NO174225B - Fremgangsm}te for } tilveiebringe en flerdelt hvit blodcellepopulasjonsdifferensiering samt fremgangsm}te for } bestemme i det minste en hvit blodcellepopulasjon eller populasjonsundergruppe - Google Patents

Abstract

Fremgangsmåte og anordning for automatisk og hurtig å gjenvinne, telle og/eller analysere i det minste en valgt hvit blodcellepopulasjon og/eller delsett derav til en blodprøve (60) eller deler derav. Et volum med et biologisk medium inneholdende hvite blodceller prepareres og i det minste en reaktant (66, 74, 144, 132) spesifikk eller fortrinnsvis i forhold til 1 det minste noen valgte biologiske celler innfares dertil og blandes hurtig i en kortere tidsperiode. Ugjennomskinneligheten og/eller volumparameteren til cellene kan modifiseres og blandingen blir så talt og analysert i en eller flere trinn for å tilveiebringe ønsket hvit blodcellepopulasjonsanalyse. Den biologiske prøven kan være en hel blodprøve og reaktanten kan innbefatte eller være en lysering (66) eller et monoklonalt anti legeme bundet til mikroskoperingen (132, 144), som vil bindes til spesifikt en av cellene eller en kombinasjon av lysering og mkroskopering med antilegeme bundet dertil. Mikroskoperingene kan være magnetiske og bundne celler kan være magnetisk fjernet for gjenvinning og analysering av den øvrige blodcellepopulasjonen.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåte for å tilveiebringe en flerdelt hvit blodcellepopulasjonsdiffe-rensiering av den art som angitt i innledningen til krav 1 samt en fremgangsmåte for å bestemme i det minste en hvit blodcellepopulasjon eller populasjonsundergruppe av den art som angitt i innledningen til krav 4.

Automatisering av rutinen for fullstendig blodcelle (CBC) analyse av menneskelig perifert blod ved en automatisk blodcelleteller er blitt tilveiebrakt av "COULTER COUNTER<®>" til Coulter Electronics, Inc. i Hialeah, Florida. Det elektroniske partielle avfølingssystemprinsippet til dette instrumentet er beskrevet i US-patent nr. 2.656.508. Bruk av optiske avfølingsinnretninger eller laser, som kan være vanskelig og dyrt, er unngått ved hjelp av partikkelanalyse-ringsinstrumenteringen, som brukes alene ved dette Coulter elektroniske avfølingsprinsippet.

Coulter-avfølingsprinsippet ble utviklet og utviklet til ennå mer raffinert instrumentering slik som "COULTER COUNTER<® >Model S" instrumenttype som muliggjør CBC-parametere, absolutt celletelleverdier, blodplatetelling og morfologi, røde blodceller (RBC) morfologi, tolking av normale og unormale blodprøver ved bestemte datamaskinprogrammer.

Coulters elektroniske partikkelavfølingsprinsipp anvender en apparaturavfølingskrets som anvender en likestrømsapparatur-forsyning. Slike partikkelsensorer er enkle i konstruksjon, ekstremt solide og pålitelige som har vist seg ved den generelt aksepterte holdningen til COULTER COUNTER<®> automatiske analysator ved kliniske laboratorier i USA og ellers i resten av verden. En forbedring av denne basisapertur-avfølingskretsen er beskrevet i US-patent nr. 3.502.974. I tillegg til standard likestrømsapparaturforsyningen ble en høyfrekvent apparaturstrøm tilført som muliggjør avføling av en ytterligere parameter for klassifikasjonsformål. Den høyfrekvente apparaturstrømmen frembrakte et signal som er en funksjon av blodcellens interne ledeevne så vel som dets volum. Det frembrakte signalet tilveiebrakt samtidig av likestrømsapparaturkretsen er et konvensjonelt likestrøms-amplitudesignal som gir en primærindikasjon av cellevolumet. Radiofrekvensamplituden deles av likestrømspulsamplituden som anvender en høyhastighetsdelerkrets for å tilveiebringe en kvotient som er en funksjon av cellevolumet og den interne motstanden, vanligvis henvist til som en "ugjennomskinnelighet". Prinsippet er ytterligere beskrevet i US-patent nr. 3.5 02.973. Denne parameteren kan også anvendes ved celleklassifikasjonssystemer. Enten en enkel eller et par med separate aperaturer kunne bli anvendt for dette formålet.

Klassifiseringen av forskjellige populasjoner blir tilveiebrakt ved innsamling av data for signalparene når de frembringes, den ene som et mål på partikkelvolumet og den andre som mål på den indre celleresistiviteten eller gjennomskinneligheten. En vanlig form for å presentere denne dataen er ved hjelp av to-dimensjonale kurver henvist til som spredningskurver eller spredningsdiagrammer. Slike kurver er beskrevet i "Flow Cytometry and Sorting" side 371, av "Melamed Melaney and Medelsohn" i 1979, av "John Wiley & Sons, NY, NY".

Fig. 5A på tegningene viser et eksempel på en datakurve til en prøve med normalt blod. Hvert punkt utgjør en individuell celle. Høyden over basislinjen representerer det relative volumet til cellen. Avstanden til punktet til høyre for den vertikale basislinjen representerer den relative ugjennomskinneligheten. En kurve over normale hvite blodceller (WBC) (med de røde blodcellene fjernet) viser tre grupper med punkter, som representerer tre klare populasjoner som er en konsekvens av deres indre forskjeller i størrelse og interne sammensetning. Om ønskelig kan disse populasjonene med egnet krets bli talt for å tilveiebringe antallet for hver av dem. Cellene klassifiseres på basis av deres iboende forskjeller.

Den første anvendelsen av Coulters elektroniske partik-kelavfølingsprinsipp var å utføre røde blodcelletellinger og så den mer kompliserte bestemmelsen av andre røde blodcelle-parametere. Ved å fjerne røde blodceller fra hele det perifere blodet kunne analysen av hvite blodcellepopulasjoner bli foretatt så lenge som den røde blodcellefjerningen ikke i betydelig grad svekker egenskapene til de øvrige hvite blodcellepopulasjonene som ønskes målt. Røde blodcelle-analyseringsreagenter ble utviklet for dette formål som selv om nyttig og anvendt i stor utstrekning ikke var helt tilfredsstillende i alle deres henseende for påfølgende hvite blodcellebestemmelser.

Tidligere metoder for strømningsanalysering av leukocytter ved å anvende likestrømsvolumet alene eller lysbredt ved forskjellige vinkler har vist tre grupper med leukocytter som korresponderer med lymfocytter, monocytter og granulocytter som innbefatter de nøytrofile, basofile og eosinofile populasjoner. En grov, men nyttig vurdering av eosinofil konsentrasjon kan bli gjort på noen prøver. Den femte hovedpopulasjonen er relativt for liten for denne metoden. Eosinofiler har også blitt observert som en klar gruppe ved å anvende spesielle fluoressensteknikker.

Disse fluoressensteknikkene ble anvendt ved strømnings-cyttometriinstrumenter slik som "EPICS-strømningscyttometer" tilgjengelig fra Coulter Corporation. Slike instrumenter anvender prinsippet med cellebevegelse i en kolonnestrøm begrenset av en omhyllingsstrøm, slik at cellene linjes opp i en fil og passerer enkeltvis gjennom en laserstråle. Lyssprednings- og/eller fluoressenssignaler fra cellene ble så anvendt ved klassifisering av cellepopulasjonene. Flekkede celler med absorptive eller fluoreserende farver gjorde ytterligere cellepopulasjonsklassifisering mulig. Utviklingen av instrumentering og fluorkroms fra automatisk multi-parameteranalyse er videre beskrevet av R.C. Leif, et al. i "Clinical chemistry", Vol. 23, side 1492-98 (1977). Disse oppdagelsene utvidet antallet samtidige populasjons-klassifikasjoner av leukocytter til fire, nemlig lymfocytter, monocytter, eosinofiler og "granulocytter" (neutrofiler og basof iler).

Et nyere analyttisk hematologyinstrument har anvendt lysspredningsteknikk sammen med peroksidasenzymflekking (absorptiv farving) av celler for å frembringe et femdelt leukocyttdifferensial. Farver i kombinasjon med bestemte reagerende biologiske molekyler, slik som monoklonale antilegemer, har dessuten øket antall mulige leukocytt-klassifikasjoner til å innbefatte funksjonell neddeling.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således en fremgangsmåte av den innledningsvis nevnte art hvis karakteristiske trekk fremgår av krav 1 samt en fremgangsmåte som angitt i innledningen til krav 4 og hvis karakteristiske trekk fremgår av dette kravet. Ytterligere trekk ved ovenfornevnte fremgangsmåte fremgår av de uselvstendige kravene.

Selektiv festing av mikroskopiske partikler gjør det mulig å modifisere parameteren hhv. parametrene som er ansvarlig for de opprinnelige lokaliseringene av i det minste en av populasjonene. Det massive tillegget av mikroskopiske partikler til valgte målpopulasjoner hvor dette dessuten påvirker det målte volumet og/eller ugjennomskinneligheten resulterer i forskyvning av lokaliseringen til punktene som representerer populasjonen.

Antilegemer med kjente spesifisiteter anvendes ved belegging av mikroskopiske partikler. Denne beleggingen gir partiklene evne til å kunne selektivt feste til visse celler som uttrykker antigenet som er spesifikk for antilegemet. De belagte eller merkede cellene er en kombinasjon av partikler og celler som oppfører seg som en ny enhet. Deres parametere for ugjennomskinnelighet, volum eller både ugjennomskinnelighet og volum kan bli "betraktet og representere summen av virkninger på både cellen og partiklene på de tilveiebrakte signalene. Dersom karakteristikkene for komponentene er forskjellige, vil den nye enheten bevege seg til en ny posisjon i samsvar med nettoeffekten. Det nye stedet, i motsetning til den tidligere posisjonen til cellen alene, skulle tillate en klassifikasjon av en slik ny enhet med grupper av nye enheter. Dersom partiklene festet til cellene er magnetiske, så vil naturligvis i samsvar med løpende praksis de nye enhetene bli fanget opp ved bruk av en magnet. Dersom hurtig blandet, innbefatter uventede resultater fullstendig oppfanging av en populasjon uten ugunstig påvirkning av egenskapene til cellene som studeres.

Kun tre klare populasjoner med celler kan bli lett identifisert og talt fra en blodprøve ved å anvende deres iboende og bestemte egenskaper til likestrømsvolumet og ugjennomskin-nelighetsparametrene som tidligere nevnt. Ytterligere trinns, slik som forbedrede analyseringssystemer ("lysing")-systemer må bli foretatt for å kunne klargjøre detekteringen og tellingen av flere populasjoner. Disse ytterligere populasjonene utgjør naturligvis delpopulasjoner til de tre hovedpopulasjonene henvist til som lymfocytter, monocytter og granulocytter. De utvalgte trinnene i samsvar med oppfinnelsen vil vise hvorledes delpopulasjoner til disse tre basispopulasjonene tilveiebringes.

Ved anvendelse av slike enkle apparaturavfølingsteknikker i kombinasjon med to eller flere biologiske partikler, kan man frembringe en bestemt og ny posisjon for punktgruppen som representerer en gitt populasjon. Denne selektive bevegelsen av populasjonen på punktkurven eller spredningsdiagrammet kan reproduseres og bli anvendt for å klassifisere populasjon separat fra de tre basispopulasjonene.

Den opprinnelige og iboende kombinasjonen av likestrøms-volumet og ugjennomskinnelighetsavfølingsteknikken kan bli modifisert ved å feste mikroskopiske partikler til valgte individuelle celler. Denne selektiviteten er gitt partiklene ved arten eller spesifisiteten til de biologiske molekylene, antilegemene blant andre, anvendt som belegg på deres overflate. En populasjon av kun celler, som ikke har noen partikler på deres overflate, kan oppta punktkurveposisjonen ikke forskjellig fra andre populasjoner eller delpopulasjoner og derfor ikke bli adskilt fra en annen. De ytterligere partiklene med en selektiv tiltrekning til en bestemt populasjon med celler som man forsøker å identifisere, telle og studere er mulig ved å anvende denne metoden. Det selektive tillegget av tilstrekkelig masse med selektive partikler til en bestemt populasjon som er av interesse, resulterer i forskyvning av den populasjonens punkt-kurvelokalisering som et resultat av den nye og bestemte kombinasjonen av masse, volum og ugjennomskinnelighet.

Separering av bestemte cellepopulasjoner blir tilveiebrakt uten materiell påvirkning av egenskapene til de øvrige cellepopulasjonene. Fjerningen av erytrocytter eller røde blodceller (RBCer) fra hele blodet i samsvar med oppfinnelsen tillater f.eks. måling av T4 og/eller T8 lymfocytter som ellers ikke var mulig med for dette tilgjengelig kjemiske RBC analyseringsreagenter. Forholdet mellom antall T4 i forhold til T8 celler har blitt angitt for å angi immunmanglene med flere virusinfeksjoner innbefattende AIDS-virus blant annet. Tilstedeværelsen av bestemte reseptorer på overflaten til cellene kan bli anvendt for å klassifisere populasjonen til delsett, hvis telling tillater detektering av begynnelsen på en sykdom. Ved fremherskende former for leukemi er der f.eks. en skarp stigning i perifere blodlymfocytter. Dersom subpopulasjonen til lymfocyttene, som er en hurtig forleve-ring for bærere til Til reseptoren, er risikoen at pasienten har immune uregelmessigheter. Dersom delpopulasjonen til Til positive lymfocytter er bærere av T4 reseptoren, så er pasienten klassifisert som den vanlig i Japan. Dersom T4 reseptordelpopulasjonene ekspanderer er 2E4 positiv, så vil ikke pasienten bare vise en tendens til flere infeksjoner, men akutt leukemi så vel som for Til, T4, 2H4 positiv celle er innfører av undertrykning og funksjonell sperring av pasientens evne til å lage antilegemer. Pasienten er således utsatt for en f lerinfeksjon og må bli behandlet for både leukemier og immunmangler, jfr. K. Takatsuki, et al., "GÅNN monograph on Cancer Research 28:13-22, 1982; C. Morimoto, et al., Coulter Japan Symposium, 1984; C. Morimoto, et al., Immunology 134 (3):1508-1515, 1985; C. Morimoto, et al., New England Journal of Medicine 316(2): 67-71, 1987." Oppfinnelsen angår også analyse av formede legemssuspensjoner slik som bakterie og virus blant annet.

Foreliggende oppfinnelse frembringer en allsidig fremgangsmåte for å anvende samme som kombinerer elektroniske partikkelavfølingsteknologi og spesifisitet til selektive biologiske molekyler for å tilveiebringe et fremskritt innenfor området med automatisk analysatorer for klinisk laboratoriebruk og for industriell anvendelse. Detektering av flere leukocyttpopulasjoner og deres forhold til hverandre ved et menneskelig perfert blod er viktig ved medisinsk undersøkelse og diagnose av menneskelige sykdommer. Slik data er nyttig som et screeningsverktøy for å identifisere og klassifisere sykdommer, slik som leukemi. Abnormale situa-sjoner identifisert av anvendelse av oppfinnelsen gir relevant diagnoseinformasjon innenfor undersøkelsesområder som ikke er begrenset kun til detektering av leukocyttpopulasjoner som det vil fremgå av beskrivelsen og tegningene .

Ett av de mest verdifulle trekkene ved oppfinnelsen er anvendelsen av en enkel røff "Coulter"-operasjon. Den er stabil og krever ikke komplekse og dyre optiske systemer. Den nødvendige kretsen for ytterligere RF-generator og detektor er billig, kompakt og pålitelig. En enkel apparatur er alt som er nødvendig, men en ytterligere eller andre eller også tredje apparatur kan muliggjøre en større prøvegjennom-gangshastighet på en billig måte.

I det påfølgende skal foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen bli beskrevet nærmere ved hjelp av eksempel med henvisning til medfølgende tegninger, hvor: Fig. 1 viser et skjematisk blokkdiagram av en cellepopula-sjonsanalysator-utførelsesform. Fig. 2 viser et skjematisk blokkdiagram av en andre

analysatorutførelsesform.

Fig. 3 viser en spesifikk analysatorutførelsesform til-svarende fig. 1 og 2. Fig. 4 viser et skjematisk blokkdiagram av en annen

analysatorutførelsesform.

Fig. 5A og 5B viser spredningsdiagram av et sett med resultater som anvender et prototypeanalysatorsystem lignende det vist med hensyn til fig. 2 og 3. Fig. 6 viser et skjematisk blokkdiagram av en ytterligere

analysatorutførelsesform.

Fig. 7 viser et skjematisk blokkdiagram av en ytterligere

analysatorutførelsesform.

Fig. 8A og 8B, 9A og 9B, 10A og 10B og 11A og 11B viser spredningsdiagrammer av et sett med resultater som anvender et prototypeanalysatorsystem lignende det vist på fig. 6 og 7. Fig. 12 viser et skjematisk blokkdiagram av en ytterligere analysatorutførelsesform. Fig. 13 viser et spredningsdiagram av et sett med resultater som anvender et prototypeanalysatorsystem lignende det vist på fig. 12.

Med henvisning til fig. 1 skal en første utførelsesform av en cellepopulasjonsanalyseringsmetode og en anordning for utførelse av fremgangsmetoden bli beskrevet, idet anordningen er generelt betegnet med henvisningstallet 10. Analysatoren 10 innbefatter en biologisk prøve 12 som inneholder i det minste et første sett med levedyktige biologiske celler (ikke vist), slik som i eller fra en blodprøve. Cellene til den biologiske prøven 12 skal bli involvert i en biologisk reaksjon ved en kvantitativ og/eller kvalitativ bestemmelse eller analyse. Prøven 12 kan innbefatte en buffer i hvilken cellene er anbrakt.

Prøven 12 er kombinert via en linje 14 med i det minste ett reaktantmiddel 16 via en linje 18. De røde blodcellene (RBC) bli så fjernet fra blandingen ved hjelp av en funksjonsbeteg-net RBC-fjerningsstasjon 20. RBC'ene kan bli fjernet fra blandingen på forskjellige måter. RBC'ene kan bli lysert ved hjelp av en lysering i reaktanten 16. En slik foretrukket lysering og en avkjøling og herding (quench) som kan bli anvendt her er beskrevet i US-søknad nr. 025303 med tittelen "Method and reagent system for isolation, identification and/or analysis of leukocytes from whole blood samples". Reaktanten 16 kan være eller innbefatte flere magnetiske mikrosfærer med et antilegeme spesifisert til RBC'ene bundet til mikrosfaerene (ikke vist). Ved dette eksemplet er det spesifikke antilegemet med den bestemte røde blodcellen beskrevet i US-søknad nr. 799489 med tittelen "Monoclonal antibody for recovery of leukocytes in human peripheral blood and method of recovery employing said monoclonal antibody". Reaktanten 16 kan også innbefatte en buffer i tillegg til eller i stedet for bufferprøven. Reaktanten 16 kan dessuten være en kombinasjon av fortrinnsvis RBC-analyse og RBC-spesifikke mikrosfærer.

Så snart RBC'ene i det vesentlige er fjernet fra blandingen, blir en del blandingen ført inn i en hvit blodcelle (WBC) analysator 22 via en linje 24. WBC-analysatoren 22 teller i det minste antall WBC'er i blandingen. WBC-analysatoren 22 kan også måle en eller flere volumer eller ugjennomskin-nelighetsparametere til WBC'ene. Resultatet fra analysatoren 22 blir matet til en komparator 26 via en linje 28.

En andre del av RBC-fjernet blanding blir matet til en WBC-delsett subtraheringsstasjon 30 via linjen 32. WBC'ene kan bli subtrahert fra blandingen på forskjellige måter. Mikroskoperinger med et monoklonalt antilegeme spesifikt til ett av WBC-delsettene bundet dertil kan bli tillagt blandingen. Ikke-magnetiske mikroskoperinger kan bli bundet til WBC'ene for å endre eller forskyve resultatugjennomskin-neligheten eller volumsparameterne til cellene. Magnetiske mikroskoperinger kan også bli bundet til WBC'ene som så kan bli fjernet fra blandingen ved hjelp av et magnetisk felt.

Blandingen med WBC-delsettpopulasjonen fjernet eller med en eller flere parametere endret blir så ført til en WBC-delsettanalysator 34 via en linje 36. Analysatoren 34 kan være identisk med analysatoren 22. Resultatene av anlysa-toren 34 blir så matet til komparatoren 26 via en linje 38. Komparatoren 36 kan så sammenligne WBC-resultåtene fra analysatoren 22 med de modifiserte resultatene fra analysatoren 34 for å bestemme i det minste en egenskap til den valgte hvite blodcellepopulasjonen, slik som antall celler innenfor et bestemt område.

Med henvisning til fig. 2 skal den andre utførelsesformen av cellepopulasjons-analyseringsmetoden bli beskrevet, idet det her er vist en anordning som utgjør utførelsesf ormen og som er betegnet med henvisningstallet 40. Analysatoren 40 innbefatter en biologisk prøve 42 som igjen inneholder i det minste et første sett med levedyktige biologiske celler (ikke vist), slik som i eller fra en blodprøve. Cellene til den biologiske prøven 42 skal bli involvert i en biologisk reaksjon ved en kvantitativ og/eller kvalitativ bestemmelse eller analyse. Prøven 42 kan igjen innbefatte en buffer i hvilken cellene blir tilført.

Prøven 42 kombineres via en linje 44 med i det minste en reaktant 46 via en linje 48. I analysatoren 40 blir RBCene fjernet fra blandingen og samtidig blir i det minste en egenskap til i det minste et WBC-delsett endret eller forskjøvet ved hjelp av en funksjonsmessig betegnet RBC-fjernings- og WBC-forskyvningsstasjon 50. Som nevnt ovenfor kan RBCene bli fjernet fra blandingen ved hjelp av stasjonen på forskjellige måter, fortrinnsvis talt med hensyn til stasjonen 20. I samme blandingsdel er samtidig WBC'ene bundet til, generelt ikke-magnetisk, mikrosfærer for å endre eller forskyve resultatugjennomsiktigheten og/eller volum-parameterne til cellene.

Blandingen med de fjernede RBCene og WBC-delsettpopulasjonen forskjøvet blir så matet til analysatoren 52 via en linje 54. Analysatoren 52 kan i det vesentlige være identisk med den til analysatoren 22. Analysatoren 40 gir således en hurtig og direkte analyse av i det minste en egenskap til en valgt WBC-populasjon eller bloddelsett.

En spesifikk utførelsesform av et analyseinstrument formet ifølge oppfinnelsen og som kan utføre metodene til første og andre analysatoren 10 og 40, er betegnet generelt med henvisningstallet 56 på fig. 3.

Ved instrumentet 56, er kun en bestemt telling vist, som kan bli variert i nesten en endeløs detalj i samsvar med prinsippene ifølge oppfinnelsen. Instrumentet 56 er dessuten vist med generelle funksjonelle detaljer og de spesifikke utførelsesformene kan konstruksjonsmessig bli utført på mange forskjellige kjente måter.

Instrumentet 56 innbefatter en aspiratorpumpemekanisme 58 som anvendes ved å trekke ut biologiske prøver av interesse, f.eks. prøvene 12 eller 42 inn i instrumentet 56. Aspiratoren 58 er koplet via en linje 60 med en prøveventil 62, som kan være koplet med en prøvesonde 63. En lyseringspumpe 64 kan innbefatte lyseringsmiddel, slik som en del av reaktanten 18 eller 46 og også være koplet med ventilen 62 via en linje 66. Ventilen 62 og pumpen 58 kan aspirere den biologiske prøven 12 eller 42 sammen med lyseringsmiddelet via pumpen 64 når ønsket.

Eeaktantblandingen eller den biologiske prøven i seg selv blir så matet via en uttømningslinje 68 inn i en blandeanordning 70. Blanderen 70 innbefatter et blandekammer 72 i hvilket prøven eller reaktanten blir matet. Ved dette punktet adskiller seg operasjonen av analysatoren 10 og 40 og vil følgelig bli beskrevet separat.

Ved analysatoren 10, dersom RBCene har blitt lysert av lyseringsvæsken/middelet fra pumpen 64, så blir når reaksjonen er fullført, et middel (quench) eller preparering (fix) tilført fra en stasjon 74 via en linje 76. Reaksjonen er fulgt. Reaksjonen kan bli assistert ved blanding av lyseringsmiddelet og prøven i kammeret 72 som vist funksjonsmessig ved henvisningstallet 78.

Detaljer ved en egnet blandeanordning 70, som kan bli anvendt her, er beskrevet i US-patentsøknad nr. 25337 med tittelen "Method and apparatus for rapid mixing of small volumes for enhancing biological reactions". Ved å anvende blanderen 70 blir reaksjonene øket i stor grad med hensyn til hastighet uten merkbar ødeleggelse av egenskapene som er av interesse for cellene, slik som det forekommer ved økning av reaksjons-temperaturen. Reaksjonene blir generelt fullført på betydelig mindre tid enn ett minutt, generelt i størrelsesorden av femten sekunder eller mindre. Dette tillater en hurtig analyse ved det automatiske høyvolumsanalysatorinstrumentet 56.

Den avkjølte reaktanten med RBCene fjernet ved lysering (da fra stasjonen 20) blir så tilført via en linje 80 til et holdekammer 82, som i dette tilfellet vil holde en andre del av blandingen. En første del av blandingen vil bli tilført fra kammeret 82 via en linje 84 til en WBC-analysator 86 (dvs. analysatoren 22). Analysatoren 86 kan være av mange fysiske typer i samsvar med telling og dimensjoneringsteknikk beskrevet i US-patent nr. 2.656.508.

Analysatoren 86 innbefatter generelt en strømningssensor av et avfølingskammer 88. Kammeret 88 innbefatter en transduser 90 som har en apparatur 92 derigjennom. Kammeret 88 innbefatter en første del 99 som har en første elektrode 96 i kontakt med fluidet deri.

Kammerdelen 94 og elektroden 96 kommuniserer via apparaturen 92 med en andre kammerdel 98 som har en andre elektrode 100.

Elektrodene 96 og 100 er koplet via reaktive ledere 102 og 104 med en RF/DC-kilde (radiofrekvens/likestrømskilde) og avfølingskrets 106. Kretsen 106 kopler både en likestrøm, eller en lavfrekvensstrøm eller signal og et høyfrekvent signal mellom elektrodene 96 og 100.

Lavfrekvenssignalet anvendes for å avføle amplituden til en signalpuls bevirket av en celle som passerer gjennom apparaturen 92. Høyfrekvenssignalet anvendes for å tilveiebringe den elektriske ugjennomskinneligheten til samme cellen som passerer gjennom apparaturen 92.

Målingen av elektrisk ugjennomskinnelighet til celler er beskrevet i US-patent nr. 3.502.974. En spesiell krets som kan bli anvendt her er beskrevet i US-patentsøknad nr. 921654 med tittelen "Particle analyzer for measuring the resistance and reactance of a particle".

Signalene generert av kretsen 106 fra de avfølte cellene er koplet via en 1ikstrømssignalleder 108 og en RF-signalleder 110 til en komparator 112 (lik komparatoren 26). Komparatoren 112 kan holde signalet generert fra den første delen, dvs. de uten WBC-delsettet subtrahert, for en sammenligning med resultatene fra en andre del som skal bli beskrevet.

Analysatoren 86 kan innbefatte en omhyllingsstrøm for å fokusere cellene i sensoren 88 på velkjent måte. Omhyl-lingsstrømmen kan være tilveiebrakt av et fluidsystem 114, koplet til sensoren 88 ved hjelp av et par med linjer 116 og 118 på kjent måte. Prøvereaksjonsblandingen kan bli matet inn til sensoren 88 via et innføringsrør 120 og kan bli matet fra sensoren 88 via et utløpsrør 122 inn i en avfallsbeholder 124 .

Mens den første delen av blandingen ble analysert i analysatoren 86, blir den andre delen fastholdt i kammeret 82, mens blanderen 72 renses eller skylles via en renselinje 126 og tømmes gjennom en avfallsledning 128. Så snart kammeret 72 er rengjort, blir den andre delen ført tilbake inn i kammeret 72 via en linje 130. Som stasjonen 30, blir nå WBC-delsettet subtrahert ved å legge til WBC-mikroskoperinger fra en stasjon 132 via en linje 134, en ventil 136 og en kammerlinje 138.

WBC-mikrosfærene ble blandet med den andre delen ved hjelp av blandemekanismen 78. Dersom WBC-mikrosfærene er ikke-magnetiske, vil reaksjonsblandingen med de bundne WBC-mikrosfærene bli matet via linjen 80, kammeret 82 og linjen 84 til analysatoren 86 (dvs. analysatoren 84), hvor den andre delen ble analysert slik som den første delen og resultatene ble så sammenlignet i komparatoren 112 (dvs. komparatoren 26). I det minste en av WBC-delsettcelleparametrene ble endret i den andre delen, slik som celleugjennomskinnelig-heten av WBC-delsettbundne mikrosfærer for å tilveiebringe endrede resultater som så kan bli analysert.

Dersom WBC-mikrosfærene er magnetiske, så blir WBC-delsettet bundet dertil fjernet av et magnetisk felt i løpet av og/eller etter blandeprosessen ved hjelp av et magnetisk felt eller en magnet 140. Feltet kan være tilveiebrakt ved hjelp av en elektromagnetisk innretning eller ved hjelp av magneten 140 som er fysisk beveget i forhold til kammeret 172 for å fange opp det innfangede magnetisk bundne WBC-delsettet. Den andre delen uten bundet WBC-delsett blir så matet via linjen 80, kammeret 82 og linjen 84 til analysatoren 86 som tidligere beskrevet for å tilveiebringe analysen (som ved analysatoren 34).

Instrumentet 56 blir så preparert for å ta neste prøve for neste analyse. Sonden 63 kan bli renset ved hjelp av en sonderensemekanisme 142 og linjene og kamrene 72 og 82 kan bli spylt på konvensjonell måte. Hver analyse av påfølgende prøveblanding tilveiebringes på en hurtig og automatisk måte. Perioden mellom analysen til påfølgende prøveblandinger kan være i størrelsesorden av minutter eller mindre.

Ved drift av analysatorinstrumentet 56, som analysatoren 40, blir reaksjonsblandingen med RBC-lyseringen/reaktanten 46 og prøven 42 blandet i kammeret 72 sammen med ikke-magnetisk WBC-mikrosfærer fra stasjonen 132, som binder til en av WBC-delsettene. Prepareringen 74 blir tilført den reaktive blandingen som så blir matet via linjen 80, kammeret 82 og linjen 84 til WBC-analysatoren 86 for analyse (dvs. som analysator 52).

Alternativ til anvendelsen av lyseringen i en av analysatorene 10 og 40, kan prøvene 12 eller 42 bli matet til blanderen 70 via ventilen 62 uten noen analyse. I dette tilfellet kan RBCene bli fjernet magnetisk ved å anvende mikrosfærer med RBC-spesifikke antilegemer bundet dertil fra en RBC-mikrosfærestasjon 144 og matet til ventilen 136 via en linje 146 og følgelig til kammeret 70 via linjen 138. Hvor ingen analyse anvendes, blir bundne RBC'er magnetisk fjernet ved hjelp av magneten 140 etter blandingen på en måte i det vesentlige identisk med de magnetisk bundne WBC'ene beskrevet ovenfor.

I et annet tilfelle kan for å fremme hastigheten til reaksjonen, en reaksjonsblanding av prøven med både RBC-lyseringen og med RBC-magnetiske perler bli anvendt. Reaksjonsblandingen ble blandet, lyseringen ble preparert og de bundne RBCene ble magnetisk fjernet og WBCene analyseres som tidligere beskrevet.

Med henvisning til fig. 4 er en annen utførelsesf orm av cellepopulasjons-analysemetoden og anordningen som utfører metoden betegnet med henvisningstallet 148 nærmere beskrevet. Analysatoren 148 innbefatter en biologisk prøve 150 som kan inneholde i det minste et første sett med levedyktige biologiske celler, slik som i eller fra en blodprøve. Prøven 150 kan igjen innbefatte en buffer i hvilken cellene er tillagt.

Prøven 150 er kombinert via en linje 152 med i det minste en reaktant 154 via en linje 156. RBCene fjernes så som ovenfor beskrevet ved hjelp av en funksjonsmessig konstruert RBC-fjernestasjon 158. Reaksjonsblandingen med RBCene fjernet blir matet via en linje 160 inn i en WBC-analysator 162. Resultatene fra analysatoren 162 blir så matet til en komparator 164 via en linje 166, som gir en tredelt WBC-differensiering med resultater for monocytter (M), lymfocytter (L) og granulocytter (G).

Blandingen blir så ført til en neutrofil (N) funksjonsmessig konstruert fjernestasjon 168 via en linje 170. Neutrofilene kan nå bli fjernet fra blandingen ved å forskyve eller endre en parameter, slik som ugjennomskinneligheten, eller ved magnetisk fjerning, som er beskrevet ovenfor. I dette eksemplet er det spesielle neutrofile antilegemet, som er anvendt, beskrevet i US-søknad nr. 938864 med tittelen "Monoclonal antibody specific to neutrophils".

Blandingen med neutrofilene fjernet eller forskjøvet, blir så tilført en annen WBC-analysator 172 via en linje 174. Resultatene til analysatoren 172 blir så tilført komparatoren 164 via en linje 176. Resultatene til analysatoren 172 blir anvendt for å tilveiebringe en firedels WBC-differensiering med resultater igjen for monocytter og lymfocytter, men nå i tillegg siden neutrofiler er forskjøvne eller fjernede resultater fra eosinofiler (E) og basofiler (B) er tilveiebrakt. De to analytiske resultatene fra analysatorene 162 og 172 kan så bli sammenlignet med komparatoren 164 for å danne en femtedels WBC-differensiering. Subtrahering av antall B'er og E'er fra antall G'er resulterer i et antall fjernede N'er.

Med henvisning til fig. 5A og 5B er vist to sett med spredningsdiagrammer som er tilveiebrakt av blodprøver som anvender en prototypeanalyseringsmetode lignende analysatoren 148. Den biologiske prøven 150 var en 20 mikroliter prøve med blod som ble blandet med 40 mikroliter magnetisk mikroskoperinger med RBC-spesifikt antilegeme bundet dertil blandet med 140 mikroliter bufferoppløsning for å danne reaktanten 154. Reaksjonsblandingen ble blandet i 15 sekunder og anbrakt i et magnetisk felt i 10 sekunder i stasjonen 158. Blandingen med fjernede RBC'er ble analysert av analysatoren 162 som vist i spredningsdiagrammet på fig. 5A som gir telleverdier for L'er lik 45,6 (1), M'er lik 5,6 (2) og G'er lik 48,7 (3).

Blandingen blir så kombinert ved stasjonen 168 med 10 mikroliter av magnetiske mikrosfærer med N spesifikke antilegemer bunner dertil. Blandingen blir så blandet i 30 sekunder og så anbrakt i det magnetiske feltet i 10 sekunder. Blandingen med således fjernede N'er ble matet til analysatoren 176 som resulterte i spredningsdiagrammet på fig. 5B som resulterer i telleverdiene for L'er lik 81,0 (1), M'er lik 0,6 (2), E'er lik 11,0 (3) og B'er lik 1,8 (4). Komparatoren 164 frembringer så femtedels WBC-telleforskjellen lik 45,6 L'er, 5,6 M'er, 41,6 N'er, 6,0 E'er og 1,2 B'er. Dette tilsvarer en standard mikroskopi femtedels WBC-differensiell som anvender Wright-flekking på prøven på et objektglass som resulterer i telleverdier på 44,9 L'er, 3,4 M'er, 45,0 N'er, 6,1 E'er og 0,4 B'er.

Fig. 6 viser en ytterligere utførelsesform av en cellepopulasjons-analyseringsmetode og anordning for utførelse av denne metoden og som generelt er betegnet med henvisningstallet 178. Analysatoren 178 innbefatter en biologiske prøve 180.som igjen inneholder minst et første sett med levedyktige biologiske celler og som kan innbefatte en buffer.

Prøven 180 blandes via en linje 182 med en reaktant 184 via en linje 186. Funksjonsmessig vist, blir en første del med blandingen tilført via en linje 188 til en funksjonsmessig betegnet RBC og N f jernestasjon 190. RBCene og N'ene fjernes eller forskyves som beskrevet tidligere og første delen blir matet via en linje 192 til en WBC-analysator 194.

Dette gir et resultat fra analysatoren 194 som er tilført en linje 196 til en komparator 198. Resultatet innbefatter ovenfornevnte firedels differensiering innbefattende M'er, L'er, E'er og B'er.

Samtidig blir en andre del av blandingen til prøven 180 og reaktanten 184 matet via en linje 200 til en funksjonsmessig betegnet RBC-fjernestasjon 202. Blandingen med fjernede RBC'er blir matet via en linje 204 til en annen WBC-analysator 206. Resultatene for analysatoren 206 ble matet til komparatoren 198 via en linje 208. Resultatene for analysatoren 206 innbefatter direkte ovenfornevnte tredels WBC-dif ferensiering innbefattende M'er, L'er og G'er. Resultatet av analysatorene 194 og 206 sammenlignes så med komparatoren 198 for å tilveiebringe femtedels WBC-differensiering.

En bestemt analyseringsinstrumentutførelse som innbefatter fremgangsmåten og anordningen for analysatoren 178 er betegnet med henvisningstallet 210 på fig. 7. Kun en bestemt hardware-telling har blitt vist, men på samme måte som analyseringsinstrumentet 56, kan analyseringsinstrumentet 210 bli anvendt ved et utall sammenstillinger.

Instrumentet 210 innbefatter en aspiratorrensemekanisme 212 som er koplet til en prøvetagningsventil 214 via en linje 216. Ventilen 214 kan innbefatte en prøvesonde 218 for å suge opp biologiske prøver som er av interesse, slik som prøven 180. En fortynningsmiddelleverende pumpe 220 er koplet til ventilen 214 via en linje 222 for å tilveiebringe en fortynning av prøven, slik som en blodprøve, når ønskelig. En første del av blandingen er så koplet via en linje 224 og en linje 226 med en første blandeanordning 228. Samtidig er en andre del av blandingen matet via linjen 224 og en linje 230 til en andre blandeanordning 232.

Blanderen 228 (sammenlignbar med stasjonen 190) er i det vesentlige identisk med blanderen 232 (sammenlignbar med stasjonen 202) og vil bli beskrevet først. Blanderen 228 innbefatter et blandekammer 234 i hvilket den første blandingsdelen er matet. Blanderen 228 innbefatter alle de forskjellige ovenfor beskrevne valgene og kan innbefatte en lyseringsinngangslinje 236 for RBC-lysering om ønskelig. Dersom analysen er anvendt etter blandingen som vist funksjonsmessig med henvisningstallet 238, så blir preparatet tilført via en preparatlinje 240. Endene blir samtidig fjernet ved å tilføre egnet magnetiske eller ikke-magnetiske mikrosfærer med N-spesifikke antilegeme under dertil fra en kilde med mikrosfærer 242 tilført kammeret 234 via en linje 244. Dersom magnetiske mikrosfærer anvendes for endene eller RBCene så blir en magnet 246 eller et magnetisk felt" anvendt for å fjerne de magnetisk bundne cellene.

Blandingen og den preparerte (når nødvendig) blandingen blir så matet via en linje 248 gjennom en ventil 250 og en linje 252 til en WBC-analysator 254 (en analysator 194). Analysatoren 254 er den samme som analysatoren 86 og vil ikke bli beskrevet nærmere igjen. Analysatoren 254 innbefatter igjen et avfølingskammer 256 med en apparatur 258 deri gjennom hvilken blandingen av cellene passerer. Et omhyllingsstrøm-ningsfluidsystem 260 kan være koplet til kammeret 256. Signalene generert av cellene blir detektert av en RF/DC-kilde og avfølingskretsen 262 hvis utgang er tilført en komparator 264 som tidligere beskrevet.

Den andre blandingsdelen blir deretter matet til et blandekammer 266. Ved den andre delen er kun RBC'er fjernet (dvs. lik stasjonen 202 ) og RBCene kan bli fjernet ved at RBC-analysen er matet inn i kammeret 266 via en linje 268. Lyseringen er blandet med prøven og en preparering blir tillagt via en perpareringslinje 270. Alternativt kan RBCene fjernes ved magnetiske mikrosfærer med RBC-spesifikke antilegemer bundet dertil fra en mikrosfaerekilde 232 matet inn i kammeret 266 via en linje 274. Mikrosfærene er faste, funksjonsmessig ved 276, og de magnetisk bundne RBC-mikrosfærene fjernes ved hjelp av en magnet 278.

Den fjernede RBC-blandingen blir så matet via en linje 280 til ventilen 250 og via linjen 252 til analysatoren 254 for å tilveiebringe ovenfornevnte resultater. Blandingene 228 og 232 innbefatter egnede respektive bremselinjer 282 og 284 og avfallslinjer 286 og 288 og en sonderenser 290 for å rense instrumentene 210 før oppsuging av neste prøve eller prøver for analysering.

Fig. 8A og 8B viser spredningsdiagramresultater tilveiebrakt av en blodprøve under anvendelse av en analyseringsmetode lignende den til analysatoren 178. Ved dette eksemplet utgjør 20 mikroliter av blodet prøven 180, mens 40 mikroliter av magnetiske mikrosfærer blandes med RBC-spesifikk antilegemer bundet dertil med 140 mikroliter bufferoppløsning som utgjør reaktanten 184. En del av blandingen blir så blandet i 20 sekunder i stasjonen 202 og så anbrakt i det magnetiske feltet i 10 sekunder. Den RBC-fjernede blandingen analyseres så i analysatoren 206 som resulterer i spredningsdiagrammet på fig. 8A som gir en telleverdi for L'er lik 29,4 (1), M'er lik 8,1 (2) og G'er lik 62,4 (3).

Samtidig blir en annen del av samme blanding kombinert med 10 mikroliter med magnetiske mikrosfærer med N-spesifikke antilegemer bundet dertil for å fjerne RBC'er og N'er ved stasjonen 190. Blandingen blir blandet i 30 sekunder og så anbrakt i et magnetisk felt i 10 sekunder. Blandingen med N'er og RBC'er fjernet blir så analysert og analysatoren 194 som gir spredningsdiagrammer på fig. 8B som gir en telleverdi for L'er lik 73,5 (1), M'er lik 21,7 (2), E'er lik 3,4 (3) og B'er lik 1,4 (4). De to telleverdiene blir sammenlignet i komparatoren 198 som resulterer i en femtedels WBC-differen-sieringstelleverdi for L'er lik 29,4, M'er lik 8,0, N'er lik 60,8, E'er lik 1,2 og B'er lik 0,6. En mikroskopsammenligning ble igjen gjort som resulterte i telleverdier for L'er lik 29,4, M'er lik 5,0, N'er lik 65,0, E'er lik 1,0 og B'er mindre enn 1,0.

Fig. 9A og 9B viser spredningsdiagramresultater til en femtedels V/BC-dif f erensieringseksempel lignende det på fig. 8A og 8B. En 20 mikroliter prøve av blod ble analysert i samme trinnet som beskrevet med henvisning til fig. 8A og 8B og som resulterte i spredningsdiagrammet på fig. 9A som gir en telleverdi på L'er lik 35,4 (1), M'er lik 14,6 (2) og G'er lik 50,0 (3). Spredningsdiagrammet på fig. 9B gir en telleverdi for L'er lik 66,4 (1), M'er lik 25,0 (2), E'er lik

6,6 (3) og B'er lik 2,0 (4). Den resulterende femtedels WBC-differensieringen resulterer i telleverdier lik 35,4 L'er, 14,6 M'er, 45,5 N'er, 3,5 E'er og 1,1 B'er og blir sammenlignet med en mikroskoptelleverdi lik 36 L'er, 11 M'er, 49 N'er, 3 E'er og 1 B.

Fig. 10A og 10B viser spredningsdiagramresultåtene til en femtedels WBC-differensiering igjen lignende den til fig. 8A, 8B og 9A, 9B, men ved dette eksemplet ble lysering anvendt. Ved dette eksemplet ble 20 mikroliter blod kombinert med 80 mikroliter buffer og 240 mikroliter med RBC-foretrukket lysering, som henvist til ovenfor. Blandingen blandes i 6 sekunder og så blir en preparering tilført. En tidsperiode er viktig på grunn av at lyseringen latt ikke-preparert i en tidsperiode større enn omkring 10 sekunder vil begynne å påvirke de viktige egenskapene til WBC'ene. Blandingen med RBCene som er fjernet analyseres for å tilveiebringe spredningsdiagrammene på fig. 10A som resulterer i telleverdier av L'er lik 25,7 (1), M'er lik 9,6 (2) og G'er lik 65,0 (3).

En andre del av blandingen innbefatter en andre 20 mik-roliters prøve med blod kombineres med 120 mikroliter buffer og 10 mikroliter magnetiske mikrosfærer med N-spesifikke antilegemer bundet deri og blandet i 30 sekunder og så anbrakt i et magnetisk felt i 10 sekunder. RBC-fortrinnsvis lysering tillegges så til den N-fjernede blandingen som så blir blandet i 6 sekunder før den blir preparert. Det resulterende spredningsdiagrammet på fig. 10B resulterer i prosentvis telleverdier for L'er lik 74,6 (1), M'er 21,6 (2), E'er lik 2,9 (3) og B'er lik 0,8 (4). Den resulterende femtedels WBC-differensieringen resulterer i prosentvise telleverdier for L'er lik 25,6, M'er lik 9,6, N'er lik 63,5, E'er lik 1,06 og B'er lik 0,3. Igjen resulterte en mikroskopsammenligning i telleverdien for L'er lik 29,4, M'er lik 5,0, N'er lik 65,0, E'er lik 1,0 og B'er mindre enn 1.

Et annet eksempel på spredningsdiagram resulterer i en femtedels WBC-differensiering lik den på fig. 10A og 10B vist på fig. HA og 11B. En prøve på blod hadde to prøver samtidig analysert på samme trinn beskrevet med henvisning til fig. 10A og 10B. Spredningsdiagrammet på fig. 11A gir en telleverdi på L'er lik 31,9 (1), M'er lik 17,6 (2) og G'er lik 50,4 (3). Spredningsdiagrammet på fig. 11B gir en telleverdi av L'er lik 67,1 (1), IVTer lik 24,1 (2), E'er lik (7,6 (3) og B'er lik 1,2 (4). Den resulterende femtedels VJBC-dif f eren-sieringen resulterer i telleverdier på 31,9 L'er, 11,4 M'er, 46,0 N'er, 3,6 E'er og 0,7 B'er da sammenlignet med en mikroskoptelleverdi på 36 L'er, 11 M'er, 49 N'er, 3 E'er og 1

B.

En ytterligere utførelsesform av cellepopulasjonsanalyse-ringsmetoden og en anordning for utførelse av denne metoden er betegnet med henvisningstallet 292 vist på fig. 12. Analysatoren 292 innbefatter en biologisk prøve 294 som igjen innbefatter et første sett med levedyktige biologiske celler og innbefatter en buffer om ønskelig.

Prøven 294 kombineres via en linje 296 med i det minste en reaktant 298 via en linje 300. Ved analysatoren 292 fjernes RBC'er og N'er forskyves sekvensielt for samtidig i en funksjonsmessig betegnet stasjon 302. RBC-fjernefunksjonen er betegnet med 304 og N-bevegelsen eller forskyvningsdelen er betegnet med henvisningstallet 306 for å indikere at funksjonene kan bli utført samtidig og sekvensmessig. RBCene kan bli fjernet magnetisk eller ved lysering eller med en kombinasjon av de to som tidligere beskrevet. N'ene blir fjernet eller forskjøvet ved å tillegge mikrosfærer med et spesifikt antilegeme bundet dertil til blandingen.

Så snart RBCen er fjernet og N'ene er beveget eller forskjøvet, blir den resulterende blandingen tilført en linje 308 til en analysator 310. N'ene blir i dette tilfellet forskjøvet tilstrekkelig fra mønsteret til E'ene og B'ene, slik at en femtedels WBC-differensiering av M'ene, L'ene, E'ene, B'ene og N'ene blir direkte tilveiebrakt. Funksjonene til analysatoren 292 kan bli utført enten av instrumentene 56 og 210 eller varianter derav.

Spredningsdiagrammet som resulterer av et eksempel på en direkte femtedels V/BC-dif f erensiering i samsvar med analysatoren 292 er vist på fig. 13. I dette eksemplet er den biologiske prøven 294 20 mikroliter med blod og reaktanten 298 er 10 mikroliter med ikke-magnetiske mikrosfærer med N-spesifikke antilegemer bunder dertil kombinert med 100 mikroliter buffer og blandet i delstasjonen 306 i 30 sekunder. RBC-fortrinnslyseringsmiddel, 240 mikroliter derav, blir så tillagt blandingen som er blandet i delstasjonen 304 i 6 sekunder etter at prepareringen er tillagt. RBC-fjernet og N-forskjøvet blanding blir så analysert av analysatoren 310 som resulterer i spredningsdiagrammet på fig. 13 som gir en direkte telleverdi for 29,6 L'er, 13,6 M'er, 52,2 N'er, 3,4 E'er og 1,06 B'er da sammenlignet med en mikroskop-bestemmelse av 35 L'er, 5 M'er, 56 N'er, 4 E'er og ingen B'er. Ved dette spesielle eksemplet ble blodprøven også analysert på et generelt celletellingsinstrument fra Coulter Electronics, Inc., som resulterte i 29 L'er, 11,1 M'er og 59,9 G'er (N'er, E'er og B'er).

Mange modifikasjonér og variasjoner av foreliggende oppfinnelse er mulig i lys av ovenfornevnte teknikk. Prøvene 12, 42, 150, 180 og 294 kan innbefatte fullblod, menneske-legemets fluider inneholdende celler, eller andre fluider som inneholder formede legemer, slik som bakterie, viruser og sopp. Volumet av mikrosfærene er gitt i vekt av mikrosfærer pr. volum med oppløsning. Det skal derfor bemerkes at det vil være mulig med modifikasjoner innenfor rammen av oppfinnelsen slik som angitt i kravene.

Claims (8)

1. Fremgangsmåte for å tilveiebringe en flerdelt hvit blod-cellepopulasjonsdifferensiering, hvilken differensiering ikke kan tilveiebringes på annen måte, fra en fullblodsprøve med i det minste en rød blodcellepopulasjon og hvite blodcellepopulasjoner deri for identifisering og/eller telling og/eller studium, innbefattende fjerning av den røde blodcellepopulasjonen fra prøven uten ugunstig å påvirke relevante kvaliteter og/eller kvantiteter av nevnte hvite blodcellepopulasjoner, karakterisert ved elektronisk avføling og telling av i det minste nevnte hvite blodcellepopulasjoner av granulocyter, monocyter og lymfocyter, for å gi en totaltelling av populasjoner med hvite blodceller, fjerning eller skifting av det nøytrofile populasjonsbidraget fra nevnte hvite blodcellepopulasjoner ved tilveiebringelse av mikrosfærer som har et nøytrofilt spesifikt monoklonalt antistoff bundet til seg og blanding av nevnte mikrosfærer med prøven for å binde den nevnte nøytrofile populasjonen og derved tilveiebringe elektronisk avføling av eosinofiler og basofiler, elektronisk avføling og telling av i det minste de øvrige hvite blodcellepopulasjonene av monocyter, lymfocyte, eosinofiler og basofiler, og sammenligning av nevnte telleverdier for å tilveiebringe en telleverdi for nevnte hvite blodcellepopulasjon med nøytrofiler og dermed tilveiebringelse av i det minste en femdelt, hvit blodcelledifferensiering.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved elektronisk avføling og telling av i det minste nevnte hvite blodcellepopulasjoner av granulocyter, monocyter og lymfocyter i en første del av nevnte prøve for å gi en totaltelling av populasjonene av hvite blodceller, fjerning av det nøytrofile populasjonsbidraget fra nevnte hvite blodcellepopulasjon uten å ugunstig påvirke relevante kvaliteter og/eller kvantiteter av nevnte hvite blodcellepopulasjoner ved å tilveiebringe mikrosfærer som har et nøytrofUspesifikt monoklonalt antistoff bundet til seg, og blanding av nevnte mikrosfærer med nevnte prøve til binding av nevnte nøytrofilpopulasjon og derved tilveiebringe elektronisk avføling av eosinofiler og basofiler, elektronisk avføling og telling av i det minste nevnte øvrige hvite blodcellepopulasjoner av monocyter, lymfocyter, eosinofiler og basofiler fra en andre del av nevnte prøve, og sammenligning av nevnte telleverdier fra nevnte første og andre deler til utledning av en telleverdi for nevnte hvite blodcellepopulasjon av nøytrofiler og derved tilveiebringe i det minste et femdelt, hvitt blodcelle-differensial.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved skifting av det nøytrofile populasjonskarakteris-tiske, elektroniske avfølingsbidrag i forhold til de andre hvite blodcellepopulasjonene ved tilveiebringelse av mikrosfærer som har et nøytrofUspesifikt monoklonalt antistoff bundet til seg, og blanding av nevnte mikrosfærer med nevnte prøve for binding av nevnte nøytrofile populasjon til skifting av i det minste et elektronisk karakteristikum hos nevnte nøytrofile populasjon og derved tilveiebringelse av elektronisk avføling av eosinofiler og basofiler, og elektronisk avføling og telling av i det minste nevnte hvite blodcellepopulasjoner av monocyter, lymfocyter, nøytrofiler, eosinofiler og basofiler og derved tilveiebringelse av i det minste femdelt, hvit blodcelledifferensiering.

4 . Fremgangsmåte for å bestemme i det minste en hvit blodcellepopulasjon eller populasjonsundergruppe, hvilket ikke kan bestemmes på annen måte, i en fullblodprøve eller en del derav for identifisering og/eller telling og/eller studium, karakterisert ved fjerning av eller skifting av det karakteristiske elektroniske avfølingsbidraget fra i det minste en hvit blodcellepopulasjon eller populasjonsundergruppe i forhold til andre hvite blodcellepopulasjoner eller undergruppepopulasjoner, ved at til i det minste en av nevnte hvite blodcellepopulasjoner eller undergrupper derav bindes mikrosfærer, som har en for i det minste en av nevnte hvite blodcellepopulasjoner eller undergrupper derav spesifikt monoklonalt antistoff bundet til seg, og elektronisk avføling og analyse eller direkte telling av i det minste nevnte fjernede eller skiftede populasjon for tilveiebringelse av bidraget fra nevnte fjernede eller skiftede populasjon til nevnte prøve.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4 for å tilveiebringe en analyse av hvite blodcellepopulasjoner, hvilken analyse ikke kan tilveiebringes på annen måte, av en fullblodsprøve med i det minste en rød blodcellepopulasjon og hvite blodcellepopulasjoner deri, hvorved videre i det minste en av nevnte hvite blodcellepopulasjoner har i det minste to undergrupper, innbefattende fjerning av den røde blodcellepopulasjonen fra prøven uten på en ugunstig måte å påvirke relevante kvaliteter og/eller kvantiteter av de hvite blodcellepopulasjonene, karakterisert ved fjerning eller skifting av i det minste ett bidrag fra en utvalgt spesifikk hvit blodcellepopulasjon av en undergruppe av de hvite blodcellepopulasjonene, ved at til nevnte undergruppe av hvite blodcellepopulasjoner bindes mikrosfærer, som har et for nevnte undergruppe spesifikt monoklonalt antistoff bundet til seg, og elektronisk avføling og analyse av nevnte fjerning eller skiftede undergruppe med hvite "blodcellepopulasjoner og nevnte utvalgte hvite blodcellepopulasjon til bestemming av i det minste ett karakteristikum hos nevnte utvalgte blodcellepopulasjon .

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4 for å bestemme i det minste en hvit blodcellepopulasjon eller populasjonsundergruppe, hvilket ikke kan bestemmes på annen måte, i en fullblodprøve eller en del derav for identifisering og/eller telling og/eller studium, karakterisert ved skifting av det karakteristiske elektroniske avfølingsbidraget fra i det minste en hvit blodcellepopulasjon eller populasjonsundergruppe i forhold til andre hvite blodcellepopulasjoner eller undergruppepopulasjoner, ved at til i det minste en av nevnte hvite blodcellepopulasjoner eller undergrupper derav bindes mikrosfærer, som har en for i det minste en av nevnte hvite blodcellepopulasjoner eller undergrupper derav spesifikt monoklonalt antistoff bundet til seg, og elektronisk avføling og direkte telling av i det minste nevnte skiftede populasjon med i det minste to ulike elektroniske parametre for tilveiebringelse av bidraget fra nevnte skiftede populasjon til nevnte prøve.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 4 for å tilveiebringe en analyse av i det minste en hvit blodcellepopulasjon eller populasjonsundergruppe, hvilken analyse ikke kan tilveiebringes på annen måte, for identifisering og/eller telling og/eller studium, fra en fullblodprøve med i det minste hvite blodcellepopulasjoner deri, innbefattende i det minste en undergruppe med en hvit blodcellepopulasjon, karakterisert ved elektronisk avføling og telling av i det minste de hvite blodcellepopulasjonene og undergrupper derav for å gi en første totaltelling, fjerning av i det minste en av de hvite blodcellepopulasjonene eller en undergruppe derav ved at det til i det minste en av nevnte hvite blodcellepopulasjoner eller en undergruppe derav bindes mikrosfærer, som har en for nevnte hvite blodcellepopulasjoner eller en undergruppe derav spesifikk monoklonalt antistoff bundet til seg, elektronisk avføling og telling av i det minste de øvrige hvite blodcellepopulasjonene uten den fjernede populasjon eller undergruppen for å gi en andre telling, sammenligning av nevnte telleverdi med de tilveiebrakte eller utledede av i det minste et av (a) de øvrige hvite blodcellepopulasjonene uten den fjernede populasjonen eller undergruppen, (b) den fjernede hvite blodcellepopulasjonen eller undergruppepopulasjonen, eller (c) begge de øvrige og de fjernede hvite blodcellepopula-sj onene.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 4 for å tilveiebringe en analyse av i det minste en hvit blodcellepopulasjon eller populasjons-gruppe, hvilken analyse ikke kan tilveiebringes på annen måte, for identifisering og/eller telling og/eller studium av en fullblodsprøve med i det minste hvite blodcellepopulasjoner deri innbefattende i det minste en undergruppe av en hvit blodcellepopulasjon, karakterisert ved elektronisk avføling og telling av i det minste de hvite blodcellepopulasjonene og undergrupper derav for å gi en første totaltelling, skifting av i det minste en av de hvite blodcellepopulasjonene eller en undergruppe derav, ved at til i det minste en av nevnte hvite blodcellepopulasjoner eller en undergruppe derav bindes mikrosfærer, som har en for nevnte hvite blodcellepopulasjoner eller en undergruppe derav spesifikk monoklonalt antistoff bundet til seg, elektronisk avføling og telling av i det minste en av (a) de øvrige hvite blodcellepopulasjonene uten den skiftede populasjonen eller undergruppen, (b) den skiftede hvite blodcellepopulasjonen eller undergruppepopulasjonen, eller (c) både den øvrige og den skiftede hvite blodcellepopu- lasjonen, og sammenligning av nevnte telleverdi med tilveiebrakt eller utledet av en analyse av i det minste en av (a) de øvrige hvite blodcellepopulasjonene uten den skiftede populasjonen eller undergruppen, (b) den skiftede hvite blodcellepopulasjonen eller undergruppepopulasjonen, eller (c) både den øvrige og den skiftede hvite blodcellepopu-lasj onen .