som deres energikilde for å dyrke eller utsondre naturlige bioprodukter så som alkoholer, gasser, syrer, surfaktanter og polymerer. Disse bioproduktene endrer råoljens fysiologiske/kjemiske egenskaper og stimulerer endringer i olje-vann-stein-interaksjoner for å forbedre oljeutvinning.
De positive effektene av MEOR-teknologi i et reservoar inkluderer: 1) å endre den underjordiske formasjonens permeabilitet for å forbedre vannsveipeffektivitet; (2) å produsere biosurfaktanter for å redusere overflate- og grenseflatespenninger; (3) å formidle endringer i fuktningsgrad; (4) å produsere polymerer som forenkler petroleums mobilitet; og (5) å generere gasser (hovedsakelig CO2) for å øke formasjonstrykk og redusere oljeviskositet for derved å fremme og reetablere gassdriven i reservoaret. De kombinerte effektene av disse bioproduktene reduserer kapilliarkreftene som virker mellom oljen, vannet og steinen, for å frigjøre den fangede oljen.
Fremgangsmåter for å identifisere mikroorganismer nyttige i MEOR-prosesser som tidligere er beskrevet krever identifisering av konsortiumet av mikroorganismer i prøvene tatt fra en oljebrønn eller prøve under spesifikke forhold med et definert næringsstoffmedium i nærværet av anaerobe gassblandinger (amerikansk patentsøknad nr. 2007/0092930A1). En prosess for å stimulere et mikrobielt konsortiums in situ-aktivitet for å produsere metan for olje ble beskrevet i US 6 543 535B2. Slike prosesser er tidkrevende og arbeidskrevende. Derved er det et behov for å utvikle fremgangsmåter for: 1) å utvikle en stasjonær populasjon av konsortium av mikroorganismer som kan dyrkes i eller på olje under anaerobe denitriifserings-forhold; 2) å identifisere elementene i det stasjonære konsortiet for egenskaper som kan være nyttige i oljemodifisering og/eller -interaksjoner og 3) å bruke det stasjonære konsoritiet av mikroorganismer, på en kostnadseffektiv måte, for å forbedre oljeulvinning under anaerobe forhold.
SAMMENDRAG
En fremgangsmåte for å øke oljeutvinning fra et oljereservoar ved å anvende et anriket anaerobt, stasjonært konsortium av mikroorganismer tilveiebringes. Fremgangsmåten inkluderer å ta miljøprøver innbefattende stedegne mikrobielle populasjoner eksponert for råolje og å anrike populasjonene per en amikingsprotokoll. Anrikingsprotokollen bruker en kjemostat bioreaktor for å tilveiebringe en stasjonær populasjon. Den stasjonære populasjonen kan karakteriseres ved å anvende sekvensanalyseteknikker for fylogenetisk DNA, som inkluderer 16S rDNA-profilering og/eller DGGE-fingeravtrykkprofilering som beskrevet heri. Den stasjonære populasjonen karakteriseres videre som et anriket konsortium innbefattende mikrobielle bestanddeler som har relevante funksjonaliteter for å forbedre oljeutvinning. Det stasjonære anrikede konsortiet kan dyrkes in situ, under reservoarforhold, ved å anvende én eller flere elektronakseptorer og reservoarets råolje som karbonkilden for mikrobiell økning av oljeutvimung. Det stasjonære anrikede konsortiet kan anvendes med andre mikroorganismer for å forbedre oljeutvinning i reservoarer eller brønner med analoge reservoarforhold for de valgte/utpekte brønnene.
I en utførelsesform tilveiebringes en fremgangsmåte for å øke oljeutvinning fra et måloljereservoar ved å anvende et anriket stasjonært mikrobielt konsortium, der fremgangsmåten innbefatter: (a) å tilveiebringe miljøprøver innbefattende stedegne mikrobielle populasjoner av målolj ereservoaret; (b) å anrike for ett eller flere stasjonære mikrobielle konsortier tilstedeværende i prøvene, hvori anrikingen resulterer i et konsortium som bruker råolje som en karbonkilde under anaerobe denitrifiseiirigsforhold; (c) å karakterisere de anrikede stasjonære konsortiene i (b) ved å anvende 16S rDNA-profilering; (d) å sette sammen et konsortium ved å anvende karakteirseringen i (c) innbefattende mikrobielle genera innbefattende én eller flere TTiawera-arter og hvilke som helst to tilleggsarter som er elementer i genera valgt fra gruppen bestående av Rhodocyclaceae, Pseudomonadales, Bacteroidaceae, Clostridiaceae, Incertae Sedis, Spirochaetacea. es, Deferribacterales, Brucellaceae og Chloroflexaceae; (e) å identifisere minst én relevant funksjonalitet for konsortiet i (d); (f) å dyrke det anrikede stasjonære konsortiet i (e) som har minst én relevant funksjonalitet til en konsentrasjon tilstrekkelig for reservoarinokulermg; og (g) å inokulere målreservoaret med den tilstrekkelige konsentrasjonen av konsortiet i (f) og innsprøytingsvann innbefattende én eller flere elektronakseptorer, hvori konsortiet dyrkes i reservoaret og hvori dyrkingen fremmer økt oljeutvinning.
KORT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSENS FIGURER
Figurl; Distribusjon av mikroorganismer i moder-POGl-konsortiet etter tre måneder i andregenerasjons moderpopulasjoner som fastsatt av 16S rDNA-identiteter. Figur 2A og 2B: Distribusjon av mikroorganismer i moder-POGl-konsortiet etter 190 dager i andre- og tredjegenerasjons moderpopulasjoner som fastsatt av 16S rDNA-identiteter. Figur 2A: Populasjonsdistribusjon av tredjegenerasjons moder ved 190 dager mens 6400 ppm nitrat har blitt redusert. Figur 2B : Populasjonsdistribusjon av andregenerasjons moder ved 240 dager mens 6400 ppm nitrat har blitt redusert. Figur 3: Diagram av den anaerobe kjemostat bioreaktoren for denitrifiseringsdyrkingsstudier med det stasjonære POGl-konsortiet: A) Motstrømsblåserør; B) Nitrogenmagnifold; C) Mateprøvesprøyte og sikkerhetsventil (5 psi); D) Matesprøytepumpe; E) Matereservoar luftromnitrogengassport; F) Mateinngangsport på kjemostat bioreaktor; G) Matemediumreservoar (minimal og nitrat); H) Kjemostat bioreaktor; I) Minimalsaltmedium og konsortiumkultur; J) Magnetomrører; K) Råoljesupplement; L) Effluentreservoar; M) Effluentutgangsport på kjemostat bioreaktor; N) Effluentreservoar luftromnitrogengassport; O) Effluentsprøyteport; P) Effluentprøvesprøyte og sikkerhetsventil (5 psi); Q) Inokulerings- og prøveport på kjemostat bioreaktor; R) Ekstra port og plugg; S) Kjemostat bioreaktor luftromnitrogrengassport. Figur 4: Distribusjon av mikroorganismer i stasjonær POG1 som fastsatt av 16S rDNA-identiteter. Konsortiumbestanddeler ved 0, 28 og 52 dager ble sammenlignet med moderpopulasj onene. Figur 5: Denatureringsgradient gelelektroforese fingeravtrykkprofil av de bakterielle 16S rRNA-genfragmentene derivert fra koloni-DNA ekstrahert fra den stasjonære POG1 kjemostat bioreaktoren ved å anvende primere SEKV.ID-NR.: 12 og SEKV.ID-NR: 14 for region V4-5. (A) Thauera AL9:8 er en prominent art av et konsortium som beskrevet heri. (B) Pseudomonas stutzeri LH4:15 er også en representert art i konsortiet. (C) Ochrobactrum oryzae ALI:7 er en underordnet art. Underordnede bakterielle arter (D til og med L) er nærværende i alle prøver. Bakterielle arter (C og M til og med O) er mindre viktige elementer i populasjonen og velges mot. Figur 6: Mikrosandkolonne oljefngjøring - Å anvende olje på North Slope-sand, 3'generasjon moder-POGl-konsortiumkultur EH40:1 (2400 ppm nitrat). Følgende sekvenser er i overensstemmelse med 37 C.F.R. § 1.821-1.825 ("Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures - the Sequence Rules") og stemmer overens med Den internasjonale opphavsrettsorganisasjonens (World Intellectual Property Organization (WIPO)) standard ST.25 (1998) og sekvensoppføringskravene i følge EPO og PCT (regel 5.2 og 49.5 (a-bis), og avsnitt 208 og vedlegg C i de administrative instruksene. Symbolene og formatene som anvendes for nukleotid- og aminosyresekvensdata er i overensstemmelse med reglene fremsatt i 37 CF .R. §1.822.
Følgende DNA-sekvenser var konsensussekvenser av unike klonede PCR-sekvenser, som ble generert ved å anvende universale 16S primere med DNA isolert fra bele POG1-koloni:
DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
Søkere inkorporerer spesifikt hele innholdet i alle henviste referanser i denne redegjørelsen. Hvis ikke annet er oppgitt, er alle prosenter, deler, forhold, osv., i vekt. Varemerker vises med store bokstaver. Videre, når en mengde, konsentrasjon eller annen verdi eller parameter oppgi som enten et område, foretrukket område eller liste over øvre foretrukne verdier og nedre foretrukne verdier, skal dette forstås som å spesifikt redegjøre for alle områder tilformet av hvilket som helst par av hvilken som helst øvre områdegrense eller foretrukket verdi og hvilken som helst nedre områdegrense, uten hensyn til om områder redegjøres for separat. Når et område med numeriske verdier nevnes heri, hvis ikke annet er oppgitt, er området ment å inkludere endepunktene av dette, og alle heltall og brøktall innenfor området. Det er ikke ment at oppfinnelsens omfang skal være begrenset til de spesifikke verdiene nevnt når et område defineres.
Midlene, fremgangsmåtene og prosedyrene for å tilveiebringe et anriket stasjonært konsortium som har én eller flere relevante funksjonaliteter for å øke frigjøringen og utvinningen av olje fra et petroleumreservoar, blir redegjort fort.
De følgende definisjoner tilveiebringes for uttrykkene og forkortelsene som anvendes i denne søknaden: Uttrykket "miljøprøve" betyr hvilket som helst stoff eksponert for hydrokarboner, inkludert en blanding av vann og olje innbefattende mikroorganismer. Som brukt heri inkluderer miljøprøver vann- og oljeprøver som innbefatter stedegne mikroorganismer og/eller populasjoner av mikroorganismer av varierende slekt og art som kan karakteriseres vedl6S rDNA-profilering eller DNA-fingeravtrykk-teknikker som beskrevet i detalj nedenfor. Miljøprøvene kan innbefatte et mikrobielt konsortium unikt for en geografisk region eller et målreservoar, eller alternativt kan det mikrobielle konsortiet være tilpasningsbare til andre miljøsteder, geografier og reservoarer.
Uttrykket "å anrike for ett eller flere stasjonære konsortier" som brukt heri betyr at en miljøprøve kan anrikes i følge oppfinnelsen ved å kultivere prøven i en kjemostat bioreaktor under ønskede forhold så som anaerobe demtrifiseirngsforhold ved å anvende et grunnleggende minimalmedium, så som CL-10 som beskrevet i tabell 2 og en prøve av måloljen eller dennes komponenter som en karbonkilde.
Uttrykket "kjerneoverfyllingsundersøkelse" refererer til å vannoverfylle kjernen i et oljereservoar etter bruk av en oljeutvinningsteknikk, dvs. en MEOR-teknologi, på reservoaret. Økning i oljefrigjøring representerer evnen til brukte mikrober til å bidra til frigjøring av olje fra kjernematrisen.
Uttrykket "stedegne mikrobielle populasjoner" betyr naturlig forekommende populasjoner av mikroorganismer nærværende i et oljereservoar (stein- eller jordmasse, olje, vann eller olje-vann-prøver).
Uttrykket "POGl-konsortiets komponenter" refererer til POGl-konsortiets elementer eller mikrobielle bestanddeler (både store og underordnede). Disse kan være stedegne for konsortiet eller kan være tilsatte stammer. Ytterligere komponenter så som elektronakseptorer og kombinasjoner av elektronakseptorer kan også være nærværende.
Uttrykkene "stasjonært konsortium" og "anriket stasjonært mikrobielt konsortium" refererer til en blandet kultur av mikroorganismer og/eller mikrobielle populasjoner dyrket i en kjemostat bioreaktor og i et medium under spesifikke dyrkingsforhold for å anrike for dyrking av bestemte populasjoner av mikroorganismer, og når de er anriket, å nå et stabilt forhold slik at konsortiet endrer seg betydelig over tid under et gitt sett med forhold. Stasjonæren styres av et begrensende næringsstoff. I en utførelsesform tilveiebringes det stasjonære konsortiet ved å anrike mikroorganismene i et definert minimalt denitrifiseringsmedium, under anaerobe denitrifiseringsforhold, ved å anvende råolje som karbonkilden, til populasjonen har nådd dens stasjonær. I det nærværende tilfellet er elektronakseptor, nitrat, begrensende og mates i en konstant strøm. Konsortiet kan innbefatte mikrobielle populasjoner fra miljøprøver eller fra rene eller blandede ikke-stedegne kulturer. Uttrykket POG1-konsortium" som brukt heri refererer til et konsortium derivert fra en miljøanriking som ble tatt fra en jordprøve kontaminert med polysykliske aromatiske hydrokarboner.
Uttrykket "råolje" refererer til en naturlig forekommende, antennbar væske som finnes i steinformasjoner og innbefatter en blanding av hydrokarboner med ulike molekylvekter, pluss andre organiske forbindelser. Råoljen kan inneholde, for eksempel, en blanding av parafiner, aromater, asfaltener, alifatiske, aromatiske, sykliske, polysykliske og polyaromatiske hydrokarboner. Råoljen kan være generisk eller kan være fra et reservoar utpekt for økt oljeutvinning.
Uttrykket "elektronakseptor" refererer til et molekyl eller en forbindelse som mottar eller aksepterer et elektron under cellerespirasjon.
Uttrykkene "denitrifisere" og "denitrifisering" betyr å redusere nitrat for å anvende det som en elektronakseptor i respiratorisk energigenerering.
Uttrykkene "nitrater" og "nitritter" refererer til hvilket som helst salt av nitrat (NO3) eUernitirtt(N02).
Uttrykket "relevante funksjonaliteter" betyr at konsortiet har evnen til å fungere på måter som fremmer oljeutvinning. Visse slike funksjonaliteter inkluderer: (a) endring av den underjordiske formasjonens permeabilitet for forbedret vannsveipeffektivitet; (b) produksjon av biosurfaktanter for å redusere overflate- og grenseflatespenninger; (c) endring i fuktningsgrad; (d) produksjon av andre polymerer enn surfaktanter som forenkler petroleums mobilitet; (e) produksjon av syrer med lav molekylvekt som fører til steinoppløsning; (f) generering av gasser for å øke formasjonstrykk; og (g) reduksjon i oljeviskositet.
Evnen til å demonstrere slike funksjonaliteter i den foreliggende oppfinnelse avhenger av konsortiets evne til (1) å dyrkes under anaerobe forhold og samtidig redusere nitrater eller mtritter; (2) å anvende minst én komponent tilgjengelig i oljebrønnen som en karbonkilde; (3) å anvende minst én komponent i det innsprøytede eller produserte vannet; (4) å utvikle seg i nærværet av olje; (5) å utvikle seg optimalt i et oljebrønnmiljø; og (6) å oppnå kombinasjoner av det ovennevnte.
Uttrykket "å modifisere oljereservoarets miljø" inkluderer evnen til det anrikede stasjonære, mikrobielle konsortiets evne til å innvirke på en oljebærende formasjon på følgende måter (per de relevante funksjonalitetene) 1) å endre den underjordiske formasjonens permeabilitet (sveipeffektivitet), (2) å produsere biosurfaktanter som reduserer overflate- og grenseflatespenninger, (3) å formidle endringer i fuktningsgrad, (4) å produsere polymerer som forenkler petroleums mobilitet; og (5) å generere gasser (hovedsakelig CO2) som øker formasjonstrykk; og (6) å redusere oljeviskositet.
Uttrykkene "brønn" og "reservoar" kan bli anvendt omvekslende heri og refererer til en underj ordisk eller havbunnsformasj on fra hvilken olj e kan utvinnes. Uttrykkene brønn og reservoar inkluderer den fysiske/kjemiske sammensetningen av reservoarets jord-stein-sedMmentshxiktur under overflaten.
Uttrykkene "måloljereservoar" og "målreservoar" kan bli anvendt omvekslende heri og refererer til en underjordisk eller havbunnsformasj on fra hvilken økt oljeutvinning ønskes og til hvilken det anrikede stasjonære, mikrobielle konsortiet kan brukes. Uttrykket "dyrking på olje" betyr de mikrobielle artene som er i stand til å metabolisere alifatiske, aromatiske og polysykliske hydrokarboner eller hvilke som helst andre organiske komponenter i råpetroleumen som et næringsmiddel for å støtte dyrking. Evnen til dyrking på olje i følge en utførelsesform av oppfinnelsen eliminerer behovet for å tilføre visse næringsmidler, så som ytterligere karbonkilder, for å anvende det mikrobielle konsortiet for forbedret oljeutvinning.
Uttrykket "kjemostat bioreaktor" refererer til en bioreaktor som anvendes for en kontinuerlig strømkultur for å opprettholde mikrobielle populasjoner eller et konsortium av mikroorganismer i en stasjonær dyrkingsfase. Dette oppnås ved å regulere en kontinuerlig tilførsel av medium til mikrobene, som opprettholder elektrondonoren eller elektronreseptoren i begrensede mengder for å styre kulturens dyrkingsrate.
Uttrykket "frngeravtrykkprofil11 refererer til prosessen med å generere et spesifikt mønster av DNA-bånd på denatureringsgradient elektroforesegel som er definert av deres lengde og sekvens, og anvendes for å identifisere og beskrive den dominerende mikrobielle populasjonen for en kulturevaluerende mikrobiell diversitet og populasjonsstabilitet ved hvilken som helst bestemt metabolsk tilstand.
Uttrykket "reservoarinokulering" betyr inokulering av oljereservoaret med én eller flere mikrober for mikrobielt økt oljeutvinning.
Uttrykket "konsentrasjon tilstrekkelig for reservoarinokulering" betyr å dyrke den mikrobielle populasjonen til en densitet som ville være egnet for å inokulere oljereservoaret. For denne oppfinnelsens formål kan en konsentrasjon på IO<7>celler per milliliter av prøven brukes.
Uttrykket "fremmer økt oljeutvinning" som brukt heri betyr å dyrke det mikrobielle konsortiet i oljereservoaret under anaerobe forhold for å tilveiebringe for modifisering av oljen i reservoaret eller brønnen som definert over med en relevant funksjonalitet som kan resultere i en endring i oljebrønnen eller -reservoaret eller oljebrønnens eller -reservoarets miljø. Slik endring støtter frigjøring av olje fra sand eller noe modifisering som øker utvinningen av olje.
Uttrykket "korrosjon på oljeutvinnings- og prosesseringsutstyr" som brukt heri refererer til de kjemiske, fysiske og mikrobielle prosessene som skader oljerørledningen og/eller oljeutvinningsutstyr.
Uttrykket "rDNA-typebestemmelse" eller "rDNA-profilering" betyr prosessen med å sammenligne 16S rDNA-gensekvensene funnet i forsøksprøvene med rDNA-sekvensene oppbevart i flere internasjonale databaser for å identifisere, ved sekvenshomologi, den "nærmeste slektningen" til mikrobielle arter.
Uttrykket "signatursekvenser" vil heri referere til unike sekvenser med nukleotider i 16s rRNA-gensekvensen som kan anvendes spesifikt til å definere en organisme eller gruppe med organismer fylogenetisk. Disse sekvensene anvendes for å skjelne sekvensens opprinnelse fra en organisme ved riket, domenet, fylumet, klassen, ordenen, genuset, familien, arten og selv en isolering ved klassifiseringens fylogeniske nivå.
Uttrykket "strukturelt domene" refererer heri til spesifikke sekvensregjoner i 16s
rRNA-gensekvensen som når den stilles på linje avslører et mønster i hvilket relativt bevarte stykker med primær sekvens og en sekundær sekvens alternerer med variable regioner som avviker påfallende i sekvenslengde, basissammensetning og potensiell sekundær struktur. Disse strukturelle domenene av 16S rRNA-gensekvens er delt inn i tre kategorier: de universelt bevarte eller "U"-regionene, de halvbevarte eller "S"-regionene og de variable eller "V"-regionene. Alle de strukturelle domenene inneholder signatursekvensregioner som definerer en mikroorganisme fylogenetisk.
(Neefs, J-M et al. Nucleic acids Res., 18: 2237, 1990, Botter, E. C, ASM News 1996).
Uttrykket "fylogenetikk" refererer til studien om evolusjonsbeslektefhet blant ulike grupper av organismer (f.eks. bakterielle eller arkeale arter eller populasjoner). Uttrykket "fylogenetisk typebestemmelse", "fylogenetisk kartlegging" eller "fylogenetisk klassifisering" kan bli anvendt omvekslende heri og refererer til en form for klassifisering i hvilken mikroorganismer grupperes i følge deres slektslinje. Fremgangsmåtene heri er spesifikt rettet mot fylogenetisk typebestemmelse på miljøprøver basert på 16S ribosomalt DNA (rDNA) -sekvensialisering. I denne sammenhengen genereres omlag 1400 basepar (bp) lengde av 16S rDNA-gensekvensen ved å anvende 16S rDNA universale primere identifisert heri og sammenlignet ved sekvenshomologi med en database med mikrobielle rDNA-sekvenser. Denne sammenligning anvendes deretter for å bidra til å klassifisere taksonomisk rene kulturer for anvendelse i økt oljeutvinning.
Forkortelsen "DNA" refererer til deoksyribonukleinsyre.
"Gen" er en spesifikk enhet på et DNA-molekyl som består av en nukleotidsekvens som koder en distinkt genetisk melding for regulerende regioner, transkriberte strukturelle regioner eller funksjonelle regioner.
Forkortelsen "rDNA" refererer til ribosomal operon eller gensekvenskoding ribosomal RNA på den genom DNA-sekvensen.
Forkortelsen "NTPs" refererer til ribonukleotid trifosfater, som er de kjemiske byggeklossene eller "genetiske bokstavene" for RNA.
Forkortelsen "dNTPs" refererer til deoksyribonukleotid trifosfater, som er de kjemiske byggeklossene eller "genetiske bokstavene" for DNA.
Uttrykket "rRNA" refererer til ribosomalt strukturell RNA, som inkluderer 5S, 16 S og 23S rRNA-molekylene. Uttrykket "rRNA-operon" refererer til et operon som produserer strukturell RNA, som inkluderer 5S, 16 S og 23S ribosomalt strukturelle RNA-molekyler.
Uttrykket "mRNA" refererer til et RNA-molekyl som har blitt transkribert fra et gen kodet for av en DNA-templat og som bærer den genetiske informasjonen til et protein til ribosomene som skal translateres og syntetiseres til proteinet.
Uttrykket "hybridisere" blir anvendt for å beskrive formasjonsbaseparene mellom komplementærregioner DNA-strenger som ikke var paret opprinnelig.
Uttrykket "komplementær" blir anvendt for å beskrive forholdet mellom nukleotidbaser som er i stand til å hybridisere med hverandre. For eksempel, når det gjelder DNA, er adenosin komplementær til tymin, og cytosin er komplementær til guanin.
Forkortelsen "cDNA" refererer til DNA som er komplementær til og derivert fra enten messenger-RNA eller -rRNA.
Forkortelsen "NCBI" refererer til National Center for Biotechnology Information. Uttrykket "GenBank" refererer til National Institute of Healths genetiske sekvensdatabase.
Uttrykket "næringsstoffsupplering" refererer til tilsettingen av næringsstoffer som er fordelaktige for dyrkingen av mikroorganismer som er i stand til å anvende råolje som deres hovedkarbonkilde, men dyrkes optimalt med andre ikke-hydrokarbonnæirngsstoffer, dvs. gjærekstrakt, pepton, suksinat, laktat, formiat, acetat, propionat, glutamat, glysin, lysin, citrat, glykose og vitammoppløsninger.
Forkortelsen "NIC" refererer til ikke-inokulume, negative kontroller i mikrobielle kulturfbrsøk.
Forkortelsen "ACO" (autoklavert råolje) refererer til råolje som har blitt dampsterilisert ved å anvende en autoklav, og antas å være fri for levende mikrober.
Uttrykket "bakteriell" betyr å tilhøre bakteriene - Bakterier er et evolusjonsdomene eller rike av mikrobielle arter som skiller seg fra andre prokaryoter basert på deres fysiologi, morfologi og 16S rDNA-sekvenshomologier.
Uttrykket "mikrobielle arter" betyr distinkte mikroorganismer identifisert basert på deres fysiologi, morfologi og fylogenetiske karakteristikker ved å anvende 16S rDNA-sekvenser.
Uttrykket "arkeal" betyr å tilhøre arkebakteriene — Arkebakterier er et evolusjonsdomene eller rike av mikrobielle arter som skiller seg fra andre prokaryoter basert på deres fysiologi, morfologi og 16S rDNA-sekvenshomologier.
Uttrykket "sveipeffektivitet" betyr evnen til innsprøytet vann brukt i oljeutvinningsteknikker med vannoverfylling for å "skyve" olje gjennom en geologisk formasjon mot en produksjonsbrønn.
Uttrykket "biofilm" betyr en film dannet av en matrise av en kompakt masse av mikroorganismer bestående av strukturell heterogenitet, genetisk diversitet, komplekse koloniinteraksjoner og en ekstracellulær matrise av polymere stoffer. Uttrykket "ikke-reduserbar vannmetning'1 er den minimale vannmetningen som kan oppnås i en porøs kjerneplugg ved overfylling av olje for metning. Det representerer matrisens interstitiale vanninnhold hvor vannet aldri fortrenges fullstendig av oljen fordi en minimal mengde vann må holdes tilbake for å tilfredsstille kapillærkrefter.
Uttrykket "ribotypebestemmelse" eller "riboavtrykk" refererer til å ta fingeravtrykk av genom DNA-restriksjonsfragmenter som inneholder hele eller deler av rRNA-operonkodingen for 5S, 16S og 23S rRNA-genene. Ribotypebestemmelse, som beskrevet heri, er når restriksjonsfragmenter, produsert fra mikrobielt kromosom-DNA, skilles ved elektroforese, overføres til en filtermembran og probes med merkede rDNA-operonprober. Restriksjonsfragmenter som hybridiserer på merkeproben produserer et distinkt merket mønster eller fingeravtrykk/strekkode som en unik for en spesifikk mikrobiell stamme. Ribotypebestemmelsesprosedyren kan utføres i sin helhet på Riboprinter<®->instrumentet (DuPont Qualicon, Wilmington,
DE).
Uttrykket "prosent identitet", som kjent i teknikken, er et forhold mellom to eller flere polypeptidsekvenser eller to eller flere polynukleotidsekvenser, som fastsatt av sekvenssammenligning. I teknikken betyr "identitet" også graden av sekvensbeslektethet eller homologi mellom polynukleotidsekvenser, som fastsatt av samsvaret mellom strenger i slike sekvenser og deres grad av invarians. Uttrykket "likhet" refererer til hvor beslektet én nukleotid- eller proteinsekvens er med en annen. Utstrekningen av likhet mellom to sekvenser er basert på prosenten av sekvensidentitet og/eller -bevaring. "Identitet" og "likhet" kan enkelt beregnes med kjente fremgangsmåter, inkludert, men ikke begrenset til de beskrevet i "Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed. Oxford University Press, NY, 1988"; og "Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, NY, 1993"; og "Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, NJ, 1994"; og "Sequence Analysis in Molecular Biology, vonHeinje, G., ed., Academic Press, 1987"; og "Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., Stockton Press, NY, 1991". Foretrukne fremgangsmåter for å fastsette identitet er utformet for å gi det beste samsvaret mellom sekvensene som testes. Fremgangsmåter for å fastsette identitet og likhet er kodifisert i offentlig tilgjengelige dataprogrammer.
Uttrykket "sekvensanalyseprogramvare" refererer til hvilken som helst dataalgoritme eller programvareprogram som er nyttig for analyse av nukleotid- eller aminosyresekvenser. "Sekvensanalyseprogramvare" kan være kommersielt tilgjengelig eller utviklet uavhengig. Typisk sekvensanalyseprogramvare vil inkludere, men er ikke begrenset til: GCG-programpakken (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI), BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410,1990), DNASTAR (DNASTAR, Inc., Madison, WI) og FASTA-programmet som inkorporerer Smith-Waterman-algoritmen (Pearson, W. R., Comput. Methods Genome Res., /Proe. Int. Symp., MeetingDate 1992, 111-120. eds.: Suhai, Saridor. Utgiver: Plenum, New York, NY, 1994). hmenfor denne søknadens kontekst skal det forstås at hvor sekvensanalyseprogramvare anvendes for analyse, vil resultatene av analysen være basert på det referererte programmets "standardverdier", hvis ikke annet er spesifisert. Som brukt heri vil "standardverdier" bety hvilket som helst sett med verdier eller parametrer som lastes med programvaren når det initialiseres for første gang.
Uttrykket "denatureringsgradient gelelektroforese" eller "DGGE" refererer til en molekylær fingeravtrykkfremgangsmåte som skiller polymerase kjedereaksjon-genererte (PCR-genererte) DNA-produkter basert på deres lengde og sekvens. Skillingen av PCR-produktfragmentet av samme størrelse, men med en forskjellig sekvens, gjenspeiler differensielle denatureringskarakteristikker for DNA-et på grunn av deres sekvensvariasjon. Under DGGE, møter PCR-produkter stadig høyere konsentrasjoner av kjemisk denatureringsmiddel idet de migrerer gjennom en polyakrylamidgel. rDNA PCR-produktene genereres fra den blandede mikrobielle populasjonen som blirkarakterisert. De svakere smeltedomenen for visse dobbeltstrengede PCR-sekvenser vil begynne å denaturere, noe som sinker den elektroforetiske migrasjonen dramatisk. De forskjellige DNA-sekvensene (som genereres fra forskjellige bakterier) vil denatureres ved forskjellige konsentrasjoner av denatureringsmiddel, som resulterer i et mønster av bånd som samlet kan refereres til som "kolom^geravtrykkprofir1. I teorien representerer hvert bånd i en gitt DGGE-fingeravtrykkprofil en individuell bakteriell art nærværende i kolonien. Når de er generert, representerer dataene en fingeravtrykkprofil for populasjonen på et gitt tidspunkt og under visse dyrkingsforhold. DGGE-fingeravtrykkprofilen kan lastet opp i databasen for å sammenligne profiler i konsortiet under foreskrevne dyrkingsforhold. Derved anvendes DGGR for å generere fingeravtrykkene til en mikrobiell koloni og for å løse den genetiske diversiteten til komplekse mikrobielle populasjoner.
Den foreliggende fremgangsmåte tilveiebringer for mikrobielt økt oljeutvinning fra et oljereservoar ved å anvende et anriket stasjonært mikrobielt konsortium innbefattende følgende trinn: 1) å ta en miljøprøve innbefattende stedegne mikrobielle populasjoner; 2) å utvikle et anriket stasjonært mikrobielt konsortium hvori konsortiet anrikes under anaerobe demtrifiseringsforhold, ved å anvende råolje som karbonkilden, til populasjonen har nådd dens stasjonær; 3) å utvikle fingeravtrykkprofiler av prøver i det stasjonære konsortiet ved å anvende 16S rDNA-profileringsfremgangsmåter av prøvene; 4) velge prøver fra konsortiet innbefattende ulike mikrobielle genera, for eksempel én eller flere Thauera- aiter og andre tilleggsarter valgt fra gruppen bestående av Rhodocyclaceae, Pseudomonadales., Bacteroidaceae., Clostridiaceae, Incertae Sedis., Spirochete, Spirochaetaceaes., Deferribacterales, Brucellaceae og Chlor<q>flexaceae; 5) å identifisere minst én relevant funksjonalitet for den valgte anrikede stasjonære konsortiet for anvendelse til å forbedre oljeutvinning; 6) å dyrke det valgte anrikede stasjonære konsortiet som har minst én relevant funksjonalitet til en konsentrasjon tilstrekkelig for reservoarinokulering; 7) å inokulere en reservoarmatrise under overflaten med den tilstrekkelige konsentrasjonen av det stasjonære konsortiet og iimsprøytirigsvann innbefattende én eller flere elektronakseptorer, hvori konsortiet dyrkes in reservoarmatrisen under overflaten og hvori aktiviteten eller dyrkingen av konsortiet fremmer økt oljeutvinning.
Miljøprøver for å utvikle et mikrobielt konsortium
Prøvekilden som anvendes for å anrike kulturer og utvikle et konsortium for anvendelse i MEOR kan være: (1) selve oljebrønnen i form av: en vannprøve (innsprøytings-, trykk- eller produksjonsvann), jord fra en reservoarkjerne eller fra en prøve av den utpekte olje; (2) en miljøprøve som har blitt eksponert for råolje eller en hvilken som helst én eller kombinasjon av dennes komponenter, så som parafiner, aromater, asfaltener, osv,; eller (3) et eksisterende konsortium som oppfyller kriteriene for dyrking i nærvær av den utpekte oljen. Prøven må være i kontakt med eller nær oljeformasjonen, ettersom prøvebestanddeler er spesifikke for et område. Prøvetaking nær en påtenkt lokalitet foretrekkes. Prøvevolumet og antall mikrobielle celler per milliliter kan variere fra 1 ml til 51 og fra IO<5>til 1010celler/ml, avhengig av de spesifikke kravene for den tiltenkte anvendelsen. For denne oppfinnelsens formål, kan celledensiteten i prøven være IO<7>celler per milliliter. Til disse prøvene kan et grunnleggende mineralsaltmedium, som kreves for mikrobiell dyrking, vitaminer og elektronakseptorer, tilsettes i tillegg til prøven av råoljen fra den ønskede lokaliteten, og blandingen kan inkuberes ved en passende temperatur for å tillate utvikling av det ønskede konsortiet med spesifikke funksjonaliteter.
I en utførelsesform kan et stasjonært mikrobielt konsortium tilveiebringes av en miljøprøve tatt fra Milne Pont-reservoaret, North Slope i Alaska.
I en annen utførelsesform kan en miljøprøve tilveiebringes fra en oljebrønn eller reservoarmiljø lokalisert i oljefeltene i Texas, Oklahoma, California, Mexicogolfen, Vest-Afrika, Midtøsten, India, Kina, det nordlige og østlige Sør-Amerika, Nordsjøen og det gamle Sovjetunionen.
Mikrobiell kjemostat bioreaktor
Miljøprøvene innbefattende mikrobielle populasjoner kan dyrkes i en kjemostat bioreaktor ved å bruke anrikmgsteknikker. Anrikingsforholdene kan inkludere å dyrke en miljøprøve under anaerobe denitrifiseringsforhold i flasker mens konsentrasjonen av elektroakseptor tilveiebrakt under anaerob respirasjon begrenses ettersom raten manuell mating ofte er for treg til å holde tritt med reduksjon av nitrat. I tillegg, hvis en for høy konsentrasjon av nitrat (f.eks. > 2500 ppm) blir tilført, kan den enten hemme dyrking av noen mikrober eller være toksisk og drepe noen andre arter. Omvendt stanser denitrifiseringsbakterier dyrking når nitrat reduseres fullstendig, for følgelig å tillate andre mikrobielle populasjoner å dominere konsortiets sammensetning gjennom å redusere andre spormetaller, mineraler og umettede hydrokarboner eller organiske molekyler. Fluktuasjoner i nitratnivåer kan ha innvirkning på endringer i konsortiets mikrobielle sammensetning og ha overdreven innvirkning på definisjonen av populasjonens sammensetning i den. De ikke-begrensende eksemplene tilveiebrakt heri beskriver hvordan disse forholdene kan manipuleres for å anrike for og identifisere ønskede bestanddeler i et stasjonært mikrobielt konsortium.
Kjemostat bioreaktorer er systemet for kultivering av mikrobielle kolonier eller enkle mikrobielle arter, og tilveiebringe for å vedlikeholde forholdene for mikrobiell dyrking og populasjoner stasjonær ved å styre den volumetriske materaten for en dyrkingsavhengig faktor. Kjemostatoppsettet består av et sterilt, ferskt næringsmiddelreservoar forbundet med en dyrkingsreaktor. Ferskt medium som inneholder næringsmidler avgjørende for celledyrking pumpes kontinuerlig til kammeret fra mediumreservoaret. Mediet inneholder en spesifikk konsentrasjon av ett eller flere dyrkingsbegrensende næringsmiddel som tillater dyrking av konsortiet i en styrt, psykologisk stasjonær. Å variere, på sin side, konsentrasjonen av de dyrkingsbegrensende næringsmidlene vil endre den stasjonære konsentrasjonen av celler. Effluenten, som består av ubrukte næringsstoffer, metabolsk avfall og celler, fjernes kontinuerlig fra karet, pumpes fra kjemostat bioreaktoren til effluentreservoaret og overvåkes for fullstendig reduksjon av nitrat For å opprettholde konstant volum, opprettholdes strømmen av næringsmidler og fjerningen av effluent ved samme rate og styres av synkroniserte sprøytepumper.
Anrikingsforhold
Som oppgitt over kan en miljøprøve anrikes i følge oppfinnelsen heri ved å kultivere prøven i en kjemostat bioreaktor under ønskede forhold så som anaerobe denitrifiseirngsforhold. Ytterligere anrikingsforhold inkluderer å anvende et grunnleggende minimalmedium, så som SL-10 som beskrevet i tabell 2.
Kjemostat bioreaktoren kan holdes ved en romtemperaturer som kan fluktuere fra omlag 15 °C til omlag 35 °C.
Det stasjonære konsortiet kan anrikes under anaerobe derjitrifiseringsforhold ved å anvende et nitratsalt som elektronakseptoren. Anrikingskulturen kan derved inkludere nitratkonsentrasjoner fra 25 ppm til 10 000 ppm. Mer spesifikt kan nitratkonsentrasjonen være fra 25 ppm til 5000 ppm. Mest spesifikt kan nitratkonsentrasjonen være fra 100 ppm til 2000 ppm.
I én utførelsesform ble et anriket stasjonært mikrobielt konsortium betegnet POG1 utviklet under denitrifiseringsforhold med et nitratsalt som elektronakseptoren. Andre egnede anaerobe reduksjonsforhold ville anvendt selektive elektronakseptorer som inkluderer, elektronakseptorer som kan anvendes for å utvikle lignende konsortier inkluderer, men er ikke begrenset til: jern (JU), mangan (IV), sulfat, karbondioksid, nitritt, jernion, svovel, sulfat, selenat, arsenat, karbondioksid og organiske elektronakseptorer som inkluderer, men ikke er begrenset til kloretener, fumarat, malat, pyruvat, acetylaldehyd oksaloacetat og lignende innettede hydrokarbonfbrbindelser kan også anvendes.
Anrikingen av konsortiet kan inkludere en minimal dyrkingsmedium supplert med ytterligere påkrevde næringsstoffsupplementer, f.eks. vitaminer og spormetaller, og råolje som karbonkilden som beskrevet i detalj nedenfor.
Dette konsortiet kan dyrkes ved en pH fra 5,0 til 10. Mer spesifikt kan pH-en være fra 6,0 til omlag 9,0. Mest spesifikt kan pH-en være fra 6,5 til 8,5. I tillegg bør det stasjonære konsortiet ha en OD55ofra omlag 0,8 til omlag 1,2 og bør aktivt redusere elektronakseptoren.
Karakterisering av mikrobielle populasjoner i det anrikede stasjonære mikrobielle konsortiet
Bestanddeler eller de mikrobielle populasjonene i det anrikede stasjonære konsortiet kan identifiseres med molekylære fylogenetiske lypebestemmelsesteknikker. Identifisering av mikrobielle populasjoner i et konsortium tilveiebringer for valg av et konsortium med visse mikrobielle genera og arter beskrevet som å ha relevante funksjonaliteter for å øke oljeutvinning.
I en utførelsesform av oppfinnelsen ble et anriket stasjonært konsortium (referert til som "POG1") utviklet fra en blandet moderkultur, anriket fra en miljøprøve, ved å anvende råolje fra det utpekte reservoaret som energikilden. Ulike bestanddeler i konsortiet blekarakterisert vedå anvende fingeravtrykkprofiler av deres 16S rDNA som beskrevet nedenfor, å anvende signaturregioner inne i de variable sekvensregionene funnet i mikroorganismers 16S rRNA-gen (se Gerard Muyzer, et al., Appl. Environ. Microbiol., 59: 695,1993). DNA-sekvenser av V3-regionen av 16S rRNA-gener i en blandingspopulasjon ble utpekt og PCR forsterket som beskrevet i detalj nedenfor. Ved å bruke denne fremgangsmåten ble et konsortium innbefattende elementer fra Thauera, Rhodocyclaceae, Pseudomonadales, Bacteroidaceae, Clostridiaceae, Incertae Sedis, Spirochete, Spirochaetaceaes, Deferribacterales, Brucellaceae og Chloroflexaceaekarakterisert(figur 1). Thauera- staxnmen AL9:8 var den dominerende mikroorganismen i konsortiet. Den representerte mellom 35 til 70 % av bestanddelene under prøvetakingsprosesser. Det var 73 unike sekvenser (SEKV.ID-NR.: 15 - 87), som var gruppert inn i åtte bakteriefylum, som inkluderte alfa,- Proteobacteria, beta.- Proteobacteria, gamma-Proteobacteria, Deferribacteraceae, Spirochaetes, Bacteroidetes, Chloroflexi (grønn svovelbakterie) og Firmicutes / Clostridiales. Den primære genera fortsatte å være betSL- Proteobacteria, Thauera, og TTiaHera-stammen AL9:8 var den dominerende bestanddelen. Det var en stor diversitet blant elementene i Thauera/ Azoarcus-gruppen ( Rhodocyclaceae), hvor det var 31 unike 16S rDNA-sekvenser hvis sekvensforskjeller forekom i de variable regionenes primære signaturregioner. Også Firmicutes/ Clostridiales- grwppea var variert med 16 unike sekvenser som inkluderer bestanddeler fra Clostridia- ( Clostridiaceae) og Anaerovorax- og Finegoldia-gruppen ( Incertae Sedis). Ytterligere analyser ved å anvende fingeravtrykkprofilering kan tillate å tildele DNA-båndene i DGGE DNA-fhigeravtrykket noen av disse sekvensene.
Basert på disse karakteriseringene av prøver av et anriket stasjonært mikrobielt konsortium, inkluderer en utførelsesform av oppfinnelsen et anriket stasjonært konsortium innbefattende arter fra: beta,- Proteobacteria ( Rhodocyclaceae, spesifikt Thauera), aifn- Proteobacteria, gdxnmz- Proteobacteria, Deferribacteraceae, Bacteroidetes, Chloroflexi og Firmicutes / Clostridiales fyla. Visse mikrobielle genera og arter er kjent for å ha evnen til å øke oljeutvinning. Se sideløpende amerikansk søknad nr. 12/194749, som spesifikt beskriver de én eller flere mikrobielle kulturene som kan velges fra gruppen bestående av Marinobacterium georgiense fATCC#33635j, Thauera aromatica Tl (ATCC#700265j, Thauera chlorobenzoica (ATCC#700723), Petrotoga miotherma (ATCC#51224), Shewanellaputrefaciens (ATCC#51753), Thauera aromatica S100 ( ATCC§700265), Comamonas terrigena (ATCC#14635), Microbulbifer hydrolyticus (ATCC#700072), og blandinger av disse, som har relevante funksjonaliteter for å forbedre oljeutvinning. Følgelig er det innenfor omfanget til oppfinnelsens fremgangsmåter å tilveiebringe en fremgangsmåte hvori de én eller flere ikke-stedegne mikroorganismene er: a) valgt fra gruppen bestående av Marinobacterium georgiense Thauera aromatica Tl, Thauera chlorobenzoica Petrotoga miotherma Shewanella putrefaciens, Thauera aromatica Sl 00), Comamonas terrigena (, Microbulbifer hydrolyticus, og blandinger av disse; og b) innbefatter enl6s rDNA-sekvens som har minst 95 % identitet med en 16s rDNA-sekvens isolert fra mikroorganismene i (a).
Å sammenligne et anriket stasjonært konsortiums komponenter med fylogenien til kjente mikroorganismer som har evnen til å øke oljeutvinning tilveiebringer en mekanisme for å velge et konsortium som er nyttig for å øke oljeuWinning. Videre kan slike kjente mikroorganismer tilsettes til et stasjonært konsortium for å øke oljeutvinning ytterligere.
Fylogenetisk typebestemmelse
Den følgende beskrivelsen tilveiebringer mekanismer for å karakterisere bestanddelene i det anrikede stasjonære mikrobielle konsortiet.
Fremgangsmåter for å generere oligonukleotidprober og mikrogrupperinger for å utføre fylogenetisk analyse er kjent for fagpersonen (Loy, A., et al., Appl. environ. Microbiol., 70: 6998-700,2004) og (Loy A., et al., Appl. Environ. Microbiol., 68: 5064-5081,2002) og (Liebich, J., et al., Appl. Environ. Microbiol., 72: 1688-1691, 2006). Disse fremgangsmåtene brukes heri til formål for å identifisere mikroorganismer nærværende i en miljøprøve.
Spesifikt ble bevarte sekvenser av 16S ribosomalt RNA-kodingsregionen av det genom DNA-et brukt heri. Det er imidlertid andre nyttige metodologier for fylogenetisk typebestemmelse nevnt i litteraturen. Disse inkluderer: 23S rDNA eller roterte A-gener eller hvilke som helst andre høyt bevarte gensekvenser. 16S rDNA er vanlig brukt fordi det er den største databasen med sammenlignbart kjente fylogenetiske genotyper og har vist seg å tilveiebringe en robust beskrivelse av store evolusjonsforbindelser (Ludwig, W., et al., Antonie Van Leewenhoek, 64: 285,1993 and Brown, J.R. et al., Nature Genet., 28: 631,2001).
Primerne beskrevet heri ble valgt som relevante for miljøprøver fra et oljereservoar (Grabowski, A., et al., FEMS Micro. Eco., 544: 427-443,2005) og ved sammenligning med andre primersett brukt til andre miljøstudier. En gjennomgåelse av primere tilgjengelige for bruk heri finnes i Baker et al (G.C. Baker, G. C. et al., Review and re-analysis of domain-specific primers, J. Microbiol. Meth., 55: 541-555,2003). Hvilke som helst primere som genererer en del eller hele 16S rDNA-sekvensen vil være egnet for den krevde fremgangsmåten.
DNA-ekstraksjon med fenol/kloroform-teknikk er kjent i teknikken og brukes heri som passende for å ekstrahere DNA fra oljekontaminerte miljøprøver. Det er imidlertid andre metodologier for DNA-ekstraksjon i litteraturen som kan anvendes i henhold til den foreliggende oppfinnelse.
DNA-sekvenseringsmetodologier som genererer > 700 basiser av høykvalitetssekvens kan anvendes for typen plasmid basert på sekvensering i henhold til den foreliggende oppfinnelse sammen med andre sekvenskvalitetsanalyseprogrammer. Sammenligningen ved homologi ved å anvende BLAST-algoritmene på hvilke som helst omfattende database over 16S rDNA-er vil oppnå et akseptabelt resultat for å identifisere generaen for mikroorganismer nærværende i miljøprøven. De mest vanlig anvendte databasene er ARB (Ludwig, W., et al, ARB: et programvaj^miljø for sekvensdata. Nucleic Acid Res., 32:1363-1371,2004) og NCBI.
Fingeravtrykkprofilering
Fingeravtrykkprofilering er en prosess for å generere et bestemt mønster av DNA-bånd på en elektroforesegel som er definert av deres lengde og sekvens. Denne profilen anvendes for å identifisere og beskrive den dominerende mikrobielle populasjonen for en kulturevaluerende mikrobiell diversitet og populasjonsstabilitet ved bestemt metabolsk tilstand. For eksempel representerer hvert bånd og dets intensitet i en gitt D GGE-fingeravtrykkprofil en individuell bakteriell art nærværende i kolonien og dens relative representasjon i populasjonen. Når de er generert, representerer dataene en fingeravtrykkprofil for populasjonen på et gitt tidspunkt og under visse dyrkingsforhold. DGGE-fingeravtrykkprofilen kan sammenHgnes med profiler i konsortiet under foreskrevne dyrkingsforhold.
Denatureringsgradient gelelektroforese
Denne teknikken har blitt adoptert for å analyser PCR-forsterkningsprodukter ved å utpeke variable sekvensregioner i bevarte gener så som én av de ni variable regionene som finnes i mikroorganismers 16S rRNA-gen (Gerard Muyzer et al., supra og Neefs, J-M et al., supra, og Botter, E. C, ASM News 1996). DGGE tilveiebringer en genetisk fingeravtrykkprofil for hvilken som helst gitt populasjon. Denatoeringsgradient gelelektroforese (DGGE) og temperaturgradient gelelektroforese (TGGE) er elektroforesegelseparasjonsfremgangsmåter som detekterer forskjeller i små DNA-fragmenters (50-600 bp) denatureringsoppførsel, og skiller DNA-fragmenter av samme størrelse basert på deres denaturerings- eller "smelte"-profiler relatert til forskjellene i deres basissekvenser. Dette står i kontrast til ikke-denatureringselektroforesegel hvor DNA-fragmenter kun skilles etter størrelse.
DNA-fragmentene elektroforeses gjennom en parallell DGGE-gel, slik kalt fordi denatureringsmiddelets lineærgradient -30-60 % (urea/formamid) er parallell med gelens elektriske felt. Ved å anvende DGGE separeres eller smelter to strenger av et DNA-molekyl når en kjemisk denatureringsmiddelgradient tUføres ved konstant temperatur mellom 55 °-65 °C. Denatureringen av en DNA-dupleks påvirkes av to faktorer: 1) hydrogenbåndene tilformet mellom komplementære basispar (ettersom GC-rike regioner smelter ved høyere denatureringsforhold enn regioner som er AT- rike; og 2) tiltrekningen mellom nabobasiser av samme streng, eller "stabling". Følgelig kan et DNA-molekyl har flere smeltedomener, avhengig av denatureringsforholdene, som er karakteristiske for og fastsettes av deres nukleotidsekvens. DGGE utnytter det faktum at praktisk talt identiske DNA-molekyler som har samme lengde og lignende DNA-sekvens, som kan avvike med kun én nukleotid inne i et spesifikt denatureringsdomene, vil denaturere ved forskjellige forhold. Derved, når det dobbeltstrengede (ds) DNA-fragmentet beveger seg (via elektroforese) gjennom en gradient med økende kjemisk denatureringsmiddel, urea, formamid eller begge deler, begynner det å denaturere og går gjennom både form- og mobilitetsendringer. På ett tidspunkt vil de to DNA-strengene falle fullstendig fra hverandre (også kalt "smelting"). Ved noen av de mellomliggende denatureringsmiddelkonsentrasj onene, ettersom denatureringsmiljøet øker, vil imidlertid de to strengene blir delvis atskilt, mens noen segmenter av molekylene fremdeles er dobbeltstrenget og andre er enkeltstrenget, spesifikt i de spesielt lave denatureringsdomene; derved tilformes variable og mellomliggende denaturerte strukturer, som begynner å forsinke fragmentenes bevegelse gjennom geldemtureringsmiddelgradientene. dsDNA-fragmentet vil bevege seg raskere enn et denaturert enkeltstrenget (ss) DNA-fragment. Det mer denaturerte fragmentet vil bevege seg saktere gjennom gehnatrisen. DGGE-gelelektroforesefremgangsmåten tilbyr en"sekvensavhengig, størrelsesuavhengig fremgangsmåte" for å skille DNA-molekyler.
I praksis utføres DGGE-elektroforesen ved en konstant temperatur (60 °C) og kjemiske denatureringsmidler anvendes ved konsentrasjoner som vil resultere i at 100 % av DNA-molekylene blir denaturert (dvs. 40 % formamid og 7M urea). Denne variable denatureringsgradienten opprettes ved å anvende en gradientskaper, slik at denatureringsmidlers sammensetning i gelen gradvis reduseres fra bunnen av gelen til toppen, hvor fragmentene er lastet, f.eks. 60 % til 30 %.
Prinsippet som anvendes i DGGE-profilering kan også brukes på en andre fremgangsmåte, temperaturgradient gelelektroforese (TGGE) som bruker en temperaturgradient i stedet for en kjemisk denatureringsmiddelgradient. Denne fremgangsmåten anvender en temperaturgradient for å indusere formendringen av dsDNA til ssDNA for å skille fragmenter av samme størrelse med forskjellige sekvenser. Som i DGGE vil DNA-fragmenter blir immobile i forskjellige posisjoner i gelen avhengig av deres forskjellige nukleotidsekvenser.
For å karakterisere mikrobielle kolonier, har DGGE-fmgeravtrykkprofilering blitt brukt for å identifisere og karakterisere komplekse mikrobielle populasjoners genetiske diversitet mye slik riboavtrykk har blitt brukt for å identifisere nye miljøisolater via deres rRNA-fingeravtrykkprofil som å være de samme eller forskjellige fratidligere beskrevne stammer.
Ved praktisering av DGGE-profilering, utpekes de variable sekvensregionene som
finnes i mikroorganismers 16S rRNA-gener i PCR-forsterkning av hele DNA isolert fra en blandingspopulasjon (Gerard Muyzer et al ( supra)). Variabelen eller det "V"-regionale segmentet avviker ikke kun i nukleotidsekvens, men i lengde og sekundær struktur i sekvensen. Den er kun gjenkjennelig som lignende sekvens i kun nært beslektede mikroorganismer. Det er ni variable regioner i det bakterielle/arkeale 16S-genet. Disse variable regionene betegnes av bokstaven V pluss tallet 1 til og med 9. To V-regioner er mest nyttige ved anvendelse av DGGE-profilanalyse, V3-regionen og V4/V5-regionen. Begge V-regioner er flankert av universelt bevarte U-regioner.
V3-regionen er flankert av to U-sekvenser. Den første ved basiskoordinater 341 til 357 hvor bakterie- og arkesignatursekvenser eksisterer. Bakteriell universal primer, UB357F (SEKV.NR.: 5) og arkeale universale primere 341F1 og 341F2, (SEKV.NR,: henholdsvis 7, 9) er formgitt fra denne regionen. Den andre U-regionen, som er universelt bevart i alle fylogenetiske domener, finnes ved basiskoordinater 518 til 534. Den reverserende universalprimeren for domenet, UB518R (SEKV.NR.: 5) utformes fra denne regionen.
V4/V5-regionen flankeres også av to universelt bevarte sekvenser. Den første som over er i domeneuniversalregionen ved basiskoordinater 518 til 534. Den universale domenefremmeren U519F (SEKV.NR.: 11) ble utformet fra denne regionen. Den andre regionen ved basiskoordinater 918 til 960, hvor ytterligere universal bakterie-og arkesignatursekvenser eksisterer. Den bakterielle reverserende universalprimeren, UB939R (SEKV.NR.: 14) og arkeale universalprimeren UA958R (SEKV.NR.: 13) i denne søknaden ble utformet fira denne regionen.
En 40-bp GC-rik klemme i 5'-enden av én av PCR-primerne gjør fremgangsmåten robust for genetisk fmgeravtrykkprofileringsanalyse av mikrobielle populasjoner. For profilanalyse av region V3 ble GC-klemmen utformet inn i den bakterielle universalprimeren, betegnet dG»UB357F (SEKV.NR.: 6) og arkeale universale primere betegnet dG*341Fl og dG»341F2, (SEKV.NR.: henholdsvis 8,10), og for V4/V%-regionen ble den universale domenefremmeren, betegnet dG»U 519F (SEKV.NR.: 12) utformet fra denne regionen. Ved å anvende denne fremgangsmåten, produserer PCR-forsterkning av det totale DNA-et fra en variert mikrobiell populasjon forsterkede fragmenter bestående av heterogene sekvenser med en lengde på omtrent 193 bp. Disse 16S rDNA-fragmentene, når de analyseres med DGGE-analyse, demonstrerer nærværet av flere skjelnbare bånd i skillemønsteret, som er derivert fra de mange forskjellige artene som utgjør populasjonen. Hver bånd representerer derved et distinkt element i populasjonen. Intensitet for hvert bånd er mest sannsynlig representativ for den relative rikdommen av en bestemt art i populasjonen, etter at intensiteten korrigeres for rRNA-genkopier i én mikrobe kontra kopiene i andre. Båndmønsteret representerer også en DGGE-profil eller -fingeravtrykk for populasjonene. Ved å anvende denne fremgangsmåten, er det mulig å identifisere bestanddeler som kun representerer 1 % av den totale populasjonen. Endringer i populasjonens DGGE-fmgeravtrykkprofil kan signalisere endringer i parametrene, f.eks. elektrondonorene og elektronakseptorene som fastsetter koloniens dyrking og metabolisme som et hele. ;Relevante funksjonaliteter forkarakterisert, anriket stasjonært mikrobielt konsortium Når et anriket stasjonært mikrobielt konsortium kan blittkarakterisert, eller i visse utførelsesformer før genetisk karakterisering av den genetiske bestanddels-karakteriseringen, kan konsortiet undersøkes for én eller flere relevante funksjonahteter relatert til å øke oljeutvinning, inkludert evne til å bryte ned råolje under forholdene av interesse. Undersøkelser for de relevante funksjonalitetene inkluderer mikrosandkolonne frigjøringsundersøkelse og LOOS-testen (frigjøring av olje fira sand (Liberation of Oil Off Sand)) (se eksempel 8) og "sandfylt smalrør eller kjerneoverfyllingstest (sand packed slim tube or core flood test). ;Å inokulere en oljebrønn for økt oljeutvinning ;De følgende trinnene utføres for å inokulere en oljebrønn/-reservoar: ;a) Å inokulere det mikrobielle konsortiet i en bioreaktor som inneholder et anaerobt minimalsaltmedium, målråoljen og en egnet elektronakseptor (f.eks. nitrat heri). b) Å inkubere det mikrobielle konsortiet i trinn (a) ved en temperatur lignende målbrønnen for å oppnå en såpopulasjon for det mikrobielle konsortiet (f.eks. 30 °C, ;eller i området for romtemperatur, +/- 5 °C i denne redegjørelsen). ;c) Å inokulere det såmikrobielle konsortiet i trinn (b) under anaerobt forhold i anaerobt reservoarinnsprøytingsvann. d) Å sprøyte den biologiske blandingen i trinn (c) inn i reservoaret, etterfulgt av innsprøytingsvann med oppløst elektronakseptor for å skyve konsortiumblandingen ;inn i den underjordiske reservoarmatrisen, for å tillate det mikrobielle konsortiet å dyrkes og formere seg, noe som resulterer i dissosiasjon og fngjøring av råoljen fra reservoarmatrisen. ;Fordeler ved å øke oljeutvinning ved å anvende anriket stasjonært mikrobielt konsortium ;I denne søknaden er det redegjort for fremgangsmåter for å tilveiebringe et anriket stasjonært konsortium av mikrobiell populasjon under demfrifiseringsforhold(ved å anvende en anaerob elektronakseptor), ved å anvende en kjemostat bioreaktor. Den anrikede stasjonære konsortiumpopulasjonen nedbryter råoljekomponenter anaerobt under reservoarforhold for å modifisere råoljens og/eller reservoarmiljøets fysiokjemiske egenskaper, som resulterer i økt utvinning av råoljen. Det ideelle konsortiet vil utvikles og anrikes fra en stedegen mikrobiell populasjon. ;En ytterligere fordel ved bruken av det foreliggende mikrobielle konsortiet kan være i forebyggingen av skaden på oljerørledninger og oljeutvinningsutstyr. Korrosjon på oljerørledningen og annet oljeutvinningsutstyr kan defineres som det destruktive angrepet på metaller av noen mikrobielle, kjemiske eller elektrokjemiske mekanismer. Mikrobielt påført korrosjon i oljerørledninger er kjent (EP3543361 B og US4879240A) og forårsakes av en rekke mikroorganismer inkludert, men ikke begrenset til, aerobe bakterier, anaerobe bakterier, syredannende bakterier, slimdannere og sulfatreduserende bakterier (SRB). I et anaerobt miljø skyldes korrosjon mest vanlig fremvekst av dissimilatorisk SRB. Denne gruppen bakterier er ansvarlig for muligens 50 % av alle tilfeller av korrosjon. Kontrollen av mikrobiell korrosjon i oljeutvinningsoperasjoner inkorporerer generelt både fysiske eller mekaniske og kjemiske behandlinger. ;Anvendelsen av nitrat som et middel for å kontrollere SRBs aktivitet og fjerne hydrogensulfid fra oljerørledninger og annet oljeutvinningsutstyr er godt dokumentert (The stimulation of nitrate-reducing bacteria (nrb) in oilfield systems to control sulfate-reducing bacteria (srb), microbiologically influenced corrosion (mic) and reservoir souring an introductory review, publisert av The Energy Institute, London, 2003). Bruk av denitrifiserende mikroorganismer for å øke oljeutvinning kan derfor tilveiebringe et kostnadseffektivt, effektivt og miljømessig akseptabelt middel for å kontrollere SRB og bøte på hydrogensulfidkontaminerte systemer, for å unngå å anvende dyre og miljømessig uakseptable organiske biocider. Det foreslås derfor at å anvende konsortiet av denitrifiserende anaerobt mikrobielt konsortium POG1 ikke bare ville være fordelaktig for oljeutvinning, det vil også forhindre kostbar skade på oljerørledninger og annet oljeutvinningsutstyr. ;Generelle fremgangsmåter ;Dyrke mikroorganismer ;Teknikker for å dyrke og vedlikeholde anaerobe kulturer beskrives i "Isolation of Biotechnological Organisms from Nature", (Labeda, D. P. ed. pll7-140, McGraw-Hill Publishers, 1990). Anaerob dyrking ble målt ved m^attønmiing fra dyrkingsmediet over tid. Nitrat ble brukt som den primære elektronakseptoren under dyrkingsforholdene anvendt i denne oppfinnelsen. Reduksjonen av nitrat til nitrogen har blitt beskrevet tidligere (Moreno-Vivian, C, et al., J. Bacteriol.,181: 6573 - 6584,1999). I noen tilfeller fører nitratreduksjonsprosesser til mtrittakkumulasjon, som deretter reduseres ytterligere til nitrogen. Akkumulasjon av nitritt betraktes derfor også som bevis for aktiv dyrking og metabolisme av disse mikroorganismene. ;Beskrivelse av kjemostat bioreaktoren anvendt i denne oppfinnelsen ;I denne redegjørelsen ble en kjemostat bioreaktor anvende som en bioreaktor for å holde konsortiumpopulasjonen stasjoner, ved å anvende rikelig med råolje som eneste energikilde og en begrensende nitrattilførsel, som elektronakseptoren. Figur 3 viser et diagram av kjemostat bioreaktoren som anvendes i denne oppfinnelsen. Kjemostat bioreaktoren ble utformet og anvendt som et kontinuerlig kultiveringssystem, ved å anvende en konstant mating av medium og nitrat for å utvikle en stasjonær populasjon betegnet "POG1-konsortium". Kjemostat bioreaktoren ble operert under anaerobe forhold, ved romtemperatur, pH 7,4 og ett atmosfæretrykk, ved å anvende den utpekte råoljen (Milne Pont-reservoaret, North Slope i Alaska) som karbonkilde (primær kilde for elektrondonorer), og å tilføre et minimalsaltmedium (tabell 2) inneholdende minimale vesentlige mineraler, salter, viteminer og nitrat, som primær elektronakseptor, for dyrking. ;Kjemostat bioreaktoren ble satt opp i en kjemikaliehette ved romtemperatur (20 til 25 °C). Alle luftrom var anaerobe, ved å anvende et teppe av nitrogen og et system med åpennitrogenstrøm (< 1 psi), med et reversert dobbelt blåserørsystem, inneholdende ;5 ml mineralolje som stengte systemet fra atmosfæren. Både det innledende SL10-mediet (tabell 2) i bioreaktoren og mediummatereservoaret ble avgasset med en anaerob blanding av karbondioksid og nitrogen (20/80 på en %-basis) i 10 min, pH-en kontrollert og deretter titrert med enten C02/N2-blanding eller bare N2til en pH på 7,4. SL10 minimalsaltmediet (11) i bioreaktoren ble innledningsvis supplert med 800 ppm nitrat og 400 ml av den utpekte råoljen. Bioreaktoren ble inokulert med 50 ml av 3. generasjons (3. gen) moder-POGl-en fra anrikingskulturen (benevnt EH50:1) dyrket på målråoljen og 1600 ppm nitrat i 1 uke, og inkubert ved romtemperatur ved risting ved 100 rpm. En magnetomrører i bunnen av reaktoren rørte om kulturen ved 40 til 50 rpm. ;
SLlO-mediet, supplert med 3800 ppm nitrat, ble pumpet fra mediumreservoaret (figur 3: G) inn i kjemostat bioreaktoren ved hjelp av matesprøytepumpen (KDS230 Syringe Pump, KD Scientific, Holliston, MA) (figur 3: D). En prøvetakingsport ble festet til og på linje med matesprøytepumpen. En 5 ml Becton-Dickinson (BD) steril plastpolypropylensprøyte (figur 3: C) (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) ble festet til prøvetakingsporten og hadde en dobbeltfunksjon: 1) som en prøvetakingssprøyte for inngangsmatingen og 2) som en 5 psi trykkavlastningsventil for matesprøytepumpen. Effiuenten fra kjemostat bioreaktoren ble pumpen inn i et effluentreservoar (figur 3: L) ved hjelp av effluentsprøytepumpen (supra) (figur 3: 0). En andre prøvetakingsport ble festet til og på linje med effluentsprøytepumpen. Effluentprøvetakingsporten hadde også en 5 ml BD steril plastpolypropylensprøyte ( supra) festet (figur 3: P). Igjen fungerte den både som en prøvetakingssprøyte for effluent og en 5 psi trykkavlastningsventil for effluentsprøytepumpen. ;Ta miljøprøven ;I denne redegjørelsen ble jord- eller vannprøver tatt fra anaerobe og mikroaerofile ;(aerobe mikroorganismer som krever lavere nivåer av oksygen for å overleve) ;lokaliteter på et industriområde, som hadde blitt eksponert for tjære, kreosol og polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH-er) anvendt for å utvikle det mikrobielle konsortiet. Jordprøver ble tatt fra lokaliteter hvor PAH-er hadde blitt vist å være på høye nivåer. Jordprøver ble plassert i 500 ml brune flasker, fylt til topps, forseglet uten plass til luft og deretter skipet tilbake til laboratoriet på is i en kjøler. I laboratoriet ble prøvene plassert i et Coy Type B anaerobt kammer (Coy Laboratories, Grass Lake, MI), fylt med en spesifikk anaerob gassblanding (oksygenfri anaerob blanding av hydrogen, karbondioksid og nitrogen, henholdsvis 5 %, 10 % og 85 %) for videre prosessering. ;Ionekromatografi ;En ICS2000 kromatografienhet (Dionex, Banockburn, IL) ble anvendt for å kvantitere nitrat- og nitrittioner i dyrkingsmediet. Ionebytte ble oppnådd på en AS 15 ionebyttekolonne ved å anvende en gradient på 2 til 50 mM kaliumhydroksid. Standardkraver ble generert og anvendt for å kalibrere nitrat- og nitrittkonsentrasj oner. ;Genom DNA-ekstraksjoner fra bakterielle kulturer ;For å ekstrahere genom DNA fra bakterielle kulturer i væskeform, ble cellene høstet og konsentrert ved filtrering på et 0,2 mikron Supor<®->filter (Pall Corp, Ann Arbor, MI) eller ved sentrifugering. En alikvot (2-5 ml) av en bakteriell kultur ble passert gjennom en 0,2 mikron, 25 mm filterskive i en uttakbar kassettholder ved å anvende enten vakuum eller sprøytetrykk. Filtrene ble fjernet og plassert i følgende lysisbuffer (100 mM Tris-HCL, 50 mM NaCl, 50 mM EDTA, pH 8,0) etterfulgt av omrøring ved å anvende en Vortex-blander. De følgende reagensene ble deretter tilsatt til en endelig konsentrasjon på 2,0 mg/ml lysozym, 10 mg/ml SDS og 10 mg/ml Sarkosyl for å lysere cellene. Etter ytterligere blanding med en Vortex-blander ble 0,1 mg/ml RNase og 0,1 mg/ml Proteinase K tilsatt for å fjerne RNA- og proteinkontaminantene, og blandingen ble inkubert ved 37 °C i 1,0- 2,0 hr. Etter inkubasjon ble filtrene fjernet og prøver ble ekstrahert to ganger med et likt volum av en fenol: kloroform: isoamylalkohol (25:24:1, v/v/v) og én gang med kloroform: isoamylalkohol (24:1, v/v). En tiendels volum av 5,0 M NaCl og to volumer av 100 % etanol ble tilsatt til det vannholdige sjiktet og blandet. Rørene ble frosset ved -20 °C over natten og deretter sentrifugert ved 15 000 xg i 30 min ved romtemperatur for å pelletere kromosom-DNA. Pelletene ble vasket én gang med 70 % etanol, sentrifugert ved 15 000 xg i 10 min, tørket, resuspendert i 100 ul avionisert vann og oppbevart ved -20 °C. En alikvot av det ekstraherte DNA-et ble analysert på en agarosegel for å bestemme det ekstraherte DNA-ets kvantitet og kvalitet. Populasjonsanalyse av mikroorganismene i det stasjonære konsortiet og moderanrikingskulturer ved å anvende klonede 16S rDNA-biblioteker ;Primersett ble valgt fra Grabowski et al. (FEMS Microbiol. Ecol., 54: 427- 443, 2005) for å generere 16S rDNA av mikrobielle arter i DNA-prøver preparert fra konsortiet. Kombinasjonen av forover primer (SEKV.NR.: 1) og reverserende primer (SEKV.NR.: 2 eller 3) ble valgt for å spesifikt forsterke de bakterielle 16S rDNA-sekvensene. ;PCR-forsterkningsblandingen inkluderte: 1,0 X GoTaq PCR-buffer (Promega), 0,25 mM dNTPs, 25 pmol av hver primer, i 50 Dl reaksjonsvolum. 0.5 Dl GoTaq polymerase (Promega) og 1,0 Dl (20 ng) prøve-DNA ble tilsatt. Termosykloprotokollen for PCR-reaksjon som ble anvendt var 5,0 min ved 95 °C etterfulgt av 30 sykluser på: 1,5 min ved 95 °C, 1,5 min ved 53 °C, 2,5 min ved 72 °C og endelig forlengelse i 8 min ved 72 °C i en Perkin Eimer 9600 termosykler (Waltham, MA). Denne protokollen ble også anvendt med celler fra enten rensede kolonier eller blandede arter fra anrikmgskulturer. ;1400-baseparforsterkningsproduktene for en gitt DNA-bank ble visualisert på 0,8 % agarosegeler. PCR-reaksjonsblandingen ble anvendt direkte for å klone til pPCR - ;TOP04-vektor ved å anvende TOPO TA-klonesystemet (Invitrogen) som anbefalt av produsenten. DNA ble transformert til TOP10 kjemiske kompetente celler med valg for ampiciUinresistens. Individuelle kolonier (~48-96 kolonier) ble valgt og dyrket i mikrotiterplater for sekvensanalyse. ;Preparere plasmidmal ;Storskalaautomatiserte malrensingssystemer anvendte faststoffase reversibel immobilisering (Solid Phase Reversible Immobilization) (SPRI, Agencourt, Beverly, MA) (DeAngelis, M. M., et al., Nucleic AcidRes., 23: 4742 - 4743,1995). SPRI<®->teknologien anvender karboksylatbelagte, paramagnetiske partikler med jernkj erne for å fange DNA med en ønsket fragmentlengde basert på avstemte bufringsforhold. Når det ønskede DNA-et er fanget på partiklene, kan de konsentreres og skilles magnetisk slik at kontaminerende stoffer kan vaskes bort. ;Plasmidtemplatene ble renset ved å anvende en strømlinjet SprintPrep™ SPRI-protokoll (Agencourt). Denne prosedyren høster plasmid-DNA direkte fra lyserte bakterielle kulturer ved å fange både plasmid- og genom DNA til de funksjonaliserte dråpepartiklene og å selektivt eluere kun plasmid-DNA-et. I korthet involverer rensingsprosedyren å tilsette alkalisk lysisbuffer (som inneholder RNase A9 til den bakterielle kulturen, å tilsett alkoholbasert presipitasjonsreagens inkludert paramagnetiske partikler, å skille de magnetiske partiklene ved å anvende tilpassede ringbaserte magnetiske separatorplater, å vaske dråper 5x med 70 % ETOH og å eluere plasmid-DNA-et med vann. ;rDNA-sekvensering, klonesammenstilling og fylogenetisk DNA-analyse DNA-templater ble sekvensert i et 384-brønnforaiat ved å anvende BigDye® Version 3.1-reaksjoner på ABI3730-instrumenter (Applied Biosystems, Foster City, CA). Termosykling ble utført ved å anvende en 384-brønns termosykler. ;Sekvenseringsreaksjoner ble renset ved å anvende Agencourts CleanSeq® dye-terminator fjerningssett som anbefalt av produsenten. Reaksjonene ble analysert med en modell ABI3730XL kapillærsekvenser ved å anvende et utvidet kjøremodul utviklet ved Agencourt. Alle sekvensanalyser og anrop ble prosessert ved å anvende Phred basisanropsprogramvare (Ewing et al., Genome Res., 8:175 -185, 1998) og overvåket konstant mot kvalitetsmålestokker. ;Sammenstille rDNA-kloner ;En fil for hver rDNA-klone ble generert. Sammenstilhngen av sekvensdataene generert for rDNA-klonene ble utført av PHRAP-sarmnenstillingsprogrammet (Ewing, et al., supra). Patenterte skripter genererer konsensussekvens- og konsensuskvalitetsfiler for større enn én overlappende sekvensavlesning. ;Analysere rDNA-sekvenser ;Hver sammenstilt sekvens ble sammenlignet med NCBI (rDNA-database;~260 000 rDNA-sekvenser) ved å anvende BIAST-algoritmeprogrammet (Altschul, supra). BLAST-treffene ble anvendt for å gruppere sekvensene i homologiklynger med > 90 % identitet med det samme NCBI rDNA-fragmentet. Homologiklyngene ble anvendt for å beregne proporsjoner for bestemte arter i hvilken som helst prøve. Fordi forsterknings- og kloneprotokoller var identisk for analyse av hver prøve, kunne proporsjonene sammenlignes fra prøve til prøve. Dette tillot sammenligninger av populasjonsforskjeller i prøver tatt for forskjellige anrikingsvalg og/eller ved forskjellige prøvetakingstider for den samme anrikmgskonsortiumkulturen. Anvende fhigeravtrykkprofiler for å karakterisere komplekse mikrobielle populasjoners genetiske diversitet ;For å karakterisere mikrobielle kolonier, har DGGE-fingeravtrykkprofilering (som beskrevet over) blitt brukt for å identifisere og karakterisere komplekse mikrobielle populasjoners genetiske diversitet ;Med de variable sekvensregjonene som finnes i mikroorganismers 16S rRNA-gen som mål, PCR-forsterket Gerard Muyzer et al { supra) DNA-sekvens av 16S rRNA-geners V3-region i en blandet populasjon. Som oppgitt over, flankeres regionen av to universelt bevarte primerregioner, én ved 341 til 357 og den andre ved 518 til 534. En 40-bp GC-rik klemme i 5'-enden av én av PCR-primerne, som inkluderte: universal bakteriell primer 357, universale arkeale primere, 341F1, 341F2, (SEKV.NR.: 5,7 og 9) ble benevnt henholdsvis dG»UB 357, dG-UA 341F1 ogdG*UA341F2, (SEKV.NR,: 6, 8,10). Som beskrevet over ble rDNA PCR-produktene elektroforest på en lineærgradient av denatureringsmiddel ~30-60 %
(urea/formamid), som er parallell med gelens elektriske felt. DGGE-geler ble spredd og elektroforest ved å anvende et D Gene™: denatureringselektroforesesystem (Denaturing Electrophoresis System) fra BIORAD (Hercules, CA) ved å følge produsentens foreslåtte protokoller. rDNA-prøver ble elektroforest ved en konstant temperatur på 60 °C i 8-24 hr ved en passende spenning avhengig av 16S rDNA-fragmentpopulasjonen som ble analysert. Elektroforesebufferen (1XTAE) ble forvarmet til måltemperaturen i D GENE-kammeret før elektroforese. DGGE-geler ble farget med SYBR® GOLD nukleinsyrefarge (Invitrogen, Carlsbad, CA) for visualisering og avbildet på en Kodak avbildningsstasjon 440. Flere skjelnbare bånd, som ble visualisert i skillemønsteret, ble derivert fra de forskjellige artene som utgjorde POGl-populasjonen. Hver bånd representerte derved et distinkt element i populasjonen. Intensitet for hvert bånd var mest sannsynlig representativ for den relative rikdommen av en bestemt art i populasjonen, etter at intensiteten ble korrigert for rRNA-genkopier i én mikrobe kontra kopiene i andre. Båndrnønsteret representerte også en DGGE-profil eller -fingeravtrykk for populasjonene. Det mulig å identifisere bestanddeler, som kun representerer 1 % av den totale populasjonen. Endringer i populasjonens DGGE-fingeravtrykkprofil kan signalisere endringer i parametrene, f.eks. elektrondonorene og elektronakseptorene som fastsetter koloniens dyrking og metabolisme som et hele. Derved tilveiebrakte fremgangsmåten beskrevet over et unikt og kraftig verktøy for avgjørende identifisering av ulike mikrobielle arter i en blandet populasjon.
Mikrosandkolonne oljefrigjøringstest
Isolerte bakterielle stammer ble undersøkt for deres evne til å frigjøre olje fra sand ved å anvende en mikrosandkolonneundersøkelse for å visualisere oljefrigjøring. Mikrosandkolonnen besto av en invertert Pasteur-pipette av glass som inneholdt sanden (10 til 100 mikroner) fra North Slope-oljereservoarene i Alaska, som hadde blitt belagt med råolje og fått lov til å modnes i minst én uke. Spesifikt ble olje og sand autoklavert separat for å steriliseres. Autoklaverte sandprøver overføres deretter til en vakuumtørker og tørkes ved 180 °C i minimum én uke. Sterilisert tørket sand og olje ble deretter kombinert~1:1 v/v i et anaerobt miljø. Blandingene ble rørt om og tillatt å modnes i minimum syv dager i et anaerobt miljø. Løpene til Pasteur-pipette av glass (5 3A inches) ble kuttet til omlag halv høyde (3 inches) og autoklavert. Pipettens kuttede ende ble stukket ned i sand/olje-blandingen og kjernen fylt til omtrent 0,5 inches i høyde fra bunnen av pipetteløpet. Deretter ble den kuttede enden av pipetten, som inneholdt olje/sand-blandingen, plassert (med pipettens avsmalende ende pekende oppover) i det 13 mm glassreagensrøret. Et testinokulum i fire milliliter med niinimalsaltmediiim ble tilsatt i det 13 mm glassrøret. Apparat ble forseglet inne i 23 x 95 mm glassampuller i et anaerobt miljø. Olje frigjort fra sanden samles i Pasteur-pipettenes smale hals eller som små dråper på sandsjiktets overflate. Kulturer som økte frigjøring av olje over bakgrunn (sterilt medium) ble antatt å ha endret interaksjonen mellom oljen og sandoverflaten, og å demonstrere potensialet for å bidra til å øke oljeutvinning i et petroleumreservoar.
Gasskromatografi
En fremgangsmåte for flammeionisasjonsdetektor gasskromatografi (GC FID) ble utviklet for å analysere den våte sanden fra de ofrede smalrørene for restolje. Et empirisk forhold ble fastsatt basert på North Slope-sand og egenporevolumet for hardpakket sand, f.eks. for 240 g hardpakket sand var det et porevolum på 64 ml. Vekter for de individuelle sandprøvene ble tatt og oljen på sanden ble ekstrahert med en kjent mengde toluen. En prøve av denne toluenen med ekstrahert olje ble deretter analysert ved GC. Prøvene ble analysert ved å anvende en Agjlent Model 5890 gasskromatograf (Agilent, Wilmington, DE) utstyrt med en flammeionisasjonsdetektor, en sphtt/splittløs injektor og kapillærkolonne, DB5-kolonne (lengde 30 m X tykkelse 0,32 mm, filmtykkelse 0,25 □ m). En alikvot på 2 fil ble sprøytet inn med en analyse på 42 min. Injektortemperaturen var 300 °C og detektortemperaturen ble holdt på 300 °C. Bæregassen var helium, som strømmet ved 2 ml/min. FID-detektorgassene var luft og hydrogen som strømmet ved henholdsvis 300 mVmiti og 30 ml/min. En kalibreirngskurve ble generert og anvendt for å fastsette mengden olje i toluen på en vektprosentbasis. Kalibreringskurven anvendte 0,01, 0,1,1, 5 og 10 wt% oppløst råolje i toluen.
EKSEMPLER
Den foreliggende oppfinnelsen defineres ytterligere i følgende eksempler. Det skal forstås at disse eksemplene, selv om de indikerer foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen, kun er ment som illustrasjon. Ut ifra drøftelsen over og disse eksemplene kan fagpersonen bestemme denne oppfinnelsens karakteirstikker, og kan uten å gå bort fra ånden og omfanget av denne gjøre ulike endringer og modifiseringer av oppfinnelsen for å tilpasse den til ulike anvendelser og forhold.
I den foreliggende redegjørelse var det ment at å utvikle et stasjonært konsortium av mikroorganismer, under anaerobe denitrifiseringsforhold, ved å anvende råolje som karbonkilden, ville opprettholde den rikdommen av ulike mikrobielle arter i konsortiet, for derved å tillate konsortiets optimale operasjon i modifisering av olje sammenlignet med evnen til en enkelt stor art på konsortiet som vist nedenfor. Ytterligere forkortelser anvendt i eksemplene nedenfor er som følger: "hr" betyr time(r), "min" betyr minutt(er), "1" betyr liter, "ml" betyr milliliter, "ul" betyr mikroliter, "g" betyr gram, "mg/ml" betyr milligram per milliliter, "M" betyr molar, "mM" betyr millimolar, "mmoles" betyr millimol, "umoles" betyr mikromol, pmoles betyr picomol, "°C" betyr grader celcius, "bp" betyr basepar, "rpm" refererer til omdreininger per minutt, "ppm" betyr deler per million, "v/v" betyr volum for volum, "v/v/v" betyr volum for volum for volum, "w/v" betyr vekt for volum, "ml/hr" betyr milliliter per time, "nil/min" betyr milhliter per minutt, "%" betyr prosent, " g" betyr tyngdekraft, "nm" betyr nanometer, "psi" betyr per square inch, "sec" betyr sekund, "LB" betyr Luria Broth kulturmedium, "R2A" betyr Reasoner's 2A kulturmedium, "PCR" betyr polymerase kjedereaksjon og "SDS" betyr natriumdodecylsulfat.
EKSEMPEL 1
ANRIKE ET MIKROBIELT KONSORTIUM PÅ UTPEKT OLJE, SOM KARBONKILDEN, UNDER ANAEROBE DENITRIFISERINGSFORHOLD
Utvikle moder-POGl-konsortiet
For det foreliggende eksempel ble moderanrikingskulturer og en sorteringsprotokoll utviklet for å identifisere mikrober som er i stand til å dyrkes under anoksiske forhold på enten råolje eller dets komponenter som eneste karbonkilde. Nitrat ble brukt som den primære elektronakseptoren som beskrevet heri. Jordprøver ble fortynnet ved en forhold på 1 til 10 w/v (10 g i 100 ml medium) og inkubert i SL10-mediet og 250 ppm natriumnitrat som elektronreseptoren i 72 hr som beskrevet nedenfor. Disse jordsuspensjonene ble anvendt som et inokulum i 60 ml serumampuller som inneholdt 2:1 v/v av minimalsaltmediet (20 ml) og den autoklaverte råoljen (10 ml). Inokuleringer for anrikingskulturene ble utført i Coy anaerobe hanskepose som beskrevet over. All råolje som ble anvende i de foreliggende eksemplene var fra Milne Point, Prudhoe Bay på North Slop i Alaska. Anrikingskulturene ble oppbevart anaerobt i de gasstette, septaforseglede ampullene. Disse kulturene ble dyrket med moderat risting (100 ipm) ved omgivelsestemperaturer i uker til måneder, og tatt prøver av regelmessig for nitrattømming og rn^ttakkumulasjon, synlig turbiditet og synlig endret oljeviskositet eller oljeadheranse til glass. Kulturer ble innimellom tatt prøver av for analyse av deres struktur av mikrobielle populasjoner ved rDNA-sekvenstypebestemmelse. Etter 10 til 15 dager hadde en biomasse utviklet seg i de opprinnelige anrikingskulturene som anvender råolje som karbonkilden. Ved å anvende disse anrikingen som et inokulum, ble en ny serie anrikingsmoderunderkulturer preparert. Disse andre sett med anrikingsunderkulturer ble betegnet 'T generasjons moderkulturer" (1'gen) og ble inokulert, påført hette og forseglet i det anaerobe kammeret. 60 ml underkulturserumampullene inneholdt 30 ml av SL10-mineralsaltmediet (tabell 2) med 250 ppm natriumnitrat og 15 ml autoklavert råolje. 1'gen-underkulturene ble dyrket med moderat risting (100 rpm) ved omgivelsestemperaturer i uker til måneder, og tatt prøver av regelmessig for nitrattømming og nitrittakkumulasjon, eller i noen tilfeller, nitrittømming. Endringer som ble observert inkluderte: synlig turbiditet, biofihner observert på glassflaskene eller på det olje-vann-grensesnittet, olje-vann-emulsjon og synlig endret oljeviskositet eller oljeadheranse til glass. Kulturer ble innimellom tatt prøver av for 16S rDNA fylogenetisk typebestemmelse.
Da alle tilgjengelige nitrater og produserte nitritter var redusert, ble kulturene underkultivert anaerobt til ferskt medium supplert med ytterligere 250 ppm natriumnitrat. Kulturprøvetøking ble utført som før. Etter tre måneders dyrking og én til tre underkulturer, ble de resulterende underkulturpopulasjonenekarakterisertved å anvende 16S rDNA-typebestemmelse (se over). Anrikingspopulasjonen besto av både fakultative og obligate anaerober. Disse inkluderte ulike arter av beta-Proteobacteria, primært Thauera- arter og andre arter fra: beta.- Proteobacteria ( Rhodocyclaceae), aLfa.- Proteobacteria, gammzi- Proteobacteria, Deferribacteraceae, Bacteroidetes, Chloroflexi and Firmicutes / Clostridiales fyla (figur 1).
Ettersom de individuelle anrikingspopulasjonene var lignende hverandre, ble de gruppert anaerobt og inokulert i én liter SLIO-medium med 250 ppm natriumnitrat. Det inokulerte mediet ble deretter delt opp i 250 ml-porsjoner og hver alikvot ble inokulert i én av fire 500 ml-serumflasker som inneholdt 125 ml steril råolje. Alle flasker ble forseglet anaerobt. Kulturene ble referert til som "andregenerasjons moderkulturer" (2'gen). Anrikingsprøver (benevnt EH36:1A, EH36:1B, EH36:1C, EH36:1D) (se tabell 5) av 2. gen-kulturene ble dyrket med moderat risting (100 rpm) ved omgivelsestemperaturer i flere uker og tatt prøver av regelmessig for nitrat- og nitrittømming. Nitrat ble etterfylt til 250 ppm i fire separate tilfeller. Etter den fjerde tømmingen av nitrat, ble en 10 ml alikvot fra én av kulturene anaerobisk inokulert og forseglet i en 500 ml-serumflaske som inneholdt 200 ml SLIO-medium med 2400 ppm nahiumnitrat og 100 ml steril råolje, og benevnt "tredjegenerasjons moder" (3. gen) (benevnt EH40:1 og EH44:1). 2. gen-kulturene ble forsatt på 250 ppm natriumnitrat, ved å fjerne 150 ml kultur og tilsette tilbake 150 ml sterilt SL10-minimalsaltmedium pluss nitrat. Alle konsortiumkulturer ble inkubert som beskrevet over i flere uker og tatt prøver av regelmessig for nitrat- og mtrittømming. Etter at 3. gen-moderkulturene hadde tømt de 2400 ppm natriumnitrat og all den produserte nitritten, ble alle anrikingskulturer etterfylt med 2400 ppm natriumnitrat. Etter 190 dager hadde alle 2 og 3"gen-anrikinger redusert 6600 ppm nitrat. Kulturer ble deretter tatt prøver av for 16S rDNA fylogenetisk typebestemmelse for å karakteriseres populasjonene deres (figur 2). Elementene i anrikingenes populasjonsprofiler var lignende de som hadde blitt detektert i tidligere anrikinger.
EKSEMPEL 2
Å overvåke denitrifisering og dyrking av et stasjonært konsortium i en kjemostat bioreaktor
Dyrking av det stasjonære POGl-konsortiet i kjemostaten ble overvåket ved optisk densitet (OD55o) og nitratreduksjon gjennom å ta daglige prøver i seks uker og deretter hver andre til tredje dag i de neste ni ukene. Nitrat og nitrittkonsentrasjonene ble fastsatt ved ionekromatografi som beskrevet over. I de første to ukene ble nitrat matet med 14 ppm/dag og deretter med 69 ppm/dag. Tabell 3 viser at ekvilibrium for nitratreduksjon ble nådd etter 9 dager, hvor alt nitrat, som vel som den produserte nitritten, var fullstendig redusert. Kulturen reduserte dens nitratbeholdning fullstendig i de neste 97 dagene. Celledensitetsekvilibrium ble nådd etter 32 dager, to uker etter at nitratmatingen hadde blitt økt med omtrent det femdobbelte. De optiske densitetene forble relativt konstante de neste 74 dagene. Ved 35 til 43 dager begynte cellene å klumpe seg sammen og tilforme biofilmer ved olje-vann-grensesnittet, og olj evannemulsj oner ble observert. Disse kulturkarakteristikkene gjorde det vanskelig å ta homogene prøver for dyrkingsmålinger. Mellom 30 og 32 inn i eksperimentet, hadde magnetomrøreren sluttet å blande og nitratreduksjon ble avbrutt på grunn av ufullstendig blanding av kulturen i bioreaktoren. Da omrøreren ble startet på nytt, ble nitratet redusert fullstendig innen to dager og kjemostaten returnerte til ekvilibrium.
Det stasjonære POGl-konsortiet forbrukte 6662 mg eller 107,5 mol nitrat på 106 dager før nitratreduksjon begynte å reduseres som indikert av nærværet av 27 ppm nitritt i effluenten etter 106 dager. Den reduserte raten på nitratreduksjon syntes å indikere at oljens målkomponent var i ferd med å bli begrensende. Denitriifseringen av nitrat og dets reduserte nitritt til nitrogen er ekvivalent med 537,3 mmol elektroner forbrukt i råoljeoksidasjon (Rabus, R., et al., Arch Microbiol., 163: 96-103, 1995). Det følger at ekvivalent med 1,23 g dekan (8,6 mmol) ble degradert til karbondioksid. Derfor, ettersom 400 g råolje måtte tilsettes i kjemostat bioreaktoren, hadde teoretisk sett omtrent 0,31 % av olj en blitt dissimilert.
Etter 106 dagers inkubasjon, ble det sett biofilm på glasset i bioreaktoren ved eller nær olje-/vannfraksjonen. Olje- og vannfraksjonene viste tegn til emulgering. For å observere emulgering ble prøver undersøkte ved å anvende mørkfelts- og lysfeltsfasemikroskopi ved 400x forstørrelse (Zeiss Axioskop 40, Carl Zeiss Micro Imaging, Inc, Thornwood, NY). Mikrober adherte til både preparatglasset og dekselet, noe som demonstrerte en positiv hydrofob respons. Denne undersøkelsen er en modifisert versjon av en prosedyre som indirekte måler hydrofobitet gjennom vedhefting av mikrober på polystyrenplater (Pruthi, V. and Cameotra, S., Biotechnol. Tech., 11: 671-674,1997). I tillegg ble ørsmå, emulgerte oljedråper (rundt 3 til 40 mikron i diameter) sett i vannfasen. Bakterier ble også sett i en biofilm- som vedheftinger til noen av disse emulgerte oljedråpene.
En alikvot (1 □ L) med stasjonært POG1-konsortium med en emulgert oljedråpe ble plassert på et objektglass og dekket med et 20 mm-square No.l-deksel og undersøkt ved å anvende en faseavbildningsmikroskopi under en oljeemersjonslinse ved lOOOx forstørrelse. Mikrober ble også funnet i oljefasen i irregulære "lommer" tilformet rundt sammenklumpede bakterier.
Normalt vil vanndråper som er fanget i olje innta en nær sirkulær form. Vann-olje-grensesnitt beveget seg mot bunnen av objektglasset, bakteriene ble fanget opp ved grensesnittet innenfor disse sammenklumpede hydrofobiske formene, som til slutt ble "klemt av" og etterlatt i oljefasen.
Mikrober ble også sett sammenklumpet i vann-olje-grensesnittet. Bakterier tilstrekkes vanligvis til grensesnittet, men ikke i mengder; de strømmer ofte raskt langs grensesnittet i én retning, én bakterie om gangen. I dette eksempelet ble mikrobene tiltrukket til grensesnittet som en ikke-motil sammenklumping 30 til 50 mikroner bred. Disse observasjonene demonstrerer formasjon av en hydrofob sammenklumpet masse som kan bidra til formasjon av biofilm i vann-olje-grensesnittet eller med en olje-/vannemulsjon. Denne strukturen tillater mikrober å samhandle med olje og anvende noen av dens komponenter som karbonkilden deres. Populasjonsprofilers elementer i stasjonær var lignende det som har blitt detektert i tidligere anrikinger og vises i tabell 4 nedenfor. Det var 73 unike sekvenser (SEKV.ID-NR.: 15-87), som var gruppert inn i syv bakterieklasser, som inkluderte a\ fa.- Proteobacteria, betSL- Proteobacteria, gsamna.- Proteobacteria, Deferribacteraceae, Spirochaetes, Bacteroidetes og Firmicutes / Clostridiales og Incertae sedis. Den primære genera fortsatte å være beta- Proteobacteria, Thauera. Thauera -stamme AL9:8 var den dominerende bestanddelen. Diversiteten blant elementene i Thauera/ Azoarcus- gruppen ( Rhodocyclaceae) er betydelig ettersom det er 31 unike 16S rDNA-sekvenser hvis sekvensforskjeller forekommer de variable regionenes primære signaturregioner. Også Firmicutes/ Clostridiales- gmpp& a. er variert med 16 unike sekvenser som inkluderer bestanddeler fra Clostridia-, Anaerovorax- og Finegoldia-<g>sneræn.
Eksempel 3
Populasjonsanalyse av det stasjonære POGl-konsortiet og moder-POGl-kulturer ved å anvende klonede 16S rDNA-biblioteker
DNA ble ekstrahert som beskrevet over fra 3'gen POGl-moderanrikingskulturene og fra de stasjonære POGl-kjemostalkulturprøvene, og anvendt for å lage klonede 16S rDNA-biblioteker. I korthet ble 1400-basepar 16S rDNA-forsterkningsproduktene for en gitt DNA-bank visualisert på 0,8 % agarosegeler. PCR-reaksjonsblandingen ble anvendt direkte for å klone til pPCR -TOP04-vektor ved å anvende TOPO TA-klonesystemet (Invitrogen) i følge produsentens anbefalte protokoll. DNA ble transformert til TOP10 kjemiske kompetente celler (Juvitrogen) med valg for ampicillinresistens. Individuelle kolonier (~48-96 kolonier) ble valgt, dyrket i mikrotiterplater, preparert og fremlagt for sekvensanalyse som beskrevet over.
Resultater av 16S rDNA-sekvensanalyse
En samlet 16S-profil ble kompilert for 1"gen, 2 gen og 3'genmoder-POGl-kulturer beskrevet heri. 16S rDNA-profiler ble også preparert fra prøver tatt på flere forskjellige tidspunkt fra den kontinuerlige stasjonære POGl-kjemostatkulturen. Minimum 48 16S rDNA-kloner for hver anrikings- og/eller stasjonærtidsprøve ble sendt til Agencourt for sekvensering. 16S rDNA-sekvensen som ble tatt ble deretter blastet (BLASTn) mot NCBI-databasen. Sekvenser ble gruppert i homologiklynger med ved > 90 % identitet med det samme NCBI rDNA-fragmentet.
Homologiklyngene ble tatt for alle moder-POGl-kulturer og stasjonær kultur ble anvendt for å beregne proporsjonene for bestemte bakterier i hvilken som helst prøve. Populasjonenes resultater tatt fra valgte moderanrikingskulturer kontra stasjonær vises i figur 4.
Analyse indikerte at 50-90 % av de totale 16S rDNA-ene som ble sekvensert tilhørte den taksonomiske klassen beta- Proteobacteria, familien Rhodocyclaceae. Spesielt elementer i beta.- Proteobacteria fylum -underklassen, Thauera var den mest rikelige mikroorganismen i det stasjonære POGl-konsortiet til enhver gitt tid. Stammer av Thauera har vist seg å kunne dyrkes på olje og/eller oljebestanddeler under anaerobe forhold uten behov for ytterligere næringsstoffsupplering (Anders et. al. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 45: 327-333,1995).
Sekvenser som tilhørte fyla Bacteroides, Firmicutes / Clostridiales (lave G+C-grampositive bakterier), Deferribacteres og Spirochaetes representerte mellom 4-23 % av den mikrobielle populasjonen og var konsekvent representert i POG1-konsortiets stasjonærprøver og dets moderanrikiriger. Prøvestørrelsen på klonede 16S rDNA-er (n=47) for stasjonære POG1-prøver underrapporterer mest sannsynlig forekomstene av disse organismene i den mikrobielle populasjonen. Sekvenser knyttet til elementer i gamma- Proteobacteria, Pseudomonadales, var også representert på et konsekvent lavt nivå i stasjonære POGl-tidsprøver. Dette står i kontrast til 16S rDNA-profiler tatt for flere av de innledende moderanrikingene for dette konsortiet, som ikke inneholdt Pseudomonadales 16S rDNA-sekvenser, noe som indikerer at elementer av denne fylotypen kan ikke er kritiske for stasjonær POG1-funksjon i MEOR.
Til slutt ble et lavt nivå av sekvenser (< 3 %) forbundet med fylotyper som representerer Chloroflexi, Synergistes, åoita- Proteobacteria og sifa- Proteobacteria ofte detektert i POGl-moderanrikingskulturer.
I korthet beskriver distribusjonen 16S rDNA-sekvenser beskrevet for den stasjonære POG1-kulturen så vel som POGl-moderanrikingskulturene sammensetningen av organismer for definerer det stasjonære POGl-konsortiet. Denne valgte sammensetningen av mikroorganismer antas å øke oljeutvinningen.
EKSEMPEL 4 (delvis profetisk)
Analyse av mikrobiell koloni ved DGGE
Distribusjonen av individuelle mikrobielle populasjoner i det stasjonære POG1-konsortiets koloni ble analysert ved å anvende den 16S rDNA-variable regionanalysen ved DGGE. DNA for å ta fingeravtrykk av DGGE-koloni ble isolert fra prøver tatt fra det stasjonære POG1-konsortiets råoljekjemostat i løpet av to måneder. PCR-forsterkede fragmenter ble generert ved å anvende primere dG.UB357 og U518R for bakterier (SEKV.ID-NR.: 6 og 4) og dG. UA341F1 og F2 med U518R for Årchaea (SEKV.ID-NR.: 8, 10 og 4). Dette produserte en omtrent 200 bp sekvens fra V3-regionen i det bakterielle og arkeale 16S rDNA-et, som deretter ble analysert ved DGGE. I tillegg ble også PCR-forsterkede fragmenter for V4/V5-regionen av de bakterielle og arkealel6S rDNA-sekvensene generert for å produsere fragmenter på omtrent 400 bp generert ved å anvende primere dG.U519F og UB 936R for bakterier (SEKV.ID-NR.: 12 og 14) og dG.U519F og UA 9958R for arkebakterier (SEKV.ID-NR.: 12 og 15). Disse PCR-fragmentene ble skilt etter lengder og nukleotidsekvens ved å anvende DGGE.
Denatureringsgradient gelelektroforese for fmgeravtrykkprofilering ble utført ved å anvende et Bio-Rad DGGE DCode-system (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Fhigeravtrykkprofiler for de forsterkede rRNA-genrfagmentene ble oppløst ved elektroforese ved 60 °C ved 35 V i 16 hr på 8 % (w/v) denatureringspolyakrylamidgeler som inneholdt fra 30 % til 60 % konsentrasjonsgradient denatureringsmiddel (w/v, 7M urea og 40 % formamid i 1XTAE (50X TAE: 2M Tris-acetat, 50 mM EDTA, pH 8,0)). Figur 5 er et eksempel på en koloni-DGGE-profil av V4/V5-regionen fra tid null til 52 dager. Profilene for de stasjonære POGl-konsortiumtestprøvene (dager, 0,4,28,44,52) på venstre side synes å ha stabilisert seg etter 28 dager. Kontrollene, på høyre halvdel av gelen, inkluderer moder-POGl-oppstartsinokulumet EH50:1 og en stamme Thauera-stamme AL9:8. Også inkludert som kontroller var to stammer isolert fra North Slope-produksjonsoljen i Alaska, henholdsvis stamme LH4-.15 ( Pseudomonas stutzeri) og stamme ALI :7 ( Ochrobactrum sp. fra Brucellaceae- familieri). De to siste stammene ble valgt som kontroller for å se om den stasjonære POG1-populasjonen inkluderte mikroorganismer som har blitt sett som store bestanddeler i en oljefeltpopulasjon. Det store båndet i alle konsortiumprofiler (A) korrelerte med båndet observert for stamme Thauera AL9:8.
Det andre båndet, (B), som korrelerer med stamme LH4:15, synes å reduseres som en stor bestanddel i populasjonen i profiler fra dag 4 til og med dag 52. Det tredje båndet, (C), som korrelerer med stamme ALI :7, er mindre tett, og er en bestanddel i populasjonen i profiler for null til og med 28 dager. Dette båndet forsvinner imidlertid i de senere trinnene av denitrifisering. Bånd D til og med L er også detekterbare som underordnede bestanddelsbånd i populasjonen i alle prøvene.
De følgende trinnene er profetiske: For å identifisere disse stasjonære POG1-profilbåndene, kan tidligere identifiserte 16S rDNA-kloner som representerer bestanddeler fra det stasjonære POGl-konsortiet tilføres til DGGE-analyse for å identifisere individuelle DGGE-bånd slik det ble gjort for å identifisere bånd A til og med C i figur 5. V4/V5-regionen fra klonede bestanddeler 16S rDNA-er kan anvendes for å analysere og identifisere de resterende båndene D til og med L for den stasjonære POG1 DGGE-profilen. Resultatene skal korrelatere nært med profilbåndene med store bestanddeler i konsortiet identifisert i den tidligere 16S rDNA-profilen i figur. Tabell 4 i eksempel 2 lister de isolerte 16S rDNA-klonene, tatt fraPOGl 16S rDNA-populasjonsprofilstudier. Klonene som ble anvendt for å ta disse sekvensene kan anvendes for å generere PCR-produkter ved å anvende DGGE PCR-produkter for å identifisere og korrelere de individuelle båndene (A-L) i DGGE 16S V4/V5 rDNA-et. Tabell 4 inkluderer også den tilknyttede NCBI rDNA-database aksesjonsnummer-ID-ene tatt for disse referanseklonene. Disse klonene representerer de store gruppene med bakterier innbefattende POGl-konsortiet, som inkluderer beta- Proteobacteria, primært Thauera aromatica- arten ( Rhodocyclaceae), og fra Pseudomonadales, Bacteroidaceae,, Clostridiaceae, Incertae Sedis., Spirochete, Spirochaetaceaes., Deferribacterales Brucellaceae og Chloroflexaceae. PCR-forsterkede fragmenter for V4/V5-regionen i det mikrobielle 16S rDNA-et kan da genereres fra både de klonede rDNA-ene (plasmid-DNA) som ble identifisert som POG1-bestanddeler og genom DNA fra korrelerte POG1-prøvetakinger så vel som POGl-kulturer start fra frosne kulturråmaterialer. Miniprep-DNA fra POG1 16S rDNA-kloner kan prepareres ved å anvende et Qiagen Miniprep-sett (Valencia, CA) ved å følge produsentens protokoll. PCR-forsterkede fragmenter fra V4/V5-regionen på omtrent 400 bp kan genereres ved å anvende primere dG.U519F og UB 936R for bakterier (SEKV.ID-NR.: 12 og 14). Forsterkede fragmenter kan skilles etter lengde og nukleotidsekvens ved å anvende DGGE som beskrevet over.
Eksempel 5 (profetisk)
Langvarig oppbevaring og restitusjon av konsortiet for feltinokuleringer
Et viktig kriterium for bruken av hvilket som helst konsortium er dets levedyktighet og funksjon etter dets langvarige oppbevaring. En alikvot (20 ml) med det stasjonære POGl-konsortiet ble tatt under den stasjonære dyrkingen i kjemostaten. 16S rDNA-kolonisekvensen og en DGGE-fingeravtrykkprofil ble utført for å definere sammensetningen av kolonien på prøvetakingstidspunktet. Den anaerobe prøven ble plassert i en 15-20 % glykolblanding (f.eks. 150 ul steril avgasset glyserol i 650 ul av prøven) i Coy anaerobt kammer, dispensert i steril 2,0 ml kryogeniske polypropylenrør og behandlet som beskrevet over. Rørene ble raskt frosset på tørris og oppbevart i en -70 °C fryseboks til det var behov for dem.
For å teste levedyktigheten til den stasjonære POGl-frysebokskulturen eller for å anvende den som et inokulum, ble et kryogenisk rør fjernet fra en -70 °C fryseboks og tint på våtis i et anaerobt kammer. En alikvot (50 DL) av prøven ble anvendt for å starte en såkultur for et større inokulum for kjemostat bioreaktoren. Såkulturen ble inokulert i 20 ml SLlO-minimalmedium supplert med 300 ppm nitrat og 10 ml av den autoklaverutpekte råoljen i en 60 ml steril serumflaske. Den anaerobe flasken ble forselget med en septum, inkubert utenfor det anaerobe kammeret ved romtemperatur (20 °C til 25 °C) ved risting ved 100 rpm på en orbitalrister. Kulturturbiditet, som var indikativ for dyrkingen av konsortiets bestanddeler, ble observert visuelt.
De følgende trinnene er profetiske: I tillegg, med et gjenopplivet konsortium, forventes reduksjon av nitrat til nitritt å forekomme etter tre dager. Når nitratkonsentrasjon når omlag 50 ppm eller mindre, kan en prøve tas for å isolere den mikrobielle koloniens DNA for 16S rDNA-typebestemmelse og DGGE- fingeravtrykkprofilering. Det ville være å forvente at frysebokssåkulturens DGGE-profil og 16S rDNA-typebestemmelse vil være lignende til profiler tatt for det stasjonære POGl-konsortiet. Hvis frysebokskulturen var stabil som forventet, kan en såkultur prepareres som et anaerobt inokulum for kjemostat bioreaktoren for nitratassimilasjonsanalyse. Det gjenopplivede frosne konsortiet kan også anvendes i en oljefrigjøringssandpakke eller kjerneoverfyllingsundersøkelse. Dessuten kan det gjenopplivede frosne konsortiet anvendes som en såkultur for en reservoardyrkingsinnsprøytingstank, som er et kar ved siden av oljebrønnen for å oppbevare kulturen før innsprøyting, eller det kan anvendes til å dyrke kulturen før innsprøyting av kulturen i oljebrønnen.
Eksempel 6
Oljefrigjøringssandpakke eller kjerneoverfyllingsundersøkelse Bruken av det stasjonære POGl-konsortiet på en sandpakke mettet med olje for å evaluere dets bruk i MEOR ble gjort ved å anvende sandpakketeknikken i et internt utviklet Teflon<®>krympefoliepakket sandpakkeapparat som simulerer tettpakket sand i sandstein. Prosessen beskrevet heri ble anvendt for å lage to kolonnesett, et "kontroU"-sett og et "test"-sett, som ble inokulert med det stasjonære POGl-konsortiet for å teste dets effisiens for å frigjøre olje fra sandkolonnen. Ved å anvende et 1,1 inches tykt og 7 inches langt Teflon varmekrymperør, ble en aluminiumsinnløpsrørdel med Viton<®>o-ring festet til én ende av røret ved å anvende en varmepistol North Slope-sand ble tilsatt til kolonnen, som ble vibrert med et gravérjern for å pakke ned sanden og frigjøre innesperret luft. En andre aluminiumsinnløpsrørdel med Viton<®>o-ring ble festet til den andre enden av røret og forseglet med en varmepistol. Sandpakken ble deretter lagt i en ovn ved 275 °C i 7 min for å varme opp og krympe omslaget. Sandpakken ble fjernet og fikk kjøle seg ned til romtemperatur. Et andre Teflon<®>varmekrymperør ble installert over den opprinnelige pakken og varmet opp i ovnen som beskrevet over. Etter at kolonnen hadde kjølt seg ned, ble en slangeklemme festet på pakken på det ytre omslaget over o-ringen og deretter strammet.
Begge kolonnesett (to kolonner i hvert sett) ble deretter overfylt horisontalt (i 60 ml/hr) med fire porevolumet "lake" (sterilt, anaerobt SLIO-medium, supplert med 250 ppm nitrat og 3 mM fosfatbuffer, pH 7,4) ved hjelp av en sprøytepumpe og en 60 ml steril plastpolypropylensprøyte. Begge sett med sandpakker ble deretter overfylt med anaerob autoklavert råolje til ikke-reduserbar vannmetning, som var forutbestemt til å være to porevolumer. Oljen ble overfylt, ved en rate på 0,4 ml/hr, ved å anvende en 10 ml steril sprøyte og en sprøytepumpe. Råoljen ble modnet på sanden ved å lukke inne kolonnene i syv dager. Ett kolonnesett ble inokulert anaerobt med én halvpart av et porevolum ved 0,4 ml/hr med en prøve av konsortiet tjernet anaerobt rfa kjemostaten. Samtidig ble en kontrollinokulering som anvendte anaerob "lake" også lastet på kontrollkolonnesettet ved å anvende samme prosedyre. Inokulum ble lukket inne for inkubasjon med oljen i syv dager, og kolonnene ble deretter overfylt med fire porevolumet anaerob steril "lake" ved 0,4 ml/hr.
Ved avslutningen av produksjonsoverfyllingen, ble de 7 inches lange smalrørene ofret inn i 5x en-inch seksjoner merket A-E. Én inch ble hoppet over i begynnelsen og ved utgangen av smalrøret for å unngå kanteffekter under analyse. Seksjon "A" kom fra frontenden av kolonnen. Seksjonene A, C og E ble analysert for restoljemetning på sanden. Mengden olje på den våte sanden fra de ofrede smalrørene for restolje ble mål ved GC som beskrevet over. Denne verdien ble multiplisert med den totale mengde toluen som ble anvendt for å ekstrahere olje, noe som resulterte i den totale mengde olje på sanden. Verdien som ble tatt ble deretter dividert med den totale prøvevekten for å gj prosent av olje når det gjelder den totale prøvevekten. Vektprosenten av olje i prøven ble deretter multiplisert med kvotienten av den empirisk deriverte karakteristikken for tettpakket North Slope-sand (totalvekt for prøve etter å ha blitt overfylt med lake dividert på total sandvekt, 1,27). Dette forholdet er likt mengden olje på tørr sand. Denne verdien ble deretter multiplisert med kvotienten av vekten på North Slope-sand med vekten på fluidet innesperret i sandens porehuhom, 3,75. Den resulterende verdien reflekterte restoljen som var igjen på sanden i enheter på g på olje/g av totalt fluid i porehulrommet. Som vist i tabell 5 var restolje som var igjen på kolonnen, i testkolonnens fraksjon A og C, mindre enn kontrollen, noe som bekreftet at kolonnene inokulert med POG1-konsortier friga mer olje enn de som ikke var inokulert.
EKSEMPEL 7
MODER-POG1-KONSORTIETS EVNE TIL Å ØKE OUEFRIGJØRTNG
Moder-POGl-komotriurnkulturene ble undersøkt for deres evne til å frigjøre olje fra sand i en visuell oljefrigjøringsundersøkelse ved å bruke mikrosandkolonnen beskrevet over. Inokulum fra tidlige parallelle anrikingskulter av det 2'gen moder-POGl-konsortiet, f.eks. EH36:1A, EH36:1B, EH36:1C, EH36:1D hver med-250 ppm iritrat og én 3"genkultur (EH40:1) med høy nitratkonsentrasjon (-1600 ppm) ble testet i denne undersøkelsen. Alle anrikingskulturer ble dyrket anaerobt i SL10-minimalsaltmediet (tabell 2) ved å anvende ACO-olje som karbonkilden og nitrat som elektronakseptoren til turbiditet ble observert. Alle operasjoner for å preparere mikrosandkolonnene, inokulering og dyrking ble gjort i et anaerobt kammer ved å anvende sterile teknikker. En 4,0 ml alikvot av hvert inokulum til tilsatt i de 13 mm glassrørene, enten direkte eller fortynnet 1:2 med minimalsaltmediet. Mikrosandkolonnene (fylt med oljemettet sand som beskrevet over) ble plassert i hvert glassrør, senket ned i mediet/celleinokulumet med Pasteur-pipettens avsmalende halsen pekende oppover. De ytre ampullene ble forseglet i det anaerobe Coy-kammeret og tillatt å inkubere ved omgivelsestemperatur i de neste flere ukene. Hver kolonne ble kontrollert for oljefrigjøring periodisk. Kulturer som økte fngjøring av olje over bakgrunn (sterilt medium) ble antatt å ha endret interaksjonen mellom oljen og sandoverflaten.
Olje frigjort fra sanden ble visualisert ved at den frigjorte oljen samlet seg i Pasteur-pipettens avsmalende hals eller tilformet små dråper på sandsjiktets overflate (figur 6). Oljefrigjøring ble observert for noen av POGl-moderanrikingskulturene så hurtig som kun 3 hr etter inokulering. Oljefrigjøring ble også observert med den rene Thauera- stsmmsa. AL9:8, isolert fra 1. gen POGl-moderanrikingskulturene. Mikrosandkolonner ble deretter observert i løpet av flere uker. En økning i den innledende mengden olje frigjort ble observert etter 3 måneders inkubasjon. Uinokulerte kontroller viste ingen visuell frigjøring av olje i løpet av eksperimentet. Triton<®>X-100 (Rohm & Haas Co), en ikke-ionisk surfaktant, ble anvendt som en positiv undersøkelse for frigjøringen av olje fra sand. Tabell 6 lister anrikingskulturene som ble testet og observasjonene av oljefrigjøring etter 7 dagers og 3 måneders inkubasjon ved omgivelsestemperaturer. Disse resultatene indikerte at moder-POGl-konsortiet samhandlet med oljevåt sand ved vann/olje/sand-grensesnittet og induserte oljefrigjøring fra sandens overflate.
1. Mikrosandkolonner ble bedømt for oljefrigjøring på en skala fra 1 til 5 (+) i rekkefølgen for økt oljefrigjøring; (-) = ingen frigjøring av olje, 5 = fullstendig frigjøring av olje fra oljebelagt sand, etter visuell bedømmelse
EKSEMPEL 8
DET STASJONÆRE KONSORTIETS EVNE TIL Å FRIGJØRE OLJE FRA SANDP ARTIKLER
For å kunne sortere anrikingskulturene etter evnen til å frigjøre olje fira det ikke-porøse silikamediet, ble en mikrotiterplateundersøkelse utviklet for å måle mikrobers evne til å frigjøre olje/sand fra oljemettet North Slope-sand. Denne undersøkelsen refereres til som LOOS-testen (Liberation of Oil Off Sand).
En mikrotiterplateundersøkelse ble utviklet for å måle amikingskulturenes og konsortiets evne til å frigjøre olje/sand fra den oljemettede North Slope-sanden i Alaska. North Slope-sand ble autoklavert og deretter tørket under vakuum ved 160°C i 48 timer, og 20 g av denne tørkede sanden ble deretter blandet med 5 ml autoklavert, avgasset råolje tatt fra Milne Point, North Slope. Den oljebelagte sanden ble deretter tillatt å adsorbere til sanden og modnes anaerobt ved romtemperatur i minst en uke. Mikrotiterplateundersøkelser ble sart opp i Coy anaerobt kammer. En alikvot av det utfortynnede stasjonære POGl-konsortiet (20 ml) ble tilsatt i brønnene i en 12-brønns mikrotiterplate. POGl-et ble dyrket anaerobt i SLlO-minimalmediurn med 2000 ppm natriumnitrat og North Slope-råolje. Kontrollbrønnene inneholdt 2 ml kun av SLI 0/2000 ppm NaNOs-mediet. Omtrent 40 mg oljebelagt sand ble deretter tilsatt i midten av hver brønn. Prøver ble deretter overvåket over tid for frigjøringen og akkumuleringen av "fri" sand som samlet seg i bunnen av brønnene. Omtrentlige diametre (i millimeter) av den akkumulerte totale sanden frigjort ble målt daglig. En score på 3 mm og over indikerte mikrobenes potensial for å frigjøre olje fra et ikke-porøst silikamedium så som sand.
Tabell 7 viser den relative sandfrigjøringen av det stasjonære POGl-konsortiet over en periode på fire uker. Etter omlag 15 dager, ble en 4 mm sone med frigjort sand observert i bunnen av brønnene som inneholdt det stasjonær POGl-konsortiet. Ingen frigjøring ble observert for kun mediet. Resultatene indikerer at det stasjonære POGl-konsortiet har potensialet til å frigjøre olje fra ikke-porøse silikatsubstrater.
EKSEMPEL 9
EMULGERING AV RÅOLJE AV 3 GENERASJONS MODERKONSORTJET
Mikroorganismer isolert fra råoljereservoarprøven, raffinerimiljøprøver eller miljøprøver, som inneholder råolje eller dennes komponenter, har blitt vist å tilforme en stabil emulsjon ved dyrking på råolje, eller i det minst organiske syrer med lav molekylvekt (low molecular weight organic acids (LMWOA)), f.eks. suksinat, propionat, laktat, acetat og format, som en karbonkilde. Formålet med dette eksempelet var å demonstrere mikroorganismers evne, enten som isolerte arter eller som et konsortium, til å tilforme en stabil emulsjon i råoljen organiske fase.
For å teste 3. gen POG1-konsortiets evne til å utvikle en olje-vann-faseemulsjon, ble et testsystem utviklet ved å anvende rene stammer isolert fra prøve eksponert for råolje eller dets organiske komponenter. 3. gen POGl-konsortiet ble anaerobt dyrket i 32 ml SLIO-medium med 1600 ppm NaN03og 16 ml autoklavert råolje (ACO). Én prøve inneholdt kun ACO som karbonkilden. De andre testprøvene inneholdt 0,2 % av en av følgende LMWOA-er, f.eks. suksinat, propionat, laktat eller acetat. Hvert emulsjonstestsett inneholdt én ampulle som hadde blitt inokulert med moderkonsortiet og den andre ampullen som var kontrollen. Disse ble alle forseglet anaerobt og inkubert i to uker ved romtemperatur. Alle inokulerte prøver hadde redusert nitratet fullstendig til nitritt etter to uker. En alikvot (2 ml) ble fjernet fra hver ampulle og sentrifugert ved 14 000 i 5 min i en Thermo 5519 mikrosentrifuge (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA). Det overskytende ble tilsatt i en 4 ml Wheaton 225142 prøveampulle (Wheaton Science Products, Millville, NJ) som inneholdt 1 ml 2,2,4,4,6,8,8-heptametyl- nonan (HMN) (Sigma-Aldrich, St Louis, Mo) og et rettkjedet flytende organisk løsningsmiddel som den organiske fasen. Ampullene ble festet godt i et reagensrørstativ. Reagensrørstativet ble plassert på laboratoriebenken, tolv inches unna forsiden på et Canon Powershot A530 digitalkamera, som var satt til dets makrobildefunksjon. Et kontrollbilde ble tatt av de 10 ampullene for å dokumentere deres to væskefaser i deres innledende tilstand som inneholdt 2 ml vannfase og 1 ml organisk fase. Ampullene og innholdet i dem ble ristet ved å vende stativet raskt hals-over-hode 12 ganger. De ble deretter plassert ned på laboratoriebenken, i den samme posisjonen hvor kontrollbildet var blitt tatt. Et bilde ble tatt umiddelbart for å dokumentere hver ampulles innledende emulsjonstilstand ved tid null. For å dokumentere dissipasjonen eller stabiliteten, over tid, til emulsjonen tilformet ved å blande løsningene, ble det tatt et bilde med intervaller på 15 sec til det hadde gått 300 sec. De digitale enkeltbildene ble studert for å måle emulsjonens dissipasjon. En emulsjon ble tilformet i den organiske fasen i alle ampuller, inkludert de som ikke hadde blitt inokulert med konsortiet. Resultatene bedømmes på en skala fra 1 til 5 og vises i tabell 8. Emulsjonen ble bedømt på en skala fira null til fem for å indikere emulsjonsfasens tykkelse ved orgamsk-vann-grensesnittet, hvor fem var den reneste og tykkeste emulsjonen. Emulsjonen ble mer grov og tynnere ved grensesnittet etter hvert som tallet sank til en. En fullstendig dissipert emulsjon ble bedømt til null. De ikke-inokulerte kontrollene dissiperte enten fullstendig eller nesten fullstendig innen de første 15 sekundene. Et unntak ble observert for kontrollprøven som inneholdt 0,2 % acetat, som forble ganske stabil i 75 sec før den dissiperte fullstendig. Kulturer som kun hadde ACO, råolje pluss acetat og ACO pluss laktat var stabile utover 5 min og var faktisk stabile i én time. Den inokulerte prøven som inneholdt laktat tilformet den mest stabile emulsjonen i tykkelse og renhet sammenlignet med alle andre prøver. Suksinatmatede kulturer tilformet ikke en stabil emulsjon, og propionatmatede kulturer tilformet en stabil emulsjon som var kortlivet, under tre minutter. Disse resultatene indikerer at flere mikroorganismer i konsortiet kan emulgere råolje, og at denne evnen kan økes ved å anvende organiske syrer med lav molekylvekt-suppleringer så som laktat og acetat.
EKSEMPEL 10
Sammenligne dyrking av POGl-konsortiet og den rene stammen Thauera AL9:8 på utpekt olje under anaerobe demtrifiseirngsforhold
Dyrkingsrater for POGl-konsortiet og TTjaMera-stammen AL9:8 i oljeanrikinger under anaerobe demtrMseringsforhold ble sammenlignet. Thauera- stamme AL9:8 representerer den store mikrobielle bestanddelen i POGl-konsortiet. Ekvivalente inokulum på omlag 10<6>celler fra konsortiet og den rensede stammen ble anvendt for å inokulere 60 ml serumampuller som inneholdt mineralsaltmedium i et forhold på 1:2 til autoklavert råolje under anaerobe forhold. SLlO-medium (20 ml) (tabell 2) med tilsatt nitrat (endelig konsentrasjon på 1100 til 1200 ppm) og 10,0 ml autoklavert råolje ble anvendt. Mediet og råoljen hadde blitt deoksygenert ved gjennomblåsning med en blanding av nitrogen og karbondioksid etterfulgt av autoklavering. Alle manipulasjoner av bakterier ble gjort i et anaerobt kammer. Prøver ble inokulert i tre eksemplarer, ble inkubert ved omgivelsestemperaturer i flere dager og overvåket for nitrat- og mtrittnivåer for synlig turbiditet og brutto synlige endringer i oljefasens integritet. POG1-inokulerte ampuller reduserte konsekvent nitrat med en raskere rate enn de rene kulturene av 7%attem-stamme AL9:8 gjorde. Tabell 9 oppsummerer resultatene av den gjennomsnittlige nitratreduksjonen for kulturene av POGl-konsortiet i tre eksemplarer kontra rene kulturer av Thauera- stamme AL9:8.
POGl-konsortiet utviklet konsekvent biofilmer under anaerobe denitrifiseringsforliold i oljeanrikinger, et fenomen som ikke ble observert konsekvent i oljeanrikinger av Thauera- stamme AL9:8. Tabell 10 oppsummerer resultatene som ble oppnådd for et sett oljeanrikinger kultivert anaerobt som over i SLlO-mediet og autoklavert råolje forhold (2:1). Disse kulturene ble innledningsvis inkubert med -300 ppm nitrat og deretter ytterligere supplert med nitrat til en endelig konsentrasjon på 1100-1200 ppm i 6 dager. Formasjon av en stabil biofilm ble observert på glassampullens overflate [etter 3-5 dager]. Disse resultatene understreker den synergistiske effekten til ulike komponenter i POG1 -konsortier, hvis store bestanddel er Thauera-stamme AL9:8, ved tilforming av en biofilm sammenlignet med den tilformet av kun TTiauera-stamme AL9:8.
Claims (12)
1.
Fremgangsmåtekarakterisert vedat den for å øke oljeutvinning fra et måloljereservoar anvender et anriket stasjonært mikrobielt konsortium innbefattende: (a) å tilveiebringe miljøprøver innbefattende stedegne mikrobielle populasjoner av måloljereservoaret; (b) å anrike for ett eller flere stasjonære mikrobielle konsortier tilstedeværende i prøvene, hvori anrikingen resulterer i et konsortium som bruker råolje som en karbonkilde under anaerobe denitrifiseringsforhold; (c) å karakterisere de anrikede stasjonære konsortiene i (b) ved å anvende 16S rDNA-proiflering; (d) å sette sammen et konsortium ved å anvende karakteirseringen i (c) innbefattende mikrobielle genera innbefattende én eller flere Thauera-arter og hvilke som helst to tilleggsarter som er elementer i genera valgt fra gruppen bestående av Rhodocyclaceae, Pseudomonadales, Bacteroidaceae, Clostridiaceae, Incertae Sedis, Spirochaetaceaes, Deferribacterales, Brucellaceae og Chloroflexaceae; (e) å identifisere minst én relevant funksjonalitet for konsortiet i (d); (f) å dyrke det anrikede stasjonære konsortiet i (e) som har minst én relevant funksjonalitet til en konsentrasjon tilstrekkelig for reservoarinokulering; og (g) å inokulere målreservoaret med den tilstrekkelige konsentrasjonen av konsortiet i (f) og innsprøyitngsvann innbefattende én eller flere elektronakseptorer, hvori konsortiet dyrkes i reservoaret og hvori dyrkingen fremmer økt oljeutvinning.
2.
Fremgangsmåten i følge krav 1,karakterisert vedat det anrikede stasjonære konsortiet kan oppbevares ved -70 oC før trinn (f) uten tap av relevant funksjonalitet for oljeutvinning.
3.
Fremgangsmåten i følge krav 1,karakterisert vedat de stedegne mikrobielle populasjonene er miljøprøver valgt fra gruppen bestående av: (a) prøve fra en måloljebrønn i form av innsprøytings vann, spillvann, produksjonsvann; og (b) prøve av jord som har blitt eksponert for råolje eller hvilken som helst én eller kombinasjon av oljekomponenter inkludert parafiner, aromater og asfaltener.
4.
Fremgangsmåten i følge krav 1,karakterisert vedat anrikingen inkluderer forhold innbefattende i) anaerobe og denitrifiseringsforhold; ii) en temperatur på fra omlag 15 °C- 45 °C; iii) en pH fra omlag 6 til omlag 9; og iv) en nitratkonsentrasjon fra omlag 25 ppm til omlag 7000 ppm.
5.
Fremgangsmåten i følger krav 1,karakterisert vedat elektronakseptoren i (g) er valgt fra gruppen bestående av oksygen, nitrat, jern (113), mangan (IV), sulfat, karbondioksid, fumarat, malat, pyruvat og oksaloacetat, nitritt, jernion, svovel, selenat, arsenat og kloretener.
6.
Fremgangsmåten i følger krav 1,karakterisert vedat den én eller flere 77iflHera-arten i (d) er én eller flere arter valgt fra gruppen bestående av Thauera- stamme AL9:8, Thauera aromatica, Thauera chlorobenzoica, Thauera vanillica og Thauera selenatis.
7.
Fremgangsmåten i følge krav 1,karakterisert vedat det mikrobielle konsortiet i (f) er et konsortium innbefattende minst én art fra hver av Firmicutes, Clostridiales, Deferribacterale, Spirochaetaceaes, Bacteroidaceae, Rhodocyclacea, Pseudomonadales, Brucellaceae og Chloroflexaceae.
8.
Fremgangsmåten i følge krav 1,karakterisert vedat den relevante funksjonaliteten i (e) er konsortiets evne til å forårsake hvilken som helst én eller flere av følgende: (i) endring av den underjordiske formasjonens permeabilitet for forbedret vannsveipeffektivitet; (ii) produksjon av biosurfaktanter for å redusere overflate- og grenseflatespenninger; (iii) endring i fuktningsgrad; (iv) produksjon av andre polymerer enn surfaktanter som forenkler petroleums mobilitet; (v) produksjon av syrer med lav molekylvekt som fører til stemoppløsning; (vi) generering av gasser for å øke formasjonstrykk; og (vii) reduksjon i oljeviskositet.
9.
Fremgangsmåten i følge krav 1,karakterisert vedat den forbedrede oljeutvinningen forekommer ved en reduksjon i råoljeviskositet ved dyrking av det stasjonære konsortiet i målreservoaret, hvori dyrkingen resulterer i produksjonen av hvilken som helst én eller flere biosurfaktanter, karbondioksid eller cellemasse, eller selektiv nedbryting av komponenter med høy molekylvekt i oljebrønnen, eller kombinasjoner av disse.
10.
Fremgangsmåten i følge krav 1,karakterisert vedat den økte oljeutvinningen forekommer ved dyrking av det anrikede stasjonære konsortiet i et målreservoar i det vesentlige uten korrosjon på oljeutvinnings- og prosesseringsutstyr.
11.
Fremgangsmåten i følge krav 1,karakterisert vedat den videre innbefatter å tilsette i det stasjonære mikrobielle konsortiet i (d) én eller flere ikke-stedegne mikroorganismer som har en relevant funksjonalitet for å forbedre oljeutvinning.
12.
Fremgangsmåten i følge krav 11,karakterisert vedat de én eller flere ikke-stedegne mikroorganismene er: a) valgt fra gruppen bestående av Marinobacterium georgiense Thauera aromatica Tl, Thauera chlorobenzoica Petrotoga miotherma Shewanella putrefaciens, Thauera aromatica S100), Comamonas terrigena (, Microbulbifer hydrolyticus, og blandinger av disse; og b) innbefatter en 16s rDNA-sekvens som har minst 95 % identitet med en 16s rDNA-sekvens isolert fra mikroorganismene i (a).
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US15449809P | 2009-02-23 | 2009-02-23 | |
| PCT/US2010/024516 WO2010096514A2 (en) | 2009-02-23 | 2010-02-18 | Method of improving oil recovery from an oil reservoir using an enriched anaerobic steady state microbial consortium |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20111275A1 true NO20111275A1 (no) | 2011-09-21 |
Family
ID=42629930
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20111275A NO20111275A1 (no) | 2009-02-23 | 2011-09-21 | Fremgangsmate for a forbedre oljeutvinning fra et oljereservoar ved a anvende anriket anaerobt, stasjonaert mikrobielt konsortium |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8528634B2 (no) |
| BR (1) | BRPI1005321A2 (no) |
| CA (1) | CA2750863C (no) |
| GB (1) | GB2481334B (no) |
| NO (1) | NO20111275A1 (no) |
| WO (1) | WO2010096514A2 (no) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2475226A (en) | 2009-11-03 | 2011-05-18 | Genetic Analysis As | Universal Prokaryote 16S ribosome PCR primer pair |
| GB2492687B (en) * | 2010-03-16 | 2014-08-13 | Univ Ohio | Methods and compositions for applications related to microbiologically influenced corrosion |
| CA2812167C (en) | 2010-09-21 | 2018-10-02 | Multi-Chem Group, Llc | Method for the use of nitrates and nitrate reducing bacteria in hydraulic fracturing |
| US20130075085A1 (en) * | 2011-09-23 | 2013-03-28 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Use of glutamate for microbial enhanced oil recovery |
| RU2014128561A (ru) * | 2011-12-14 | 2016-02-10 | Е.И.Дюпон Де Немур Энд Компани | Обогащение популяции shewanella из жидкостей из нефтеносного коллектора |
| US9650561B2 (en) * | 2013-06-18 | 2017-05-16 | Titan Oil Recovery, Inc. | Method of biological permeability modification of oil reservoirs using resident microorganisms and nutrient supplementation |
| GB201313897D0 (en) * | 2013-08-02 | 2013-09-18 | Maersk Olie & Gas | Conformance control in enhanced oil recovery |
| GB201315745D0 (en) * | 2013-09-04 | 2013-10-16 | Maersk Olie & Gas | Enhanced hydrocarbon recovery |
| GB201315743D0 (en) * | 2013-09-04 | 2013-10-16 | Maersk Olie & Gas | Provision and uses of wettability modifiers |
| US20160010010A1 (en) * | 2014-07-11 | 2016-01-14 | Intevep, S.A. | Additive for reducing viscosity in heavy crude oil |
| WO2016016677A1 (en) * | 2014-07-29 | 2016-02-04 | Total Sa | Bacterial method of treatment of oil reservoir and outcrop samples |
| CN104481476B (zh) * | 2014-10-27 | 2017-01-18 | 中国石油化工股份有限公司 | 一种微生物驱油提高原油采收率的方法 |
| EP3334798A4 (en) * | 2015-08-10 | 2019-01-23 | Baker Hughes, a GE company, LLC | PROTEINS FOR REMOVING SULFUR CONNECTIONS AND / OR ACID COMPOUNDS IN DRILLING LIQUIDS |
| EA201890544A1 (ru) | 2015-09-22 | 2018-08-31 | 9668241 Канада Инк. | Гравитационный дренаж с применением пара под микробиологическим воздействием |
| CN105156083B (zh) * | 2015-10-23 | 2017-07-18 | 中国石油化工股份有限公司 | 一种内源微生物驱油藏适应性的评价方法 |
| NZ743052A (en) * | 2015-11-25 | 2019-04-26 | Baker Hughes A Ge Co Llc | Method of preventing or mitigating formation of metal sulfide scales during oil and gas production |
| US11718801B2 (en) | 2019-09-16 | 2023-08-08 | Saudi Arabian Oil Company | Apparatus to simulate biocide performance in crude pipeline conditions |
| CN111878075B (zh) * | 2020-09-14 | 2022-02-11 | 西南石油大学 | 一种倾斜油藏气水协同注入分区采出程度的测试方法 |
| US11732560B1 (en) | 2022-03-14 | 2023-08-22 | Saudi Arabian Oil Company | Nitrate treatment for injectivity improvement |
Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4879240A (en) | 1988-07-19 | 1989-11-07 | Combustion Engineering, Inc. | Microbial control of hydrogen sulfide production by sulfate reducing bacteria |
| US5044435A (en) | 1990-07-16 | 1991-09-03 | Injectech, Inc. | Enhanced oil recovery using denitrifying microorganisms |
| US5858766A (en) | 1990-08-24 | 1999-01-12 | Brookhaven Science Associates | Biochemical upgrading of oils |
| US6322621B1 (en) | 1999-05-24 | 2001-11-27 | Nuritchem, Llc (La) | Chemical method of liquefaction and dispersion of paraffin waxes, asphaltenes and coke derived from various sources |
| GB9926156D0 (en) | 1999-11-04 | 2000-01-12 | Norske Stats Oljeselskap | Method of treating a hydrocarbon-bearing measure |
| US6543535B2 (en) * | 2000-03-15 | 2003-04-08 | Exxonmobil Upstream Research Company | Process for stimulating microbial activity in a hydrocarbon-bearing, subterranean formation |
| US6852234B2 (en) | 2000-11-09 | 2005-02-08 | The Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Apparatus and method for in situ burning of oil spills |
| GB0028268D0 (en) | 2000-11-20 | 2001-01-03 | Norske Stats Oljeselskap | Well treatment |
| CA2436625A1 (en) | 2001-02-01 | 2002-08-22 | Lobo Liquids, Llc. | Cleaning of hydrocarbon-containing materials with critical and supercritical solvents |
| GB0112343D0 (en) * | 2001-05-21 | 2001-07-11 | Norske Stats Oljeselskap | Well treatment |
| US20030213747A1 (en) | 2002-02-27 | 2003-11-20 | Carbonell Ruben G. | Methods and compositions for removing residues and substances from substrates using environmentally friendly solvents |
| US7442313B2 (en) | 2003-08-27 | 2008-10-28 | Thinkvillage-Kerfoot, Llc | Environmental remediation method and system |
| WO2005005773A2 (en) | 2003-07-14 | 2005-01-20 | The Energy Research Institute | A process for enhanced recovery of crude oil from oil wells using novel microbial consortium |
| US7172688B2 (en) | 2003-12-08 | 2007-02-06 | Petersen Robert N | Mixed immiscible liquids vacuum, separation, and disposal method and system (Mod 1) |
| JP4751617B2 (ja) * | 2005-01-21 | 2011-08-17 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 欠陥検査方法及びその装置 |
| US7922893B2 (en) * | 2006-02-08 | 2011-04-12 | International Business Machines Corporation | System and method for preparing near-surface heavy oil for extraction using microbial degradation |
| US20090082227A1 (en) | 2007-08-24 | 2009-03-26 | Hnatow Linda L | Application of anaerobic denitrifying bacteria utilizing petroleum components as sole carbon source for oil |
| CN102027195B (zh) * | 2008-05-12 | 2014-05-14 | 合成基因组股份有限公司 | 刺激生物源甲烷从含烃地层中生成的方法 |
| US7740063B2 (en) * | 2008-08-20 | 2010-06-22 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Method for identification of novel anaerobic denitrifying bacteria utilizing petroleum components as sole carbon source |
| US7708065B2 (en) | 2008-09-29 | 2010-05-04 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Identification, characterization, and application of Thauera sp. AL9:8 useful in microbially enhanced oil recovery |
-
2010
- 2010-02-12 US US12/704,589 patent/US8528634B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-02-18 BR BRPI1005321A patent/BRPI1005321A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2010-02-18 GB GB1116201.3A patent/GB2481334B/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-02-18 CA CA2750863A patent/CA2750863C/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-02-18 WO PCT/US2010/024516 patent/WO2010096514A2/en active Application Filing
-
2011
- 2011-09-21 NO NO20111275A patent/NO20111275A1/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20100212888A1 (en) | 2010-08-26 |
| CA2750863C (en) | 2017-01-03 |
| GB2481334A (en) | 2011-12-21 |
| US8528634B2 (en) | 2013-09-10 |
| GB2481334B (en) | 2014-11-26 |
| GB201116201D0 (en) | 2011-11-02 |
| WO2010096514A2 (en) | 2010-08-26 |
| CA2750863A1 (en) | 2010-08-26 |
| WO2010096514A3 (en) | 2010-12-09 |
| BRPI1005321A2 (pt) | 2015-11-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO20111275A1 (no) | Fremgangsmate for a forbedre oljeutvinning fra et oljereservoar ved a anvende anriket anaerobt, stasjonaert mikrobielt konsortium | |
| NO20111277A1 (no) | Et stasjonaert anaerobt denitrifiseringskonsortium for bruk i in situ bioremediasjon av hydrokarbonkontaminerte omrader og okt oljeutvinning | |
| Grabowski et al. | Microbial diversity in production waters of a low-temperature biodegraded oil reservoir | |
| US7740063B2 (en) | Method for identification of novel anaerobic denitrifying bacteria utilizing petroleum components as sole carbon source | |
| NO20111273A1 (no) | Fremgangsmate for in-situ bioremediasjon av hydrokarbonkontaminerte omrader ved a anvende et anriket anaerobt stasjonaert mikrobielt konsortium | |
| US20090082227A1 (en) | Application of anaerobic denitrifying bacteria utilizing petroleum components as sole carbon source for oil | |
| Nazina et al. | Functional and phylogenetic microbial diversity in formation waters of a low-temperature carbonate petroleum reservoir | |
| EP2432847A1 (en) | Altering the interface of hydrocarbon-coated surfaces | |
| Siegert et al. | Starting up microbial enhanced oil recovery | |
| EP2179064B1 (en) | Method for identification of novel anaerobic denitrifying bacteria utilizing petroleum components as sole carbon source | |
| Cui et al. | Stimulation of indigenous microbes by optimizing the water cut in low permeability reservoirs for green and enhanced oil recovery | |
| Grabowski et al. | Characterization of long-chain fatty-acid-degrading syntrophic associations from a biodegraded oil reservoir | |
| Wang et al. | Monitoring exogenous and indigenous bacteria by PCR-DGGE technology during the process of microbial enhanced oil recovery | |
| Tüccar et al. | Bacterial Community Composition in Produced Water of Diyarbakır Oil Fields in Turkey: Bacterial communities in produced waters of south-eastern Turkey reported in detail for the first time | |
| Li et al. | Effect of exogenous inoculants on enhancing oil recovery and indigenous bacterial community dynamics in long-term field pilot of low permeability reservoir | |
| Dellagnezze et al. | Evaluation of bacterial diversity recovered from petroleum samples using different physical matrices | |
| Gudiña et al. | Biosurfactant producing microorganisms and its application to enhance oil recovery at lab scale | |
| Nazina et al. | Diversity and activity of microorganisms in the daqing oil | |
| Halim et al. | Profiling of indigenous microbial community dynamics and metabolic activity during enrichment in molasses-supplemented crude oil-brine mixtures for improved understanding of microbial enhanced oil recovery | |
| Xingbiao et al. | Influences of microbial community structures and diversity changes by nutrients injection in Shengli oilfield, China | |
| Gao et al. | Low‐Abundance Dietzia Inhabiting a Water‐Flooding Oil Reservoir and the Application Potential for Oil Recovery | |
| Hernández-Torres et al. | Prokaryotic community characterization in a mesothermic and water-flooded oil reservoir in Colombia | |
| Biktasheva et al. | Composition of Prokaryotic Communities in Anaerobic Enrichment Cultures of Crude Oil from Romashkino Oilfield (Russia) | |
| Johnson et al. | Fuel for the Future | |
| FIELD | CHARACTERIZATION OF THE METHANOGENIC COMMUNITY FROM THE HIGH-TEMPERATURE |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FC2A | Withdrawal, rejection or dismissal of laid open patent application |