NO175668B - Fremgangsmåte for fremstilling av parenteralt tilförbare blodprodukter fra blodplasma - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåter ved fremstilling av parenteralt tilføringsbare blodprodukter av blodplasma, som i det vesentlige er frie for immunmodulerende komponenter og som kommer til uttrykk ved at en nedmodulering av Fc-reseptorer i membranen hos leukocytter mangler eller uteblir, hvorved ekspresjonen av reseptorer for Fc-enheten av immunglobulin G i membranen til monocytter etter interaksjon med et blodproduktpreparat ikke senkes eller senkes høyst 30%, hvilket blodprodukt er egnet til behandling av nedarvede eller ervervede koagulasjonsforstyrrelser, til behandling av primær eller sekundær immundefisiens, såvel som til behandling av autoimmun-, immunkompleks- og infeksjonslidelser.

Kjente fremgangsmåter for fremstilling av menneskelige blodprodukter inneholder ved siden av fraksjoneringstiltak for renfremstilling av de ønskede produkter også fremgangsmåter for fjerning av forurensende substanser som kan fremkalle bivirkninger. Eksempler på dette er fremgangsmåter for fjerning av vasoaktive substanser (EP 0 120 835, EP 0 122 909) såvel som inaktivering av i slike preparater eventuelt forekommende virus (EP 0 159 311, US-PS 4.297.344).

Ved disse kjente fremgangsmåter blir imidlertid problemene ved en mulig immunmodulerende bivirkning av produktene ikke tatt i betrakning. Første antydning av en mulig terapimediert immunmodulering ga studier som blir gjennomført på hemofili-pasienter. Disse pasienter viste en forhøyet mottakelighet i forhold til bestemte infeksjoner av bakteriell og viral art (se feks A.C. Beddall et al., J. Clin. Pathol. 1985 38., 1163-1165; Haemophilie, K. Leuchner av "Handbuch der inneren Medizin" side 143, Band 11/9, 1985, Springer Verlag; P.H. Levine et al., Health of the Intensively Treated Hemophiliac, With Special Reference of Abnormal Liver Chemistries and Splenomegaly, 1977, 5_0, 1-9; B.A. McVerry et al., J. Clin. Pathol. 1979 32., 377-381) . Videre peker defekter hos isolerte lymfocytter i perifert blod fra disse pasienter på forstyr-relser i immunsystemet. Som eksempler på dette kan det nevnes forskyvning av forholdet mellom T-hjelper- og T-suppressor-celler (CM. Kessler et al. 1983, Lancet, 991-992; P. Saidi et al., 1983, New Engl. J. Med. 308, 1291-1292, nedsetningen av den "naturlige killer" selvaktivitet (M.M. Lederman et al., N. Engl. J. Med. 1983 308. 79-82) såvel som nedsetning av den antigen-presenterende kapasitet av sirkulerende mononukleære fagocytter (J. W. Mannhalter et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 1986, 38, 390-397).

Foreliggende oppfinnelse løser de angitte problemer ved fremstilling av parenteralt tilførbare blodprodukter som i det vesentlige er fri for immunmodulerende komponenter og som kommer til uttrykk ved at det ikke finner sted en nedmodulering av Fc-reseptorer i membranen hos leukocytter.

Ved dette er det forstått at ekspresjonen av reseptorer for Fc-enheten hos immunoglobulin G i membranen av Fc-reseptor-positive leukocytter, f.eks. monocytter, etter intraksjon med et blodprodukt-preparat, ikke eksisterer eller ikke er signifikant, dvs. er nedsatt med høyst 30%. Ekspresjonen av Fc-reseptorer i membranen hos monocytter blir bestemt ved den egenskapen disse celler har til å knytte seg til erythrocytter belagt med immunoglobulin G. Egenskapen blir uttrykt som prosent rosettdannende celler (% RFZ). Bestemmelsesmetoden for nedmodulering av Fc-reseptorer er kjent og eksempelvis beskrevet i litteraturen av J.W. Mannhalter et al., Clinical Immunology and Immunopathology 1986 38., 390-397; A. Berken et al., J. Exp. Med. 1966 123. 119-144 og C.S. Scott, Clin. Exp. Immunol. 1979 38., 300-305.

Ekspresjonen av reseptorer for Fc-enheten av immunoglobulin G (Fc-reseptorer) i membranen til monocytter er en viktig forutsetning for riktig funksjon av immunforsvaret. Disse reseptorer letter ikke bare fagocytosen av opsoniserte pato-gener (Contemporary Topics in Immunobiology, Vol. 14, Regulation of Leukocyte Function, R. Snyderman, ed., Plenum Press New York og London 1971) , men en interaksjon mellom disse reseptorer og deres ligander utløser også en rekke signaler som er av betydning for det riktige forløp av immunforsvaret (induksjon av fremskaffelse av oksygenradi-kaler (R.B. Johnston et al., J. Exp. Med. 1976 143, 1551-1556; D.N. Rush et al., Cellular Immunology 1984, 87, 252-58 og S.D. Wright, J. Exp. Med. 1983 158, 2016-2023. Aktivering av T-celler (J.A. Griffin et al., J. Exp. Med. 1979 150. 653-675 og F.M. Griffin et al., J. Immunol. 1980 125. 844-849), antigenpresentasjon (J.W. Mannhalter et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 1986 39., 491-503) . En nedmodulering av Fc-reseptorer har således betydelige kliniske konsekvenser og kunne bidra til en økning av infeksjonsmottageligheten hos pasienter behandlet med blodprodukter.

Blodprodukter fremstilt ifølge oppfinnelsen som i det vesentlige er fritt for immunmodulerende komponenter, kan erholdes ved at blodproduktet - underkastes en molsikting, nemlig en gelfiltrering eller - blir behandlet med et molsiktbart bærermateriale til hvilket immunmodulerende komponenter har blitt selektivt adsorbert, eksempelvis sepharose hvor immobiliserte ligander, spesielt proteiner av bakteriell opprinnelse, såsom protein A fra stafylokokker, protein G eller protein M fra streptokokker eller antistoffer som er fremskaffet ved immunisering med immunmodulerende substanser, er bundet, eller blir filtrert over et filter med en porestørrelse som er lik eller mindre enn 10 nm.

Ved gelfiltreringen blir molekylene adskilt i forhold til sin molekylvekt. Gelen består av mikroskopisk små kuler som inneholder porer med en bestemt størrelse. Molekyler som er større enn disse porer kan ikke trenge inn i gelen og blir eluert først. Mindre molekyler som kan trenge inn i gelporene blir derfor holdt tilbake og vandrer således langsommere. På denne måte kan en adskillelse av de enkelte proteiner i en proteinblanding bli oppnådd.

Ved filtreringsfremgangsmåten, somn egner seg spesielt for fremstilling av gammaglobulin-preparater, blir bestanddeler utskilt etter sin størrelse. Ved den her anvendte fremgangsmåte blir spesielle f iltermembraner med meget liten porestør-relse (10 nm eller mindre) anvendt. Bestanddeler som er større enn disse porer blir holdt tilbake av membranen innen-for rammen av filtreringsutføringen. På denne måte kan det fra en proteinblanding bli utskilt store (høymolekulære) bestanddeler.

Blodproduktet fremstilt ifølge oppfinnelsen egner seg for-delaktig til anvendelse ved behandling av nedarvede og ervervede koaguleringsforstyrrelser, til behandling av primær eller sekundær immundefisiens så vel som til behandling av autoimmun-, immunkompleks- og infeksjonssykdommer.

I de følgende eksempler blir blodproduktets egenskaper fremstilt ifølge oppfinnelsen, fremgangsmåten ved fremstilling og bestemmelsen av en eventuelt eksisterende nedmodulering i forhold til blodproduktfri kontrollmedier nærmere omtalt.

Eksempel 1

Det blir fremstilt et faktor Vlll-preparat ifølge den i EP

0 127 603 beskrevne metode. Dette preparat blir underkastet en affinitetskromatografering med immobilisert protein A i følge "batch"-metoden. Deretter blir et frysetørket faktor Vlll-preparat som inneholder 500 IE faktor VIII løst i 20 ml destillert vann som er tilsatt 10 IE konserveringsmiddel fritt heparin (Immuno AG, Wien) og dialysert ved romtemperatur over natten mot 2 1 av en sitrat-buffer (0,024 M natriumsitrat, 0,120 M natriumklorid innstilt til pH 7,2 med HC1 tilsatt 10 IE/ml konserveringsmiddelfritt heparin, i det følgende forkortet og kalt "sitrat pH 7,2"). 8 ml av dialysatet (med ca. 200 IE faktor VIII) ble erholdt og blandet med 2 ml av en protein-A-sepharose-suspensjon (50% suspensjon [vol/vol] i sitrat pH 7,2 hvor protein-A-sepharosen på forhånd var ekvilibrert i sitrat pH 7,2). Deretter ble dette inkubert i 4 timer ved romtemperatur under passende ryst ing. Mot slutten av inkuberingstiden ble protein-A-sepharosen sentrifugert av (5 min, 700 x g, romtemperatur) og supernatanten ble pipettert av og gelen vasket enda tre ganger med 10 mM sitrat pH 7,2. De enkelte supernatanter ble slått sammen, sterilfiltrert, innstilt på 2 IE faktor VIII/ml og oppbevart ved 4°C til undersøkelse.

På den beskrevne måte ble det fremstilte og behandlede faktor Vlll-preparat, som beskrevet i det følgende, undersøkt for sin immunmodulerende aktivitet.

Mononukleære celler fra perifert blod ble isolert ved tett-hetsgradientsentrifugering (J.W. Mannhalter et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 1986 38, 390-397). Ved dette ble 8 ml av en tetthetsgradient (Lymforep, Nyegaard & Co., Oslo, Norge) satt til et oversjikt av 20 til 25 ml heparinisert blod og sentrifugert 35 minutter ved romtemperatur ved 400 x g. De mononukleære celler som hadde samlet seg i interfasen mellom plasma og gradient ble suget av, vasket tre ganger med fysiologisk saltvann og suspendert i RPMI-1640-medium som inneholdt 15% sammenslått varme inaktivert (30 minutter, 56 °C) AB-serum så vel som penicillin (100 IE/ml), streptomycin (100 ug/ml) og L-glutamin (2 mM) (RPMI-suppl.).

Isoleringen av monocytter fra den mononukleære cellepopula-sjon fulgte ved adhering. Monocytter har, i motsetning til andre mononukleære blodceller, egenskapen å hefte ved glass-eller plastkolbeoverflater. For isolering av monocytter ble mononukleære celler innstilt til en konsentrasjon på 1 x 10<7 >celler pr. ml RPMI-suppl. 2 ml av denne suspensjon ble så pipettert i plastvevskulturskåler (Makroplatte TC, Greiner & Sohne, Kremsmunster, Østerrike) og inkubert 3 timer i et dyrkningsskap (5% C02, mer enn 95% luftfuktighet) ved 37°C. Derpå ble de ikke-adherte celler pipettert av; de vedhengende celler (monocytter) ble vasket tre ganger med fysiologisk saltvann, tilsatt RPMI-suppl. og oppbevart i C02-dyrkningsskap til videre anvendelse.

Ekspresjonen av Fc-reseptorer i monocyttenes membran ble påvist ved tilføring av IgG-inneholdene bovine erythrocytter (A. Berken et al., J. Exp. Med. 1966 123. 119-144). Bovint blod ble tatt opp i "Alsever11 -løsning og vasket flere ganger i fosfatbufret saltoppløsning pH 7,2 til 7,4 (PBS). Derpå ble erythrocytt-konsentrasjonen innstilt på 2% i PBS. Påsetningen av erythrocyttene med immunglobulin G fulgte ved inkubasjon med en subagglutinerende dose av et antibovin- eller erythrocytt-antistoff (IgG-fraksjon): 0,167 mg/ml PBS, inkubasjonstid 1 time, 37°C) (C.S. Scott, Clin. Exp. Immunol. 1978 38, 300-3 05). Etter avsluttet inkubasjonstid ble fritt IgG fjernet ved tre gangers vask i PBS, og de med antistoffene belastede erythrocytter ble innstilt på en konsentrasjon på 0,5% i PBS som inneholdt 0,2% bovint serum-albumin (PBS-BSA). Denne erythrocyttsuspensjon kunne nå bli brukt til påvisning av Fc-reseptorer i monocyttmembranen.

Deretter ble først de ved vedhefting til plastvevkultur-skålene isolerte monocytter forsiktig løsnet fra vevskultur-skålene ved hjelp av en gummiskrape og innstilt til en konsentrasjon på 2 - 3 x IO<6> celler/ml PBS-BSA. 100 ul av denne monocyttsuspensjon ble så blandet med 100 \ il av den ovenfor beskrevne erythrocyttsuspensjon og sentrifugert ved 4"C i løpet av 10 minutter ved 120 x g. Etter 1 times inkubasjon ved 0"C ble de pelleterte celler forsiktig resuspendert og prosentandelen av monocyttene som hadde fått tilkoblet erythrocytter ble bestemt ved hjelp av et fasekon-trastmokroskop. Ved dette ble minst 200 monocytter undersøkt med hensyn til sin evne til å tilkoble IgG-påsatte erythrocytter. Resultatene er angitt som prosent rosettformende celler (% RFZ) eller som tilkoblingsindeks (AI). Som rosett blir det ansett en monocytt som minst har tilkoblet tre erythrocytter. Ved tilkoblingsindeksen blir de gjennomsnitt-lige antall av de pr. monocytt tilkoblede erythrocytter angitt.

Utprøvningen av faktor Vlll-preparatene fulgte ved at det umiddelbart etter tilkobling av monocyttene til plastvevs-kulturskålene ble tilsatt faktor VIII (2 IE/ml) til cellene og inkubert 1 time ved 37 °C i en C02-inkubator. Mot slutten av inkuberingstiden ble de adherende monocytter vasket fire ganger med fysiologisk saltvann tilsatt RPMI-suppl. og inkubert 16 timer i en C02-inkubator ved 37°C. Denne inkubasjons-

tid er nødvendig, idet de i blodproduktet inneholdte konta-minanter kan utøve sin immunmodulerende virkning. Mot slutten av denne 16 timers inkubasjonstid ble ekspresjonen av Fc-reseptorer i monocyttmembranen bestemt ifølge den overfor beskrevne metode.

Som kontroll ble monocytter umiddelbart etter tilføringen med RPMI-1640-medium, men uten faktor VIII, inkubert i 1 time og videre behandlet som ovenfor beskrevet.

Resultatene for Fc-reseptorekspresjon er angitt som % rosettformede celler (% RFZ) såvel som tilkoblingsindeks (AI).

Fra dette kan det observeres at faktor Vlll-utgangsproduktet fremskaffer en nedmodulering av Fc-reseptorekspresjon fra 81% RFZ til 2 0% RFZ. I motsetning til dette er, etter interaksjon mellom monocyttene og det behandlende faktor Vlll-preparat fremstilt ifølge oppfinnelsen, prosentsatsen av rosettformede celler 75%. Forskjellen mellom 81% RFZ i kontrollen og 75% RFZ etter interaksjon med det behandlende faktor VIII-preparat fremstilt ifølge oppfinnelsen er ikke signifikant (Students t-test for parvise stikkprøver). Dette betyr at det behandlende faktor Vlll-produkt fremstilt ifølge oppfinnelsen er fritt for immunmodulerende komponenter, idet RFZ-verdien ikke er forskjellige fra kontrollverdien (RFZ for monocytter uten faktor Vlll-behandling) etter interaksjon mellom monocyttene og det behandlede produkt fremstilt ifølge oppfinnelsen.

Eksempel 2

500 IE av et ifølge metoden beskrevet av Suokela H. et al. i Vox. Sang. 1977 33., 37-50, fremstilte og frysetørkede faktor IX-preparat ble løst i 20 ml destillert vann og dialysert over natten mot 2 1 av en sitratbuffer (sitrat pH 7,2 hvis nøyaktige sammensetning er beskrevet i eksempel 1) ved 4°C.

8 ml (tilsvarende ca. 200 IE) faktor IX ble erholdt og underkastet en affinitets-kolonnekromatografi på protein A-sepharose. Ved dette ble det 8 ml faktor IX-preparat pumpet med en gjennomstrømningshastighet på 0,1 ml pr. minutt over en protein A sepharose-kolonnee (kolonne C 10/10 fra Pharmacia, 1 ml gelvolum) som på forhånd hadde blitt ekvilibrert med 50 ml sitrat pH 7,2. Den gjennom kolonnen pumpede faktor IX ble innstilt på 2 IE/ml, sterilfiltrert og oppbevart ved 4°C til uttesting. Utprøvningen av den immunmodulerende aktivitet i utgangspreparatet såvel som det på den beskrevne måte behandlede faktor IX-preparat fulgte som beskrevet i eksempel 1. Resultatene av disse undersøkelser er sammenfattet i den følgende tabell.

Fra resultatene av denne tabell kan det ses at en interaksjon mellom faktor IX og monocyttene førte til en nedgang av Fc-reseptorekspresjon fra 75% RFZ (kontroll) til 42% RFZ (etter interaksjon med faktor IX) . Etter interaksjon mellom monocyttene og det behandlede faktor IX-produkt utgjorde Fc-reseptorekspresjonen imidlertid 70% RFZ. Forskjellen mellom 75% RFZ i kontrollen og 70% RFZ etter interaksjon med den behandlede faktor IX er ikke signifikant (Students t-test for parvise stikkprøver) og dette betyr at det ifølge oppfinnelsen behandlede faktor IX-produkt er fritt for immunmodulerende egenskaper.

Eksempel 3

Et frysetørket FEIBA-preparat (500 IE, immuno AG) ble løst i 20 ml destillert vann og ble som beskrevet i eksempel 1 og 2 for faktor VIII eller faktor IX, dialysert mot sitrat pH 7,2. Fjerningen av de immunmodulerende substanser fulgte ved absorpsjons-kolonnekromatograf i med protein A-sepharose. Den nøyaktige metode var som beskrevet i eksempel 2 for faktor IX. Uttestningen av de immunmodulerende egenskaper av utgangsproduktet så vel som av FEIBA-preparatet behandlet ifølge oppfinnelsen fulgte som beskrevet i eksempel 1. Resultatene fra disse undersøkelser som er sammenfattet i nedenstående tabell, viser at behandlingen med immobilise-rende protein A fjerner den immunmodulerende aktivitet fra

FEIBA.

Det kan fastslås at ved alle de undersøkte kroppsvæskefaktor-preparater (faktor VIII, faktor IX, FEIBA) blir de immunmodulerende egenskaper fjernet ved behandling med immoboliserende protein A såvel etter "batch" fremgangsmåten som ved kolonne-fremgangsmåten.

Eksempel 4

Et for intramuskulær anvendelse egnet immunglobulin G-preparat (i.m. IgG) ble fremstilt ved etanolfraksjonering (H.F. Deutsch et al., J. Biol. Chem. 1946 164 109ff.). Dette preparat ble underkastet en gelpermeasjonskromatografering. For dette ble en adskillelseskolonne (K 50/60 Pharmacia) fylt med 750 ml kromatograferingsgel (Sephacryl S 300 Pharmacia) og ekvilibrert med en fosfatbuffer (20 mM KH2P04, 0,15 M NaCl, 0,02 % NaH3, pH 8,0). Denne kolonne ble så påsatt 300 mg i.m. IgG (i 10 ml fosfatbuffer) og eluert med en gjennomstrøm-ningshastighet på 1 ml/minutt. Eluatet ble delt opp i 11 ml fraksjoner og proteininnholdet ble ved hjelp av en UV-detek-tor bestemt ved 280 nm. Fra dette ble det utviklet eluerings-kurver som er gjengitt i tegningen. De fraksjoner som er angitt med < > ble slått sammen og undersøkt med hensyn til immunmodulerende aktivitet som beskrevet i eksempel 1. Resultatene fra disse undersøkelser kan finnes i nedenstående tabell, hvorav det fremgår at denne behandling har oppnådd å gjøre immunglobulin-G-preparatet fritt for immunmodulerende komponenter. RFZ-verdien som ble erholdt etter interaksjon mellom monocytter og i.m. IgG fremstilt ifølge oppfinnelsen overensstemmer i hovedsak med ovenstående kontrollverdi.

Eksempel 5

Et som i eksempel 4 beskrevet fremstilt immunglobulin-G-preparat (i.m. IgG), ble innstilt til en konsentrasjon på 50 mg/ml i fosfatbuffret saltoppløsning (PBS). Etter passende oppklaring over et egnet filter ble preparatet filtrert gjennom et spesielt filter med meget liten porestørrelse (Sarto-rius SM 11318, porestørrelse 10 nm) . Ved dette ble filtermem-branen lagt inn i en egnet filterholder og f.eks. 20 ml av i.m. IgG-løsningen ble filtrert gjennom filteret med et trykk på 1 til 1,5 bar. Filtratet ble så, som beskrevet i eksempel 1, undersøkt for eventuelle immunmodulerende egenskaper. De i den følgende tabell angitte resultater viser at denne behandling fjerner størstedelen av de immunmodulerende egenskaper fra preparatet. Mens en behandling av monocyttene med i.m. IgG-utgangsproduktet forårsaker en nedmodulering av Fc-reseptor-ekspresjonen fra 79% til 21%, utgjør Fc-reseptorekspresjonen av monocytter etter interaksjon med det ifølge oppfinnelsen behandlede produkt 67%. Den ifølge oppfinnelsen behandlede i.m. IgG-fraksjon er altså i det vesentlige fri for immunmodulerende egenskaper.

Eksempel 6

Det ble fremstilt et faktor Vlll-preparat ifølge den i EP-A-0 127 603 beskrevne metode. Dette preparat ble underkastet en af f initetskromatograf ering med immobilisert antistoff, rettet mot den immunmodulerende komponent.

For å fremstille de for affinitetskromatograferingen nødven-dige antistoff ble først de immunmodulerende komponenter isolert fra et som ovenfor beskrevet fremstilt faktor VIII-preparat. Dette ble oppnådd ved en kombinasjon av af f initetskro-matografering og kolonnekromatografering. For dette ble 2500 IE av faktor VIII i 100 ml oppløst i destillert vann og dialysert i 24 timer mot sitrat pH 7,2. Dette produkt ble så satt på en kolonne som var fylt med immobilisert protein A (protein A-sepharose, 12 ml gelvolum, kolonne C 10/2 0 Pharmacia, Sverige) og sirkulert over natten ved romtemperatur og en gjennomstrømningshastighet på 0,5 ml/minutt. Til slutt ble kolonnen vasket med 100 ml sitrat pH 7,2 (gjennom-strømningshastighet 0,5 ml/minutt). Det til protein A-sepharose bundne materiale ble til slutt eluert med en sur sitratbuffer (50 mM trinatriumsitrat, 50 mM sitronsyre, pH 3,0, i det følgende forkortet "sitrat pH 3,0") og straks etter elueringen nøytralisert med IM natriumfosfatbuffer, pH 8,5. Etter dialyse mot PBS ble dette materiale underkastet en molekylærsiktkromatografering. Deretter ble det dialyserte protein A-eluat satt på en "Superase Prep Grade" kolonne (HR 16/50) og kromatografert med en gjennomstrømningshastighet på 0,5 ml/min. Fraksjonen med en molekylvekt større enn 400 kD inneholdt de immunmodulerende komponenter, noe som lett ble fastslått ved den beskrevne rosett-test. Disse fraksjoner ble slått sammen og anvendt for fremstilling av antistoff i forsøksdyr.

150 \ ig av de immunmodulerende komponenter (i 200 \ il PBS) ble blandet med 200 \ il fullstendig Freunds medium og med dette ble en kanin immunisert to ganger subkutant. Ved dag 21 og 28 etter første stimulering ble på samme måte en "booster"-immu-niser ing gjennomført. Etter dag 35 ble det hver uke i seks uker foretatt en tapning på ca. 3 0 ml blod og serum ble fremstilt fra dette. Deretter ble serumprøvene fra de forskjellige blodtapningsdatoene slått sammen og fra dette ble immunglobulin-G-fraksjonen isolert.

Derved ble serumet tilsatt ammoniumsulfat til en 35 %-ig metning, omrørt 25 minutter ved romtemperatur og til slutt sentrifugert ved 800 x g i 15 minutter. Pelleten ble resuspendert i 33% mettet ammoniumsulfat, omrørt 15 minutter og sentrifugert på nytt. Den derved erholdte pellett ble opp-løst i PBS inneholdene 0,1 % natriumazid og underkastet en gelfiltrering på en Superase Prep Grade kolonne (HR 16/50, gjennomstrømningshastighet 0,5 ml/minutt). Fraksjonene i molekylvektområdet fra 150 kD (altså de immunoglobulin-G-inneholdene fraksjoner) ble samlet opp og dialysert mot 0,1 M natriumhydrogenkarbonat, 0,5 M natriumklorid, pH 8,5

( = koblingsbuffer).

De således erholdte antistoff ble ved koblingen til cyano-genbromid (CNBr)-aktivert sepharose immobilisert (etter påbud fra firmaet Pharmacia). Deretter ble 4 g CNBr-aktivert Sepharose 4B (Pharmacia, Sverige) svellet i 1 mM saltsyre og vasket på en glassfiltersmokk med 500 ml 1 mM saltsyre. 10 ml av gelen ble blandet med 40 ml av de i koblingsbuf feren foreliggende antistoff (tilsvarende 90 mg protein) og inkubert under risting av mog til i 2 timer ved romtemperatur. Derpå ble dette avsentrifugert av (800 x g, 15 minutter) , vasket ved resuspensjon i koblingsbuffer og påfølgende sentrifugering, og gelmaterialet ble suspendert i 50 ml blokkeringsbuffer (= koblingsbuffer + 1 M etanolamin). Etter en inkubasjon på 2 timer ved romtemperatur ble gelmaterialet vasket, først i 100 ml 0,1 M Tris, 0,5 M natriumklorid, pH 8,0 og derpå i 100 ml 0,1 M iseddik, 0,5 M natriumklorid, pH 4,0. pH 8- til pH 4-vasketrinnene ble gjentatt tre ganger.

(Gelvaskingen ble gjennomført ved resuspensjon og avsentri-fugering). Tilslutt ble gelmaterialet suspendert i 20 ml PBS + 10 IE heparin/ml. En analyse viste at 9 mg av det mot de immunmodulerende komponenter rettede antistoff pr. ml gel

var bundet.

4,5 ml av denne gel ble pakket i en kromatograferingskolonne (C 10/10, Pharmacia, Sverige) og gjennomtrukket med etter hverandre følgende 30 ml 3% bovint serum albumin (i PBS), 50 ml 50 mM trinatriumsitrat, 50 mM sitronsyre (pH 3,0) og til slutt 200 ml PBS (inneholdene 10 IE/ml heparin) (gjennom-strømningshastighet 0,5 ml/minutt) . Dette gelmateriale ble så

anvendt til adskillelse av de immunmodulerende komponenter.

Denne adskillelse kan like godt bli gjennomført i "baten"-fremgangsmåte som ved anvendelse av kolonne. I eksemplet blir adskillelsen av de immunmodulerende komponenter fra et faktor VTII-preparat beskrevet gjennomført ved anvendelse av kolonne. Ifølge tilsvarende prinsipp kan imidlertid også de immunmodulerende komponenter bli fjernet fra faktor IX og FEIBA-preparater. 1 eksemplet ble 500 IE av et som ovenfor beskrevet fremstilt faktor Vlll-preparat løst i 20 ml destillert vann og dialysert to ganger i 24 timer mot 1 1 PBS hver gang som inneholdt 10 IE/ml heparin. Deretter ble konsentrasjonen for faktor VI11-preparatet innstilt med samme buffer til 10 IE faktor VIII pr. ml. 100 IE av dette materiale ble så tatt opp på den ovenfor beskrevne adskillelseskolonne (sepharose til hvilken antistoff mot de immunmodulerende komponenter hadde blitt koblet) og sirkulert over kolonnen i 16 timer ved romtemperatur med en gjennomstrømningshastighet på 0,5 ml/minutt. Det materiale som ikke var bundet til søylen ble så innstilt på 2 IE faktor VIII pr. ml som beskrevet i eksempel 1, og testet ved hjelp av rosettetesten med hensyn til immunmodulerende aktivitet. Resultatene fra denne undersøkelse er sammenfattet i følgende tabell.

Resultatene som er fremstilt i denne tabell viser tydelig en immunomodulerende aktivitet av faktor Vlll-utgangsproduktet. En interaksjon mellom monocyttene og utgangsproduktet førte til en senkning av Fc-reseptorekspresjonen på 81 + 3% RFZ (kontroll) til 31+5% RFZ (etter interaksjon med faktor VIII). I motsetning til dette førte en interaksjon mellom monocyttene og det ifølge oppfinnelsen fremstilte faktor Vlll-produkt ikke til reduksjon av Fc-reseptorer i monocyttmembranen (81 + 3% RFZ etter interaksjon med kontrollmediet i forhold til 80+6% RFZ etter interaksjon med det ifølge oppfinnelsenfremstilte faktor Vlll-produkt). Forskjellen mellom 81 + 3% RFZ og 80 + 6% RFZ er statistisk ikke signifikant (Students t-test for parvise stikkprøver), og dette betyr at det i følge oppfinnelsen fremstilte faktor Vlll-produkt er fritt for immunmodulerende egenskaper.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av parenteralt tilførbare blodprodukter fra blodplasma, som i det vesentlige er fri for immunmodulerende komponenter, noe som kommer til uttrykk ved at en nedmodulering av Fc-reseptorer i membranen hos monocytter mangler eller uteblir, hvorved ekspresjonen av reseptorer for Fc-enheten av immunglobulin G i membranen til monocytter etter interaksjon med et blodproduktpreparat ikke senkes eller senkes høyst 30%, hvilket blodprodukt er egnet til behandling av nedarvede eller ervervede koagulasjonsforstyrrelser, til behandling av primær eller sekundær immundefisiens, såvel som til behandling av autoimmun-, immunkompleks- og infeksjonslidelser,karakterisert ved at blodproduktet - underkastes en molsikting, nemlig en gelfiltrering, eller - blir behandlet med molsiktbart bærermateriale til hvilket de immunmodulerende komponenter blir selektivt adsorbert, eksempelvis sepharose, hvor immobiliserte ligander, spesielt proteiner av bakteriell opprinnelse, såsom protein A fra stafylokokker, protein G eller protein M fra streptokokker eller antistoffer som er fremskaffet ved immunisering med immunmodulerende substanser, er bundet, eller - blir filtrert over et filter med en porestørrelse som er lik eller mindre enn 10 nm.