NO179271B

NO179271B - Procedure for storing vegetable embryos

Info

Publication number: NO179271B
Application number: NO901479A
Authority: NO
Inventors: Bruno Florin; Claude Lecouteux; Vincent Petiard
Original assignee: Nestle Sa
Priority date: 1989-05-23
Filing date: 1990-04-02
Publication date: 1996-06-03
Also published as: DE69017078T2; IE901035L; JPH0339019A; EP0399158A1; PT94115B; DK0399158T3; ATE118813T1; FR2647465A1; CA2013821A1; NO179271C; FI902519A0; BR9002404A; FI95042C; ZA902288B; NO901479L; IE67530B1; NZ233157A; EP0399158B1; FI95042B; MY105890A

Abstract

In order to ensure the preservation of plant embryos for long periods, the embryos are pretreated in a medium containing an osmotic pressure agent before they are deep-frozen at a temperature of -15/-40 DEG C.

Description

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for lagring av somatiske eller zygotiske vegetabilske embryoer. The invention relates to a method for storing somatic or zygotic vegetable embryos.

En lang rekke arter kan bli lagret ved lav-temperaturer i form av cellesuspensjoner, kallus eller til og med meri-stemer. A wide range of species can be stored at low temperatures in the form of cell suspensions, callus or even meristems.

Lav-temperaturlagring av embryoer blir justert i mange tilfeller, f.eks. for regulering av produksjon av småplanter der det er sesong eller for å opprettholde en klonlinje. Low-temperature storage of embryos is adjusted in many cases, e.g. for regulating the production of small plants where there is a season or for maintaining a clone line.

Lav-temperaturlagringen av embryoer tillater muligheten for temporær stopping av utviklingen til embryoene, tiden som er nødvendig for transporten til såstedet eller deres lagring og muligheten for å skape genotypbanker for å unngå økende verdiforringelse av genetisk patrimoni. The low-temperature storage of embryos allows the possibility of temporarily stopping the development of the embryos, the time necessary for the transport to the sowing site or their storage and the possibility of creating genotype banks to avoid the increasing depreciation of the genetic patrimony.

Somatiske embryoer har visse fordeler ved formering av planter. De utgår i prinsippet fra en enkelt celle og gir genetisk uniforme planter. Fra begynnelsen av deres dannelse, har somatiske embryoer en bipolar struktur: de har to stamme-og rotmeristemer som er nødvendige for å fremstille en plante. Således viser somatisk embryogenese et interessant alternativ for utvikling av planter; den kan bli anvendt for rask formering av arter som er kostbare å fremstille eller av høy-yteevneindivider som utgår fra in vitro-kulturer eller av transformerte planter som er vanskelige å behandle, f.eks. ved kjønnsbestemmelse. Somatic embryos have certain advantages in propagating plants. In principle, they start from a single cell and produce genetically uniform plants. From the beginning of their formation, somatic embryos have a bipolar structure: they have two stem and root meristems that are necessary to produce a plant. Thus, somatic embryogenesis shows an interesting alternative for the development of plants; it can be used for rapid propagation of species that are expensive to produce or of high-yielding individuals starting from in vitro cultures or of transformed plants that are difficult to process, e.g. by sex determination.

Problemene som er involvert i lagringen av embryoer er komplekse. Særlig må de to meristemiske polene som har evne til å forsikre gjenopptagelse av forlengelse og organogenese av roten og stammen, bli bevart levende. The problems involved in the storage of embryos are complex. In particular, the two meristematic poles, which have the ability to ensure the resumption of elongation and organogenesis of the root and stem, must be kept alive.

Det finnes forskjellige kjente fremgangsmåter for lav-temperaturlagring av embryoer. En av disse fremgangsmåtene omfatter trinnet med forhåndsdyrking av embryoer på et medium anriket med sorbitol, prolin eller mannitol, impregnering ved 0°C i dyrkingsmedium som inneholder tilsatt dimetylsulfoksid og/eller glyserol, indusert langsom frysing til -40°C og deretter rask frysing i flytende nitrogen. Gjenopptagelse av embryogenese etter nedfrysing nødvendiggjør tilsetning av 2,4-diklorfenoksyeddiksyre til dyrkingsmediet. There are various known methods for low-temperature storage of embryos. One of these methods includes the step of pre-culturing embryos on a medium enriched with sorbitol, proline or mannitol, impregnation at 0°C in culture medium containing added dimethylsulfoxide and/or glycerol, induced slow freezing to -40°C and then rapid freezing in liquid nitrogen. Resumption of embryogenesis after freezing necessitates the addition of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid to the culture medium.

En annen fremgangsmåte som kan anvendes på somatiske embryoer som er dyrket på et agarmedium, omfatter trinnene med forhåndsdyrking av embryoene i en uke på et sukrose-anriket medium og direkte frysing av embryoene plassert tørt i et kryorør i flytende nitrogen. Another method that can be applied to somatic embryos cultured on an agar medium includes the steps of pre-cultivating the embryos for one week on a sucrose-enriched medium and directly freezing the embryos placed dry in a cryotube in liquid nitrogen.

I en annen fremgangsmåte blir somatiske embryoer forhånds-dyrket på et medium som blir tilsatt minst 2,5$ dimetylsulfoksid gradvis og deretter frosset langsomt til -100°C og deretter raskt i flytende nitrogen. Gjenopptagelse av embryo-genesen blir forenklet ved dyrking på et medium som inneholder 0,1 mg 1_<1> 2,4-diklorfenoksyeddiksyre. In another method, somatic embryos are pre-cultured on a medium to which at least 2.5% dimethylsulfoxide is added gradually and then frozen slowly to -100°C and then quickly in liquid nitrogen. Resumption of embryogenesis is facilitated by cultivation on a medium containing 0.1 mg of 1_<1> 2,4-dichlorophenoxyacetic acid.

Funksjonen av de kryobeskyttende midlene, slik som dimetylsulfoksid eller glyserol, er å forhindre dannelse av is under frysing. Imidlertid kan anvendelse av substanser slik som disse ha visse uheldige sider. På den ene side er de generelt ikke raskt sublimerbare og kan derfor ikke delta i en etterfølgende lyofiliseringsbehandling; på den annen side kan de være cytotoksiske. The function of the cryoprotectants, such as dimethylsulfoxide or glycerol, is to prevent the formation of ice during freezing. However, the use of substances such as these can have certain negative aspects. On the one hand, they are generally not rapidly sublimable and therefore cannot participate in a subsequent lyophilization treatment; on the other hand, they can be cytotoxic.

Funksjonen til auxinene, slik som 2,4-diklorfenoksyeddiksyre, er å bevare cellene i nøytraltilstand under kallogenese og å fremme gjenopptagelse av celleproliferering etter avi sing av embryoene. Nå induserer stopping av utviklingen til embryoene ved frysing ofte unormal gjenopptagelse av veksten. Auxinene har evne til å fremme dannelse av ytterligere embryoer ved celledeling under gjenopptagelse av embryogenese og økning av farene med sekundærembryogenese. For å unngå ulempene ved nåværende teknikk, søker foreliggende oppfinnelse å frembringe en fremgangsmåte for å lagre somatiske eller zygotiske vegetabilske embryoer som muliggjør at utviklingen av embryoene blir stoppet ved frysing og deretter gjenopptatt uten fremkomst av andre former av morfogenese, slik som sekundær embryogenese eller kallogenese. The function of the auxins, such as 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, is to preserve the cells in a neutral state during callogenesis and to promote the resumption of cell proliferation after hatching of the embryos. Now, arresting the development of the embryos by freezing often induces abnormal resumption of growth. The auxins have the ability to promote the formation of further embryos by cell division during the resumption of embryogenesis and increase the dangers of secondary embryogenesis. In order to avoid the drawbacks of the current technique, the present invention seeks to provide a method for storing somatic or zygotic vegetable embryos which enables the development of the embryos to be stopped by freezing and then resumed without the appearance of other forms of morphogenesis, such as secondary embryogenesis or callogenesis .

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved at The method according to the invention is characterized in that

embryoene blir forhåndsbehandlet på et dyrkingsmedium som inneholder et osmotisk trykkmiddel og blir etter forbehandling avkjølt og frosset til en temperatur i området fra —15°C til -40°C. the embryos are pretreated on a culture medium containing an osmotic pressure agent and, after pretreatment, are cooled and frozen to a temperature in the range from -15°C to -40°C.

Embryoene som er frosset ved -15 til -40°C kan bli lagret ved den temperaturen og kan deretter bli nedsunket i en væske avkjølt og lagret ved en lavere temperatur. The embryos frozen at -15 to -40°C can be stored at that temperature and can then be immersed in a liquid cooled and stored at a lower temperature.

En fordel med denne fremgangsmåten er at den unngår anvendelse av toksiske og/eller ikke-sublimerbare kryobeskyttende midler. En annen fordel er at den unngår anvendelse av auxiner i dyrkingsmediet som blir anvendt før frysing og etter avising under gjenopptagelse av veksten. En ytterligere fordel med fremgangsmåten er at den frembringer en raskt tilgjengelig lav lagringstemperatur (-15/40°C) (for eksempel i en vanlig fryser) uten behov for kostbart utstyr. An advantage of this method is that it avoids the use of toxic and/or non-sublimable cryoprotectants. Another advantage is that it avoids the use of auxins in the culture medium which are used before freezing and after freezing during the resumption of growth. A further advantage of the method is that it produces a quickly available low storage temperature (-15/40°C) (for example in a normal freezer) without the need for expensive equipment.

En annen fordel med oppfinnelsen er at den frembringer en lagringsfremgangsmåte som kan bli utført raskt og enkelt. Another advantage of the invention is that it provides a storage method which can be carried out quickly and easily.

En annen fordel er at den sørger for etterfølgende lyofili-sering av embryoene. Another advantage is that it provides for subsequent lyophilisation of the embryos.

Lagringsfremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gjør det mulig å oppnå embryoer som viser normal vekstgjenopptagelse uten noe behov for vekstf remmere og som ikke har noe ytterligere proliferering, og resulterer i forbedret kvalitet av frøene som blir fremstilt fordi sekundær embryogenese er skadelig for industriell fordeling av produktet da uønskede multi-spirefrø kan bli oppnådd. The storage method according to the invention makes it possible to obtain embryos which show normal growth resumption without any need for growth promoters and which have no further proliferation, and results in improved quality of the seeds produced because secondary embryogenesis is harmful to industrial distribution of the product as unwanted multi -germinating seeds can be obtained.

Embryoene som blir anvendt i foreliggende oppfinnelse kan være av en hvilken som helst art og forskjellig opprinnelse. For eksempel kan embryoene være gulrotembryoer. The embryos used in the present invention can be of any species and of different origin. For example, the embryos may be carrot embryos.

Embryoene kan være somatiske embryoer eller zygotiske embryoer. The embryos can be somatic embryos or zygotic embryos.

De somatiske embryoene kan bli oppnådd fra udifferensierte cellesuspensjoner. I dette tilfellet kan frø fra en hybrid foreldregenerasjon f.eks. være aseptisk spiret. Hypokotylene kan bli kuttet og deretter plassert på et dyrkningsmedium som inneholder auxiner. Kallus oppnådd kan deretter bli dissosi-ert i et væskedyrkingsmedium. Dette gir en udifferensiert cellesuspensjon der cellene, etter flere underkulturer, blir overført til et dyrkningsmedium. Etter ca. 10 dager kan cellesuspensjonen bli filtrert slik at bare celleaggregater av nødvendig størrelse blir bevart. Disse aggregatene kan bli dyrket i noen få dager på et auxin-fritt dyrkningsmedium for å indusere dannelse av embryoene. The somatic embryos can be obtained from undifferentiated cell suspensions. In this case, seeds from a hybrid parent generation can e.g. be aseptically germinated. The hypocotyls can be cut and then placed on a culture medium containing auxins. Callus obtained can then be dissociated in a liquid culture medium. This gives an undifferentiated cell suspension in which the cells, after several subcultures, are transferred to a culture medium. After approx. After 10 days, the cell suspension can be filtered so that only cell aggregates of the required size are preserved. These aggregates can be cultured for a few days on an auxin-free culture medium to induce formation of the embryos.

De zygotiske embryoene kan bli oppnådd ved prøvetaking ved disseksjon av frøene ved modent eller svakt umodent trinn. The zygotic embryos can be obtained by sampling by dissection of the seeds at the mature or slightly immature stage.

De oppnådde somatiske og zygotiske embryoene kan bli klassi-fisert i henhold til deres utviklingstrinn. Foretrukkede embryoer er i begynnertrinnet i deres utvikling når de er mellom 150 og 600 pm i størrelse fordi de er mest stabile for frysing ved dette trinnet. Disse størrelsene tilsvarer hjerte- (150-300 um) eller torpedo- (300-600 um) trinnene i utvikling av somatiske embryoer. The obtained somatic and zygotic embryos can be classified according to their stage of development. Preferred embryos are in the early stage of their development when they are between 150 and 600 µm in size because they are most stable to freezing at this stage. These sizes correspond to the heart (150-300 µm) or torpedo (300-600 µm) stages of somatic embryo development.

Embryoene som er oppnådd blir deretter forhåndsbehandlet på et dyrkningsmedium kalt forhåndsbehandlingsmediet. Dette mediet kan være et typisk medium innenfor feltet med embryokultur, slik som f.eks. et Murashige- og Skoog-medium, som et osmotisk trykkmiddel blir tilsatt og som visse organiske substanser, slik som vitamin Bl, nikotinsyre eller adenin, også kan bli tilsatt. The embryos obtained are then pre-treated on a culture medium called the pre-treatment medium. This medium can be a typical medium within the field of embryo culture, such as e.g. a Murashige and Skoog medium, to which an osmotic pressure agent is added and to which certain organic substances, such as vitamin B1, nicotinic acid or adenine, may also be added.

Det er nødvendig i lav-temperaturlagringsprosesser å forhindre dannelse av intracellulær is som til og med, hvis det ikke direkte skader embryoene under frysing, kan indusere ødeleggende rekrystallisering under avising. I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir embryoene delvis dehydrert ved forhåndsbehandling på -et medium som inneholder et osmotisk trykkmiddel for å redusere en hver skade som de kan påføres. It is necessary in low-temperature storage processes to prevent the formation of intracellular ice which even, if it does not directly damage the embryos during freezing, can induce destructive recrystallization during thawing. In the method according to the invention, the embryos are partially dehydrated by pre-treatment on a medium containing an osmotic pressure agent in order to reduce any damage that may be inflicted on them.

Dette midlet kan bli utvalgt av en ekspert fra substanser som har evne til å trenge inn i vevet og å frembringe et godt osmotisk trykk for å oppnå korrekt dehydrering av cellene uten påvirkning av membranpermeabilitet. I tillegg må dette midlet ikke på noen måte være toksisk til embryoene. Dette midlet kan være sukker, slik som sukrose eller trealose, eller en hvilken som helst annen kjent substans som har evne til å utføre de samme funksjonene. This agent can be selected by an expert from substances that have the ability to penetrate the tissue and to produce a good osmotic pressure to achieve correct dehydration of the cells without affecting membrane permeability. In addition, this agent must not be toxic to the embryos in any way. This agent can be sugar, such as sucrose or trehalose, or any other known substance capable of performing the same functions.

Konsentrasjonen av det osmotiske trykkmidlet i forhåndsbehandlingsmediet bør ikke være for lav for å forsikre korrekt dehydrering av cellen. Heller ikke bør den være for høy slik at den skader embryoene eller hindrer gjenopptagelse av deres vekst etter avising. The concentration of the osmotic pressure agent in the pretreatment medium should not be too low to ensure proper dehydration of the cell. Nor should it be too high so as to damage the embryos or prevent resumption of their growth after freezing.

I en foretrukket utførelsesform av lagringsfremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, inneholder forhåndsbehandlingsmediet sukrose i en konsentrasjon fra 75 til 190 gl-<1> og fortrinnsvis i en konsentrasjon fra 100 til 150 gl-<1>. In a preferred embodiment of the storage method according to the invention, the pretreatment medium contains sucrose in a concentration of from 75 to 190 gl-<1> and preferably in a concentration of from 100 to 150 gl-<1>.

Det har vært funnet at denne forhåndsbehandlingen alene, etterfulgt av et frysingstrinn til den angitte temperaturen, muliggjør at det ønskede målet blir oppnådd på en enkel, effektiv og pålitelig måte. It has been found that this pre-treatment alone, followed by a freezing step to the specified temperature, enables the desired objective to be achieved in a simple, efficient and reliable manner.

Forhåndsbehandl ingen kan vare i 30 sekunder til 36 timer. Forhåndsbehandlingen bør ikke være for kort for å tillate at det osmotiske trykkmidlet delvis dehydrerer cellene og for å øke deres stabilitet til frysing. Heller ikke bør forhåndsbehandlingen vare for lenge, fordi ellers minker stabiliteten til embryoene til frysing, og dette gjenspeiles i en reduksjon i antallet embryoer som fremdeles er i live etter avising når forhåndsbehandlingen overskrider 36 timer. I tilfelle med forlenget forhåndsbehandling, kan embryoet muligens undergå morfologiske endringer som kan redusere dens stabilitet til frysing på grunn av det faktum at embryoet fortsetter å gro og oppnår et trinn som er mindre forlikelig med frysing. På den annen side kan reduksjonen i beskyttel-seseffekten til det osmotiske trykkmidlet under lang forhåndsbehandling også bli forklart ved tilpassing av embryoet til forhåndsbehandlingsmediet som vil resultere i en reduksjon i effekten av det osmotiske trykket. Pre-treat none can last 30 seconds to 36 hours. The pretreatment should not be too short to allow the osmotic pressure agent to partially dehydrate the cells and to increase their stability to freezing. Nor should the pre-treatment last too long, because otherwise the stability of the embryos to freezing decreases, and this is reflected in a reduction in the number of embryos still alive after freezing when the pre-treatment exceeds 36 hours. In the case of prolonged pretreatment, the embryo may possibly undergo morphological changes that may reduce its stability to freezing due to the fact that the embryo continues to grow and reaches a stage less amenable to freezing. On the other hand, the reduction in the protective effect of the osmotic pressure agent during long pre-treatment can also be explained by adaptation of the embryo to the pre-treatment medium which will result in a reduction in the effect of the osmotic pressure.

Forhåndsbehandlingen blir fortrinnsvis utført ved omgivelsestemperatur, dvs. tilnærmet 18 til 24 "C under middels belysning, f.eks. 150 til 250 lux. The pretreatment is preferably carried out at ambient temperature, i.e. approximately 18 to 24 "C under medium illumination, eg 150 to 250 lux.

De forhåndsbehandlede embryoene blir avkjølt og deretter frosset til en temperatur fra -15°C til -40°C. De blir fortrinnsvis frosset til en temperatur på tilnærmet -20°C. Frysingsprosessen kan bli utført ved å overføre embryoene med forhåndsbehandlingsmediet til kryorør og plassere kryorørene f.eks. i en vanlig fryser. Avkjølingshastigheten som blir påsatt under frysingen, influerer hastigheten som isen dannes og graden av dehydrering av embryoene i det øyeblikket isen dannes. Kjølingshastigheten er fortrinnsvis moderat i størrelsesorden 0,1 til 1°C pr. minutt, for temperatur i området fra -6°C til -40°C for å fremme etterfølgende gjenopptagelse av veksten i embryoene. Til avkjøling fra omgivelsestemperatur til en temperatur på -6°C, kan avkjøl-ingshastigheten være raskere, f.eks. mellom 1 og 5°C pr. minutt. The pre-treated embryos are cooled and then frozen to a temperature of -15°C to -40°C. They are preferably frozen to a temperature of approximately -20°C. The freezing process can be carried out by transferring the embryos with the pretreatment medium to cryotubes and placing the cryotubes e.g. in a normal freezer. The rate of cooling applied during freezing influences the rate at which ice forms and the degree of dehydration of the embryos at the time of ice formation. The cooling rate is preferably moderate in the order of 0.1 to 1°C per minute, for temperature in the range from -6°C to -40°C to promote subsequent resumption of growth in the embryos. For cooling from ambient temperature to a temperature of -6°C, the cooling rate can be faster, e.g. between 1 and 5°C per minute.

Embryoene frosset ved en temperatur i området fra -15 °C til-40° C kan bli lagret slik i minst 1 måned. Til lengre lagringstider blir embryoene fortrinnsvis lagret ved en lavere temperatur, f.eks. i en flytende avkjølingsvæske. Dette er fordi det synes som om forlenget lagring ved -15/- 40°C er uforlikelig med gjenopptagelse av vekst og således levedyktigheten til embryoene etter avising. Det synes at temperaturen på -15/-40°C er for høy til å forsikre fullstendig stopp av metabolismen til embryoet. Hvis forlenget lagring er nødvendig, kan frysing til -15/-40°C bli vurdert som det første trinnet som kan bli etterfulgt av frysing i en flytende avkjølingsvæske ved en lavere temperatur. The embryos frozen at a temperature in the range from -15°C to -40°C can be stored like this for at least 1 month. For longer storage times, the embryos are preferably stored at a lower temperature, e.g. in a liquid coolant. This is because it seems that prolonged storage at -15/- 40°C is incompatible with the resumption of growth and thus the viability of the embryos after freezing. It seems that the temperature of -15/-40°C is too high to ensure complete cessation of the metabolism of the embryo. If prolonged storage is required, freezing to -15/-40°C can be considered as the first step which can be followed by freezing in a liquid coolant at a lower temperature.

I dette tilfellet blir embryoene fortrinnsvis bevart ved —15/—40° C i en viss periode i størrelsesorden 18 til 24 timer, slik at frysingen er fullstendig. In this case, the embryos are preferably preserved at -15/-40° C for a certain period of the order of 18 to 24 hours, so that the freezing is complete.

Embryoene kan deretter bli direkte nedsunket i en flytende avkjølingsvæske, f.eks. i et metanolbad ved -70°C eller i et bad med flytende nitrogen ved -196°C, eller avkjølt til en meget lav temperatur i en hvilken som helst annen innretning. The embryos can then be directly immersed in a liquid cooling liquid, e.g. in a methanol bath at -70°C or in a liquid nitrogen bath at -196°C, or cooled to a very low temperature in any other device.

De frosne embryoene kan deretter bli lagret i lange perioder, opp til flere år. De frosne embryoene kan deretter bli innkapslet med kunstige eller naturlige polymerer, f.eks. av alginattypen, for å oppnå kunstig frø. The frozen embryos can then be stored for long periods, up to several years. The frozen embryos can then be encapsulated with artificial or natural polymers, e.g. of the alginate type, to obtain artificial seed.

Embryoene kan bli aviset, f.eks. ved å senke kryorørene i et vannbad ved 40° C i 2 minutter. Rørene kan bli tatt opp fra vannbadet før isen smelter fullstendig for å unngå for rask heving av temperaturen. Etter fullstendig avising, kan embryoene bli frigjort fra forhåndsbehandlingsmediet ved enkel vasking, de vaskede embryoene kan bli plassert i et dyrkingsmedium som er typisk innenfor embryodyrkingsfeltet, slik som f.eks. et Murashige og Skoog medium. The embryos can be frozen, e.g. by immersing the cryotubes in a water bath at 40° C for 2 minutes. The tubes can be removed from the water bath before the ice melts completely to avoid too rapid a rise in temperature. After complete thawing, the embryos can be freed from the pretreatment medium by simple washing, the washed embryos can be placed in a culture medium typical of the field of embryo culture, such as e.g. a Murashige and Skoog medium.

Dette mediet kan inneholde et assimiliserbart karbon-inneholdende substrat, f.eks. slik som sukrose i en konsentrasjon fra 1 til 10 gl-<1>. This medium may contain an assimilable carbon-containing substrate, e.g. such as sucrose in a concentration of from 1 to 10 gl-<1>.

Dette dyrkingsmediet er bemerkelsesverdig ved det faktum at det er fritt for auxiner. This culture medium is remarkable for the fact that it is free of auxins.

Etter denne gjendyrking, gjenopptar embryoene en utvikling som kan sammenlignes med den til ikke-frosne embryoer. After this reculture, the embryos resume a development comparable to that of non-frozen embryos.

Overlevelse etter frysing og gjendyrking blir reflektert i bipolar vekst av embryoene. Embryoet bevarer effektivt integriteten i sin struktur under etterfølgende utvikling uten noen annen form for morfogenese, slik som kallogenese eller ytterligere embryogenese. Survival after freezing and reculture is reflected in bipolar growth of the embryos. The embryo effectively preserves the integrity of its structure during subsequent development without any other form of morphogenesis, such as callogenesis or further embryogenesis.

Således frembringer lagringsprosessen ifølge oppfinnelsen, på den ene siden overlevelse av embryoene med deres morfologiske integritet intakt, og på den annen side muliggjør at embryoene effektivt opprettholder deres kapasitet til å regenerere en kimplante. Thus, the storage process according to the invention produces, on the one hand, survival of the embryos with their morphological integrity intact, and on the other hand enables the embryos to effectively maintain their capacity to regenerate a seedling.

Foreliggende oppfinnelse blir illustrert i mer detalj ved de følgende eksemplene. Disse eksemplene blir forutgått av et eksempel på konvensjonell fremstilling av somatiske embryoer, der beskrivelse av levedyktighetstesten og der tabell 1 gir sammensetning av en foretrukket forhåndsbehandling og dyrkingsmedium. The present invention is illustrated in more detail by the following examples. These examples are preceded by an example of conventional preparation of somatic embryos, where the viability test is described and where table 1 gives the composition of a preferred pre-treatment and culture medium.

Eksempel på fremstilling av somatiske embryoer Example of production of somatic embryos

En udifferensisert cellesuspensjon av gulrotceller (Daucus carota L. ) blir subdyrket hver 12 dag (1 g biomasse til 100 ml medium) på et Murashige- og Skoog-vaeskedyrkingsmedium som har sammensetningen vist i tabell 1, og til dette har 20 g 1~<1> sukrose og 0,1 mg 1_<1> 2,4-diklorgenoksyeddiksyre blitt tilsatt. All behandling blir utført under aseptiske forhold under en laminar strømningsbeskyttelse. Suspensjonen blir plassert på en omrører som lager en eksentrisk gyratorisk bevegelse på 100 rpm og blir dyrket ved 24° C under 200 lux belysning med en lysperiode på 16 timer. An undifferentiated cell suspension of carrot cells (Daucus carota L.) is subcultured every 12 days (1 g of biomass to 100 ml of medium) on a Murashige and Skoog liquid culture medium whose composition is shown in table 1, and for this 20 g of 1~< 1> sucrose and 0.1 mg of 1_<1> 2,4-dichlorogenoxyacetic acid have been added. All treatment is performed under aseptic conditions under a laminar flow protection. The suspension is placed on a stirrer that creates an eccentric gyratory movement of 100 rpm and is grown at 24° C under 200 lux illumination with a light period of 16 hours.

Etter dyrking i 8 til 10 dager blir cellesuspensjonen filtrert slik at bare celleaggregater mellom 50 og 180 pm i størrelse blir beholdt. Disse små aggregatene representerer et proembryonisk trinn til embryoet som vil fortsette sin utvikling til hjerte-, torpedo- og kimplantetrinnene. Aggregatene blir vasket og plassert på et Murashige- og Skoog-medium som ikke inneholder noe 2,4-diklorfenoksyeddiksyre i en mengde som tilsvarer 1,5 x 10<3> aggregater pr. ml medium. After cultivation for 8 to 10 days, the cell suspension is filtered so that only cell aggregates between 50 and 180 µm in size are retained. These small aggregates represent a proembryonic stage of the embryo which will continue its development to the heart, torpedo and seedling stages. The aggregates are washed and placed on a Murashige and Skoog medium which does not contain any 2,4-dichlorophenoxyacetic acid in an amount corresponding to 1.5 x 10<3> aggregates per ml medium.

Etter dyrking i 10 dager har embryoene blitt dannet. Suspensjonen blir filtrert slik at bare embryoer mellom 150 og 600 um i størrelse blir beholdt. After cultivation for 10 days, the embryos have formed. The suspension is filtered so that only embryos between 150 and 600 µm in size are retained.

Test på levedyktighet Test for viability

En rask og enkel levedyktighetstest har blitt utviklet for å evaluere levedyktighetshastigheten til embryoene etter frysing. A rapid and simple viability test has been developed to evaluate the viability rate of the embryos after freezing.

Blant de forskjellige kriteriene som kan bli anvendt for å evaluere levedyktighetshastigheten til embryoene, er økning i størrelse på embryoene, og Among the different criteria that can be used to evaluate the viability rate of the embryos are increase in size of the embryos, and

fremkomst av klorofyllfarging er særlig hensiktsmessig. emergence of chlorophyll staining is particularly appropriate.

Disse kriteriene har blitt vurdert på forskjellige måter, f.eks. ved visuell telling eller ved biokjemiske tester (f.eks. fargingstester). These criteria have been assessed in different ways, e.g. by visual count or by biochemical tests (e.g. staining tests).

Ifølge denne testen blir avisede embryoer plassert på et flytende dyrkingsmedium. Etter dyrking i 10 dager registreres antallet embryoer som har øket i størrelse og som viser tegn på klorofyllfarging. Forholdet mellom dette antallet og det samlede antall med embryoer som er tilstede muliggjør at levedyktighetshastigheten til embryoene kan bli bestemt. According to this test, thawed embryos are placed on a liquid culture medium. After cultivation for 10 days, the number of embryos that have increased in size and show signs of chlorophyll staining is recorded. The ratio of this number to the total number of embryos present allows the viability rate of the embryos to be determined.

Embryoene kan deretter bli plassert på et faststoff-dyrkingsmedium som har samme sammensetning som foregående flytende medium slik at de kan fortsette utvklingen til kimplante-stadiet. The embryos can then be placed on a solid culture medium that has the same composition as the preceding liquid medium so that they can continue their development to the seedling stage.

Etter dyrking i 10 dager på dette faste mediet, blir regenereringshastigheten bestemt som forholdet mellom antallet embryoer som har blitt utviklet til kimplantetrinnet og samlet antall embryoer. After cultivation for 10 days on this solid medium, the regeneration rate is determined as the ratio of the number of embryos that have developed to the seedling stage to the total number of embryos.

Eksempel 1 Example 1

Somatiske gulrotembryoer på torpedotrinnet, gjennomsnittlig størrelse 550 pm, oppnådd som beskrevet over, blir plassert i petri-skåler på et flytende Murashige- og Skoog-forbehand-lingsmedium som inneholder 135 gl-<*> sukrose og som er fri for auxiner i en mengde på tilnærmet 100 embryoer til 10 ml medium. Somatic carrot embryos at the torpedo stage, average size 550 µm, obtained as described above, are placed in petri dishes on a liquid Murashige and Skoog pretreatment medium containing 135 g<*> sucrose and which is free of auxins in an amount of approximately 100 embryos to 10 ml of medium.

Disse embryoene blir f orhåndsbehandlet i 1 time ved 20° C under 200 lux belysning. De blir deretter overført til kryorør som inneholder 1,8 ml forhåndsbehandlingsmedium. Kryorørene blir plassert i en vanlig fryser der innholdene blir avkjølt ved en hastighet på 1° C/minutt til -6°C og deretter ved en hastighet på 0,4°C/minutt fra -6°C til -20°C. These embryos are pre-treated for 1 hour at 20° C under 200 lux lighting. They are then transferred to cryotubes containing 1.8 ml of pretreatment medium. The cryotubes are placed in a normal freezer where the contents are cooled at a rate of 1° C/minute to -6°C and then at a rate of 0.4°C/minute from -6°C to -20°C.

Etter 24 timer ved -20° C blir kryorørene separert i to grupper. Den første gruppen blir aviset ved nedsenking av de frosne kryorørene i vannbad ved 40°C i 2 minutter. Den andre gruppen blir nedsenket i flytende nitrogen ved -196°C der de forblir i 1 time før de blir aviset på samme måte som den første gruppen. After 24 hours at -20° C, the cryotubes are separated into two groups. The first group is defrosted by immersing the frozen cryotubes in a water bath at 40°C for 2 minutes. The second group is immersed in liquid nitrogen at -196°C where they remain for 1 hour before being defrosted in the same way as the first group.

Etter total avising blir embryoene vasket for å fjerne forhåndsbehandl ingmediet og plassert i 10 dager på et flytende Murashige- og Skoog-dyrkingsmedium som inneholder 5 gl~<l> sukrose og som er fri for auxiner. De blir deretter overført til fastdyrkingsmediet som har lik sammensetning. Kontrollembryoer som ikke har blitt forhåndsbehandlet eller frosset blir plassert på det samme dyrkingsmediet. After total thawing, the embryos are washed to remove the pre-treatment medium and placed for 10 days on a liquid Murashige and Skoog culture medium containing 5 µl sucrose and free of auxins. They are then transferred to the solid culture medium, which has a similar composition. Control embryos that have not been pretreated or frozen are placed on the same culture medium.

Etter dyrking i 10 dager på fast medium, blir embryoenes kapasitet til å regenerere gulrotkimplanter sammenlignet. After cultivation for 10 days on solid medium, the capacity of the embryos to regenerate carrot seedlings is compared.

Blant kontrollembryoene har 46$ evne til å regenerere en kimplante. For embryoer frosset til -20°C og til -196°C er regenereringshastighetene henholdsvis 44$ og 43$. Among the control embryos, 46$ have the ability to regenerate a seedling. For embryos frozen to -20°C and to -196°C, the regeneration rates are 44$ and 43$, respectively.

Embryoenes kapasitet til å regenerere kimplanter er således ikke påvirket ved frysing forutsatt at de har blitt forhåndsbehandlet. The embryos' capacity to regenerate seedlings is thus not affected by freezing, provided they have been pre-treated.

Eksempel 2 Example 2

To populasjoner av somatiske Daucus carota L. gulrotembryoer blir utvalgt. Two populations of somatic Daucus carota L. carrot embryos are selected.

En populasjon består av embryoer på hjertetrinnet med en gjennomsnittlig størrelse på 300 um, den andre populasjonen består av embryoer på torpedotrinnet med en gjennomsnittlig størrelse på 500 pm. One population consists of heart stage embryos with an average size of 300 µm, the other population consists of torpedo stage embryos with an average size of 500 µm.

Fem prøver (A, B, C, D og kontroll) som hver inneholder tilnærmet 100 embryoer blir tatt fra hver populasjon med embryoer. Five samples (A, B, C, D and control) each containing approximately 100 embryos are taken from each population of embryos.

Prøvene A^, B^ og C^ av embryoene på hjertetrinnet og prøvene At, B-(- og C-t av embryoene på torpedotrinnet, blir forhåndsbehandlet på et Murashige- og Skoog-dyrkingsmedium som inneholder 135 gl-<1> sukrose i 1 time ved 20° C under 200 lux belysning. Samples A^, B^ and C^ of the heart stage embryos and samples At, B-(- and C-t of the torpedo stage embryos are pre-treated on a Murashige and Skoog culture medium containing 135 ml- <1> sucrose for 1 hour at 20° C under 200 lux lighting.

Prøvene A^, Bjj, At og Bt blir deretter avkjølt til -20°C ved en hastighet på tilnærmet 0,5°C/minutt. De blir deretter bevart ved -20° C i 24 timer. Prøvene A^ og A-^ blir aviset, mens prøvene B^ og B^ blir senket i flytende nitrogen ved The samples A^, Bjj, At and Bt are then cooled to -20°C at a rate of approximately 0.5°C/minute. They are then preserved at -20° C for 24 hours. The samples A^ and A-^ are de-iced, while the samples B^ and B^ are immersed in liquid nitrogen at

—196°C der de forblir i 1 time før de blir aviset. -196°C where they remain for 1 hour before being defrosted.

Til sammenligning blir prøvene C^ og C^ direkte nedsunket i flytende nitrogen ved —196°C etter forhåndsbehandlingen. De blir aviset etter 1 time. Til sammenligning blir prøvene D^ og D-t avkjølt til -20° C ved en hastighet på tilnærmet 0,5° C/minutt uten at de har vært f orhåndsbehandlet. De blir aviset etter 24 timer. For comparison, samples C^ and C^ are directly immersed in liquid nitrogen at -196°C after the pre-treatment. They are de-iced after 1 hour. For comparison, the samples D^ and D-t are cooled to -20° C at a rate of approximately 0.5° C/minute without having been previously treated. They will be notified after 24 hours.

Hjerte- og torpedokontrollprøvene blir verken forhåndsbehandlet eller frosset. The heart and torpedo control samples are neither pre-treated nor frozen.

De forskjellige embryoprøvene blir deretter dyrket på nytt på et Murashige- og Skoog-væskemedium som inneholder 5 gl-<1 >sukrose. The different embryo samples are then re-cultured on a Murashige and Skoog liquid medium containing 5 gL sucrose.

Etter dyrking i 10 dager ble følgende resultater oppnådd: After cultivation for 10 days, the following results were obtained:

Levedyktighet av embryoer ($) Viability of embryos ($)

Man kan se at i fravær av forbehandling overlever ikke embryoene som er frosset til —20°C (D), men impregnering i 1 time i forhåndsbeahndlingsmediet forsikrer overleving av nesten alle embryoene på hjerte- og torpedotrinnet frosset til -20°C (A). It can be seen that in the absence of pretreatment the embryos frozen to -20°C do not survive (D), but impregnation for 1 hour in the pretreatment medium ensures the survival of almost all the embryos at the heart and torpedo stage frozen to -20°C (A) .

På samme måte overlever embryoer ikke direkte nedsenking i flytende nitrogen, til og etter forhåndsbehandling i 1 time Similarly, embryos do not survive direct immersion in liquid nitrogen, up to and including pretreatment for 1 hour

(C). (C).

Embryoene frosset til —196°C etter forhåndsbehandling og nedfrysing til -20°C (B) har en meget tilfredsstillende levedyktighet. The embryos frozen to -196°C after pretreatment and freezing to -20°C (B) have a very satisfactory viability.

Hvis det er ønskelig å lagre embryoene ved —196°C, må de bli utsatt for fasene med forhåndsbehandling og frysing til -20°C. If it is desired to store the embryos at -196°C, they must be subjected to the phases of pretreatment and freezing to -20°C.

Embryoene blir deretter plassert på et fast dyrkingsmedium med lik sammensetning som det flytende mediet. The embryos are then placed on a solid culture medium with the same composition as the liquid medium.

Etter dyrking i 10 dager har hovedmengden av embryoene fra prøvene A og B og også kontrollprøvene, utviklet seg til kimplantetrinnet med et klart differensiert rotpunkt og klorofyllkimbladapeks. After cultivation for 10 days, the bulk of the embryos from samples A and B and also the control samples have developed to the seedling stage with a clearly differentiated root point and chlorophyll cotyledon apex.

Disse embryoene viser ikke noe tegn til kallogenese eller sekundær embryogenese. These embryos show no sign of callogenesis or secondary embryogenesis.

Eksempel 3 Example 3

Somatisk gulrotembryoer på hjertetrinnet og på torpedotrinnet blir forhåndsbehandlet på et Murashige- og Skoog-væskedyrkingsmedium som inneholder 135 gl~^ sukrosé i forskjellige perioder ved 20°C under 200 lux belysning. Somatic carrot embryos at the heart stage and at the torpedo stage are pretreated on a Murashige and Skoog liquid culture medium containing 135 µg sucrose for various periods at 20°C under 200 lux illumination.

Disse embryoene blir deretter avkjølt til —20°C ved en hastighet på tilnærmet 0,5°C/minutt. Etter 24 timer ved —20°C blir noen av embryoene senket i flytende nitrogen og bevart der i 1 time. These embryos are then cooled to -20°C at a rate of approximately 0.5°C/minute. After 24 hours at -20°C, some of the embryos are immersed in liquid nitrogen and preserved there for 1 hour.

Etter avising blir embryoene plassert på et Murashige- og Skoog-væskedyrkingsmedium som inneholder 5 gl"-'- sukrose. After thawing, the embryos are placed on a Murashige and Skoog liquid culture medium containing 5 µl sucrose.

Kontrollembryoer som ikke har blitt forhåndsbehandlet eller frosset blir også dyrket. Levedyktighetsverdien til embryoene blir bestemt etter dyrking i 10 dager. Control embryos that have not been pretreated or frozen are also cultured. The viability value of the embryos is determined after cultivation for 10 days.

De følgende resultatene ble oppnådd: The following results were achieved:

Levedyktighetsverdier til embryoer på hjertetrinnet ($) Viability values of embryos at the heart stage ($)

Kontrollembryoene har en levedyktighetsverdi på 91$. The control embryos have a viability value of 91$.

Man kan se at levedyktighetsverdien etter dyrking i 10 dager faktisk er identisk med en forhåndsbehandlingstid på 30 min, 1 time eller 24 timer, både for embryoer på hjertetrinnet og for embryoer på torpedotrinnet. It can be seen that the viability value after culture for 10 days is actually identical with a pre-treatment time of 30 min, 1 hour or 24 hours, both for heart stage embryos and for torpedo stage embryos.

I motsetning, over 24 timer, avtar levedyktighetsverdien progressivt med økende forbehandlingstid. Denne verdien er ikke mer enn ca. 35$ etter f orhåndsbehandlingstid på 72 timer. In contrast, over 24 h, the viability value decreases progressively with increasing pretreatment time. This value is no more than approx. 35$ after a preliminary processing time of 72 hours.

Eksempel 4 Example 4

Somatiske gulrotembryoer på torpedotrinnet blir forhåndsbehandlet på forskjellige tidspunkter på et Murashige- og Skoog-væskemedium som inneholder 135 gl-<1> sukrose ved 20°C under 200 lux belysning. Somatic carrot embryos at the torpedo stage are pretreated at various time points on a Murashige and Skoog liquid medium containing 135 gL sucrose at 20°C under 200 lux illumination.

Disse embryoene blir avkjølt og frosset til —20°C ved en hastighet på tilnærmet 0,5°C/minutt. These embryos are cooled and frozen to -20°C at a rate of approximately 0.5°C/minute.

Etter 72 timer ved —20°C blir embryoene aviset og plassert på et Murashige- og Skoog-væskedyrkingsmedium som inneholder 5 gl-<1> sukrose. After 72 hours at -20°C, the embryos are thawed and placed on a Murashige and Skoog liquid culture medium containing 5 µl sucrose.

Kontrollembryoer som ikke har blitt forhåndsbehandlet eller frosset blir også dyrket. Control embryos that have not been pretreated or frozen are also cultured.

Levedyktighetsverdien til embryoene blir bestemt etter dyrking i 10 dager. The viability value of the embryos is determined after cultivation for 10 days.

Følgende resultater ble oppnådd: The following results were obtained:

Man kan se at levedyktighetsverdien til embryoer etter frysing til —20°C er god for alle disse forhåndsbehandlings-tidene. Embryoenes stabilitet til frysing blir således ervervet meget raskt. It can be seen that the viability value of embryos after freezing to -20°C is good for all these pre-treatment times. The stability of the embryos for freezing is thus acquired very quickly.

Eksempel 5 Example 5

Somatiske gulrotembryoer på torpedotrinnet med en gjennomsnittlig størrelse på 550 pm blir forhåndsbehandlet og frosset til —20°C. Noen av embryoene blir deretter nedsunket i flytende nitrogen ved fremgangsmåten beskrevet i eksempel 1. Torpedo stage somatic carrot embryos with an average size of 550 µm are pretreated and frozen at -20°C. Some of the embryos are then immersed in liquid nitrogen by the method described in example 1.

Embryoene blir lagret ved disse temperaturene i forskjellige tidsrom. De blir deretter aviset og plassert på et Murashige-og Skoog-væskekulturmedium som inneholder 5 gl-<1> sukrose. Levedyktighetsverdien til embryoene blir bestemt som en funksjon av deres lagringstid ved —20°C eller —196°C. Kontrollembryoene som ikke har blitt forhåndsbehandlet eller frosset har en levedyktighetsverdi på 72$. The embryos are stored at these temperatures for different periods of time. They are then defrosted and placed on a Murashige and Skoog liquid culture medium containing 5 gl <1> sucrose. The viability value of the embryos is determined as a function of their storage time at -20°C or -196°C. The control embryos that have not been pretreated or frozen have a viability value of $72.

Følgende resultater ble oppnådd: The following results were obtained:

For embryoer frosset til -20°C: For embryos frozen at -20°C:

Gjennomsnittlig levedyktighetsverdi etter frysing til -20°C eller til —196°C er tilnærmet 67$ for lagringstider på 1 dag eller mindre. Denne verdien forblir uendret etter lagring i 1 måned ved —20°C eller ved —196°C. Etter lagring i 2 måneder er det ingen overlevende blant embryoene lagret ved —20°C, mens for embryoene lagret ved —196°C er levedyktighetsverdien fremdeles den samme. The average viability value after freezing to -20°C or to -196°C is approximately 67$ for storage times of 1 day or less. This value remains unchanged after storage for 1 month at -20°C or at -196°C. After storage for 2 months, there are no survivors among the embryos stored at -20°C, while for the embryos stored at -196°C the viability value is still the same.

Eksempel 6 Example 6

Somatiske gulrotembryoer på torpedotrinnet med en gjennomsnittlig størrelse på 500 pm blir forhåndsbehandlet i 1 time ved 20°C under 200 lux belysning på et Murashige- og Skoog-væskemedium som har en sukrosekonsentrasjon som varierer fra 35 gl"<1> til 205 gl-<1.>Somatic carrot embryos at the torpedo stage with an average size of 500 pm are pretreated for 1 hour at 20°C under 200 lux illumination on a Murashige and Skoog liquid medium having a sucrose concentration ranging from 35 gL"<1> to 205 gL-< 1.>

Embryoene blir deretter avkjølt og frosset til —20°C. Etter 1 time ved — 20° C blir embryoene aviset og plassert på et Murashige- og Skoog-væskedyrkingsmedium som inneholder 5 gl-<1 >sukrose. The embryos are then cooled and frozen at -20°C. After 1 hour at -20°C, the embryos are thawed and placed on a Murashige and Skoog liquid culture medium containing 5 gL sucrose.

Levedyktighetsverdien til embryoene blir bestemt etter dyrking i 10 dager som en funksjon av sukrosekonsentrasjonen i forhåndsbehandlingsmediet. The viability value of the embryos is determined after cultivation for 10 days as a function of the sucrose concentration in the pretreatment medium.

Følgende resultater ble oppnådd: The following results were obtained:

Levedyktighetsverdien til embryoene forhåndsbehandlet på et medium som inneholder 135 gl-<1> sukrose kan sammenlignes med den til kontrollembryoer. The viability value of the embryos pretreated on a medium containing 135 gL-<1> sucrose is comparable to that of control embryos.

Denne verdien er fremdeles meget høy for en sukrosekonsentrasjon på 100 eller 170 gl-<1>. This value is still very high for a sucrose concentration of 100 or 170 gl-<1>.

Levedyktigheten til embryoene blir påvirket når sukrosekonsentrasjonen blir for høy (205 gl-<1>) eller for lav (35 gl-<1>). The viability of the embryos is affected when the sucrose concentration becomes too high (205 gl-<1>) or too low (35 gl-<1>).

Claims

1. Method for storing vegetable embryos, characterized in that the embryos are pre-treated on a culture medium containing an osmotic pressure agent and are, after pre-treatment, cooled and frozen to a temperature in the range from -15°C to -40°C.

2. Method according to claim 1, characterized in that the osmotic pressure agent is sucrose.

3. Method according to claim 2, characterized in that the pretreatment medium contains sucrose in a concentration of 75 to 190 gl-<1>.

4. Method according to claim 1, characterized in that the embryos frozen to -15/-40°C are immersed in a liquid cooling liquid.

5. Method according to claim 1, characterized in that the pre-treatment is carried out for 30 seconds to 36 hours.

6. Method according to claim 1, characterized in that the cooling rate between -6°C and -40°C is between 0.1 and 1°C/minute.

7. Method according to claim 1, characterized in that the pretreatment medium is a Murashige and Skoog medium to which an osmotic pressure agent is added.