NO174780B

NO174780B - Oligonucleotide probes and their use for detection of nucleic acids in bacteria and other living organisms by hybridization

Info

Publication number: NO174780B
Application number: NO875058A
Authority: NO
Inventors: Patrick Grimont; Philippe Marliere
Original assignee: Pasteur Institut; Inst Nat Sante Rech Med
Priority date: 1986-04-04
Filing date: 1987-12-03
Publication date: 1994-03-28
Also published as: NO875058D0; NO875058L; NO174780C

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører oligonukleotidprober og anvendelse derav for detektering av nukleinsyrene i bakterier og andre levende organismer ved hybridisering. The present invention relates to oligonucleotide probes and their use for detecting the nucleic acids in bacteria and other living organisms by hybridization.

Leger, veterinærer, plantepatologer og biologer må generelt ofte bestemme om en prøve (human, animalsk, vegetabilsk, mat-vare eller annen) inneholder bakterier eller eventuelt andre organismer. For tiden er den eneste metode som kan benyttes for detektering av tilstedeværelsen av levende mikroorganismer, mikroskopi (lys- eller elektronmikroskopi), dyrking, immunologisk detektering og detektering med spesifikke nukleinsyreprober. Doctors, veterinarians, plant pathologists and biologists generally often have to decide whether a sample (human, animal, vegetable, food or other) contains bacteria or possibly other organisms. Currently, the only methods that can be used for detecting the presence of living microorganisms are microscopy (light or electron microscopy), cultivation, immunological detection and detection with specific nucleic acid probes.

Immunologisk detektering og detektering ved hjelp av spesifikke nukleinsyreprober blir for tiden kun benyttet for spesielle organismer, f.eks. Legionella pneumophila eller Salmonella. En reagens som muliggjør detektering av en eller flere organismer, er generelt ute av stand til å detektere andre arter eller slekter (dette prinsipp med spesifisitet er grunnen for bruk av disse reagensene). Immunological detection and detection using specific nucleic acid probes are currently only used for special organisms, e.g. Legionella pneumophila or Salmonella. A reagent that enables the detection of one or more organisms is generally unable to detect other species or genera (this principle of specificity is the reason for the use of these reagents).

Mikroskopisk undersøkelse er nødvendigvis begrenset til en liten del av prøven, og nedbrutt cellemateriale eller andre partikler kan gjøre det umulig å visualisere en levende organisme og identifisere den som sådan. Microscopic examination is necessarily limited to a small part of the sample, and degraded cell material or other particles can make it impossible to visualize a living organism and identify it as such.

Dyrking er mulig bare for et visst antall organismer (spesielt bakterier) og på visse media og under betingelser som er spesifikke for disse organismene (aerobe eller anaerobe bakterier, som krever en eller annen spesiell vekstfaktor, eller lignende). Intet kulturmedium kan alene gi anledning for vekst av alle bakterier som kan dyrkes. Det er mulig at bakterier er ukjente og udetekterbare i dag fordi det ikke er kjent hvordan man skal dyrke dem. Det er mange eksempler på tilfeller hvor tilstedeværelsen av bakterier bare har kunnet påvises etter ett eller flere års forskning: Ved legionær-sykdommen (Philadelphia-epedimi), var de ansvarlige bakterier, som de humane prøvene senere viste seg å inneholde, ikke synlige etter den vanlige farging i mikroskopet og kunne ikke dyrkes på bakteriologiske medier som på det aktuelle tidspunkt var kjent. Likeledes var bakterier som infiserer veddelen i planter, ukjent i lang tid. De ble bare oppdaget som resultatet av nøye observasjoner under mikroskopet. Som i ovenstående tilfelle kunne disse bakteriene ikke dyrkes på de mediene som på tidspunktet var kjent. Det følger fra eksemplene ovenfor at mangelen på detektering av en bakteriell forurensning i et merdium som studeres ved hjelp av tradisjonelt benyttede metoder ikke nødvendigvis leder til den konklusjon at dette mediet mangler all bakteriell forurensning. Cultivation is possible only for a certain number of organisms (especially bacteria) and on certain media and under conditions specific to these organisms (aerobic or anaerobic bacteria, which require some special growth factor, or the like). No culture medium alone can give rise to the growth of all culturable bacteria. It is possible that bacteria are unknown and undetectable today because it is not known how to grow them. There are many examples of cases where the presence of bacteria could only be demonstrated after one or more years of research: In the case of Legionnaires' disease (Philadelphia epidemic), the responsible bacteria, which the human samples later proved to contain, were not visible after the ordinary staining in the microscope and could not be grown on bacteriological media known at the relevant time. Likewise, bacteria that infect the stem in plants were unknown for a long time. They were only discovered as a result of careful observation under the microscope. As in the above case, these bacteria could not be grown on the media known at the time. It follows from the above examples that the lack of detection of a bacterial contamination in a medium studied using traditionally used methods does not necessarily lead to the conclusion that this medium lacks all bacterial contamination.

Formålet med foreliggende oppfinnelse er å rette på manglene i de tradisjonelle detekteringsteknikker, m.a.o. å tilveie-bringe et middel som muliggjør enten at den sterile natur til et spesielt medium, f.eks. en human prøve, kan bekreftes, eller at eksistensen av en forurensning, f.eks. en bakteriell forurensning, kan avsløres med en grad av pålitelighet som hittil har vært ukjent. The purpose of the present invention is to correct the deficiencies in the traditional detection techniques, including to provide a means which enables either the sterile nature of a particular medium, e.g. a human sample, can be confirmed, or that the existence of a contaminant, e.g. a bacterial contamination, can be revealed with a degree of reliability hitherto unknown.

Det vil lett forstås at et slikt middel kan bli meget nyttig fordi den ville gjøre det mulig at forurensning av prøver med bakterier eller andre celler kan detekteres, idet det også er en mulighet for telling av cellene. En detektering av denne typen kan ikke slå feil, f. eks. for på effektiv måte å stimulere forskningen etter en bakterie i tilfeller for infeksjon (hos mennesker, dyr, planter) av ukjent etiologi. It will be easily understood that such a means can be very useful because it would make it possible for contamination of samples with bacteria or other cells to be detected, as there is also a possibility of counting the cells. A detection of this type cannot fail, e.g. to effectively stimulate research for a bacterium in cases of infection (in humans, animals, plants) of unknown etiology.

Oppfinnelsen har fremkommet ut fra interessen i studiet av ribosomale RNA'er. Av alle makromolekylære bestanddeler i levende organismer synes de robosomale ribonukleinsyrene (RNA) a priori å være pålitelige indikatorer for en biologisk kontaminering (tilstedeværelse av levende organismer). Disse RNA'er utgjør en vesentlig del av cellematerialet. De er nødvendige for funksjoneringen av alle kjente levende celler. RNA i den lille ribosomale underenheten (kjent som 16S RNA under henvisning til dens sedimenteringskonstant ved ultra-sentrifugering med en sukrosegradient) er nå kjent ved nukleotidnivået for omkring 20 organismer (eksempler på kom-plette nukleotidsekvenser er gitt av Weisburg et al. 1985, J. Bacteriol., vol. 164, nr. 1, s. 230-2363; Frydenberg og Christiansen, 1985, DNA, vol. 4, nr. 2, s. 127-137). Nukleotidene blir konvensjonelt nominert fra 5'-enden i 16S RNA-molekylet til 3'-enden. 16S RNA'en i Escherichia coli-bakterien omfatter 1542 nukleotider. De tilsvarende molekylene i andre levende organismer kan adskille seg fra dem i E. coli m.h.t. deres totale antall nukleotider og deres nukleotidsekvens. The invention has emerged from the interest in the study of ribosomal RNAs. Of all macromolecular components in living organisms, the robosomal ribonucleic acids (RNA) seem a priori to be reliable indicators of a biological contamination (presence of living organisms). These RNAs make up a significant part of the cell material. They are necessary for the functioning of all known living cells. RNA of the small ribosomal subunit (known as 16S RNA in reference to its sedimentation constant by ultracentrifugation with a sucrose gradient) is now known at the nucleotide level for about 20 organisms (examples of complete nucleotide sequences are given by Weisburg et al. 1985, J . Bacteriol., vol. 164, no. 1, pp. 230-2363; Frydenberg and Christiansen, 1985, DNA, vol. 4, no. 2, pp. 127-137). The nucleotides are conventionally nominated from the 5' end of the 16S RNA molecule to the 3' end. The 16S RNA in the Escherichia coli bacterium comprises 1542 nucleotides. The corresponding molecules in other living organisms may differ from those in E. coli in terms of their total number of nucleotides and their nucleotide sequence.

Sammenligningen av nukleotidsekvensene i de kjente ribosomale RNA'er og oppdagelsen av deler som er felles for disse med en grad av identitet, var i alle tilfeller for ekstrem likhet utover nivåene for sekvenskonservering som kunne forventes, faktorer som ledet til foreliggende oppfinnelse. Det har således blitt funnet at variasjonene mellom forskjellige organismer ikke er fordelt gjennom alle 16S RNA-sekvensene, men er konsentrert på visse steder (spesielt i strukturens spiralelementer), mens visse områder (spesielt de løkke-formede elementer) synes å være mye sterkere konservert. Disse variasjonene er dessuten i overensstemmelse på en konsekvent måte de store taksonomiske inndelinger. I 16S RNA-sekvensene er det således mulig å definere universielle enheter, spesielt eukaryote og bakterielle (prokaryote) enheter og enheter som er spesifikke overfor mer begrensede bakteriegrupper. The comparison of the nucleotide sequences of the known ribosomal RNAs and the discovery of parts common to them with a degree of identity were in all cases for extreme similarity beyond the levels of sequence conservation that could be expected, factors that led to the present invention. It has thus been found that the variations between different organisms are not distributed throughout the 16S RNA sequences, but are concentrated in certain places (especially in the helical elements of the structure), while certain areas (especially the loop-shaped elements) seem to be much more strongly conserved . These variations are also consistent with the major taxonomic divisions. In the 16S RNA sequences, it is thus possible to define universal units, especially eukaryotic and bacterial (prokaryotic) units and units that are specific to more limited bacterial groups.

16S RNA'ene ble således vist å være i besittelse av et universelt område (dvs. felles for eukaryoter og prokaryoter) ragende fra nukleotid 1492 til nukleotid 1506 (ifølge nummereringen som gjelder for 16S RNA-sekvensen i E. coli) og et område som er spesifikt for bakterier (eubakterier, archaebakterier, og metanogene og halofile bakterier) ragende The 16S RNAs were thus shown to possess a universal region (ie common to eukaryotes and prokaryotes) extending from nucleotide 1492 to nucleotide 1506 (according to the numbering applicable to the 16S RNA sequence in E. coli) and a region which is specific to bacteria (eubacteria, archaebacteria, and methanogenic and halophilic bacteria) rising

fra nukelotid 1527 til nukleotid 1541. I denne forbindelse vises det til nedenstående tabell hvor A, T, C og G betegner de fire standard nukleotidene som deltar i sammensetningen av DNA'er; det skal forstås at nukleotidet som er betegnet med et gitt henvisningstall, tilsvarer det som er beliggende under det første sifferet i tallet. F.eks. tilsvarer nr. 1490 uracil (U) i nukleotidsekvensen tilsvarende RNA'en. tRNA'er i et stort antall bakterier ble også vist å inneholde felles sekvenser, spesielt følgende: from nucleotide 1527 to nucleotide 1541. In this connection, reference is made to the table below where A, T, C and G denote the four standard nucleotides that participate in the composition of DNAs; it should be understood that the nucleotide designated by a given reference number corresponds to the one located below the first digit in the number. E.g. corresponds to No. 1490 uracil (U) in the nucleotide sequence corresponding to the RNA. tRNAs in a large number of bacteria were also shown to contain common sequences, notably the following:

Denne sekvensen synes imidlertid å være mindre universell enn det området som er spesifikt for bakterier nevnt ovenfor, som strekker seg fra nukleotid 1527 til nukleotid 1541. However, this sequence appears to be less universal than the region specific to bacteria mentioned above, which extends from nucleotide 1527 to nucleotide 1541.

Archabakter iene ble også vist å være i besittelse av en sekvens som var felles for hele denne bakterietypen, hvilken sekvens har følgende struktur: The Archabacteria were also shown to possess a sequence that was common to all of this type of bacteria, which sequence has the following structure:

hvor R er A eller G. where R is A or G.

Foreliggende oppfinnelse skriver seg således fra de ovenfor omtalte funn, og tilveiebringer spesifikke nukleotidsekvenser som er komplementære til ovennevnte sekvenser, og som utgjør et lignende antall prober hvorav noen kan anvendes universelt for detektering av en cellekontaminering i et hvilket som helst medium, og idet andre kan anvendes for klassifisering av celler som eventuelt er detektert blant følgende katego-rier: som bakterier, inkludert visse archaebakterier, mer spesielt metanogene og halofile archaebakterier, The present invention is thus based on the findings mentioned above, and provides specific nucleotide sequences which are complementary to the above-mentioned sequences, and which constitute a similar number of probes, some of which can be used universally for detecting a cell contamination in any medium, and while others can is used for the classification of cells that are possibly detected among the following categories: as bacteria, including certain archaebacteria, more particularly methanogenic and halophilic archaebacteria,

som archaebakterier, such as archaebacteria,

og i alle andre organismekategorier, i tilfelle for positiv respons i hybridiseringstester med den "universelle proben" og negativ respons med probene som tillater klassifisering av mikroorganismene som er detektert i de ovenfor nevnte kate-gorier. and in all other categories of organisms, in case of positive response in hybridization tests with the "universal probe" and negative response with the probes that allow the classification of the microorganisms detected in the above-mentioned categories.

Sekvensene av den angjeldende typen kan lett bestemmes ved nukleotidsyntese. Oppfinnelsen angår således mer spesielt et pentadekadeoksyribonukleotid (deoksyribonukleinsyresekvens med 15 nukleotider, eller for korthets skyld 15-mer) som er komplementær til 1492-1506 området i 16S RNA'ene, idet denne 15-meren kan hybridisere med det homologe fragmentet som er til stede i 16S RNA'en i alle levende organismer samt med den delen av deoksyribonukleinsyren (DNA) som koder, for denne RNA-delen og som er til stede i genomet til alle levende organismer. The sequences of the type in question can be easily determined by nucleotide synthesis. The invention thus relates more particularly to a pentadecadeoxyribonucleotide (deoxyribonucleic acid sequence with 15 nucleotides, or for brevity 15-mer) which is complementary to the 1492-1506 region in the 16S RNAs, as this 15-mer can hybridize with the homologous fragment that is present in the 16S RNA in all living organisms as well as with the part of the deoxyribonucleic acid (DNA) which codes for this RNA part and which is present in the genome of all living organisms.

Oppfinnelsen angår også: The invention also relates to:

de prober som består av oligonukleotidene som er komplementære til sekvensen UCAUAACCCGAAGGUC som allerede nevnt, for detektering av mikroorganismer som kan klassifiseres blant bakterier, og the probes consisting of the oligonucleotides which are complementary to the sequence UCAUAACCCGAAGGUC as already mentioned, for the detection of microorganisms that can be classified among bacteria, and

de prober som er komplementære til den ovennevnte sekvens UUCGACGAGRUGGGGCGC, idet disse probene selv er karakteristiske for archaebakterier. the probes which are complementary to the above sequence UUCGACGAGGRUGGGGCGC, these probes themselves being characteristic of archaebacteria.

Oppfinnelsen angår sluttlig en DNA-sekvens med 15 nukleotider (15-mer) som er komplementære til 1527-1441 området i 16S RNA'ene, idet denne 15-mer kan hybridisere med det homologe fragmentet som er til stede i 16S RNA'en i bakterier og andre prokaryoter, samt med de tilsvarende gener i DNA'en til disse organismene, men ikke i stand til eller bare meget lite i stand til å hybridisere med den tilsvarende RNA i eukaryote celler (gjær, sopp, protozoer, menneske-, dyre- og plantevev) eller tilsvarende gener i DNA'en til disse organismene. Finally, the invention concerns a DNA sequence with 15 nucleotides (15-mer) which is complementary to the 1527-1441 region in the 16S RNAs, as this 15-mer can hybridize with the homologous fragment that is present in the 16S RNA in bacteria and other prokaryotes, as well as with the corresponding genes in the DNA of these organisms, but unable or only very slightly unable to hybridize with the corresponding RNA in eukaryotic cells (yeast, fungi, protozoa, human, animal - and plant tissue) or corresponding genes in the DNA of these organisms.

Oppfinnelsen tilveiebringer følgelig mer spesielt: Accordingly, the invention provides more particularly:

1) Probe idet følgende betegnet "sammensetning som er spesifikk for eubakterier og visse archaebakterier) eller "eubakteriell probe", for detektering av tilstedeværelsen av bakterier i en prøve eller for lokalisering blant DNA-fragmenter separert ved elektroforese eller kromatografi, av dem som bærer genene som koder for 16S RNA'ene i bakterier, kjennetegnet ved at den består enten av et pentadekadeoksyribonukleotid med sekvens hvor (5') og (3') indikerer 5'- og 3'-endene til polymeren, og hvor bokstavene indikerer følgende rester (nukleotider): A, adenylrest; C, cytidylrest; T, tymodylrest; og G, guanidylrest; eller av et pentadekadeoksyribonukleotid som har den komplementære sekvens: 1) Probe hereinafter referred to as "composition specific for eubacteria and certain archaebacteria) or "eubacterial probe", for detecting the presence of bacteria in a sample or for locating among DNA fragments separated by electrophoresis or chromatography, those carrying the genes which codes for the 16S RNAs in bacteria, characterized in that it consists either of a pentadecadeoxyribonucleotide with sequence where (5') and (3') indicate the 5' and 3' ends of the polymer, and where the letters indicate the following residues (nucleotides): A, adenyl residue; C, cytidyl residue; T, thymodyl residue; and G, guanidyl residue; or of a pentadecadeoxyribonucleotide having the complementary sequence:

Sekvensen (5')d - CTG GAT CAC CTC CTT 8(3') tilsvarer komplementet i den overensstemmende sekvensen i 1527-1541-delen (ifølge nummereringen benyttet for Escherichia coli) i 16S RNA'ene i bakterier, og mer presist i eubakterier. Denne sekvensen er ikke helt komplementær til alle 16S RNA-sekvensene som hittil er publisert for bakterier, men adskiller seg fra disse høyst ved 1 eller 2 nukleotider. I motsetning til dette kan sekvensen i denne sammensetning bare pares svakt med det homologe området i 18S RNA'ene i eukaryoter og 12S RNA'er i mitokondrier (disse RNA'er tilsvarer 16S RNA'ene i bakterier). The sequence (5')d - CTG GAT CAC CTC CTT 8(3') corresponds to the complement of the corresponding sequence in the 1527-1541 part (according to the numbering used for Escherichia coli) in the 16S RNAs in bacteria, and more precisely in eubacteria . This sequence is not completely complementary to all the 16S RNA sequences published so far for bacteria, but differs from them by 1 or 2 nucleotides at most. In contrast, the sequence in this assembly can only be weakly matched to the homologous region in the 18S RNAs in eukaryotes and 12S RNAs in mitochondria (these RNAs correspond to the 16S RNAs in bacteria).

Oppfinnelsen angår naturligvis også enhver probe som kan pares med de samme områdene i RNA'ene og/eller genomisk DNA, spesielt en sekvens som er forskjøvet for et nukleotid i forhold til den ovenfor beskrevne "eubakterielle probe", idet den pares med sekvensen UGGAUCACCUCCUUA, hvorved proben da består av sekvensen: The invention naturally also relates to any probe that can be paired with the same regions in the RNAs and/or genomic DNA, in particular a sequence that is shifted by one nucleotide in relation to the "eubacterial probe" described above, as it is paired with the sequence UGGAUCACCUCUUA, whereby the probe then consists of the sequence:

(3') ACCTAGTGGAGGAAA (5') eller (dersom leseretningen reverseres (3') ACCTAGTGGAGGAAA (5') or (if the reading direction is reversed

som forekommer i størstedelen av bakterier. which occurs in the majority of bacteria.

Oppfinnelsen angår naturligvis videre enhver mindre oligo-nukleotidprobe hvis sekvsns ikke desto mindre inneholdes i ovennevnte "spesifikke probe for eubakterier" (eller i proben inneholdende den "forskjøvede sekvensen". The invention naturally also relates to any smaller oligonucleotide probe whose sequence is nevertheless contained in the above-mentioned "specific probe for eubacteria" (or in the probe containing the "displaced sequence".

Denne proben inneholder ikke desto mindre i det minste sekvensen TGGAGGAA (5') (som er komplementær til området i 16S RNA'en som strekker seg mellom nukleotider 1534 og 1541), spesielt: This probe nevertheless contains at least the sequence TGGAGGAA (5') (which is complementary to the region of the 16S RNA extending between nucleotides 1534 and 1541), specifically:

Sekvensene som er komplementære til de ovenfor angitte, ut-gjør også en del av gruppen av prober ifølge oppfinnelsen. The sequences which are complementary to those indicated above also form part of the group of probes according to the invention.

Det skal likevel fremheves at de lengste probene er fore-trukket p.g.a. deres større paringsstabilitet. Dessuten ville erstatningen av et nukleotid med et annet i den samme sekvensen muligens gi dem høyere affinitet for 16S RNA'ene i en spesiell bakteriell gruppe, men ville svekke deres kom-plementaritet i forhold til størstedelen av de andre. På den annen side ville forlengelse foretatt ved 3'-enden med hele eller en del av enheten CCGCA ikke gi en vinning i spesifisitet fordi komplementet til dens enhet er representert i 18S RNA'en til hvirveldyr. It must nevertheless be emphasized that the longest probes are preferred due to their greater mating stability. Moreover, the replacement of one nucleotide with another in the same sequence would possibly give them a higher affinity for the 16S RNAs of a particular bacterial group, but would weaken their complementarity in relation to the majority of the others. On the other hand, extension made at the 3' end with all or part of the unit CCGCA would not provide a gain in specificity because the complement of its unit is represented in the 18S RNA of vertebrates.

2) Probe, i det følgende betegnet "universell probe" for detektering av cellene i eukaryote eller prokaryote organismer (inkludert bakterier) i en prøve eller for lokalisering blant DNA-fragmenter separert ved elektro- 2) Probe, hereinafter referred to as "universal probe" for detecting the cells of eukaryotic or prokaryotic organisms (including bacteria) in a sample or for localization among DNA fragments separated by electro-

forese eller kromatografi, de som bærer genene som koder for RNA'ene i 16S-serien i disse cellene, kjennetegnet ved at den består enten av et pentadekadeoksyribonukleotid med sekvens: forese or chromatography, those carrying the genes that code for the RNAs of the 16S series in these cells, characterized in that it consists either of a pentadecadeoxyribonucleotide of sequence:

hvor (5'), (3'), A, C, T og G har de ovenfor angitte betydninger. where (5'), (3'), A, C, T and G have the meanings given above.

Denne proben er fullstendig komplementær til 1492-1506-delen (i overensstemmelse med den tallhenvisning som benyttes for Escherichia coli) i 16S RNA'en til denne mikroorganismen, og til tilsvarende deler i de publiserte RNA'er til alle andre bakterier, prokaryote og eukaryote celler og, skjønt i mindre grad, med RNA'er i mitokondrier. En fagmann vil ut fra dette utlede at det praktisk talt er fullstendig sannsynlighet for at denne proben også må forekomme hos, RNA'ene i alle celler som eksisterer i naturen. Denne proben er også i stand til å pares med den homologe delen i DNA'en til genene som koder for disse 16S RNA'ene og de tilsvarende eukaryote RNA'ene. This probe is fully complementary to the 1492-1506 region (consistent with the numbering used for Escherichia coli) in the 16S RNA of this microorganism, and to corresponding regions in the published RNAs of all other bacteria, prokaryotic and eukaryotic cells and, although to a lesser extent, with RNAs in mitochondria. A person skilled in the art will deduce from this that there is practically complete probability that this probe must also occur in the RNAs in all cells that exist in nature. This probe is also able to pair with the homologous part of the DNA of the genes encoding these 16S RNAs and the corresponding eukaryotic RNAs.

Proben kan naturligvis også omfatte et pentadekadeoksyribonukleotid som er komplementære sekvensen: The probe can of course also comprise a pentadecadeoxyribonucleotide which is complementary to the sequence:

som er i stand til å pares med den samme delen i genomisk DNA which is able to pair with the same part in genomic DNA

(gener som koder for 16S RNA'ene og tilsvarende RNA'er) (genes that code for the 16S RNAs and corresponding RNAs)

p.g.a. dens dobbeltkjedede natur, selv om den ikke lenger er i stand til pares med 16S RNA'en (som bare inneholder en enkelt kjede). because of. its double-stranded nature, although it is no longer able to pair with the 16S RNA (which contains only a single strand).

3) Spefisikk probe for archaebakterier 3) Specific probe for archaebacteria

Oppfinnelsen angår sluttlig mer spesielt en spesifikk probe for archeabakterier, hvor denne probe har en sekvens på minst 8 nukleotider som inneholdes i følgende sekvens: og høyst de 18 nukleotidene i sekvensen, hvor R' er T eller C, eller av en sekvens som er komplementær til ovennevnte. Finally, the invention relates more particularly to a specific probe for archaea bacteria, where this probe has a sequence of at least 8 nucleotides contained in the following sequence: and at most the 18 nucleotides in the sequence, where R' is T or C, or of a sequence that is complementary to the above.

Generelle betingelser for anvendelse av probene General conditions for using the probes

De universelle probene og de mer spesifikke probene for eubakterier på en side, og archaebakterier på den annen side (og de komplementære sammensetningene), blir fordelaktig merket. En hvilken som helst tradisjonell merking kan anvendes. Sammensetningene kan merkes ved bruk av radioaktive spor-stoffer slik som <32>P, 35S, 125I, 3E eller <14>C, bare for å nevne de mest vanlig benyttede sporstoffene. Den radioaktive merkingen kan utføres ifølge en hvilken som helst metode slik som f.eks. terminalmerking ved 3'- eller 5'-enden ved bruk av et radiomerket nukleotid, polynukleotidkinase (med eller uten defosforylering med en fosfatase) eller en ligase (avhengig av enden som skal merkes). I disse tilfeller ville den merkede sammensetning ha 16 nukleotider (idet det radioaktive nukleotidet tilføyet ved 3'- eller 5'-enden er av en hvilken som helst type. En av probene ifølge oppfinnelsen (inkludert en komplementær sammensetning) kan tjene som en templat for syntesen av en kort kjede (av ca. 15 nukleotider), bestående av radioaktive nukleotider eller en samling av radioaktive og ikke-radioaktive nukleotider. Foreliggende prober kan også fremstilles ved kjemisk syntese ved bruk av ett eller flere radioaktive nukleotider. En annen metode for radioaktiv merking er den kjemiske iodering av probene ifølge oppfinnelsen, hvilket leder til binding av flere <l25>i atomer til oligomerene. Dersom en av probene ifølge oppfinnelsen (eller en komplementær probe) gjøres radioaktiv for bruk ved hybridisering med en ikke-radioaktiv RNA eller DNA, vil metoden for detektering av hybridiseringen avhenge av det benyttede radioaktive sporstoff, og kan baseres på autoradiografi, væskescintillasjon, gamma-telling eller en hvilken som helst annen teknikk som gjør det mulig at den ioniserende stråling som utsendes av det radioaktive sporstoffet kan detekteres. The universal probes and the more specific probes for eubacteria on the one hand, and archaebacteria on the other hand (and the complementary compositions), are advantageously labeled. Any traditional marking may be used. The compositions can be labeled using radioactive tracers such as <32>P, 35S, 125I, 3E or <14>C, just to name the most commonly used tracers. The radioactive labeling can be carried out according to any method such as e.g. terminal labeling at the 3' or 5' end using a radiolabeled nucleotide, polynucleotide kinase (with or without dephosphorylation with a phosphatase) or a ligase (depending on the end to be labeled). In these cases, the labeled composition would have 16 nucleotides (the radioactive nucleotide added at the 3' or 5' end being of any type. One of the probes of the invention (including a complementary composition) can serve as a template for the synthesis of a short chain (of about 15 nucleotides), consisting of radioactive nucleotides or a collection of radioactive and non-radioactive nucleotides. Present probes can also be prepared by chemical synthesis using one or more radioactive nucleotides. Another method of radioactive labeling is the chemical iodination of the probes according to the invention, which leads to the binding of several <l25>i atoms to the oligomers. If one of the probes according to the invention (or a complementary probe) is made radioactive for use by hybridization with a non-radioactive RNA or DNA , the method for detecting the hybridization will depend on the radioactive tracer used, and can be based on autoradiography, liquid scintillation on, gamma counting or any other technique which enables the ionizing radiation emitted by the radioactive tracer to be detected.

En ikke-radioaktiv merking kan også anvendes, og omfatter kombinasjon av foreliggende prober med rester som har immuno-logiske egenskaper (antigener, haptener), en spesifikk affinitet for bestemte reagenser (ligander), egenskaper som gjør det mulig å fullføre detekterbare enzymreaksjoner (enzymer eller koenzymer, enzymsubstrat, eller et annet stoff som er involvert i en enzymatisk reaksjon), eller karakteristiske fysikalske egenskaper, slik som fluorescens eller emisjon eller absorpsjon av lys ved en hvilken som helst bølgelengde, bare for å nevne noen eksempler. Antistoffer som spesifikt gjenkjenner DNA/RNA-hydrider, kan også benyttes. A non-radioactive labeling can also be used, and includes the combination of present probes with residues that have immunological properties (antigens, haptens), a specific affinity for certain reagents (ligands), properties that make it possible to complete detectable enzyme reactions (enzymes or coenzymes, enzyme substrate, or any other substance involved in an enzymatic reaction), or characteristic physical properties, such as fluorescence or emission or absorption of light at any wavelength, just to name a few examples. Antibodies that specifically recognize DNA/RNA hydrides can also be used.

Den kjemiske merking som er nevnt ovenfor, kan utføres under den kjemiske syntesen av foreliggende prober, idet det er mulig å koble adenosin-, guanosin-, cytidin- og tymidin-restene til andre kjemiske rester som gjør det mulig å detektere sammensetningene eller hybridene dannet mellom sammensetningen og et komplementært DNA- eller RNA-fragment. Sekvensen til sammensetningen ved bruk av nukleotider som er modifisert ved kobling til andre kjemiske rester, ville imidlertid være den samme som nukleotidsekvensen til en av probene ifølge oppfinnelsen. The chemical labeling mentioned above can be carried out during the chemical synthesis of the present probes, it being possible to link the adenosine, guanosine, cytidine and thymidine residues to other chemical residues which make it possible to detect the compounds or hybrids formed between the composition and a complementary DNA or RNA fragment. However, the sequence of the composition using nucleotides which have been modified by coupling to other chemical residues would be the same as the nucleotide sequence of one of the probes according to the invention.

Oppfinnelsen angår også anvendelse av nevnte prober for detektering ved hybridisering, hvor disse probene på forhånd har blitt merket eller gjort i stand til å kunne detekteres som omtalt ovenfor. The invention also relates to the use of said probes for detection by hybridization, where these probes have previously been labeled or made capable of being detected as discussed above.

Valget av en eller annen av probene ifølge oppfinnelsen vil avhenge av formålet: detektering av prokaryote og eukaryote celler (universell sammensetning), detektering eller lokalisering av DNA eller DNA-fragmenter som bærer gener som koder for RNA'ene i 16S-serien, og som oppstår uten diskrimering fra prokaryote eller eukaryote celler (universell sammensetning eller probe som er komplementær dertil), unntatt detektering av bakterielle celler (spesifikk probe for eubakterier), detektering eller lokalisering av DNA eller DNA-fragmenter som bærer genene soin koder for de bakterielle 16S RNA'ene (spesifikk probe for eubakterier eller probe som er komplementær dertil). Anvendelsen av en eller flere prober ifølge oppfinnelsen kan ikke begrenses til en spesiell hybridiseringsteknikk. The choice of one or another of the probes according to the invention will depend on the purpose: detection of prokaryotic and eukaryotic cells (universal composition), detection or localization of DNA or DNA fragments that carry genes that code for the RNAs in the 16S series, and that occurs without discrimination from prokaryotic or eukaryotic cells (universal composition or probe complementary thereto), except detection of bacterial cells (specific probe for eubacteria), detection or localization of DNA or DNA fragments carrying the genes encoding the bacterial 16S RNA 'ene (specific probe for eubacteria or probe complementary thereto). The use of one or more probes according to the invention cannot be limited to a particular hybridization technique.

Dersom celler som skriver seg fra levende organismer (eller som i seg selv er levende organismer) skal detekteres, må RNA'ene og/eller DNA'en i disse cellene gjøres tilgjengelige (ved delvis eller total lysering av cellene ved bruk av kjemiske eller fysikalske metoder (og bringes i kontakt med en eller flere av probene ifølge oppfinnelsen, idet proben(e) i seg selv gjøres detekterbare. Denne kontakt kan finne sted på en egnet bærer slik som et nitrocellulose-, cellulose-(modifisert eller umodifisert) eller nylonfilter (bare for å nevne de vanlige bærerne) eller på et histologisk snitt eller celleutstryk eller, uten en bærer, i væskemedium. Denne kontakt finner sted under optimale eller restriktive betingelser (dvs. betingelser som tillater dannelse av hybrider bare dersom sekvensene er fullstendig homologe over en molekyllengde som øker i størrelse ettersom betingelsene blir mer "restriktive" (for temperatur og ionisk konsentrasjon, med eller uten stoffer som senker den optimale temperatur for paring av nukleinsyrer (formamid, dimetylsulfoksyd, urea), og med eller uten stoffer som tydeligvis reduserer reaksjonsvolumet (dek-stran, dekstransulfat). If cells derived from living organisms (or which are themselves living organisms) are to be detected, the RNAs and/or DNA in these cells must be made accessible (by partial or total lysis of the cells using chemical or physical methods (and brought into contact with one or more of the probes according to the invention, the probe(s) themselves being made detectable. This contact can take place on a suitable support such as a nitrocellulose, cellulose (modified or unmodified) or nylon filter (just to mention the usual carriers) or on a histological section or cell smear or, without a carrier, in liquid medium.This contact takes place under optimal or restrictive conditions (ie, conditions that allow the formation of hybrids only if the sequences are completely homologous over a molecular length that increases in size as the conditions become more "restrictive" (for temperature and ionic concentration, with or without substances that lower the optimal temperature ature for the pairing of nucleic acids (formamide, dimethyl sulphoxide, urea), and with or without substances that clearly reduce the reaction volume (dextran, dextran sulphate).

Fjerningen av ureagerte molekyler eller molekylfragmenter av proben på en bærer kan utføres ved vasking med en buffer-oppløsning av egnet ionestyrke og ved en egnet temperatur, med eller uten behandling med Sl-nuklease eller et annet enzym som nedbryter enkeltkjedet DNA eller enkeltkjedet RNA, mén ikke nedbryter DNA/RNA-hybrider eller dobbeltkjedet RNA. I væskemedium kan molekylene (eller fragmenter) av proben som har blitt paret med RNA- eller DNA-fragmenter separeres fra dem som ikke har reagert ved kromatografi på hydroksyapatitt eller, etter behandling med Sl-nuklease, ved hjelp av alle metoder for separering av dobbeltkjedede fragmenter fra frie nukleotider (kromatografi på hydroksyapatitt eller på DEAE-cellulose, eller ved eksklusjonskromatografi; selektiv ut-felling; dialyse; bare for å nevne de mest vanlige metoder. The removal of unreacted molecules or molecular fragments of the probe on a support can be carried out by washing with a buffer solution of suitable ionic strength and at a suitable temperature, with or without treatment with Sl-nuclease or another enzyme that degrades single-stranded DNA or single-stranded RNA, but does not degrade DNA/RNA hybrids or double-stranded RNA. In liquid medium, the molecules (or fragments) of the probe that have paired with RNA or DNA fragments can be separated from those that have not reacted by chromatography on hydroxyapatite or, after treatment with S1 nuclease, by any method for the separation of double-stranded fragments from free nucleotides (chromatography on hydroxyapatite or on DEAE cellulose, or by exclusion chromatography; selective precipitation; dialysis; just to mention the most common methods.

Molekylene (eller fagmentene) av den benyttede sammensetning detekteres deretter ved hjelp av den mest fordelaktige metode, avhengig av typen av valgt merking. The molecules (or fragments) of the composition used are then detected using the most advantageous method, depending on the type of labeling chosen.

De tekniske detaljene som er beskrevet i forskjellige publi-kasjoner (Maniatis et al., 1982, "Molecular cloning, A laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory; Grimont et al., 1985, J. Clin. Microbiol., Vol. 21, nr. 3, S.431-437) eller patenter, franske: 84/12250, 78/10975, 81/24631; euro-peiske: 0133288, 0063879) kan fordelaktig benyttes for foreliggende sammensetninger. The technical details described in various publications (Maniatis et al., 1982, "Molecular cloning, A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory; Grimont et al., 1985, J. Clin. Microbiol., Vol. 21 , No. 3, P.431-437) or patents, French: 84/12250, 78/10975, 81/24631; European: 0133288, 0063879) can advantageously be used for the present compositions.

Dersom kromosomale DNA-fragmenter som bærer genene som koder for 16S RNA'ene (eller tilsvarende RNA'er) skal lokaliseres etter behandling av DNA'en med ett eller flere restriksjons-enzymer, separering av fragmentene ved elektroforese eller kromatografi, og denaturering av DNA-fragmentene, dvs. separering av de to kjedene, blir en av probene ifølge oppfinnelsen bragt i kontakt med DNA-fragmentene under betingelser som begunstiger hybridisering og, etter den tid som skal til for fullføring av hybridiseringen, vil de uhybridiserte fragmentene i sammensetningen bli separert fra de hybridiserte fragmentene og merkingen visualiseres som angitt for detektering av cellene. If chromosomal DNA fragments carrying the genes that code for the 16S RNAs (or equivalent RNAs) are to be located after treatment of the DNA with one or more restriction enzymes, separation of the fragments by electrophoresis or chromatography, and denaturation of the DNA -fragments, i.e. separation of the two chains, one of the probes according to the invention is brought into contact with the DNA fragments under conditions that favor hybridization and, after the time required for completion of the hybridization, the unhybridized fragments in the composition will be separated from the hybridized fragments and the labeling is visualized as indicated for detection of the cells.

De tekniske detaljene som er beskrevet i EP-patent 0120658 (John A. Webster, Jr.) eller i arbeidet til Maniatis et al., eller i publikasjonen til Grimont et al. (angitt ovenfor) kan benyttes med en hvilken som helst av probene ifølge oppfinnelsen. Det skal bemerkes at for lokalisering av kromosomale DNA-fragmenter som bærer genene som koder for 16S RNA'ene, ville en av probene ifølge oppfinnelsen og en probe som er nøyaktig komplementær til denne, gi nøyaktig de samme resultatene. The technical details described in EP Patent 0120658 (John A. Webster, Jr.) or in the work of Maniatis et al., or in the publication of Grimont et al. (given above) can be used with any of the probes according to the invention. It should be noted that for the localization of chromosomal DNA fragments carrying the genes encoding the 16S RNAs, one of the probes according to the invention and a probe exactly complementary thereto would give exactly the same results.

Generelt kan de forskjellige probene ifølge oppfinnelsen også inneholdes i rekombinante DNA'er som gjør det mulig å klone dem, forsåvidt som tilstedeværelsen av en heterolog DNA ikke ville svekke spesifisiteten til probene i de tenkte an-vendelsene . In general, the various probes according to the invention can also be contained in recombinant DNAs which make it possible to clone them, provided that the presence of a heterologous DNA would not weaken the specificity of the probes in the intended applications.

Sluttlig skal det forstås at probene i hvilke thymidin-gruppene er erstattet med uracilgrupper (disse prober må således anses som strengt ekvivalente til probene som er mer spesielt definert) også utgjør en del av oppfinnelsen, selv om deres syntese er vanskeligere å oppnå. Finally, it should be understood that the probes in which the thymidine groups are replaced by uracil groups (these probes must thus be considered strictly equivalent to the probes which are more specifically defined) also form part of the invention, even if their synthesis is more difficult to achieve.

Claims

1. Probe for detecting the presence of bacteria in a sample or for localization among DNA fragments separated by electrophoresis or chromatography, of those carrying the genes encoding the 16S RNAs in bacteria, characterized in that it consists either of a pentadecadeoxyribonucleotide of sequence where (5') and (3') indicate the 5' and 3' ends of the polymer, and where the letters indicate the following residues (nucleotides): A, adenyl residue; C, cytidyl residue; T, thymodyl residue; and G, guanidyl residue; or of a pentadecadeoxyribonucleotide having the complementary sequence:

2. Probe for detecting the presence of bacteria in a sample or for localization among DNA fragments separated by electrophoresis or chromatography, of those carrying the genes encoding the 16S RNAs in bacteria, characterized in that it consists of a sequence: or of the corresponding complementary sequence.

3. Probe for detecting the presence of bacteria in a sample or for locating among DNA fragments, separated by electrophoresis or chromatography, of those carrying the genes encoding the 16S RNAs in bacteria, characterized in that it consists of a sequence selected from the following group of sequences: or from the corresponding complementary sequences.

4. Probe for detecting the cells of eukaryotic or prokaryotic organisms (including bacteria) in a sample or for locating among DNA fragments separated by electrophoresis or chromatography, those carrying the genes encoding the RNAs of the 16S series in these cells, characterized by that it consists either of a pentadecadeoxyribonucleotide with sequence: where (5') and (3') indicate the 5' and 3' ends of the polymer and where the letters indicate the following residues (nucleotides): A, adenyl residue; C, cytidyl residue; T, thymidyl residue; and G, guanidyl residue; or a pentadecadeoxyribonucleotide having the complementary sequence:

5 . Probe for detecting the presence of archaea bacteria in a sample or for localization among DNA fragments separated by electrophoresis or chromatography, of those carrying the genes encoding the 16S RNAs in archaea bacteria, characterized in that it consists of a sequence of at least 8 nucleotides which is contained in the following sequence: and at most the 18 nucleotides in the sequence, where R' is T or C, or of a sequence that is complementary to the above.

6. Use of a probe according to any one of claims 1,

2 and 3, where the probe is brought into contact with bacterial nucleic acids that have been made available and single-stranded, and the hybrids formed are detected, for the detection of the bacteria in a sample.

7. Use of a probe according to claim 4, where the probe is brought into contact with nucleic acids of eukaryotic or prokaryotic organism cells (including bacterial cells) that have been made available and single-stranded, and hybrids formed are detected, for the detection of such cells in a sample.

8. Use of a probe according to claim 5, where the probe is brought into contact with the nucleic acids of archaea bacteria that have been made available and single-stranded, and the hybrids formed are detected, for the detection of archaea bacteria in a sample.

9. Use of a probe according to any one of claims 1-5, wherein the probe is brought into contact with DNA fragments separated by electrophoresis or chromatography, and hybrids formed are detected, for the localization of such DNA fragments carrying genes encoding the RNAs in the 16 S series.