NO179998B - Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine mot de forskjellige patogene serotyper av gruppe B Neisseria meningitidis - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine mot forskjellige patogene serotyper av gruppe B Neisseria meningitidis.

Neisseria meningitidis har det typiske hylsteret til gram-negative bakterier bestående av en cytoplasmisk membran, et peptidoglykanlag og en ytre membran med tre lag som sammen med kapsel-polysakkaridet "utgjør bakterieveggen.

Fra et immunologisk synspunkt er de strukturer som potensielt kan komme i kontakt med immunsystemet i ethvert av trinnene i forholdet mellom mikroorganisme og vert og spesielt de i de første trinnene, dvs. de mest utvendige komponentene, av betydning. Det er ikke tilfeldig at klassifiseringen av denne mikroorganismen har blitt foretatt på grunnlag av grupper, typer og undertyper, som har blitt etablert takket være reaksjoner med polyklonale (Frasch, CE. og Chapman, 1973, J. Infect. Dis., 127: 149-154) eller monoklonale antistoffer (Hussein, A., Monoclonal Antibodies and N. meningitidis, Proefshift. Utrecht, 1988).

Det er for tiden kjent 12 serogrupper: A, B, C, X, Y, Z, 29-E, W-135, H, I, K, og L (Ashton, F.E. et al., 1983, J. Clin. Microbiol., 17: 722-727; Branham, S.E., 1956, Can. J. Microbiol., 2: 175-188, Evans, A.C., 1920, Lab. Bull., 1245: 43-87; Shao-Qing, et al., 1972, J. Biol. Stand., 9: 307-315; Slaterus, K.W., 1961, Ant. v. Leeuwenhoek J. Microbiol. Serol., 29: 265-271). Slike grupper har blitt differensiert i overensstemmelse med kapsel-polysakkaridet (CPS) som utviser forskjeller blant hver av disse gruppene i visse antigeniske determinanter (Branham, S.E., 1940, Bacteriol. Rev., 4, 59-96; Frasch, CE. et al., 1985, Rev. Infect. Dis., 7: 504-510).

Til tross for variasjoner i den epidemiologiske situasjon i forskjellige områder av verden og "kunnskapshullene" på grunn av en mangel av tilstrekkelige systemer med hygienisk kontroll i noen land, har det vært mulig å fastslå at blant alle disse gruppene så er i dag bare grupper A, B, C, Y, og W-135 ansvarlige i verden for mer enn 90$ av tilfellene (Abdillahi, H. , 1988, Proefschrift, s. 13, Utrecht, Nederland), ifølge andre forfattere så er de ansvarlige for mer enn 95$ (Frasch, C.E., Eur. J. Microbiol., 4: 533-536).

Kapselpolysakkaridene, renset og karakterisert, og benyttet hittil som vaksiner har vist seg å være effektive nok for å bekjempe utbruddene og epidemiene av gruppene A, C, Y og W—135, som en en-, to-, tre- eller fireverdig vaksine (Gold et al., 1969-1970, Bull. WHO, 45: 272-282; Gotschilch et all, 1969, J. Exp. Med., 129: 134-136; Hankins, 1982, Proe. Soc. Biol. Med., 169: 54-57). Til tross for mangler som fremdeles må løses slik som dårlig eller ingen respons overfor polysakkarid C hos barn under 2 år og termolabili-teten til polysakkarid A, ved siden av vanskeligheter med hensyn til induksjon av toleranse etter revaksinering med polysakkarider A og C, i betraktning av at på noen steder har en økning av tilfeller blitt påvist (Marzochi, K.B.F., Meningite Meningococcica, Tese (doutorado) Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil (s. 328), 1985), så er polysakkaridvaksinene, selv om de muligens ikke er fullt utviklede, nå et effektivt våpen i kampen mot sykdom forårsaket av grupper A, C, Y og W—135, men ikke mot gruppe B, hvis kapselpolysakkarid er et meget dårlig immunogen (Wyle et al., 1972, J. Infect. Dis., 126, 514-522; Zollinger et al., 1979, J. Clin. Invest., 63: 836-834; Jennings et al., 1981, J. Immunol. , 127; 104-108). Det kan skyldes forskjellige årsaker slik som kryssreaktiviteten med antigener i selve verten (hjernesialoglykopeptider), strukturmessige endringer forårsaket av disse polysakkaridene når de renses, og deres store sensitivitet overfor enzymatiske og andre typer av nedbrytning som foregår i organismen, slik som hurtig forestring, osv. (Lifely, M.R, og Moreno, C, 1986, Lancet, Jan. 25, 214-215). Sluttresultatet er at til tross for intenst arbeid til betydelig forskere og selskaper slik som -the Wellcome Foundation, har det hittil vært umulig å omdanne gruppe B-polysakkaridet til et tilfredsstillende immunogen. På grunn av de ovennevnte årsaker virker den generelle løsning for de andre polysakkaridgruppene som er benyttet for vaksiner ikke for gruppe B. Dette, foruten det faktum at serogruppe B i dag er hovedårsaken til meningokokk-sykdom i de fleste tempererte land, samt andre områder verden over, gjør det nødvendig å tilveiebringe alternative vaksiner. Hvert forsøk på å finne disse alternative vaksinene bør derfor baseres på ikke-kapsel-antigener, spesielt de i den ytre membran, under hensyntagen til deres betydning i mikroorganisme-vert-forholdet.

Blant komponentene i denne membranen har nesten hver arbeidsgruppe fokusert sin oppmerksomhet på proteinene fordi de andre relevante komponentene ville være 1ipopolysakka-ridene (LPS), men deres sterkt toksiske natur, deres pyrogene aktivitet og deres mitogene kapasitet, har vært et hinder for å betrakte dette elementet som en vaksinemulighet, skjønt det er det mest viktige i patogenesen av meningokokk-sykdommen.

Størstedelen av proteinene i den ytre membranen, både fra gruppe B og C, gir opphav til under inndel inger av disse gruppene i serotyper (i det følgende skal det bare refereres til gruppe B). De er basert på den immunologiske spesifisi-teten til disse hovedproteinene som detekteres i reaksjoner med polyklonale og monoklonale antistoffer i forskjellige teknikker (Abdillahi, H. , Proeschrift, Utrecht, Nederland, 1988). Gruppe B har allerede blitt underinndelt i flere enn 18 serotyper.

For denne identifikasjon anvendes slike teknikker som dobbelt immunodiffusjon, motimmunoelektroforese, radioimmunoanalyse, ELISA, SPRIA, koagglutinering under anvendelse av protein A-belagt Staphylococcus aureus for å feste monoklonale antistoffer eller andre faste bærere, agglutinering ved hjelp av lateks, osv. (Gold, R. og Wyle F.A., 1970, 1: 479-484; Jones, O.M. og Tobin, B.M., 1976, J. Clin. Pathol., 29: 746-748; Frasch, CE. og Chapman, S.S., 1973, Infect. Dis., 127; 149-154; Danielsson, D. og Olsen, 1979, J. Clin. Pathol., 32: 136-142).

Ved hjelp av monoklonale antistoffer har det også vært mulig å underinndele ytterligere forskjellige serotyper ved å korrelere dem med deres grad av "virulens", f.eks. ble serotype 2 underinndelt i 2a, 2b og 2c (Abdillahi, H. og Poolman, J.T., 1983, Proefschrift. Ch., 6, s. 69-78, Dtrecht, Nederland; Poolman,, J.T. et al., 1980, J. Gen. Microbiol., 116: 465-473).

Det er åpenbart at ved å bruke størstedelen av proteinene i den ytre membranen som en basis for immunogenet, så frem-stilles et spesifikt serotype-immunogen. Til tross for det faktum at det har blitt funnet at blant alle serotypene, så er bare noen få sykdomsfremkallende (Frasch, CE., et al., 1972, Seminars in Infectious Diseases, vol. 1 S.I.M. Book Corp., N.Y. 304-337) mens andre sjelden er dette, så ville det være umulig å fremstille et immunogen basert på serotype, som ville ha tilstrekkelige antigeniske determinanter for alle serotypene som forårsaker sykdom. Derfor har serotype-vaksiner som sådan et lite effektivitetsområde, idet de bare tar sikte på den spesifikke serotype for hvilken vaksinen ble utviklet. Dette har vært tilfelle for nesten alle protein-vaksinene som har vært fremstilt i de siste årene og har blant flere andre vært en av deres hovedbegrensninger. Vaksiner basert på serotype 2a proteiner har blitt fremstilt fra vesikler i den ytre membranen (Frasch, CE. et al., 1982, Infect. Immun., 37: 271-280) og visse varianter av disse vaksinene har vært studert med hensyn til deres immunogenisitet og toksisitet hos dyr (Peppler et al., 1982, Infect. Immun., 37: 264-270) og har blitt bestemt med henblikk på deres sikkerhet og immunogenisitet i frivillige voksne personer (Frasch, CE. et al., 1982, Sem. Infect. Dis., 4; Zollinger et al., 1979, J. Clin. Invest., 63: 836-848). Annet forskningsarbeid viser også viktigheten av oppløselig-heten av disse vaksinene (Frasch, CE. et al., 1982, Sem. Infect. Dis., 4; Frasch, CE. et al., 1978, J. Exp. Med., 147: 629-644).

Nyttevirkningene fra bruken av kapsel-polysakkarider og forskjellige hjelpemidler som aluminiumhydroksyd eller —fosfat har også blitt rapportert av flere forfattere (Frasch, CE. et al., 1983, Med. Microbiol., vol. 2, Acad. Press, N.Y.). I noen tilfeller har et nøye studium blitt utført på korrelasjonene mellom mengdeforholdene av disse komponentene, deres elektronmikroskopbilde og deres respons i forskjellige dyr, inkludert primater og mennesker i forskjellige aldersgrupper (Campa, C et al., 1986).

Ved forskningsarbeid foretatt av oppfinneren (Campa, C. et al., under utarbeidelse for publikasjon) er løsningen når det gjelder mangelen på immunogenisitet hos barn under 2 år funnet.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for oppnåelse av en vaksine mot forskjellige patogene serotyper av gruppe B Neisseria meningitidis, hvis hovednyhet er basert på bruken av et antigenisk proteinkompleks av høy molekylvekt som er felles for alle patogene serotyper, som forankret i vesiklene i den ytre membranen til mikroorganismen, sammen-satt blant andre komponenter av serotype-majoritetsproteiner i stammen benyttet i produksjonen, og det hele understøttet ("adjuvated"), tillater oppnåelse av et beskyttende preparat som aldri før har blitt tilveiebragt.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine mot forskjellige patogene serotyper av gruppe B Neisseria meningitidis, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved at

(i) - det anvendes levende organismer av en hvilken som helst av de kjente patogene serotypene av B-gruppen

uten inaktivering;

(ii) vesiklene i den ytre membranen og det antigeniske proteinkomplekset av molekylvekt 65-95 KD ekstraheres ved bruk av detergent valgt fra natriumdeoksykolat, natriumdodecylsulfat, Brij-96 og "Tween 80"; lysozym og ultralyd kombinert i behandlingen, idet ekstraksjonen av proteiner fra membranen utføres ved en temperatur på 2-10°C med en ekstraksjonstid varierende fra 15 minutter til 5 timer, i et bufret, vandig medium, ved en pH-verdi på 6,5-9,0 og med magnetisk eller mekanisk omrøring ved 250-950

omdr./min;

(iii) det resulterende produktet renses etter behandling for fjerning av nukleinsyrene ved en dissosierende behandling med detergent, ultralydbad og kolonnekro-matografi, idet rensingen av det resulterende produktet som er fritt for nukleinsyrer utføres ved å avpasse dets innhold av 1ipopolysakkarider og fosfolipider ved hjelp av en dissosierende behandling med natriumdeoksykolat, eller Brij-96, eller "Tween 20" eller "Tween 80" som detergenter i konsentrasjoner på 0,1-6$, og en ultralydbehandling fulgt av molekylærsikting i en Sephacryl S-300 eller S-400

eller Sepharose Cl-4B-kolonne;

(iv) det således oppnådde multi-antigeniske materialet renses for oppnåelse av det antigeniske proteinkomplekset av molekylvekt 65-95 KD ved HPLC-kromatografi (TSK 3000 SWG-kolonne) eller affinitetskromatografi med monoklonale antistoffer, eller hydrofobisitetskromatografi eller ioneutvekslingskromatografi eller en kombinasjon av hvilke som helst

derav;

(v) det antigeniske proteinkomplekset tilsettes til den fraksjonen som inneholder vesiklene ved ultralydbehandling slik at det vil festes på disse, i en mengde på 15 $ ± 3, samt at

(vi) også kapsel-polysakkarid tilsettes i et mengdeforhold på 1,1-1,4 med hensyn til proteinet og hjelpe-midlet i et forhold varierende fra 20 til 100 mcg/-

protein meg,

idet de forskjellige komponentene i blandingen kan steriliseres ved kobolt 60-ioniserende stråling med doser på 5-25 Kgy og en temperatur mellom 1 og 4°C før fremstilling av blandingen eller den resulterende blanding kan steriliseres på denne måten, og ved at de forskjellige komponentene i den resulterende vaksineblandingen eventuelt steriliseres ved membranf iltrering.

Vesiklene utgjør ett av elementene i vaksinene som bidrar med antigeniske determinanter i de antigeniske majoritetsproteinene, de regulerer immunologisk LPS og utgjør den ideelle strukturen for forankring av andre proteiner, som er i minoritet i nevnte B-meningokokk, men som er felles for alle de patogene typene som er testet og er meget gode immunogener, som induserer langvarig baktericid respons.

Det brede området av alminnelig beskyttende karakter gis av den samlede antigenisitet i gruppe B i sonen med det antigeniske proteinkompleks av høy molekylvekt. Det antigeniske proteinkompleks av høy molekylvekt vil også "hjelpe" og øke responsen mot andre antigener foruten å være ansvarlig for den forlengede immunologiske hukommelse.

Serotype-antigenene er viktige i det første trinnet av den beskyttende respons (4-6 måneder), men siden blir den beskyttende titer hovedsakelig detektert mot det antigeniske proteinkompleks av høy molekylvekt.

Av denne grunn er den andre komponenten i vaksinen det antigeniske proteinkompleks av 65-95 KD molekylvekt, som tilsettes til vesiklene i en mengde av 15$ ± 3.

Vesiklene ville i seg selv sannsynligvis tjene som en serotype-vaksine av moderat og kortvarig effektivitet.

Et trekk ved fremgangsmåten er ekstraksjonen av proteinene i den ytre membranen ved kombinert behandling av levende mikroorganismer med detergent, enzym og ultralydbad, og mer spesielt ved bruk av natriumdeoksykolat, natriumdodecylsulfat og Brij-96 som detergenter ved de følgende respektive konsentrasjoner: lavere enn 1$, fra 0,1-5$, og fra 0,01-0,05$, idet alle uavhengig kombineres med lysozym ved en konsentrasjon på 0,03-1$ og ultralydbad. En variant av denne ekstraksjonsprosessen består av bruk av "Tween 80" kombinert med ultralydbad.

Eksempler på ekstraksjonsmedier for membranprotein.

US: ultralydbad. Kontaminant DNA refererer til antall prosent av det totale av DNA/totalprotein som må fjernes i de etterfølgende trinn.

Ekstraksjonsprosessen for membranproteiner utføres ved en temperatur mellom 2 og 10°C, med en ekstraksjonstid mellom 5 minutter og 5 timer, ved magnetisk eller mekanisk (250-950 omdr./min.) omrøring; mediet i hvilket ekstraksjonen finner sted- kan utgjøres av forskjellige vandige buffere og pH-verdien holdes mellom 6,5 og 9,0 avhengig av den benyttede ekstraherende kombinasjon; magnetisk eller mekanisk omrøring kan veksle med ultralydbehandling.

Et annet trekk ved fremgangsmåten er rensingen av protei-nekstraktet ved dissosierende behandling med detergent, ultralydbehandling og kromatografi og elimineringen av nukleinsyrer. Med denne kombinasjon oppnås modulasjon av innholdet av LPS, fosfolipider og andre lipider i vesiklene, som gir vaksinen evne til å indusere en effektiv anti-stoffrespons mot endotoksin. Som detergent anvendes natriumdeoksykolat, Brij-96, "Tween 20", "Tween 80" i en konsentrasjon på 0,1-6$. Molekylsiktingen foretas i en Sephacryl S-300 og S-400 eller Sepharose Cl-4-kolonne.

Et ytterligere trekk ved fremgangsmåten er at rensingen av det antigeniske materialet, som resulterer fra modulasjonen til oppnåelse av det antigeniske proteinkompleks av høy molekylvekt, nemlig 65-95 KD, foretas ved bruk av HPLC-kromatografi (TSK3000 SW6-kolonne) eller affinitetskromatografi med monoklonale antistoffer eller hydrofob kromatografi eller ioneutvekslingskromatografi eller en kombinasjon av hvilken som helst av disse teknikker.

Det er et vesentlig trekk ved denne fremgangsmåte at den supplerer fraksjonen inneholdende vesiklene med det antigeniske proteinkompleks i en mengde på 15$ ± 3 ved bruk av ultralydbehandling slik at komplekset forankres der på.

Med ultralydbehandling lettes integrering av det antigeniske komplekset på de naturlig dannede vesiklene som allerede er i besittelse av spor av disse proteinene som rester fra rensing; på denne måten virker vesikkelen som en bærer eller hjelpemiddel med hensyn til nevnte antigen med høy molekylvekt .

Til - fraksjonen inneholdende vesiklene tilsettes kapsel-polysakkarid i et mengdeforhold på 1:1 - 1:4 med hensyn til protein og hjelpemiddel i aluminiumfosfat eller kalsium-fosfat.

Ved tilsetning av ovennevnte mengder av kapsel-polysakkarid og hjelpemiddel oppnås en økning i immunogenisiteten til vaksinepreparatet, samt en tilstrekkelig presentasjon av lipopolysakkaridkomponenten som på denne måten får redusert kapasitet til å indusere uønskede reaksjoner til et minimums-nivå.

De forskjellige komponentene i vaksineblandingen blir sterilisert ved bestråling med ioniserende kobolt 60 i doser på 5-25 Kgy, ved en temperatur på 1-4° C før fremstilling av sluttblandingen, eller steriliseringen kan utføres på denne måten etter at den resulterende blanding er oppnådd. Anvendelsen av ioniserende stråling for sterilisering av de enkelte komponentene i vaksineblandingen eller av komponenten sammen, i væskeform eller lyofilisert form for å modifisere immunogenisiteten, er beskrevet for første gang for denne type vaksiner.

Ifølge en variant ved denne fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir steriliseringen av komponenten bevirket ved membranf iltrering.

En annen variant av steriliseringstrinnet er bruken av begge metoder i kombinasjon: kobolt 60-ioniserende stråling ved de angitte doser og temperaturer og membranfiltrering på en slik måte at noen av komponentene steriliseres uavhengig ved den første metoden og resten ved den andre metoden.

Den således oppnådde vaksine har en langvarig beskyttelse mot forskjellige patogene serotyper av gruppe B Neisseria meningitidis. Det er den første vaksinen mot B meningokokker til å nå et effektivt feltnivå, således har allerede 300.000 frivillige fått vaksinen.

Denne vaksinen inneholder en immunologisk effektiv mengde av det antigeniske proteinkompleks av molekylvekt 65-95 KD, som gir antigenisk egenskap for de forskjellige patogene serotypene og induserer produksjonen av baktericide antistoffer; den inneholder også en mengde vesikler i det nødvendige mengdeforhold til å indusere en sterk antistoff-respons mot de antigeniske serotype-determinantene og endotoksinet; en andel av kapsel-polysakkarid som øker oppløseligheten og immunogenisiteten av det hele, hvilket samtidig øker organismens respons overfor polysakkarid-komponenten, selv for barn under 2 år og definerer dens flerverdige egenskap. Vaksinen optimaliseres av den nødven-dige mengde hjelpemiddel.

Oppfinnelsen tillater også oppnåelsen, fra bloddonasjoner fra vaksinerte, av et hyperimmunt antimeningokokkisk gamma-globulinpreparat som med hell er benyttet for første gang i profylakse og behandling av meningitt og meningokokkemi forårsaket av en eller annen av de forskjellige patogene serotypene av gruppe B Neisseria meningitidis mot hvilke det er i besittelse av bakteriell og nøytraliserende aktivitet.

Som følge av foreliggende oppfinnelse kan det for første gang oppnås en spesifikk overføringsfaktor (dialyserbar faktor fra hvite blodlegemer fra donorer), som er i stand til å overføre T-celle-immunitet mot nevnte mikroorganisme.

Kontroller

Kontrollene av polysakkarid C er etablert gjennom standardene ifølge WHO og de er nøyaktig oppfylt.

Kontrollene for proteinpreparatene er:

Elektroforese i polyakrylamidgel (Tsai og Frasch, 1980, J. Bacteriol., 141: 169-176). I de oppnådde elektroforetiske mønstre finnes det foruten serotype-majoritetsproteinene, 12-15$ proteiner av det antigeniske komplekset med høy molekylvekt 65-95 KD.

KDO. (Osborn, et al., 1963, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 50: 499-506). I varianten studert opptil feltnivå var den fastsatte tillatelige grense 10$.

Andre varianter med KDO over 10$ blir nå studert i frivillige personer.

Nukleinsyrer. Etter eliminering av protein ved hjelp av fenol og dialyse utføres differensiert spektrofotometrisk avlesning (260-280 nm) for derved å bekrefte detekterbart fravær av proteiner og deretter beregnes nukleinsyrekonsen-trasjonen ved lysadsorpsjon ved 260 nm, ved bruk av følgende ekstinksjonskoeff isient:

Sialinsyre: Det resterende polysakkarid B-innhold ble målt ifølge metoden til L. Svennerholm (Biochem. Biophys. Proe., 24: 604, 1957). I varianten i foreliggende oppfinnelsen utført til feltforsøksnivå ble det fastslått en 1-10$ grense.

Elektronmikroskopi. Denne utføres som en rutinemessig metode som beskrevet av Frasch og Peppler (Infect. Immun., 37: 271-280, 1982). Bilde oppnådd ved ultramikroskopi korreleres med oppløselighet og immunogenisitet. Andre strukturelle studier er under utarbeidelse med de varianter som studeres. Poteinkonsentrasjonen ble bestemt ved Lowry-metoden (1951, J. Biol. Chem., 192: 265-275).

Sluttelige vaksinekontroller

Nedenfor angitte verdier refererer til varianten av foreliggende vaksine som gjennomgår feltforsøk i mennesker.

Preparat.

Proteinantigener: 100 ± 20 meg pr. ml. Polysakkarid: 100 ± 20 meg pr. ml. Aluminiumhydroksyd (gel) 4 mg pr. ml. Timerosal: 1 g i 10.00 ml. Dosen er 0,5 ml.

Timerosal. (mertiolat, natrium-etyl-merkuri-tiosalicylat). Det bestemmes ved spektrofotometri ved anvendelse av difenyl-tiokarbazon ifølge WHO Manual BLG/UNDP/77.1 Rev. 1, s. 84-85. Tillatelig grenseområde er 0,005 - 0,02$. Ved bruk av en pH-måler med glass- og kalomelelektrode og standard buffer-oppløsninger (BDH) ved pH-verdier 5,0, 7,0, 9,0. Tillatte pH-verdier må være i området av 7,0 ± 0,4.

Bestemmelse av aluminiuminnhold: Denne foretas ifølge Appendix D.18 i WHO/UNDP/77.1 Rev. 1, s. 87-88. Kriteriet for aksepterbarhet er at 1,25 mg Al (aluminium) pr. dose ikke skal overskrides.

Bestemmelse av antigenkonsentras. ioner og prosent absorpsjon til h. ielpemiddelgel

Den absorberte vaksinen sentrifugeres og konsentrasjoner av protein og polysakkarider i supernatanten og sedimentet bestemmes ved bruk av de ovennevnte metoder. Preparatet aksepteres dersom ikke mer enn 20$ av totale opprinnelig tilsatte antigener er frie i supernatanten.

Sterilitetskontroll. Den foretas ifølge spesifikasjonene i Appendix D.27 i BLG/UNDP/7.1, Rev. 1, General Requirements for the Sterility of Biological Substances og de tilsvarende kubanske standarder.

Uskadelighetskontoll. Hver sats testes for uskadelighet ved å gi en human dose (maks. 1 ml) til 5 voksne mus med vekt 17-22 g og ikke mer enn 15 ml til 2 marsvin med vekt 250-350 g. Preparatet aksepteres dersom ingen dyr viser dårlig helse i løpet av 7 dager etter inokulasjon. Dersom noen av dyrene dør eller viser dårlig helse og de andre ikke er påvirket, gjentas testen. Satsen godkjennes dersom ingen av dyrene i den andre gruppen dør eller viser dårlig helse etter 7 dager.

Elektronmikroskopi. Prøver av sluttelige vaksinesatser underkastes elektronmikroskopi ved bruk av den allerede nevnte metode.

ELISA: Fastfase-immunoenzymatisk analyse ble foretatt som beskrevet av Peppler og Frasch (Infect. Immun., 37: 264-270, 1982), og tilpasset til foreliggende antigens koblings-egenskaper, mest for å ha et referansesystem for foreliggende fremgangsmåte (Sierra, et al., 1988, Rev. Cub. Ifn. Biot., in press ).

Dette systemet er basert på bruken av PVC-ultra-mikroplater med brønner dekket av polystyren og 10 mel effektiv volum-kapasitet, som avleses i apparaturen (SUMA) utviklet ved Centro de immunoensayo (Havanna, Cuba) av Fernånez Yero og kollegaer, bestående av et hurtigavlesende vertikalt spektrofotometer-fluorimeter med automatisk operasjon og tolkning av resultater, og 96-posisjons multipipetter som muliggjør vurdering av tusener av prøver i løpet av meget kort tid og letter matematisk bearbeidelse. Dette systemet ble kalibrert for å vurdere antistoff respons i de forskjellige vaksineforsøkene.

Baktericid mikroanalyse

Noen modifisert baktericid mikroanalyse ifølge Frasch og Robbins (J. Exp. Med., 147: 229-244; 1978), med forbedring av komplementkilden ved oppnåelse av denne fra SPF-kaninserum (produsert ved Centro de Produccion de Animales de Laboratorio, Havanna, Cuba) for analyse av sera fra immuni-serte mus; og fra friske blodbankdonasjoner, ved analjrse av sera fra mennesker eller aper.

Statistisk analyse

Ikke-parametriske metoder ble benyttet i den statistiske analysen siden fordelinger av ELISA- og baktericid-verdier ikke hadde et normalt mønster, men hadde en viss asymmetri.

Wilcoxon-testen for uavhengig prøve ble hovedsakelig benyttet. For oppnåelse av en bedre analyse ble en omfattende serie av percentiler beregnet hvorved det således ble benyttet en annen metode for oppnåelse av medianen for hvert studerte gruppe.

Dyreforsøk

Tester i mus: Hver variant av vaksinepreparatet ble underkastet immunogenisitets- og baktericidtester i mus (ved siden av de ovennevnte sikkerhetstester i marsvin og mus). Resultatene viste at preparatene er immunogene og kan fremkalle betydelige nivåer av baktericide antistoffer.

Tester i aper: Vaksinevarianter som skulle benyttes i frivillige mennesker ble også testet i aper (Macaccus aethipiens) i forskjellige doser og programmer. Resultatene viste at de var uskadelige, immunogeniske og hadde sterk evne til å fremkalle baktericide antistoffer sammenlignet med placebo.

Tester i mennesker: Rektogenisitetstester ble utført i grupper av 3, 10 og 30 personer for å dekke de forskjellige dosene som ble analysert; deretter ble større grupper benyttet for immunogenisitetstester.

De første gruppene ble nøye observert av spesialisert medisinsk personell i løpet av de første dagene, og studiene innbefattet: a) vitale tegn (puls, temperatur, blodtrykk);

b) lokale reaksjoner; c) systemiske reaksjoner; d) nyre-funksjon; e) leverfunksjon; f) hematologisk studium (diffe-rensialtelling, blodplater, koagulogrammer); g) høyere nervøs funksjon (EEG); h) hjertefunksjon (ECG).

Ingen av studiene viste noen patologiske endringer i noe organ eller system med noen av de studerte dosene som varierte fra 20 til 100 meg proteinantigener og de andre tilsvarende komponentene. De eneste reaksjonene som ble observert i de fleste av de frivillige personene var: 1. Svak smerte ved injeksjonsstedet, spesielt i løpet av de første 48 timene.

2. Rødming ved injeksjonsstedet og omgivende område.

3. Svak feber, med et middel på 37,5°C.

4. Ubehag og hodepine bare hos noen få personer, meget forbigående, i løpet av de første 10-12 timene.

Ingen alvorlige eller betydelige reaksjoner forekom, ingen umiddelbar eller forsinket hypersensitivitet ble observert. Blodtellingen var noe endret for neutrofiler og betydelig for lymfocytter.

Hver frivillig ble gitt et trykt formular som skulle utfylles med deres observasjoner. En del av det trykte formularet skulle utfylles av det medisinske personell. Denne praksis har blitt beholdt for reaktogenisitetstesten av hver fremstilt sats og frigitt for bruk.

Immunogenisitetstester og induksjon av baktericide antistoffer i mennesker

Dose-respons-studier ble utført i grupper av mennesker på 100, 200, 300, 500 og 1000 frivillige voksne (20-100 meg) og for bestemmelse av vaksinasjonsprogrammer, doseintervaller og antall doser. Tester ble utført først på unge mennesker og deretter med kontrollerte grupper av varierende alder og sosial bakgrunn i antall som gradvis øket (3, 10, 30 og 50 individer).

A. Voksne i aldersgruppen 18 til 45 år.

B. Studenter av begge kjønn og forskjellige utdannelses-systemer (kostskole og ikke-kostskole) i alderen 13-18 år.

C. Barn i grunnskolen i aldersgruppen 6-12 år.

D. Barn i aldersgruppen 2-6 år.

F. Spedbarn i aldersgruppen 3-6 måneder.

G. Voksne over 45 år.

Personer i aldersgruppen under 12 år mottok ikke doser over 50 meg. Resultatene var meget tilfredsstillende. Ingen uønskede reaksjoner ble observert med unntagelse for de ovennevnte. Hos barn var disse reaksjonene mindre intense etter hvert som alderen avtok.

Doser på 20-100 meg viste seg å være betydelig immunogene, men de beste resultatene ble oppnådd med 50 meg. Denne dosen ble valgt for alle aldersgrupper med den allerede beskrevne variant, som nådde feltbedømmelse. I alle disse studiene, inkludert de med dyr, ble reaktogenisitet osv. sammenlignet med kontrollgrupper som ble gitt placebo, som hadde det samme utseende, men manglet de aktive komponentene, dvs. kun aluminiumhydroksyd.

Antistoffmålinger ved hjelp av ELISA og bakterietester ble foretatt som nevnt ovenfor. Responsene for forskjellige antistofftyper og subtyper ble studert, idet den viktigste respons var den for IgG (immunoglobulin G).

For beskyttelsesfeltforsøkene ble det benyttet varianter med de allerede angitte egenskaper (mindre enn 10$ LPS, 50 meg protein, 50 meg polysakkarid C tilsatt 2 mg aluminiumhydroksyd). De andre variantene ble studert i enda mindre grupper.

Vaksinasjonsprogrammer valgt for feltforsøk

Selv om andre programmer som benyttet 2 og 5 doser og forskjellige intervaller ble studert, omfattet det valgte to separate doser med et intervall på 6-8 uker.

Studium av nyperimmun- gammaglobulin oppnådd fra vaksinerte frivillige

Rensing av plasma IgG-fraksjonen ble foretatt ved bruk av den modifiserte metoden ifølge E.J. Cohn et al. (J. Am. Chem. Soc, 68: 459-476, 1946) fra bloddonasjoner i en mengde av 250-350 ml, idet blodet ble gitt mer enn 4 uker etter vaksinasjon under kontroll av kvaliteten av de individuelle responser (ELISA og baktericid mikroanalyse). Den således oppnådde IgG-fraksjon av over 90% renhet ble underkastet alle kontrollene ifølge WHO med hensyn til bruk av endovenøse preparater (W.H.O. Tech. Rep. Ser., 567, 1975, idem.), inkludert test for AIDS- og hepatittvirus og bekreftelse av deres innhold av spesifikke og baktericide antistoffer mot de sirkulerende stammer. Fremgangsmåten forbedret betydelig den spesifikke antimeningokokkaktiviteten til preparatet sammenlignet med de innledende sera. Den viste høy konsentrasjon av spesifikke antistoffer mot de forskjellige antigenene i vaksinepreparatet og av de native stammene og høye baktericide titere mot disse. I overensstemmelse med vitenskapelige og lovmessige prosedyrer ble dens anvendelse godkjent for barn med meningitt og/eller meningokokkemi ., idet dens anvendelse hadde vist seg å være meget effektiv; dens antipyretiske effekt og dens innvirkning på den generelle tilstand og utvikling av pasienter er særlig betydelig. Denne hyperimmun-gammaglobulin produseres nå i stor målestokk for distribusjon til pleiestasjoner.

Virkningen av dette preparatet skyldes ikke bare dets bakterielle egenskaper, men også muligheten for fjerning av forskjellige antigener som frigjøres ved lysering fra meningokokker og hele meningokokker (Campa, C og Sierra, G. , Rev. Ciencia, 2, Julio, 1988; Galguera, M. et al., Rev. Cub. Hemat. Immun. Hemot. 2, 1988).

Effekten av nevnte antimeningokokk-hyperimmun-gammaglobulin oppnådd, fra vaksiner ved behandlingen av pasienter med meningitt eller meningokokkemi forårsaket av B meningokokker er et annet indirekte bevis på vaksinens effektivitet.

Andre resultater med vaksinevarianten sterilisert ved bruk av kobolt 60- ioniserende stråling

En omfattende og intensiv fysikalsk-kjemisk og immunologisk karakerisering av det bestrålte preparat ble utført, inkludert studier av teratogenisitet, karsinogenisitet, mutagenisitet, bestemmelse av forbindelser, og gjentagelse av alle de obligatoriske testene i dyr og frivillige mennesker med henblikk på reaktogenisitet og immunogenisitet.

Sluttelig, ble satsene av den valgte varianten med alle kontrolltester oppfylt på tilfredsstillende måte, benyttet i en gruppe av 50 unge frivillige for oppnåelse av bedømmelse av nyper immun-gammaglobul in, som ble produsert, og ga den samme kvaliteten i alle dens parametere og kliniske anvendelse i forhold til den som ble oppnådd fra variantvaksinene benyttet i det effektive feltforsøket.

Effektivitet av felttest

Et antall varianter av foreliggende bredspektrede vaksine ble testet i varianttrinn ved forsøk med mennesker. Den mest avanserte varianten blant disse er den som ble valgt for feltforsøket.

Hovedegenskaper for vaksinen benyttet i feltforsøket

Immunobiologiske egenskaper

1. Tilstedeværelsen av det antigeniske kompleks av høy molekylvekt med hånd felles for alle testede B-serotyper og det sluttelige arrangement av alle disse antigenene på majoritetsproteinenes vesikkel og LPS, bidrar med den egenskap at det fremkalles antistoffer ikke bare mot serotypen hvorfra majoritetsproteinene ble ekstrahert, men også mot helt forskjellige stammer som bare har til felles antigen av det høymolekylære komplekset.

Eksempler

2. 4-6 måneder etter den andre dosen er det et sensitivitets-fall av antistoffene til majoritetsproteinene vist ved ELISA og baktericid analyse; antistoffene til de høy-molekylære antigenkomplekset beholdes. Dette ble verifi-sert ved bruk av vaksinevarianter med forskjellige sammensetninger og Western-Blott-studier. 3. Stabilitet for det vesikulære komplekset og dets immunogenisitet samt dets immunologiske hukommelse forøkes etter hvert som den høymolekylære komponenten forøkes.

To effektivitetsforsøk ble utført:

A. Massevaksinasjon av høyrisikobefolkningen av alder 6

måneder til 24 år i en hel provins. Provinsen med den høyeste historiske forekomst, 30 pr. 100.000, ble valgt, og 145.000 personer ble vaksinert. Ingen annen type av vaksine eller placebo ble benyttet i dette studium; flere studier blir foretatt på forskjellige sosiale og aldersgrupper, og resultatene fra disse vil bli sammenlignet med den historiske forekomsten og den ikke-vaksinerte befolkning. Den grafiske fremstilling viser de innledende månedene av kampanjen og sykdommens adferd. Som det fremgår har epidemien blitt skåret ned i nevnte provins og ved sammenligning av det totale antall tilfeller i hver provins, kan det observeres at epidemien med den høyeste forekomsten i tidligere år ikke er i en slik situasjon lenger.

B. Hovedforsøket, i overensstemmelse med fordringene for godkjennelse av nye vaksiner, er en placebo-vaksine-dobbeltblindtest innbefattende et totale av 106.000 kostskolestudenter i 7 provinser med høy epidemiforekomst. Populasjonene som mottok enten vaksine eller placebo var større enn nødvendig slik at etter mer enn 1 år - hvilket er tiden fra begynnelsen av epidemien - så skulle til tross for de normale tapene i slike store og mobile populasjoner som kostskolestudenter, de nødvendige verdier være tilgjengelige. Med hensyn til ytterligere detaljer vedrørende planleggingen av dette effektivitetsfelt-studiet, så vises det til et offisielt dokument utgitt av Bureau of Epidemiology of the Cuban Ministry of Public Health, "Estudio de campo de la vacuna antimeningococcica de proteina de membrana externa y polisacårido C", 14. november 1986, Havanna.

Resultater av den første bedømmelse av placebo- vaksine-dobbeltblindforsøket

Flere måneder er nødvendig før sluttbedømmelsen av effektivi-teten, men den kan nå forutsies ut fra seroomdannelsesnivåene ved hjelp av ELISA og baktericid test og resultatene fra den terapeutiske anvendelsen av nyperimmun-gammaglobulinet oppnådd fra de vaksinerte.

For disse studiene ble det benyttet en representative prøvegruppe av 2100 kostskolestudenter.

Korrelasjonen for bærerens tilstand før vaksinasjon ble analysert som en mulig faktor sammenfallende med null eller atypiske responser til vaksinen. Både de ovenfor angitte resultater og de fra anvendelsen av antimeningokokk-hyperimmun-gammaglobulin tillater forutsigelse av at man har en generasjon av gruppe B antimeningokokkvaksine som er overlegen i forhold til de tidligere og for første gang effektiv og mottagelig for oppgradering.

BegynneIsesstammen i foreliggende oppfinnelse kan i prin-sippet være en hvilken som helst patogen stamme av B meningokokki som sirkulerer eller er ansvarlig for største-delen av sykdommene i området hvor vaksinebeskyttelse er ønsket. Denne stammen er tilstrekkelig karakterisert, spesielt hva angår stabilitet og vekstbehov i valgte dyrkningsmedia.

Mikroorganismen dyrkes i tilstrekkelig grad og sentrifugeres til oppnåelse av 500 g (våtvekt) biomasse av gruppe B Neisseria meningitidis, som resuspenderes i 2500 ml av en natriumdeoksykolatoppløsning (0,09$ natriumdeoksykolat, 50 mM Tris-ECl, pH = 8,5, 2 mM EDTA) hvortil 0,05$ lysozym tilsettes. Ekstraksjonsprosessen utføres i løpet av 2Vi time ved 4°C og i løpet av denne tiden utføres 10 behandlingsforløp i 30 sekunders ultralydbad vekslende med magnetisk omrøring ved 250 omdr./min.

Celleavfallet frasepareres fra ekstraktet ved sentrifugering ved 10.000 g. Supernatanten behandles med DNase og RNase ved en konsentrasjon på 5 mg pr. ekstraktliter hver ved 37°C.

Ekstraktet sentrifugeres ved 100.000 g i løpet av 2 timer, sedimentet suspenderes i 200 ml 5$ deoksykolatbuffer i Tris-EDTA, pH 8-9. Kromatografi foretas ved molekylarsikting i en matrise av Sephacryl S-300 med 1$ deoksykolatbuffer for elueringsformål. Den første toppen oppsamles og overvåkes på Uvicord ved 280 nm.

Den første toppen som elueres fra denne fraksjoneringen er hovedmaterialet inneholdende vesiklene hvortil det antigeniske kompleks av høy molekylvekt tilsettes i en mengde på 12-18$. Dette komplekset ekstraheres ved anrikning av fraksjonen av 65-95 KD fra den første toppen ved å gjenta ultralydbehandlingen i nærvær av 5$ Tris-EDTA-deoksykolatbuffer, fulgt av en affinitetskromatografi i en kolonne med anti-Pl- og anti-P3-monoklonale antistoffer, konsentrasjon ved ultrafiltrering og sluttelig kromatografi på en prepa-rativ kolonne (TSK 300-SWG) med Tris-EDTA-buffer.

Proteinpreparatet som inneholder 60-75$ serotypeproteiner og 12-1$ antigenisk kompleks av høy molekylvekt, utfelles og vaskes i etanol etter forutgående sterilfiltrering på en membran av Sartorius-typen. Under opprettholdelse av sterile betingelser tilsettes kapsel-polysakkarid i et forhold for polysakkarid til protein på 1:1. Denne gruppe C polysakkarid ble fremstilt ifølge Gold et al., 1969-1970, WHO Bull., 45: 279-282 og Gotschlich et al., 1969, J. Exp. Med., 129: 1349-1365, og sterilisert ved membranfiltrering (se ovenfor).

Til slutt tilsettes som hjelpemiddel til protein-polysakkarid-blandingen aluminiumhydroksyd i en mengde på 2 mg A1(0H)3 for hver 50 meg av protein og polysakkarid, idet mengdene representerer innholdet i en dose. Hjelpemiddelgelen er på forhånd radiosterilisert ved bruk av kobolt 60-bestråling med en dose av 15 Kgy ved en temperatur på 4<C>C.

En sluttelig pH-verdi for preparatet på 7,0 ± 0,4, en adsorpsjon til gelen av mer enn 80$ av det totale proteinet og polysakkaridet, og et innhold av 10$ LPS, garanteres.

Som preservativ anvendes timerosal ved en konsentrasjon på 0,005-0,02$. Hele produktet underkastes en rekke fysikalsk-kjemiske og biologiske kontroller som beskrevet ovenfor.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine mot forskjellige patogene serotyper av gruppe B Neisseria meningitidis, karakterisert ved at (i) det anvendes levende organismer av en hvilken som helst av de kjente patogene serotypene av B-gruppen uten inaktivering; (ii) vesiklene i den ytre membranen og det antigeniske proteinkomplekset av molekylvekt 65-95 KD ekstraheres ved bruk av detergent valgt fra natriumdeoksykolat, natriumdodecylsulfat, Brij-96 og "Tween 80"; lysozym og ultralyd kombinert i behandlingen, idet ekstraksjonen av proteiner fra membranen utføres ved en temperatur på 2-10°C med en ekstraksjonstid varierende fra 15 minutter til 5 timer, i et bufret, vandig medium, ved en pH-verdi på 6,5-9,0 og med magnetisk eller mekanisk omrøring ved 250-950 omdr./min; (iii) det resulterende produktet renses etter behandling for fjerning av nukleinsyrene ved en dissosierende behandling med detergent, ultralydbad og kolonnekro-matografi, idet rensingen av det resulterende produktet som er fritt for nukleinsyrer utføres ved å avpasse dets innhold av lipopolysakkarider og fosfolipider ved hjelp av en dissosierende behandling med natriumdeoksykolat, eller Brij-96, eller "Tween 20" eller "Tween 80" som detergenter i konsentrasjoner på 0,1-6$, og en ultralydbehandling fulgt av molekylærsikting i en Sephacryl S-300 eller S-400 eller Sepharose Cl-4B-kolonne; (iv) det således oppnådde multi-antigeniske materialet renses for oppnåelse av det antigeniske proteinkomplekset av molekylvekt 65-95 KD ved HPLC-kromatografi (TSK 3000 SwG-kolonne) eller affinitetskromatografi med monoklonale antistoffer, eller hydrofobisitetskromatografi eller ioneutvekslingskromatografi eller en kombinasjon av hvilke som helst derav; (v) det antigeniske proteinkomplekset tilsettes til den fraksjonen som inneholder vesiklene ved ultralydbehandling slik at det vil festes på disse, i en mengde på 15 $ ± 3, samt at (vi) også kapsel-polysakkarid tilsettes i et mengdeforhold på 1,1-1,4 med hensyn til proteinet og hjelpe-midlet i et forhold varierende fra 20 til 100 mcg/- protein meg, idet de forskjellige komponentene i blandingen kan steriliseres ved kobolt 60-ioniserende stråling med doser på 5-25 Kgy og en temperatur mellom 1 og 4°C før fremstilling av blandingen eller den resulterende blanding kan steriliseres på denne måten, og ved at de forskjellige komponentene i den resulterende vaksineblandingen eventuelt steriliseres; ved membranf iltrering.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at ekstraksjonen av proteiner fra den ytre membranen til hvilke som helst av de kjente patogene serotypene av gruppen B utføres ved en behandling med deoksykolat som detergent i en konsentrasjon mindre enn 0,1$ vekt/vol., lysozym i en konsentrasjon på 0,03-1$ og ultralydbad.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at ekstraksjonen av proteiner i den ytre membranen til hvilke som helst av de kjente patogene serotypene av gruppe B utføres ved behandling med natriumdodecylsulfat (SDS) i en konsentrasjon på 0,1-5$, lysozym i en konsentrasjon på 0,03-1$ og ultralydbad.

4 . Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at ekstraksjonen av proteiner i den ytre membranen til hvilken som helst av de kjente patogene serotypene av gruppe B utføres ved behandling med Brij-96 som detergent i en konsentrasjon på 0,01-0,5$, lysozym i en konsentrasjon på 0,03-1$ og ved bruk av ultralydbad.

5 . Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at ekstraksjonen av protein fra den ytre membranen til hvilke som helst av de kjente patogene serotypene i gruppe B, foretas ved bruk av "Tween 80".som detergent i en konsentrasjon på 0,1-2$.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1-5, karakterisert ved at noen av komponentene i vaksineblandingen radio-steriliseres og at resten steriliseres ved membranfiltrering.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1-6, karakterisert ved at utgangsmaterialet som anvendes er et konsentrat av kultursupernatanten.