NO174225B

NO174225B - Method for providing a multi-part white blood cell differentiation and method for determining at least one white blood cell population or population subgroup

Info

Publication number: NO174225B
Application number: NO885041A
Authority: NO
Inventors: Wallace H Coulter; Thomas Russell; Carlos Rodriguez; Ronald Paul; Kenneth H Kortright
Original assignee: Coulter Electronics
Priority date: 1987-03-13
Filing date: 1988-11-11
Publication date: 1993-12-20
Also published as: NO885041L; NO174225C; NO885041D0

Abstract

Fremgangsmåte og anordning for automatisk og hurtig å gjenvinne, telle og/eller analysere i det minste en valgt hvit blodcellepopulasjon og/eller delsett derav til en blodprøve (60) eller deler derav. Et volum med et biologisk medium inneholdende hvite blodceller prepareres og i det minste en reaktant (66, 74, 144, 132) spesifikk eller fortrinnsvis i forhold til 1 det minste noen valgte biologiske celler innfares dertil og blandes hurtig i en kortere tidsperiode. Ugjennomskinneligheten og/eller volumparameteren til cellene kan modifiseres og blandingen blir så talt og analysert i en eller flere trinn for å tilveiebringe ønsket hvit blodcellepopulasjonsanalyse. Den biologiske prøven kan være en hel blodprøve og reaktanten kan innbefatte eller være en lysering (66) eller et monoklonalt anti legeme bundet til mikroskoperingen (132, 144), som vil bindes til spesifikt en av cellene eller en kombinasjon av lysering og mkroskopering med antilegeme bundet dertil. Mikroskoperingene kan være magnetiske og bundne celler kan være magnetisk fjernet for gjenvinning og analysering av den øvrige blodcellepopulasjonen.Method and apparatus for automatically and rapidly recovering, counting and / or analyzing at least one selected white blood cell population and / or subsets thereof to a blood sample (60) or portions thereof. A volume of a biological medium containing white blood cells is prepared and at least one reactant (66, 74, 144, 132) specifically or preferably relative to at least some selected biological cells is introduced into it and mixed rapidly for a shorter period of time. The opacity and / or volume parameter of the cells can be modified and the mixture is then counted and analyzed in one or more steps to provide the desired white blood cell population analysis. The biological sample may be a whole blood sample and the reactant may include or be a lysis (66) or a monoclonal antibody bound to the microscopy (132, 144), which will bind to specifically one of the cells or a combination of lysis and microscopy with antibody tied to it. The microscopies may be magnetic and bound cells may be magnetically removed for recovery and analysis of the rest of the blood cell population.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåte for å tilveiebringe en flerdelt hvit blodcellepopulasjonsdiffe-rensiering av den art som angitt i innledningen til krav 1 samt en fremgangsmåte for å bestemme i det minste en hvit blodcellepopulasjon eller populasjonsundergruppe av den art som angitt i innledningen til krav 4. The present invention relates to a method for providing a multi-part white blood cell population differentiation of the kind stated in the introduction to claim 1 as well as a method for determining at least one white blood cell population or population subgroup of the kind stated in the introduction to claim 4.

Automatisering av rutinen for fullstendig blodcelle (CBC) analyse av menneskelig perifert blod ved en automatisk blodcelleteller er blitt tilveiebrakt av "COULTER COUNTER<®>" til Coulter Electronics, Inc. i Hialeah, Florida. Det elektroniske partielle avfølingssystemprinsippet til dette instrumentet er beskrevet i US-patent nr. 2.656.508. Bruk av optiske avfølingsinnretninger eller laser, som kan være vanskelig og dyrt, er unngått ved hjelp av partikkelanalyse-ringsinstrumenteringen, som brukes alene ved dette Coulter elektroniske avfølingsprinsippet. Automation of the routine complete blood cell (CBC) analysis of human peripheral blood by an automatic blood cell counter has been provided by "COULTER COUNTER<®>" to Coulter Electronics, Inc. of Hialeah, Florida. The electronic partial sensing system principle of this instrument is described in US Patent No. 2,656,508. The use of optical sensing devices or lasers, which can be difficult and expensive, is avoided by means of the particle analysis instrumentation, which is used alone by this Coulter electronic sensing principle.

Coulter-avfølingsprinsippet ble utviklet og utviklet til ennå mer raffinert instrumentering slik som "COULTER COUNTER<® >Model S" instrumenttype som muliggjør CBC-parametere, absolutt celletelleverdier, blodplatetelling og morfologi, røde blodceller (RBC) morfologi, tolking av normale og unormale blodprøver ved bestemte datamaskinprogrammer. The Coulter sensing principle was developed and developed into even more refined instrumentation such as the "COULTER COUNTER<® >Model S" instrument type which enables CBC parameters, absolute cell count values, platelet count and morphology, red blood cell (RBC) morphology, interpretation of normal and abnormal blood samples by certain computer programs.

Coulters elektroniske partikkelavfølingsprinsipp anvender en apparaturavfølingskrets som anvender en likestrømsapparatur-forsyning. Slike partikkelsensorer er enkle i konstruksjon, ekstremt solide og pålitelige som har vist seg ved den generelt aksepterte holdningen til COULTER COUNTER<®> automatiske analysator ved kliniske laboratorier i USA og ellers i resten av verden. En forbedring av denne basisapertur-avfølingskretsen er beskrevet i US-patent nr. 3.502.974. I tillegg til standard likestrømsapparaturforsyningen ble en høyfrekvent apparaturstrøm tilført som muliggjør avføling av en ytterligere parameter for klassifikasjonsformål. Den høyfrekvente apparaturstrømmen frembrakte et signal som er en funksjon av blodcellens interne ledeevne så vel som dets volum. Det frembrakte signalet tilveiebrakt samtidig av likestrømsapparaturkretsen er et konvensjonelt likestrøms-amplitudesignal som gir en primærindikasjon av cellevolumet. Radiofrekvensamplituden deles av likestrømspulsamplituden som anvender en høyhastighetsdelerkrets for å tilveiebringe en kvotient som er en funksjon av cellevolumet og den interne motstanden, vanligvis henvist til som en "ugjennomskinnelighet". Prinsippet er ytterligere beskrevet i US-patent nr. 3.5 02.973. Denne parameteren kan også anvendes ved celleklassifikasjonssystemer. Enten en enkel eller et par med separate aperaturer kunne bli anvendt for dette formålet. Coulter's electronic particle sensing principle utilizes an instrumentation sensing circuit utilizing a DC instrumentation supply. Such particle sensors are simple in construction, extremely robust and reliable as demonstrated by the generally accepted attitude of the COULTER COUNTER<®> automatic analyzer in clinical laboratories in the United States and elsewhere in the rest of the world. An improvement on this basic aperture sensing circuit is described in US Patent No. 3,502,974. In addition to the standard direct current apparatus supply, a high frequency apparatus current was supplied which enables the sensing of a further parameter for classification purposes. The high-frequency device current produced a signal that is a function of the blood cell's internal conductivity as well as its volume. The produced signal provided simultaneously by the DC apparatus circuit is a conventional DC amplitude signal which provides a primary indication of the cell volume. The radio frequency amplitude is divided by the DC pulse amplitude using a high speed divider circuit to provide a quotient which is a function of cell volume and internal resistance, commonly referred to as an "opacity". The principle is further described in US patent no. 3.5 02,973. This parameter can also be used in cell classification systems. Either a single or a pair of separate apparatuses could be used for this purpose.

Klassifiseringen av forskjellige populasjoner blir tilveiebrakt ved innsamling av data for signalparene når de frembringes, den ene som et mål på partikkelvolumet og den andre som mål på den indre celleresistiviteten eller gjennomskinneligheten. En vanlig form for å presentere denne dataen er ved hjelp av to-dimensjonale kurver henvist til som spredningskurver eller spredningsdiagrammer. Slike kurver er beskrevet i "Flow Cytometry and Sorting" side 371, av "Melamed Melaney and Medelsohn" i 1979, av "John Wiley & Sons, NY, NY". The classification of different populations is provided by collecting data for the signal pairs as they are generated, one as a measure of particle volume and the other as a measure of the internal cell resistivity or translucency. A common form of presenting this data is by means of two-dimensional curves referred to as scatter curves or scatter diagrams. Such curves are described in "Flow Cytometry and Sorting" page 371, by "Melamed Melaney and Medelsohn" in 1979, by "John Wiley & Sons, NY, NY".

Fig. 5A på tegningene viser et eksempel på en datakurve til en prøve med normalt blod. Hvert punkt utgjør en individuell celle. Høyden over basislinjen representerer det relative volumet til cellen. Avstanden til punktet til høyre for den vertikale basislinjen representerer den relative ugjennomskinneligheten. En kurve over normale hvite blodceller (WBC) (med de røde blodcellene fjernet) viser tre grupper med punkter, som representerer tre klare populasjoner som er en konsekvens av deres indre forskjeller i størrelse og interne sammensetning. Om ønskelig kan disse populasjonene med egnet krets bli talt for å tilveiebringe antallet for hver av dem. Cellene klassifiseres på basis av deres iboende forskjeller. Fig. 5A of the drawings shows an example of a data curve for a sample of normal blood. Each point constitutes an individual cell. The height above the baseline represents the relative volume of the cell. The distance to the point to the right of the vertical baseline represents the relative opacity. A curve of normal white blood cells (WBC) (with the red blood cells removed) shows three groups of points, representing three distinct populations that are a consequence of their intrinsic differences in size and internal composition. If desired, these populations can be counted with the appropriate circuit to provide the number for each of them. The cells are classified on the basis of their inherent differences.

Den første anvendelsen av Coulters elektroniske partik-kelavfølingsprinsipp var å utføre røde blodcelletellinger og så den mer kompliserte bestemmelsen av andre røde blodcelle-parametere. Ved å fjerne røde blodceller fra hele det perifere blodet kunne analysen av hvite blodcellepopulasjoner bli foretatt så lenge som den røde blodcellefjerningen ikke i betydelig grad svekker egenskapene til de øvrige hvite blodcellepopulasjonene som ønskes målt. Røde blodcelle-analyseringsreagenter ble utviklet for dette formål som selv om nyttig og anvendt i stor utstrekning ikke var helt tilfredsstillende i alle deres henseende for påfølgende hvite blodcellebestemmelser. The first application of Coulter's electronic particle sensing principle was to perform red blood cell counts and then the more complicated determination of other red blood cell parameters. By removing red blood cells from the entire peripheral blood, the analysis of white blood cell populations could be carried out as long as the red blood cell removal does not significantly impair the properties of the other white blood cell populations that are desired to be measured. Red blood cell assay reagents were developed for this purpose which, although useful and widely used, were not entirely satisfactory in all their respects for subsequent white blood cell determinations.

Tidligere metoder for strømningsanalysering av leukocytter ved å anvende likestrømsvolumet alene eller lysbredt ved forskjellige vinkler har vist tre grupper med leukocytter som korresponderer med lymfocytter, monocytter og granulocytter som innbefatter de nøytrofile, basofile og eosinofile populasjoner. En grov, men nyttig vurdering av eosinofil konsentrasjon kan bli gjort på noen prøver. Den femte hovedpopulasjonen er relativt for liten for denne metoden. Eosinofiler har også blitt observert som en klar gruppe ved å anvende spesielle fluoressensteknikker. Previous methods of flow analysis of leukocytes using the direct current volume alone or beamwidth at different angles have shown three groups of leukocytes corresponding to lymphocytes, monocytes and granulocytes which include the neutrophil, basophil and eosinophil populations. A rough but useful assessment of eosinophil concentration can be made on some samples. The fifth main population is relatively too small for this method. Eosinophils have also been observed as a distinct group using special fluorescence techniques.

Disse fluoressensteknikkene ble anvendt ved strømnings-cyttometriinstrumenter slik som "EPICS-strømningscyttometer" tilgjengelig fra Coulter Corporation. Slike instrumenter anvender prinsippet med cellebevegelse i en kolonnestrøm begrenset av en omhyllingsstrøm, slik at cellene linjes opp i en fil og passerer enkeltvis gjennom en laserstråle. Lyssprednings- og/eller fluoressenssignaler fra cellene ble så anvendt ved klassifisering av cellepopulasjonene. Flekkede celler med absorptive eller fluoreserende farver gjorde ytterligere cellepopulasjonsklassifisering mulig. Utviklingen av instrumentering og fluorkroms fra automatisk multi-parameteranalyse er videre beskrevet av R.C. Leif, et al. i "Clinical chemistry", Vol. 23, side 1492-98 (1977). Disse oppdagelsene utvidet antallet samtidige populasjons-klassifikasjoner av leukocytter til fire, nemlig lymfocytter, monocytter, eosinofiler og "granulocytter" (neutrofiler og basof iler). These fluorescence techniques were applied to flow cytometry instruments such as the "EPICS Flow Cytometer" available from Coulter Corporation. Such instruments use the principle of cell movement in a column flow limited by a sheath flow, so that the cells line up in a file and pass individually through a laser beam. Light scattering and/or fluorescence signals from the cells were then used when classifying the cell populations. Staining cells with absorptive or fluorescent colors allowed further cell population classification. The development of instrumentation and fluorochrome from automatic multi-parameter analysis is further described by R.C. Leif et al. in "Clinical chemistry", Vol. 23, pages 1492-98 (1977). These discoveries extended the number of simultaneous population classifications of leukocytes to four, namely lymphocytes, monocytes, eosinophils and "granulocytes" (neutrophils and basophils).

Et nyere analyttisk hematologyinstrument har anvendt lysspredningsteknikk sammen med peroksidasenzymflekking (absorptiv farving) av celler for å frembringe et femdelt leukocyttdifferensial. Farver i kombinasjon med bestemte reagerende biologiske molekyler, slik som monoklonale antilegemer, har dessuten øket antall mulige leukocytt-klassifikasjoner til å innbefatte funksjonell neddeling. A newer analytical hematology instrument has used the light scattering technique along with peroxidase enzyme staining (absorptive staining) of cells to produce a five-part leukocyte differential. Stains in combination with specific reacting biological molecules, such as monoclonal antibodies, have also increased the number of possible leukocyte classifications to include functional subdivision.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således en fremgangsmåte av den innledningsvis nevnte art hvis karakteristiske trekk fremgår av krav 1 samt en fremgangsmåte som angitt i innledningen til krav 4 og hvis karakteristiske trekk fremgår av dette kravet. Ytterligere trekk ved ovenfornevnte fremgangsmåte fremgår av de uselvstendige kravene. The present invention thus provides a method of the type mentioned at the outset whose characteristic features appear from claim 1 as well as a method as stated in the introduction to claim 4 and whose characteristic features appear from this claim. Further features of the above-mentioned method can be seen from the non-independent claims.

Selektiv festing av mikroskopiske partikler gjør det mulig å modifisere parameteren hhv. parametrene som er ansvarlig for de opprinnelige lokaliseringene av i det minste en av populasjonene. Det massive tillegget av mikroskopiske partikler til valgte målpopulasjoner hvor dette dessuten påvirker det målte volumet og/eller ugjennomskinneligheten resulterer i forskyvning av lokaliseringen til punktene som representerer populasjonen. Selective attachment of microscopic particles makes it possible to modify the parameter or the parameters responsible for the original localizations of at least one of the populations. The massive addition of microscopic particles to selected target populations where this also affects the measured volume and/or opacity results in displacement of the localization of the points representing the population.

Antilegemer med kjente spesifisiteter anvendes ved belegging av mikroskopiske partikler. Denne beleggingen gir partiklene evne til å kunne selektivt feste til visse celler som uttrykker antigenet som er spesifikk for antilegemet. De belagte eller merkede cellene er en kombinasjon av partikler og celler som oppfører seg som en ny enhet. Deres parametere for ugjennomskinnelighet, volum eller både ugjennomskinnelighet og volum kan bli "betraktet og representere summen av virkninger på både cellen og partiklene på de tilveiebrakte signalene. Dersom karakteristikkene for komponentene er forskjellige, vil den nye enheten bevege seg til en ny posisjon i samsvar med nettoeffekten. Det nye stedet, i motsetning til den tidligere posisjonen til cellen alene, skulle tillate en klassifikasjon av en slik ny enhet med grupper av nye enheter. Dersom partiklene festet til cellene er magnetiske, så vil naturligvis i samsvar med løpende praksis de nye enhetene bli fanget opp ved bruk av en magnet. Dersom hurtig blandet, innbefatter uventede resultater fullstendig oppfanging av en populasjon uten ugunstig påvirkning av egenskapene til cellene som studeres. Antibodies with known specificities are used when coating microscopic particles. This coating gives the particles the ability to selectively attach to certain cells that express the antigen that is specific for the antibody. The coated or labeled cells are a combination of particles and cells that behave as a new entity. Their parameters of opacity, volume, or both opacity and volume can be "considered and represent the sum of effects on both the cell and the particles on the supplied signals. If the characteristics of the components are different, the new unit will move to a new position in accordance with the net effect. The new location, as opposed to the former position of the cell alone, should permit a classification of such a new unit with groups of new units. If the particles attached to the cells are magnetic, then naturally, in accordance with current practice, the new units be captured using a magnet If rapidly mixed, unexpected results include complete capture of a population without adversely affecting the properties of the cells being studied.

Kun tre klare populasjoner med celler kan bli lett identifisert og talt fra en blodprøve ved å anvende deres iboende og bestemte egenskaper til likestrømsvolumet og ugjennomskin-nelighetsparametrene som tidligere nevnt. Ytterligere trinns, slik som forbedrede analyseringssystemer ("lysing")-systemer må bli foretatt for å kunne klargjøre detekteringen og tellingen av flere populasjoner. Disse ytterligere populasjonene utgjør naturligvis delpopulasjoner til de tre hovedpopulasjonene henvist til som lymfocytter, monocytter og granulocytter. De utvalgte trinnene i samsvar med oppfinnelsen vil vise hvorledes delpopulasjoner til disse tre basispopulasjonene tilveiebringes. Only three distinct populations of cells can be readily identified and counted from a blood sample by applying their inherent and specific properties to the DC volume and opacity parameters previously mentioned. Further steps, such as improved analysis ("lying") systems must be undertaken to enable the detection and counting of multiple populations. These additional populations naturally constitute sub-populations of the three main populations referred to as lymphocytes, monocytes and granulocytes. The selected steps in accordance with the invention will show how subpopulations of these three base populations are provided.

Ved anvendelse av slike enkle apparaturavfølingsteknikker i kombinasjon med to eller flere biologiske partikler, kan man frembringe en bestemt og ny posisjon for punktgruppen som representerer en gitt populasjon. Denne selektive bevegelsen av populasjonen på punktkurven eller spredningsdiagrammet kan reproduseres og bli anvendt for å klassifisere populasjon separat fra de tre basispopulasjonene. By using such simple apparatus sensing techniques in combination with two or more biological particles, one can produce a specific and new position for the group of points representing a given population. This selective movement of the population on the dot curve or scatter plot can be reproduced and used to classify the population separately from the three base populations.

Den opprinnelige og iboende kombinasjonen av likestrøms-volumet og ugjennomskinnelighetsavfølingsteknikken kan bli modifisert ved å feste mikroskopiske partikler til valgte individuelle celler. Denne selektiviteten er gitt partiklene ved arten eller spesifisiteten til de biologiske molekylene, antilegemene blant andre, anvendt som belegg på deres overflate. En populasjon av kun celler, som ikke har noen partikler på deres overflate, kan oppta punktkurveposisjonen ikke forskjellig fra andre populasjoner eller delpopulasjoner og derfor ikke bli adskilt fra en annen. De ytterligere partiklene med en selektiv tiltrekning til en bestemt populasjon med celler som man forsøker å identifisere, telle og studere er mulig ved å anvende denne metoden. Det selektive tillegget av tilstrekkelig masse med selektive partikler til en bestemt populasjon som er av interesse, resulterer i forskyvning av den populasjonens punkt-kurvelokalisering som et resultat av den nye og bestemte kombinasjonen av masse, volum og ugjennomskinnelighet. The original and inherent combination of the DC volume and opacity sensing technique can be modified by attaching microscopic particles to selected individual cells. This selectivity is given to the particles by the nature or specificity of the biological molecules, the antibodies among others, used as a coating on their surface. A population of only cells, having no particles on their surface, can occupy the dot curve position no differently from other populations or subpopulations and therefore not be separated from another. The additional particles with a selective attraction to a particular population of cells that one attempts to identify, count and study are possible by applying this method. The selective addition of sufficient mass of selective particles to a particular population of interest results in displacement of that population's point-curve location as a result of the new and particular combination of mass, volume and opacity.

Separering av bestemte cellepopulasjoner blir tilveiebrakt uten materiell påvirkning av egenskapene til de øvrige cellepopulasjonene. Fjerningen av erytrocytter eller røde blodceller (RBCer) fra hele blodet i samsvar med oppfinnelsen tillater f.eks. måling av T4 og/eller T8 lymfocytter som ellers ikke var mulig med for dette tilgjengelig kjemiske RBC analyseringsreagenter. Forholdet mellom antall T4 i forhold til T8 celler har blitt angitt for å angi immunmanglene med flere virusinfeksjoner innbefattende AIDS-virus blant annet. Tilstedeværelsen av bestemte reseptorer på overflaten til cellene kan bli anvendt for å klassifisere populasjonen til delsett, hvis telling tillater detektering av begynnelsen på en sykdom. Ved fremherskende former for leukemi er der f.eks. en skarp stigning i perifere blodlymfocytter. Dersom subpopulasjonen til lymfocyttene, som er en hurtig forleve-ring for bærere til Til reseptoren, er risikoen at pasienten har immune uregelmessigheter. Dersom delpopulasjonen til Til positive lymfocytter er bærere av T4 reseptoren, så er pasienten klassifisert som den vanlig i Japan. Dersom T4 reseptordelpopulasjonene ekspanderer er 2E4 positiv, så vil ikke pasienten bare vise en tendens til flere infeksjoner, men akutt leukemi så vel som for Til, T4, 2H4 positiv celle er innfører av undertrykning og funksjonell sperring av pasientens evne til å lage antilegemer. Pasienten er således utsatt for en f lerinfeksjon og må bli behandlet for både leukemier og immunmangler, jfr. K. Takatsuki, et al., "GÅNN monograph on Cancer Research 28:13-22, 1982; C. Morimoto, et al., Coulter Japan Symposium, 1984; C. Morimoto, et al., Immunology 134 (3):1508-1515, 1985; C. Morimoto, et al., New England Journal of Medicine 316(2): 67-71, 1987." Oppfinnelsen angår også analyse av formede legemssuspensjoner slik som bakterie og virus blant annet. Separation of specific cell populations is provided without materially affecting the properties of the other cell populations. The removal of erythrocytes or red blood cells (RBCs) from whole blood in accordance with the invention allows e.g. measurement of T4 and/or T8 lymphocytes which was otherwise not possible with chemical RBC analysis reagents available for this purpose. The ratio between the number of T4 in relation to T8 cells has been indicated to indicate the immune deficiencies with several viral infections including the AIDS virus among others. The presence of certain receptors on the surface of the cells can be used to classify the population into subsets, the counting of which allows the detection of the onset of a disease. In predominant forms of leukaemia, there is e.g. a sharp increase in peripheral blood lymphocytes. If the subpopulation of the lymphocytes, which is a rapid delivery for carriers to the Til receptor, the risk is that the patient has immune irregularities. If the subpopulation of Til positive lymphocytes are carriers of the T4 receptor, then the patient is classified as normal in Japan. If the T4 receptor subpopulations expand and 2E4 is positive, the patient will not only show a tendency to more infections, but acute leukemia as well as for Til, T4, 2H4 positive cells introduce suppression and functional blocking of the patient's ability to make antibodies. The patient is thus exposed to multiple infections and must be treated for both leukemias and immune deficiencies, cf. K. Takatsuki, et al., "GO monograph on Cancer Research 28:13-22, 1982; C. Morimoto, et al., Coulter Japan Symposium, 1984; C. Morimoto, et al., Immunology 134 (3): 1508-1515, 1985; C. Morimoto, et al., New England Journal of Medicine 316(2): 67-71, 1987." The invention also relates to the analysis of shaped body suspensions such as bacteria and viruses, among others.

Foreliggende oppfinnelse frembringer en allsidig fremgangsmåte for å anvende samme som kombinerer elektroniske partikkelavfølingsteknologi og spesifisitet til selektive biologiske molekyler for å tilveiebringe et fremskritt innenfor området med automatisk analysatorer for klinisk laboratoriebruk og for industriell anvendelse. Detektering av flere leukocyttpopulasjoner og deres forhold til hverandre ved et menneskelig perfert blod er viktig ved medisinsk undersøkelse og diagnose av menneskelige sykdommer. Slik data er nyttig som et screeningsverktøy for å identifisere og klassifisere sykdommer, slik som leukemi. Abnormale situa-sjoner identifisert av anvendelse av oppfinnelsen gir relevant diagnoseinformasjon innenfor undersøkelsesområder som ikke er begrenset kun til detektering av leukocyttpopulasjoner som det vil fremgå av beskrivelsen og tegningene . The present invention provides a versatile method of applying the same which combines electronic particle sensing technology and specificity to selective biological molecules to provide an advance in the field of automatic analyzers for clinical laboratory use and for industrial use. Detection of several leukocyte populations and their relationship to each other in a human perfused blood is important in medical examination and diagnosis of human diseases. Such data is useful as a screening tool to identify and classify diseases, such as leukemia. Abnormal situations identified by application of the invention provide relevant diagnostic information within examination areas which are not limited only to the detection of leukocyte populations, as will be apparent from the description and drawings.

Ett av de mest verdifulle trekkene ved oppfinnelsen er anvendelsen av en enkel røff "Coulter"-operasjon. Den er stabil og krever ikke komplekse og dyre optiske systemer. Den nødvendige kretsen for ytterligere RF-generator og detektor er billig, kompakt og pålitelig. En enkel apparatur er alt som er nødvendig, men en ytterligere eller andre eller også tredje apparatur kan muliggjøre en større prøvegjennom-gangshastighet på en billig måte. One of the most valuable features of the invention is the use of a simple rough "Coulter" operation. It is stable and does not require complex and expensive optical systems. The necessary circuitry for additional RF generator and detector is cheap, compact and reliable. A simple apparatus is all that is necessary, but an additional or second or even third apparatus can enable a greater sample throughput rate in an inexpensive manner.

I det påfølgende skal foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen bli beskrevet nærmere ved hjelp av eksempel med henvisning til medfølgende tegninger, hvor: Fig. 1 viser et skjematisk blokkdiagram av en cellepopula-sjonsanalysator-utførelsesform. Fig. 2 viser et skjematisk blokkdiagram av en andre In what follows, preferred embodiments of the invention will be described in more detail by way of example with reference to accompanying drawings, where: Fig. 1 shows a schematic block diagram of a cell population analyzer embodiment. Fig. 2 shows a schematic block diagram of a second

analysatorutførelsesform. analyzer embodiment.

Fig. 3 viser en spesifikk analysatorutførelsesform til-svarende fig. 1 og 2. Fig. 4 viser et skjematisk blokkdiagram av en annen Fig. 3 shows a specific analyzer embodiment corresponding to fig. 1 and 2. Fig. 4 shows a schematic block diagram of another

analysatorutførelsesform. analyzer embodiment.

Fig. 5A og 5B viser spredningsdiagram av et sett med resultater som anvender et prototypeanalysatorsystem lignende det vist med hensyn til fig. 2 og 3. Fig. 6 viser et skjematisk blokkdiagram av en ytterligere Figs. 5A and 5B show scatter plots of a set of results using a prototype analyzer system similar to that shown with respect to Figs. 2 and 3. Fig. 6 shows a schematic block diagram of a further

analysatorutførelsesform. analyzer embodiment.

Fig. 7 viser et skjematisk blokkdiagram av en ytterligere Fig. 7 shows a schematic block diagram of a further

analysatorutførelsesform. analyzer embodiment.

Fig. 8A og 8B, 9A og 9B, 10A og 10B og 11A og 11B viser spredningsdiagrammer av et sett med resultater som anvender et prototypeanalysatorsystem lignende det vist på fig. 6 og 7. Fig. 12 viser et skjematisk blokkdiagram av en ytterligere analysatorutførelsesform. Fig. 13 viser et spredningsdiagram av et sett med resultater som anvender et prototypeanalysatorsystem lignende det vist på fig. 12. Figs. 8A and 8B, 9A and 9B, 10A and 10B and 11A and 11B show scatter plots of a set of results using a prototype analyzer system similar to that shown in Figs. 6 and 7. Fig. 12 shows a schematic block diagram of a further analyzer embodiment. Fig. 13 shows a scatter plot of a set of results using a prototype analyzer system similar to that shown in Fig. 12.

Med henvisning til fig. 1 skal en første utførelsesform av en cellepopulasjonsanalyseringsmetode og en anordning for utførelse av fremgangsmetoden bli beskrevet, idet anordningen er generelt betegnet med henvisningstallet 10. Analysatoren 10 innbefatter en biologisk prøve 12 som inneholder i det minste et første sett med levedyktige biologiske celler (ikke vist), slik som i eller fra en blodprøve. Cellene til den biologiske prøven 12 skal bli involvert i en biologisk reaksjon ved en kvantitativ og/eller kvalitativ bestemmelse eller analyse. Prøven 12 kan innbefatte en buffer i hvilken cellene er anbrakt. With reference to fig. 1, a first embodiment of a cell population analysis method and a device for carrying out the method will be described, the device being generally denoted by the reference number 10. The analyzer 10 includes a biological sample 12 which contains at least a first set of viable biological cells (not shown) , such as in or from a blood test. The cells of the biological sample 12 are to be involved in a biological reaction by a quantitative and/or qualitative determination or analysis. The sample 12 may include a buffer in which the cells are placed.

Prøven 12 er kombinert via en linje 14 med i det minste ett reaktantmiddel 16 via en linje 18. De røde blodcellene (RBC) bli så fjernet fra blandingen ved hjelp av en funksjonsbeteg-net RBC-fjerningsstasjon 20. RBC'ene kan bli fjernet fra blandingen på forskjellige måter. RBC'ene kan bli lysert ved hjelp av en lysering i reaktanten 16. En slik foretrukket lysering og en avkjøling og herding (quench) som kan bli anvendt her er beskrevet i US-søknad nr. 025303 med tittelen "Method and reagent system for isolation, identification and/or analysis of leukocytes from whole blood samples". Reaktanten 16 kan være eller innbefatte flere magnetiske mikrosfærer med et antilegeme spesifisert til RBC'ene bundet til mikrosfaerene (ikke vist). Ved dette eksemplet er det spesifikke antilegemet med den bestemte røde blodcellen beskrevet i US-søknad nr. 799489 med tittelen "Monoclonal antibody for recovery of leukocytes in human peripheral blood and method of recovery employing said monoclonal antibody". Reaktanten 16 kan også innbefatte en buffer i tillegg til eller i stedet for bufferprøven. Reaktanten 16 kan dessuten være en kombinasjon av fortrinnsvis RBC-analyse og RBC-spesifikke mikrosfærer. The sample 12 is combined via a line 14 with at least one reactant 16 via a line 18. The red blood cells (RBC) are then removed from the mixture by means of a functionally designated RBC removal station 20. The RBCs can be removed from the mixture in different ways. The RBCs can be lysed by means of a lysis in the reactant 16. One such preferred lysis and a quench that can be used herein is described in US Application No. 025303 entitled "Method and reagent system for isolation , identification and/or analysis of leukocytes from whole blood samples". The reactant 16 may be or include multiple magnetic microspheres with an antibody specific to the RBCs bound to the microspheres (not shown). In this example, the specific antibody with the particular red blood cell is described in US Application No. 799489 entitled "Monoclonal antibody for recovery of leukocytes in human peripheral blood and method of recovery employing said monoclonal antibody". The reactant 16 may also include a buffer in addition to or instead of the buffer sample. The reactant 16 can also be a combination of preferably RBC analysis and RBC-specific microspheres.

Så snart RBC'ene i det vesentlige er fjernet fra blandingen, blir en del blandingen ført inn i en hvit blodcelle (WBC) analysator 22 via en linje 24. WBC-analysatoren 22 teller i det minste antall WBC'er i blandingen. WBC-analysatoren 22 kan også måle en eller flere volumer eller ugjennomskin-nelighetsparametere til WBC'ene. Resultatet fra analysatoren 22 blir matet til en komparator 26 via en linje 28. Once the RBCs are substantially removed from the mixture, a portion of the mixture is introduced into a white blood cell (WBC) analyzer 22 via a line 24. The WBC analyzer 22 counts at least the number of WBCs in the mixture. The WBC analyzer 22 can also measure one or more volumes or opacity parameters of the WBCs. The result from the analyzer 22 is fed to a comparator 26 via a line 28.

En andre del av RBC-fjernet blanding blir matet til en WBC-delsett subtraheringsstasjon 30 via linjen 32. WBC'ene kan bli subtrahert fra blandingen på forskjellige måter. Mikroskoperinger med et monoklonalt antilegeme spesifikt til ett av WBC-delsettene bundet dertil kan bli tillagt blandingen. Ikke-magnetiske mikroskoperinger kan bli bundet til WBC'ene for å endre eller forskyve resultatugjennomskin-neligheten eller volumsparameterne til cellene. Magnetiske mikroskoperinger kan også bli bundet til WBC'ene som så kan bli fjernet fra blandingen ved hjelp av et magnetisk felt. A second portion of the RBC-removed mixture is fed to a WBC subset subtraction station 30 via line 32. The WBCs can be subtracted from the mixture in various ways. Microscopy with a monoclonal antibody specific to one of the WBC subsets bound thereto can be added to the mixture. Non-magnetic microscopes can be attached to the WBCs to change or shift the resulting opacity or volume parameters of the cells. Magnetic microscopy rings can also be bound to the WBCs which can then be removed from the mixture using a magnetic field.

Blandingen med WBC-delsettpopulasjonen fjernet eller med en eller flere parametere endret blir så ført til en WBC-delsettanalysator 34 via en linje 36. Analysatoren 34 kan være identisk med analysatoren 22. Resultatene av anlysa-toren 34 blir så matet til komparatoren 26 via en linje 38. Komparatoren 36 kan så sammenligne WBC-resultåtene fra analysatoren 22 med de modifiserte resultatene fra analysatoren 34 for å bestemme i det minste en egenskap til den valgte hvite blodcellepopulasjonen, slik som antall celler innenfor et bestemt område. The mixture with the WBC subset population removed or with one or more parameters changed is then fed to a WBC subset analyzer 34 via a line 36. The analyzer 34 may be identical to the analyzer 22. The results of the analyzer 34 are then fed to the comparator 26 via a line 38. The comparator 36 may then compare the WBC results from the analyzer 22 with the modified results from the analyzer 34 to determine at least one characteristic of the selected white blood cell population, such as the number of cells within a certain range.

Med henvisning til fig. 2 skal den andre utførelsesformen av cellepopulasjons-analyseringsmetoden bli beskrevet, idet det her er vist en anordning som utgjør utførelsesf ormen og som er betegnet med henvisningstallet 40. Analysatoren 40 innbefatter en biologisk prøve 42 som igjen inneholder i det minste et første sett med levedyktige biologiske celler (ikke vist), slik som i eller fra en blodprøve. Cellene til den biologiske prøven 42 skal bli involvert i en biologisk reaksjon ved en kvantitativ og/eller kvalitativ bestemmelse eller analyse. Prøven 42 kan igjen innbefatte en buffer i hvilken cellene blir tilført. With reference to fig. 2, the second embodiment of the cell population analysis method will be described, as here a device is shown which constitutes the embodiment and which is denoted by the reference number 40. The analyzer 40 includes a biological sample 42 which in turn contains at least a first set of viable biological cells (not shown), such as in or from a blood sample. The cells of the biological sample 42 are to be involved in a biological reaction by a quantitative and/or qualitative determination or analysis. The sample 42 can again include a buffer into which the cells are added.

Prøven 42 kombineres via en linje 44 med i det minste en reaktant 46 via en linje 48. I analysatoren 40 blir RBCene fjernet fra blandingen og samtidig blir i det minste en egenskap til i det minste et WBC-delsett endret eller forskjøvet ved hjelp av en funksjonsmessig betegnet RBC-fjernings- og WBC-forskyvningsstasjon 50. Som nevnt ovenfor kan RBCene bli fjernet fra blandingen ved hjelp av stasjonen på forskjellige måter, fortrinnsvis talt med hensyn til stasjonen 20. I samme blandingsdel er samtidig WBC'ene bundet til, generelt ikke-magnetisk, mikrosfærer for å endre eller forskyve resultatugjennomsiktigheten og/eller volum-parameterne til cellene. The sample 42 is combined via a line 44 with at least one reactant 46 via a line 48. In the analyzer 40, the RBCs are removed from the mixture and at the same time at least one property of at least one WBC subset is changed or shifted by means of a functionally designated RBC removal and WBC displacement station 50. As mentioned above, the RBCs can be removed from the mixture by means of the station in various ways, preferably speaking with respect to the station 20. In the same mixture part, at the same time, the WBCs are bound to, generally not -magnetic, microspheres to change or shift the resulting opacity and/or volume parameters of the cells.

Blandingen med de fjernede RBCene og WBC-delsettpopulasjonen forskjøvet blir så matet til analysatoren 52 via en linje 54. Analysatoren 52 kan i det vesentlige være identisk med den til analysatoren 22. Analysatoren 40 gir således en hurtig og direkte analyse av i det minste en egenskap til en valgt WBC-populasjon eller bloddelsett. The mixture with the removed RBCs and the WBC subset population shifted is then fed to the analyzer 52 via a line 54. The analyzer 52 may be substantially identical to that of the analyzer 22. The analyzer 40 thus provides a rapid and direct analysis of at least one characteristic to a selected WBC population or blood subset.

En spesifikk utførelsesform av et analyseinstrument formet ifølge oppfinnelsen og som kan utføre metodene til første og andre analysatoren 10 og 40, er betegnet generelt med henvisningstallet 56 på fig. 3. A specific embodiment of an analysis instrument shaped according to the invention and which can perform the methods of the first and second analyzers 10 and 40, is designated generally by the reference number 56 in fig. 3.

Ved instrumentet 56, er kun en bestemt telling vist, som kan bli variert i nesten en endeløs detalj i samsvar med prinsippene ifølge oppfinnelsen. Instrumentet 56 er dessuten vist med generelle funksjonelle detaljer og de spesifikke utførelsesformene kan konstruksjonsmessig bli utført på mange forskjellige kjente måter. At the instrument 56, only a definite count is shown, which can be varied in almost endless detail in accordance with the principles of the invention. The instrument 56 is also shown with general functional details and the specific embodiments can be constructed in many different known ways.

Instrumentet 56 innbefatter en aspiratorpumpemekanisme 58 som anvendes ved å trekke ut biologiske prøver av interesse, f.eks. prøvene 12 eller 42 inn i instrumentet 56. Aspiratoren 58 er koplet via en linje 60 med en prøveventil 62, som kan være koplet med en prøvesonde 63. En lyseringspumpe 64 kan innbefatte lyseringsmiddel, slik som en del av reaktanten 18 eller 46 og også være koplet med ventilen 62 via en linje 66. Ventilen 62 og pumpen 58 kan aspirere den biologiske prøven 12 eller 42 sammen med lyseringsmiddelet via pumpen 64 når ønsket. The instrument 56 includes an aspirator pump mechanism 58 which is used in extracting biological samples of interest, e.g. the samples 12 or 42 into the instrument 56. The aspirator 58 is connected via a line 60 to a sample valve 62, which may be connected to a sample probe 63. A lysis pump 64 may include lysing agent, such as a portion of the reactant 18 or 46 and also be connected to the valve 62 via a line 66. The valve 62 and the pump 58 can aspirate the biological sample 12 or 42 together with the lysing agent via the pump 64 when desired.

Eeaktantblandingen eller den biologiske prøven i seg selv blir så matet via en uttømningslinje 68 inn i en blandeanordning 70. Blanderen 70 innbefatter et blandekammer 72 i hvilket prøven eller reaktanten blir matet. Ved dette punktet adskiller seg operasjonen av analysatoren 10 og 40 og vil følgelig bli beskrevet separat. The reactant mixture or the biological sample itself is then fed via a discharge line 68 into a mixing device 70. The mixer 70 includes a mixing chamber 72 into which the sample or reactant is fed. At this point, the operation of the analyzers 10 and 40 differ and will accordingly be described separately.

Ved analysatoren 10, dersom RBCene har blitt lysert av lyseringsvæsken/middelet fra pumpen 64, så blir når reaksjonen er fullført, et middel (quench) eller preparering (fix) tilført fra en stasjon 74 via en linje 76. Reaksjonen er fulgt. Reaksjonen kan bli assistert ved blanding av lyseringsmiddelet og prøven i kammeret 72 som vist funksjonsmessig ved henvisningstallet 78. At the analyzer 10, if the RBCs have been lysed by the lysing fluid/agent from the pump 64, then when the reaction is complete, an agent (quench) or fix (fix) is supplied from a station 74 via a line 76. The reaction is followed. The reaction can be assisted by mixing the lysing agent and the sample in the chamber 72 as shown functionally at reference number 78.

Detaljer ved en egnet blandeanordning 70, som kan bli anvendt her, er beskrevet i US-patentsøknad nr. 25337 med tittelen "Method and apparatus for rapid mixing of small volumes for enhancing biological reactions". Ved å anvende blanderen 70 blir reaksjonene øket i stor grad med hensyn til hastighet uten merkbar ødeleggelse av egenskapene som er av interesse for cellene, slik som det forekommer ved økning av reaksjons-temperaturen. Reaksjonene blir generelt fullført på betydelig mindre tid enn ett minutt, generelt i størrelsesorden av femten sekunder eller mindre. Dette tillater en hurtig analyse ved det automatiske høyvolumsanalysatorinstrumentet 56. Details of a suitable mixing device 70 which may be used herein are described in US Patent Application No. 25337 entitled "Method and apparatus for rapid mixing of small volumes for enhancing biological reactions". By using the mixer 70, the reactions are greatly increased in terms of speed without appreciable destruction of the properties of interest to the cells, as occurs when the reaction temperature is increased. The reactions are generally completed in significantly less time than one minute, generally on the order of fifteen seconds or less. This allows rapid analysis by the automatic high volume analyzer instrument 56.

Den avkjølte reaktanten med RBCene fjernet ved lysering (da fra stasjonen 20) blir så tilført via en linje 80 til et holdekammer 82, som i dette tilfellet vil holde en andre del av blandingen. En første del av blandingen vil bli tilført fra kammeret 82 via en linje 84 til en WBC-analysator 86 (dvs. analysatoren 22). Analysatoren 86 kan være av mange fysiske typer i samsvar med telling og dimensjoneringsteknikk beskrevet i US-patent nr. 2.656.508. The cooled reactant with the RBCs removed by lysis (then from the station 20) is then supplied via a line 80 to a holding chamber 82, which in this case will hold a second part of the mixture. A first portion of the mixture will be supplied from the chamber 82 via a line 84 to a WBC analyzer 86 (ie, the analyzer 22). The analyzer 86 can be of many physical types in accordance with the counting and sizing technique described in US Patent No. 2,656,508.

Analysatoren 86 innbefatter generelt en strømningssensor av et avfølingskammer 88. Kammeret 88 innbefatter en transduser 90 som har en apparatur 92 derigjennom. Kammeret 88 innbefatter en første del 99 som har en første elektrode 96 i kontakt med fluidet deri. The analyzer 86 generally includes a flow sensor of a sensing chamber 88. The chamber 88 includes a transducer 90 having an apparatus 92 therethrough. The chamber 88 includes a first part 99 which has a first electrode 96 in contact with the fluid therein.

Kammerdelen 94 og elektroden 96 kommuniserer via apparaturen 92 med en andre kammerdel 98 som har en andre elektrode 100. The chamber part 94 and the electrode 96 communicate via the apparatus 92 with a second chamber part 98 which has a second electrode 100.

Elektrodene 96 og 100 er koplet via reaktive ledere 102 og 104 med en RF/DC-kilde (radiofrekvens/likestrømskilde) og avfølingskrets 106. Kretsen 106 kopler både en likestrøm, eller en lavfrekvensstrøm eller signal og et høyfrekvent signal mellom elektrodene 96 og 100. The electrodes 96 and 100 are connected via reactive conductors 102 and 104 to an RF/DC source (radio frequency/direct current source) and sensing circuit 106. The circuit 106 connects both a direct current, or a low frequency current or signal and a high frequency signal between the electrodes 96 and 100.

Lavfrekvenssignalet anvendes for å avføle amplituden til en signalpuls bevirket av en celle som passerer gjennom apparaturen 92. Høyfrekvenssignalet anvendes for å tilveiebringe den elektriske ugjennomskinneligheten til samme cellen som passerer gjennom apparaturen 92. The low frequency signal is used to sense the amplitude of a signal pulse caused by a cell passing through the apparatus 92. The high frequency signal is used to provide the electrical opacity of the same cell passing through the apparatus 92.

Målingen av elektrisk ugjennomskinnelighet til celler er beskrevet i US-patent nr. 3.502.974. En spesiell krets som kan bli anvendt her er beskrevet i US-patentsøknad nr. 921654 med tittelen "Particle analyzer for measuring the resistance and reactance of a particle". The measurement of electrical opacity of cells is described in US Patent No. 3,502,974. A particular circuit that can be used here is described in US Patent Application No. 921654 entitled "Particle analyzer for measuring the resistance and reactance of a particle".

Signalene generert av kretsen 106 fra de avfølte cellene er koplet via en 1ikstrømssignalleder 108 og en RF-signalleder 110 til en komparator 112 (lik komparatoren 26). Komparatoren 112 kan holde signalet generert fra den første delen, dvs. de uten WBC-delsettet subtrahert, for en sammenligning med resultatene fra en andre del som skal bli beskrevet. The signals generated by the circuit 106 from the sensed cells are coupled via an electric current signal conductor 108 and an RF signal conductor 110 to a comparator 112 (similar to the comparator 26). The comparator 112 may hold the signal generated from the first part, i.e. those without the WBC subset subtracted, for a comparison with the results from a second part to be described.

Analysatoren 86 kan innbefatte en omhyllingsstrøm for å fokusere cellene i sensoren 88 på velkjent måte. Omhyl-lingsstrømmen kan være tilveiebrakt av et fluidsystem 114, koplet til sensoren 88 ved hjelp av et par med linjer 116 og 118 på kjent måte. Prøvereaksjonsblandingen kan bli matet inn til sensoren 88 via et innføringsrør 120 og kan bli matet fra sensoren 88 via et utløpsrør 122 inn i en avfallsbeholder 124 . The analyzer 86 may include a sheath current to focus the cells in the sensor 88 in a well-known manner. The sheath flow may be provided by a fluid system 114, connected to the sensor 88 by means of a pair of lines 116 and 118 in a known manner. The sample reaction mixture may be fed into the sensor 88 via an inlet pipe 120 and may be fed from the sensor 88 via an outlet pipe 122 into a waste container 124 .

Mens den første delen av blandingen ble analysert i analysatoren 86, blir den andre delen fastholdt i kammeret 82, mens blanderen 72 renses eller skylles via en renselinje 126 og tømmes gjennom en avfallsledning 128. Så snart kammeret 72 er rengjort, blir den andre delen ført tilbake inn i kammeret 72 via en linje 130. Som stasjonen 30, blir nå WBC-delsettet subtrahert ved å legge til WBC-mikroskoperinger fra en stasjon 132 via en linje 134, en ventil 136 og en kammerlinje 138. While the first part of the mixture was analyzed in the analyzer 86, the second part is retained in the chamber 82, while the mixer 72 is cleaned or flushed via a cleaning line 126 and discharged through a waste line 128. As soon as the chamber 72 is cleaned, the second part is passed back into the chamber 72 via a line 130. Like station 30, the WBC subset is now subtracted by adding WBC microscopy readings from a station 132 via a line 134, a valve 136 and a chamber line 138.

WBC-mikrosfærene ble blandet med den andre delen ved hjelp av blandemekanismen 78. Dersom WBC-mikrosfærene er ikke-magnetiske, vil reaksjonsblandingen med de bundne WBC-mikrosfærene bli matet via linjen 80, kammeret 82 og linjen 84 til analysatoren 86 (dvs. analysatoren 84), hvor den andre delen ble analysert slik som den første delen og resultatene ble så sammenlignet i komparatoren 112 (dvs. komparatoren 26). I det minste en av WBC-delsettcelleparametrene ble endret i den andre delen, slik som celleugjennomskinnelig-heten av WBC-delsettbundne mikrosfærer for å tilveiebringe endrede resultater som så kan bli analysert. The WBC microspheres were mixed with the second portion using the mixing mechanism 78. If the WBC microspheres are non-magnetic, the reaction mixture with the bound WBC microspheres will be fed via line 80, chamber 82 and line 84 to the analyzer 86 (i.e., the analyzer 84), where the second part was analyzed like the first part and the results were then compared in comparator 112 (ie comparator 26). At least one of the WBC subset cell parameters was altered in the second part, such as the cell opacity of WBC subset bound microspheres to provide altered results that can then be analyzed.

Dersom WBC-mikrosfærene er magnetiske, så blir WBC-delsettet bundet dertil fjernet av et magnetisk felt i løpet av og/eller etter blandeprosessen ved hjelp av et magnetisk felt eller en magnet 140. Feltet kan være tilveiebrakt ved hjelp av en elektromagnetisk innretning eller ved hjelp av magneten 140 som er fysisk beveget i forhold til kammeret 172 for å fange opp det innfangede magnetisk bundne WBC-delsettet. Den andre delen uten bundet WBC-delsett blir så matet via linjen 80, kammeret 82 og linjen 84 til analysatoren 86 som tidligere beskrevet for å tilveiebringe analysen (som ved analysatoren 34). If the WBC microspheres are magnetic, then the WBC subset bound thereto is removed by a magnetic field during and/or after the mixing process by means of a magnetic field or a magnet 140. The field may be provided by means of an electromagnetic device or by using the magnet 140 which is physically moved relative to the chamber 172 to capture the captured magnetically bound WBC subset. The second portion without bound WBC subset is then fed via line 80, chamber 82, and line 84 to analyzer 86 as previously described to provide the assay (as at analyzer 34).

Instrumentet 56 blir så preparert for å ta neste prøve for neste analyse. Sonden 63 kan bli renset ved hjelp av en sonderensemekanisme 142 og linjene og kamrene 72 og 82 kan bli spylt på konvensjonell måte. Hver analyse av påfølgende prøveblanding tilveiebringes på en hurtig og automatisk måte. Perioden mellom analysen til påfølgende prøveblandinger kan være i størrelsesorden av minutter eller mindre. The instrument 56 is then prepared to take the next sample for the next analysis. The probe 63 may be cleaned using a probe cleaning mechanism 142 and the lines and chambers 72 and 82 may be flushed in a conventional manner. Each analysis of subsequent sample mixture is provided in a fast and automatic manner. The period between the analysis of successive sample mixtures can be on the order of minutes or less.

Ved drift av analysatorinstrumentet 56, som analysatoren 40, blir reaksjonsblandingen med RBC-lyseringen/reaktanten 46 og prøven 42 blandet i kammeret 72 sammen med ikke-magnetisk WBC-mikrosfærer fra stasjonen 132, som binder til en av WBC-delsettene. Prepareringen 74 blir tilført den reaktive blandingen som så blir matet via linjen 80, kammeret 82 og linjen 84 til WBC-analysatoren 86 for analyse (dvs. som analysator 52). In operation of the analyzer instrument 56, like the analyzer 40, the reaction mixture with the RBC lysate/reactant 46 and the sample 42 is mixed in the chamber 72 along with non-magnetic WBC microspheres from the station 132, which bind to one of the WBC subsets. The preparation 74 is added to the reactive mixture which is then fed via line 80, chamber 82 and line 84 to the WBC analyzer 86 for analysis (ie, as analyzer 52).

Alternativ til anvendelsen av lyseringen i en av analysatorene 10 og 40, kan prøvene 12 eller 42 bli matet til blanderen 70 via ventilen 62 uten noen analyse. I dette tilfellet kan RBCene bli fjernet magnetisk ved å anvende mikrosfærer med RBC-spesifikke antilegemer bundet dertil fra en RBC-mikrosfærestasjon 144 og matet til ventilen 136 via en linje 146 og følgelig til kammeret 70 via linjen 138. Hvor ingen analyse anvendes, blir bundne RBC'er magnetisk fjernet ved hjelp av magneten 140 etter blandingen på en måte i det vesentlige identisk med de magnetisk bundne WBC'ene beskrevet ovenfor. Alternatively to the use of the lyser in one of the analyzers 10 and 40, the samples 12 or 42 may be fed to the mixer 70 via the valve 62 without any analysis. In this case, the RBCs can be removed magnetically by using microspheres with RBC-specific antibodies bound thereto from an RBC microsphere station 144 and fed to the valve 136 via a line 146 and consequently to the chamber 70 via the line 138. Where no assay is used, bound RBCs are magnetically removed by magnet 140 after mixing in a manner substantially identical to the magnetically bound WBCs described above.

I et annet tilfelle kan for å fremme hastigheten til reaksjonen, en reaksjonsblanding av prøven med både RBC-lyseringen og med RBC-magnetiske perler bli anvendt. Reaksjonsblandingen ble blandet, lyseringen ble preparert og de bundne RBCene ble magnetisk fjernet og WBCene analyseres som tidligere beskrevet. In another case, to promote the speed of the reaction, a reaction mixture of the sample with both the RBC lysate and with RBC magnetic beads can be used. The reaction mixture was mixed, the lysate was prepared and the bound RBCs were magnetically removed and the WBCs analyzed as previously described.

Med henvisning til fig. 4 er en annen utførelsesf orm av cellepopulasjons-analysemetoden og anordningen som utfører metoden betegnet med henvisningstallet 148 nærmere beskrevet. Analysatoren 148 innbefatter en biologisk prøve 150 som kan inneholde i det minste et første sett med levedyktige biologiske celler, slik som i eller fra en blodprøve. Prøven 150 kan igjen innbefatte en buffer i hvilken cellene er tillagt. With reference to fig. 4, another embodiment of the cell population analysis method and the device which performs the method designated by the reference number 148 is described in more detail. The analyzer 148 includes a biological sample 150 which may contain at least a first set of viable biological cells, such as in or from a blood sample. The sample 150 may again include a buffer in which the cells are added.

Prøven 150 er kombinert via en linje 152 med i det minste en reaktant 154 via en linje 156. RBCene fjernes så som ovenfor beskrevet ved hjelp av en funksjonsmessig konstruert RBC-fjernestasjon 158. Reaksjonsblandingen med RBCene fjernet blir matet via en linje 160 inn i en WBC-analysator 162. Resultatene fra analysatoren 162 blir så matet til en komparator 164 via en linje 166, som gir en tredelt WBC-differensiering med resultater for monocytter (M), lymfocytter (L) og granulocytter (G). The sample 150 is combined via a line 152 with at least one reactant 154 via a line 156. The RBCs are removed as described above by means of a functionally designed RBC removal station 158. The reaction mixture with the RBCs removed is fed via a line 160 into a WBC analyzer 162. The results from the analyzer 162 are then fed to a comparator 164 via a line 166, which provides a three-part WBC differentiation with results for monocytes (M), lymphocytes (L) and granulocytes (G).

Blandingen blir så ført til en neutrofil (N) funksjonsmessig konstruert fjernestasjon 168 via en linje 170. Neutrofilene kan nå bli fjernet fra blandingen ved å forskyve eller endre en parameter, slik som ugjennomskinneligheten, eller ved magnetisk fjerning, som er beskrevet ovenfor. I dette eksemplet er det spesielle neutrofile antilegemet, som er anvendt, beskrevet i US-søknad nr. 938864 med tittelen "Monoclonal antibody specific to neutrophils". The mixture is then taken to a neutrophil (N) functionally engineered removal station 168 via a line 170. The neutrophils can now be removed from the mixture by shifting or changing a parameter, such as the opacity, or by magnetic removal, as described above. In this example, the specific neutrophil antibody used is described in US Application No. 938864 entitled "Monoclonal antibody specific to neutrophils".

Blandingen med neutrofilene fjernet eller forskjøvet, blir så tilført en annen WBC-analysator 172 via en linje 174. Resultatene til analysatoren 172 blir så tilført komparatoren 164 via en linje 176. Resultatene til analysatoren 172 blir anvendt for å tilveiebringe en firedels WBC-differensiering med resultater igjen for monocytter og lymfocytter, men nå i tillegg siden neutrofiler er forskjøvne eller fjernede resultater fra eosinofiler (E) og basofiler (B) er tilveiebrakt. De to analytiske resultatene fra analysatorene 162 og 172 kan så bli sammenlignet med komparatoren 164 for å danne en femtedels WBC-differensiering. Subtrahering av antall B'er og E'er fra antall G'er resulterer i et antall fjernede N'er. The mixture with the neutrophils removed or displaced is then fed to another WBC analyzer 172 via a line 174. The results of the analyzer 172 are then fed to the comparator 164 via a line 176. The results of the analyzer 172 are used to provide a four-part WBC differentiation with results again for monocytes and lymphocytes, but now additionally since neutrophils are shifted or removed results from eosinophils (E) and basophils (B) are provided. The two analytical results from the analyzers 162 and 172 can then be compared with the comparator 164 to form a one-fifth WBC differentiation. Subtracting the number of B's and E's from the number of G's results in a number of removed N's.

Med henvisning til fig. 5A og 5B er vist to sett med spredningsdiagrammer som er tilveiebrakt av blodprøver som anvender en prototypeanalyseringsmetode lignende analysatoren 148. Den biologiske prøven 150 var en 20 mikroliter prøve med blod som ble blandet med 40 mikroliter magnetisk mikroskoperinger med RBC-spesifikt antilegeme bundet dertil blandet med 140 mikroliter bufferoppløsning for å danne reaktanten 154. Reaksjonsblandingen ble blandet i 15 sekunder og anbrakt i et magnetisk felt i 10 sekunder i stasjonen 158. Blandingen med fjernede RBC'er ble analysert av analysatoren 162 som vist i spredningsdiagrammet på fig. 5A som gir telleverdier for L'er lik 45,6 (1), M'er lik 5,6 (2) og G'er lik 48,7 (3). With reference to fig. 5A and 5B are shown two sets of scatterplots provided by blood samples using a prototype analysis method similar to the analyzer 148. The biological sample 150 was a 20 microliter sample of blood mixed with 40 microliters of magnetic microscopy samples with RBC-specific antibody bound thereto mixed with 140 microliters of buffer solution to form the reactant 154. The reaction mixture was mixed for 15 seconds and placed in a magnetic field for 10 seconds in the station 158. The mixture with removed RBCs was analyzed by the analyzer 162 as shown in the scatter diagram of FIG. 5A which gives count values for L's equal to 45.6 (1), M's equal to 5.6 (2) and G's equal to 48.7 (3).

Blandingen blir så kombinert ved stasjonen 168 med 10 mikroliter av magnetiske mikrosfærer med N spesifikke antilegemer bunner dertil. Blandingen blir så blandet i 30 sekunder og så anbrakt i det magnetiske feltet i 10 sekunder. Blandingen med således fjernede N'er ble matet til analysatoren 176 som resulterte i spredningsdiagrammet på fig. 5B som resulterer i telleverdiene for L'er lik 81,0 (1), M'er lik 0,6 (2), E'er lik 11,0 (3) og B'er lik 1,8 (4). Komparatoren 164 frembringer så femtedels WBC-telleforskjellen lik 45,6 L'er, 5,6 M'er, 41,6 N'er, 6,0 E'er og 1,2 B'er. Dette tilsvarer en standard mikroskopi femtedels WBC-differensiell som anvender Wright-flekking på prøven på et objektglass som resulterer i telleverdier på 44,9 L'er, 3,4 M'er, 45,0 N'er, 6,1 E'er og 0,4 B'er. The mixture is then combined at station 168 with 10 microliters of magnetic microspheres with N specific antibodies bound thereto. The mixture is then mixed for 30 seconds and then placed in the magnetic field for 10 seconds. The mixture with N's thus removed was fed to the analyzer 176 which resulted in the scatter plot of FIG. 5B which results in the count values for L's equal to 81.0 (1), M's equal to 0.6 (2), E's equal to 11.0 (3) and B's equal to 1.8 (4). Comparator 164 then produces the one-fifth WBC count difference equal to 45.6 L's, 5.6 M's, 41.6 N's, 6.0 E's, and 1.2 B's. This corresponds to a standard microscopy fifth WBC differential applying Wright stain to the specimen on a slide resulting in counts of 44.9 L's, 3.4 M's, 45.0 N's, 6.1 E' is and 0.4 B's.

Fig. 6 viser en ytterligere utførelsesform av en cellepopulasjons-analyseringsmetode og anordning for utførelse av denne metoden og som generelt er betegnet med henvisningstallet 178. Analysatoren 178 innbefatter en biologiske prøve 180.som igjen inneholder minst et første sett med levedyktige biologiske celler og som kan innbefatte en buffer. Fig. 6 shows a further embodiment of a cell population analysis method and device for carrying out this method and which is generally denoted by the reference number 178. The analyzer 178 includes a biological sample 180. which in turn contains at least a first set of viable biological cells and which can include a buffer.

Prøven 180 blandes via en linje 182 med en reaktant 184 via en linje 186. Funksjonsmessig vist, blir en første del med blandingen tilført via en linje 188 til en funksjonsmessig betegnet RBC og N f jernestasjon 190. RBCene og N'ene fjernes eller forskyves som beskrevet tidligere og første delen blir matet via en linje 192 til en WBC-analysator 194. The sample 180 is mixed via a line 182 with a reactant 184 via a line 186. Functionally, a first portion of the mixture is supplied via a line 188 to a functionally designated RBC and N remote station 190. The RBCs and N's are removed or displaced as described earlier and the first part is fed via a line 192 to a WBC analyzer 194.

Dette gir et resultat fra analysatoren 194 som er tilført en linje 196 til en komparator 198. Resultatet innbefatter ovenfornevnte firedels differensiering innbefattende M'er, L'er, E'er og B'er. This gives a result from the analyzer 194 which is supplied to a line 196 to a comparator 198. The result includes the aforementioned four-part differentiation including M's, L's, E's and B's.

Samtidig blir en andre del av blandingen til prøven 180 og reaktanten 184 matet via en linje 200 til en funksjonsmessig betegnet RBC-fjernestasjon 202. Blandingen med fjernede RBC'er blir matet via en linje 204 til en annen WBC-analysator 206. Resultatene for analysatoren 206 ble matet til komparatoren 198 via en linje 208. Resultatene for analysatoren 206 innbefatter direkte ovenfornevnte tredels WBC-dif ferensiering innbefattende M'er, L'er og G'er. Resultatet av analysatorene 194 og 206 sammenlignes så med komparatoren 198 for å tilveiebringe femtedels WBC-differensiering. Simultaneously, a second portion of the mixture of sample 180 and reactant 184 is fed via a line 200 to a functionally designated RBC removal station 202. The mixture of removed RBCs is fed via a line 204 to another WBC analyzer 206. The results for the analyzer 206 was fed to the comparator 198 via a line 208. The results for the analyzer 206 directly include the above-mentioned three-part WBC differentiation including M's, L's and G's. The output of analyzers 194 and 206 is then compared to comparator 198 to provide one-fifth WBC differentiation.

En bestemt analyseringsinstrumentutførelse som innbefatter fremgangsmåten og anordningen for analysatoren 178 er betegnet med henvisningstallet 210 på fig. 7. Kun en bestemt hardware-telling har blitt vist, men på samme måte som analyseringsinstrumentet 56, kan analyseringsinstrumentet 210 bli anvendt ved et utall sammenstillinger. A particular analyzing instrument embodiment which includes the method and arrangement for the analyzer 178 is designated by the reference numeral 210 in FIG. 7. Only one specific hardware count has been shown, but in the same way as the analysis instrument 56, the analysis instrument 210 can be used in countless combinations.

Instrumentet 210 innbefatter en aspiratorrensemekanisme 212 som er koplet til en prøvetagningsventil 214 via en linje 216. Ventilen 214 kan innbefatte en prøvesonde 218 for å suge opp biologiske prøver som er av interesse, slik som prøven 180. En fortynningsmiddelleverende pumpe 220 er koplet til ventilen 214 via en linje 222 for å tilveiebringe en fortynning av prøven, slik som en blodprøve, når ønskelig. En første del av blandingen er så koplet via en linje 224 og en linje 226 med en første blandeanordning 228. Samtidig er en andre del av blandingen matet via linjen 224 og en linje 230 til en andre blandeanordning 232. The instrument 210 includes an aspirator cleaning mechanism 212 that is connected to a sampling valve 214 via a line 216. The valve 214 may include a sample probe 218 for aspirating biological samples of interest, such as the sample 180. A diluent delivery pump 220 is connected to the valve 214. via a line 222 to provide a dilution of the sample, such as a blood sample, when desired. A first part of the mixture is then connected via a line 224 and a line 226 to a first mixing device 228. At the same time, a second part of the mixture is fed via line 224 and a line 230 to a second mixing device 232.

Blanderen 228 (sammenlignbar med stasjonen 190) er i det vesentlige identisk med blanderen 232 (sammenlignbar med stasjonen 202) og vil bli beskrevet først. Blanderen 228 innbefatter et blandekammer 234 i hvilket den første blandingsdelen er matet. Blanderen 228 innbefatter alle de forskjellige ovenfor beskrevne valgene og kan innbefatte en lyseringsinngangslinje 236 for RBC-lysering om ønskelig. Dersom analysen er anvendt etter blandingen som vist funksjonsmessig med henvisningstallet 238, så blir preparatet tilført via en preparatlinje 240. Endene blir samtidig fjernet ved å tilføre egnet magnetiske eller ikke-magnetiske mikrosfærer med N-spesifikke antilegeme under dertil fra en kilde med mikrosfærer 242 tilført kammeret 234 via en linje 244. Dersom magnetiske mikrosfærer anvendes for endene eller RBCene så blir en magnet 246 eller et magnetisk felt" anvendt for å fjerne de magnetisk bundne cellene. Mixer 228 (comparable to station 190) is substantially identical to mixer 232 (comparable to station 202) and will be described first. The mixer 228 includes a mixing chamber 234 into which the first mixture portion is fed. The mixer 228 includes all of the various options described above and may include a lysis input line 236 for RBC lysis if desired. If the analysis is used after the mixture as shown functionally with the reference number 238, then the preparation is added via a preparation line 240. The ends are simultaneously removed by adding suitable magnetic or non-magnetic microspheres with N-specific antibody underneath from a source with microspheres 242 added the chamber 234 via a line 244. If magnetic microspheres are used for the ends or RBCs then a magnet 246 or a magnetic field" is used to remove the magnetically bound cells.

Blandingen og den preparerte (når nødvendig) blandingen blir så matet via en linje 248 gjennom en ventil 250 og en linje 252 til en WBC-analysator 254 (en analysator 194). Analysatoren 254 er den samme som analysatoren 86 og vil ikke bli beskrevet nærmere igjen. Analysatoren 254 innbefatter igjen et avfølingskammer 256 med en apparatur 258 deri gjennom hvilken blandingen av cellene passerer. Et omhyllingsstrøm-ningsfluidsystem 260 kan være koplet til kammeret 256. Signalene generert av cellene blir detektert av en RF/DC-kilde og avfølingskretsen 262 hvis utgang er tilført en komparator 264 som tidligere beskrevet. The mixture and the prepared (when necessary) mixture are then fed via a line 248 through a valve 250 and a line 252 to a WBC analyzer 254 (an analyzer 194). The analyzer 254 is the same as the analyzer 86 and will not be described again. The analyzer 254 again includes a sensing chamber 256 with an apparatus 258 therein through which the mixture of cells passes. A sheath flow fluid system 260 may be connected to the chamber 256. The signals generated by the cells are detected by an RF/DC source and sensing circuit 262 whose output is applied to a comparator 264 as previously described.

Den andre blandingsdelen blir deretter matet til et blandekammer 266. Ved den andre delen er kun RBC'er fjernet (dvs. lik stasjonen 202 ) og RBCene kan bli fjernet ved at RBC-analysen er matet inn i kammeret 266 via en linje 268. Lyseringen er blandet med prøven og en preparering blir tillagt via en perpareringslinje 270. Alternativt kan RBCene fjernes ved magnetiske mikrosfærer med RBC-spesifikke antilegemer bundet dertil fra en mikrosfaerekilde 232 matet inn i kammeret 266 via en linje 274. Mikrosfærene er faste, funksjonsmessig ved 276, og de magnetisk bundne RBC-mikrosfærene fjernes ved hjelp av en magnet 278. The second mixing portion is then fed to a mixing chamber 266. At the second portion, only RBCs are removed (ie, similar to station 202 ) and the RBCs can be removed by feeding the RBC assay into the chamber 266 via a line 268. The lysis is mixed with the sample and a preparation is added via a preparation line 270. Alternatively, the RBCs can be removed by magnetic microspheres with RBC-specific antibodies bound thereto from a microsphere source 232 fed into the chamber 266 via a line 274. The microspheres are solid, functionally at 276, and the magnetically bound RBC microspheres are removed using a magnet 278.

Den fjernede RBC-blandingen blir så matet via en linje 280 til ventilen 250 og via linjen 252 til analysatoren 254 for å tilveiebringe ovenfornevnte resultater. Blandingene 228 og 232 innbefatter egnede respektive bremselinjer 282 og 284 og avfallslinjer 286 og 288 og en sonderenser 290 for å rense instrumentene 210 før oppsuging av neste prøve eller prøver for analysering. The removed RBC mixture is then fed via line 280 to valve 250 and via line 252 to analyzer 254 to provide the above results. The mixtures 228 and 232 include suitable respective brake lines 282 and 284 and waste lines 286 and 288 and a probe cleaner 290 to clean the instruments 210 before aspirating the next sample or samples for analysis.

Fig. 8A og 8B viser spredningsdiagramresultater tilveiebrakt av en blodprøve under anvendelse av en analyseringsmetode lignende den til analysatoren 178. Ved dette eksemplet utgjør 20 mikroliter av blodet prøven 180, mens 40 mikroliter av magnetiske mikrosfærer blandes med RBC-spesifikk antilegemer bundet dertil med 140 mikroliter bufferoppløsning som utgjør reaktanten 184. En del av blandingen blir så blandet i 20 sekunder i stasjonen 202 og så anbrakt i det magnetiske feltet i 10 sekunder. Den RBC-fjernede blandingen analyseres så i analysatoren 206 som resulterer i spredningsdiagrammet på fig. 8A som gir en telleverdi for L'er lik 29,4 (1), M'er lik 8,1 (2) og G'er lik 62,4 (3). Figs. 8A and 8B show scatter plot results provided by a blood sample using an analysis method similar to that of the analyzer 178. In this example, 20 microliters of the blood constitute the sample 180, while 40 microliters of magnetic microspheres are mixed with RBC-specific antibodies bound thereto with 140 microliters buffer solution constituting the reactant 184. A portion of the mixture is then mixed for 20 seconds in the station 202 and then placed in the magnetic field for 10 seconds. The RBC-removed mixture is then analyzed in the analyzer 206 resulting in the scatter plot of FIG. 8A which gives a count value for L's equal to 29.4 (1), M's equal to 8.1 (2) and G's equal to 62.4 (3).

Samtidig blir en annen del av samme blanding kombinert med 10 mikroliter med magnetiske mikrosfærer med N-spesifikke antilegemer bundet dertil for å fjerne RBC'er og N'er ved stasjonen 190. Blandingen blir blandet i 30 sekunder og så anbrakt i et magnetisk felt i 10 sekunder. Blandingen med N'er og RBC'er fjernet blir så analysert og analysatoren 194 som gir spredningsdiagrammer på fig. 8B som gir en telleverdi for L'er lik 73,5 (1), M'er lik 21,7 (2), E'er lik 3,4 (3) og B'er lik 1,4 (4). De to telleverdiene blir sammenlignet i komparatoren 198 som resulterer i en femtedels WBC-differen-sieringstelleverdi for L'er lik 29,4, M'er lik 8,0, N'er lik 60,8, E'er lik 1,2 og B'er lik 0,6. En mikroskopsammenligning ble igjen gjort som resulterte i telleverdier for L'er lik 29,4, M'er lik 5,0, N'er lik 65,0, E'er lik 1,0 og B'er mindre enn 1,0. Simultaneously, another portion of the same mixture is combined with 10 microliters of magnetic microspheres with N-specific antibodies bound thereto to remove RBCs and Ns at station 190. The mixture is mixed for 30 seconds and then placed in a magnetic field in 10 seconds. The mixture with N's and RBCs removed is then analyzed and the analyzer 194 which provides the scatter plots of FIG. 8B which gives a count value for L's equal to 73.5 (1), M's equal to 21.7 (2), E's equal to 3.4 (3) and B's equal to 1.4 (4). The two count values are compared in the comparator 198 resulting in a one-fifth WBC differential count value for L's equal to 29.4, M's equal to 8.0, N's equal to 60.8, E's equal to 1.2 and B is equal to 0.6. A microscope comparison was again made which resulted in count values for L's equal to 29.4, M's equal to 5.0, N's equal to 65.0, E's equal to 1.0 and B's less than 1.0 .

Fig. 9A og 9B viser spredningsdiagramresultater til en femtedels V/BC-dif f erensieringseksempel lignende det på fig. 8A og 8B. En 20 mikroliter prøve av blod ble analysert i samme trinnet som beskrevet med henvisning til fig. 8A og 8B og som resulterte i spredningsdiagrammet på fig. 9A som gir en telleverdi på L'er lik 35,4 (1), M'er lik 14,6 (2) og G'er lik 50,0 (3). Spredningsdiagrammet på fig. 9B gir en telleverdi for L'er lik 66,4 (1), M'er lik 25,0 (2), E'er lik Figs. 9A and 9B show scatterplot results of a fifth V/BC differentiation example similar to that of Figs. 8A and 8B. A 20 microliter sample of blood was analyzed in the same step as described with reference to fig. 8A and 8B and which resulted in the scatter plot of FIG. 9A which gives a count value of L's equal to 35.4 (1), M's equal to 14.6 (2) and G's equal to 50.0 (3). The scatter diagram in fig. 9B gives a count value for L's equal to 66.4 (1), M's equal to 25.0 (2), E's equal to

6,6 (3) og B'er lik 2,0 (4). Den resulterende femtedels WBC-differensieringen resulterer i telleverdier lik 35,4 L'er, 14,6 M'er, 45,5 N'er, 3,5 E'er og 1,1 B'er og blir sammenlignet med en mikroskoptelleverdi lik 36 L'er, 11 M'er, 49 N'er, 3 E'er og 1 B. 6.6 (3) and B is equal to 2.0 (4). The resulting one-fifth WBC differentiation results in counts equal to 35.4 L's, 14.6 M's, 45.5 N's, 3.5 E's and 1.1 B's and is compared to a microscope count equal to 36 L's, 11 M's, 49 N's, 3 E's and 1 B's.

Fig. 10A og 10B viser spredningsdiagramresultåtene til en femtedels WBC-differensiering igjen lignende den til fig. 8A, 8B og 9A, 9B, men ved dette eksemplet ble lysering anvendt. Ved dette eksemplet ble 20 mikroliter blod kombinert med 80 mikroliter buffer og 240 mikroliter med RBC-foretrukket lysering, som henvist til ovenfor. Blandingen blandes i 6 sekunder og så blir en preparering tilført. En tidsperiode er viktig på grunn av at lyseringen latt ikke-preparert i en tidsperiode større enn omkring 10 sekunder vil begynne å påvirke de viktige egenskapene til WBC'ene. Blandingen med RBCene som er fjernet analyseres for å tilveiebringe spredningsdiagrammene på fig. 10A som resulterer i telleverdier av L'er lik 25,7 (1), M'er lik 9,6 (2) og G'er lik 65,0 (3). Figs. 10A and 10B show the scatter diagram results of one-fifth WBC differentiation again similar to that of Figs. 8A, 8B and 9A, 9B, but in this example lysis was used. In this example, 20 microliters of blood were combined with 80 microliters of buffer and 240 microliters of RBC-preferred lysis, as referred to above. The mixture is mixed for 6 seconds and then a preparation is added. A period of time is important because the lysate left unprepared for a period of time greater than about 10 seconds will begin to affect the important properties of the WBCs. The mixture with the RBCs removed is analyzed to provide the scatter plots of Figs. 10A which results in count values of L's equal to 25.7 (1), M's equal to 9.6 (2) and G's equal to 65.0 (3).

En andre del av blandingen innbefatter en andre 20 mik-roliters prøve med blod kombineres med 120 mikroliter buffer og 10 mikroliter magnetiske mikrosfærer med N-spesifikke antilegemer bundet deri og blandet i 30 sekunder og så anbrakt i et magnetisk felt i 10 sekunder. RBC-fortrinnsvis lysering tillegges så til den N-fjernede blandingen som så blir blandet i 6 sekunder før den blir preparert. Det resulterende spredningsdiagrammet på fig. 10B resulterer i prosentvis telleverdier for L'er lik 74,6 (1), M'er 21,6 (2), E'er lik 2,9 (3) og B'er lik 0,8 (4). Den resulterende femtedels WBC-differensieringen resulterer i prosentvise telleverdier for L'er lik 25,6, M'er lik 9,6, N'er lik 63,5, E'er lik 1,06 og B'er lik 0,3. Igjen resulterte en mikroskopsammenligning i telleverdien for L'er lik 29,4, M'er lik 5,0, N'er lik 65,0, E'er lik 1,0 og B'er mindre enn 1. A second portion of the mixture includes a second 20 microliter sample of blood combined with 120 microliters of buffer and 10 microliters of magnetic microspheres with N-specific antibodies bound therein and mixed for 30 seconds and then placed in a magnetic field for 10 seconds. RBC-preferential lysis is then added to the N-removed mixture which is then mixed for 6 seconds before being prepared. The resulting scatterplot of Fig. 10B results in percentage count values for L's equal to 74.6 (1), M's equal to 21.6 (2), E's equal to 2.9 (3) and B's equal to 0.8 (4). The resulting one-fifth WBC differentiation results in percent count values for L's equal to 25.6, M's equal to 9.6, N's equal to 63.5, E's equal to 1.06, and B's equal to 0.3 . Again, a microscope comparison resulted in the count value for L's equal to 29.4, M's equal to 5.0, N's equal to 65.0, E's equal to 1.0 and B's less than 1.

Et annet eksempel på spredningsdiagram resulterer i en femtedels WBC-differensiering lik den på fig. 10A og 10B vist på fig. HA og 11B. En prøve på blod hadde to prøver samtidig analysert på samme trinn beskrevet med henvisning til fig. 10A og 10B. Spredningsdiagrammet på fig. 11A gir en telleverdi på L'er lik 31,9 (1), M'er lik 17,6 (2) og G'er lik 50,4 (3). Spredningsdiagrammet på fig. 11B gir en telleverdi av L'er lik 67,1 (1), IVTer lik 24,1 (2), E'er lik (7,6 (3) og B'er lik 1,2 (4). Den resulterende femtedels VJBC-dif f eren-sieringen resulterer i telleverdier på 31,9 L'er, 11,4 M'er, 46,0 N'er, 3,6 E'er og 0,7 B'er da sammenlignet med en mikroskoptelleverdi på 36 L'er, 11 M'er, 49 N'er, 3 E'er og 1 Another example scatterplot results in a one-fifth WBC differentiation similar to that in Fig. 10A and 10B shown in fig. HA and 11B. A sample of blood had two samples simultaneously analyzed at the same step described with reference to fig. 10A and 10B. The scatter diagram in fig. 11A gives a count value of L's equal to 31.9 (1), M's equal to 17.6 (2) and G's equal to 50.4 (3). The scatter diagram in fig. 11B gives a count value of L's equal to 67.1 (1), IVTs equal to 24.1 (2), E's equal to (7.6 (3) and B's equal to 1.2 (4). The resulting the fifth VJBC differentiation results in count values of 31.9 L's, 11.4 M's, 46.0 N's, 3.6 E's and 0.7 B's then compared to a microscope count value of 36 L's, 11 M's, 49 N's, 3 E's and 1

B. B.

En ytterligere utførelsesform av cellepopulasjonsanalyse-ringsmetoden og en anordning for utførelse av denne metoden er betegnet med henvisningstallet 292 vist på fig. 12. Analysatoren 292 innbefatter en biologisk prøve 294 som igjen innbefatter et første sett med levedyktige biologiske celler og innbefatter en buffer om ønskelig. A further embodiment of the cell population analysis method and a device for carrying out this method is denoted by reference number 292 shown in fig. 12. The analyzer 292 includes a biological sample 294 which in turn includes a first set of viable biological cells and includes a buffer if desired.

Prøven 294 kombineres via en linje 296 med i det minste en reaktant 298 via en linje 300. Ved analysatoren 292 fjernes RBC'er og N'er forskyves sekvensielt for samtidig i en funksjonsmessig betegnet stasjon 302. RBC-fjernefunksjonen er betegnet med 304 og N-bevegelsen eller forskyvningsdelen er betegnet med henvisningstallet 306 for å indikere at funksjonene kan bli utført samtidig og sekvensmessig. RBCene kan bli fjernet magnetisk eller ved lysering eller med en kombinasjon av de to som tidligere beskrevet. N'ene blir fjernet eller forskjøvet ved å tillegge mikrosfærer med et spesifikt antilegeme bundet dertil til blandingen. The sample 294 is combined via a line 296 with at least one reactant 298 via a line 300. At the analyzer 292, RBCs are removed and Ns are sequentially displaced simultaneously in a functionally designated station 302. The RBC removal function is designated by 304 and N - the movement or displacement portion is designated by reference numeral 306 to indicate that the functions may be performed simultaneously and sequentially. The RBCs can be removed magnetically or by lysis or by a combination of the two as previously described. The N's are removed or shifted by adding microspheres with a specific antibody bound thereto to the mixture.

Så snart RBCen er fjernet og N'ene er beveget eller forskjøvet, blir den resulterende blandingen tilført en linje 308 til en analysator 310. N'ene blir i dette tilfellet forskjøvet tilstrekkelig fra mønsteret til E'ene og B'ene, slik at en femtedels WBC-differensiering av M'ene, L'ene, E'ene, B'ene og N'ene blir direkte tilveiebrakt. Funksjonene til analysatoren 292 kan bli utført enten av instrumentene 56 og 210 eller varianter derav. Once the RBC is removed and the N's are moved or shifted, the resulting mixture is fed to a line 308 to an analyzer 310. The N's are in this case shifted sufficiently from the pattern of the E's and B's so that a one-fifth WBC differentiation of the M's, L's, E's, B's and N's is directly provided. The functions of the analyzer 292 may be performed either by the instruments 56 and 210 or variations thereof.

Spredningsdiagrammet som resulterer av et eksempel på en direkte femtedels V/BC-dif f erensiering i samsvar med analysatoren 292 er vist på fig. 13. I dette eksemplet er den biologiske prøven 294 20 mikroliter med blod og reaktanten 298 er 10 mikroliter med ikke-magnetiske mikrosfærer med N-spesifikke antilegemer bunder dertil kombinert med 100 mikroliter buffer og blandet i delstasjonen 306 i 30 sekunder. RBC-fortrinnslyseringsmiddel, 240 mikroliter derav, blir så tillagt blandingen som er blandet i delstasjonen 304 i 6 sekunder etter at prepareringen er tillagt. RBC-fjernet og N-forskjøvet blanding blir så analysert av analysatoren 310 som resulterer i spredningsdiagrammet på fig. 13 som gir en direkte telleverdi for 29,6 L'er, 13,6 M'er, 52,2 N'er, 3,4 E'er og 1,06 B'er da sammenlignet med en mikroskop-bestemmelse av 35 L'er, 5 M'er, 56 N'er, 4 E'er og ingen B'er. Ved dette spesielle eksemplet ble blodprøven også analysert på et generelt celletellingsinstrument fra Coulter Electronics, Inc., som resulterte i 29 L'er, 11,1 M'er og 59,9 G'er (N'er, E'er og B'er). The scatter plot resulting from an example of a direct fifth V/BC differentiation in accordance with the analyzer 292 is shown in FIG. 13. In this example, the biological sample 294 is 20 microliters of blood and the reactant 298 is 10 microliters of non-magnetic microspheres with N-specific antibodies bound thereto combined with 100 microliters of buffer and mixed in substation 306 for 30 seconds. RBC preferential lysing agent, 240 microliters thereof, is then added to the mixture mixed in substation 304 for 6 seconds after the preparation is added. The RBC-removed and N-shifted mixture is then analyzed by the analyzer 310 resulting in the scatter plot of FIG. 13 which gives a direct count value of 29.6 L's, 13.6 M's, 52.2 N's, 3.4 E's and 1.06 B's then compared to a microscope determination of 35 L's, 5 M's, 56 N's, 4 E's and no B's. In this particular example, the blood sample was also analyzed on a general cell counting instrument from Coulter Electronics, Inc., which resulted in 29 L's, 11.1 M's, and 59.9 G's (N's, E's, and B 'is).

Mange modifikasjonér og variasjoner av foreliggende oppfinnelse er mulig i lys av ovenfornevnte teknikk. Prøvene 12, 42, 150, 180 og 294 kan innbefatte fullblod, menneske-legemets fluider inneholdende celler, eller andre fluider som inneholder formede legemer, slik som bakterie, viruser og sopp. Volumet av mikrosfærene er gitt i vekt av mikrosfærer pr. volum med oppløsning. Det skal derfor bemerkes at det vil være mulig med modifikasjoner innenfor rammen av oppfinnelsen slik som angitt i kravene. Many modifications and variations of the present invention are possible in light of the above-mentioned technique. The samples 12, 42, 150, 180 and 294 may include whole blood, human body fluids containing cells, or other fluids containing shaped bodies, such as bacteria, viruses and fungi. The volume of the microspheres is given in weight of microspheres per volume with resolution. It should therefore be noted that it will be possible to make modifications within the scope of the invention as stated in the claims.

Claims

1. Method of providing a multipart white blood cell population differentiation, which differentiation cannot be otherwise provided, from a whole blood sample having at least one red blood cell population and white blood cell populations therein for identification and/or counting and/or study, including removal of the red the blood cell population from the sample without adversely affecting relevant qualities and/or quantities of said white blood cell populations, characterized by electronic sensing and counting of at least said white blood cell populations of granulocytes, monocytes and lymphocytes, to provide a total count of white blood cell populations, removing or shifting the neutrophil population contribution from said white blood cell populations by providing microspheres having a neutrophil specific monoclonal antibody bound thereto and mixing said microspheres with the sample to bind said neutrophil population thereby providing electronic sensing of eosinophils and basophils, electronic sensing and counting of at least the other white blood cell populations of monocytes, lymphocytes, eosinophils and basophils, and comparing said count values to provide a count value for said white blood cell population with neutrophils and thereby providing at least a fivefold white blood cell differentiation.

2. Method according to claim 1, characterized by electronic sensing and counting of at least said white blood cell populations of granulocytes, monocytes and lymphocytes in a first part of said sample to provide a total count of the white blood cell populations, removing the neutrophil population contribution from said white blood cell population without adversely affecting relevant qualities and/or quantities of said white blood cell populations by providing microspheres having a neutrophil-specific monoclonal antibody bound thereto, and mixing said microspheres with said sample to bind said neutrophil population thereby providing electronic sensing of eosinophils and basophils, electronic sensing and counting of at least the said other white blood cell populations of monocytes, lymphocytes, eosinophils and basophils from a second part of said sample, and comparing said count values from said first and second parts to derive a count value for said white blood cell population of neutrophils and thereby providing at least a five-part white blood cell differential.

3. Method according to claim 1 or 2, characterized by changing the neutrophil population-characteristic electronic sensing contribution in relation to the other white blood cell populations by providing microspheres that have a neutrophil-specific monoclonal antibody bound to them, and mixing said microspheres with said sample for binding said neutrophil population to change in the at least one electronic characteristic of said neutrophil population and thereby providing electronic sensing of eosinophils and basophils, and electronic sensing and counting of at least said white blood cell populations of monocytes, lymphocytes, neutrophils, eosinophils and basophils and thereby providing at least five-fold white blood cell differentiation.

4. Method for determining at least one white blood cell population or population subset, which cannot be determined in any other way, in a whole blood sample or part thereof for identification and/or counting and/or study, characterized by removing or changing the characteristic electronic sensing contribution from at least one white blood cell population or population subgroup in relation to other white blood cell populations or subgroup populations, by binding microspheres to at least one of said white blood cell populations or subgroups thereof, which have a at least one of said white blood cell populations or subsets thereof specific monoclonal antibody bound to it, and electronic sensing and analysis or direct counting of at least said removed or shifted population for providing the contribution of said removed or shifted population to said sample.

5. Method according to claim 4 for providing an analysis of white blood cell populations, which analysis cannot be provided in any other way, of a whole blood sample with at least one red blood cell population and white blood cell populations therein, whereby further at least one of said white blood cell populations has in it at least two subsets, including removal of the red blood cell population from the sample without adversely affecting relevant qualities and/or quantities of the white blood cell populations, characterized by removal or replacement of at least one contribution from a selected specific white blood cell population of a subset of the white blood cell populations, by binding to said subset of white blood cell populations microspheres, which have a monoclonal antibody specific for said subgroup bound to them, and electronic sensing and analysis of said removal or changed subgroup of white blood cell populations and said selected white blood cell population for the determination of at least one characteristic of said selected blood cell population.

6. Method according to claim 4 for determining at least one white blood cell population or population subgroup, which cannot be determined in any other way, in a whole blood sample or part thereof for identification and/or counting and/or study, characterized by shifting the characteristic electronic sensing contribution from at least one white blood cell population or population subgroup in relation to other white blood cell populations or subgroup populations, by binding microspheres to at least one of said white blood cell populations or subgroups thereof, which have a for at least one of said white blood cell populations or subsets thereof specific monoclonal antibody bound to them, and electronic sensing and direct counting of at least said shifted population with at least two different electronic parameters for providing the contribution from said shifted population to said sample.

7. Method according to claim 4 for providing an analysis of at least one white blood cell population or population subset, which analysis cannot be provided in any other way, for identification and/or counting and/or study, from a whole blood sample with at least white blood cell populations therein, including at least a subset of a white blood cell population, characterized by electronic sensing and counting of at least the white blood cell populations and subsets thereof to provide an initial total count, removal of at least one of the white blood cell populations or a subset thereof by attaching microspheres to at least one of said white blood cell populations or a subset thereof, which have a monoclonal antibody specific for said white blood cell populations or a subset thereof bound to them , electronic sensing and counting of at least the other white blood cell populations without the removed population or subset to provide a second count, comparison of said count value with those provided or derived by at least one of (a) the other white blood cell populations without the removed population or subset, (b) the removed white blood cell population or subset population, or (c) both the others and the removed white blood cells the blood cell populations.

8. Method according to claim 4 for providing an analysis of at least one white blood cell population or population group, which analysis cannot be provided in any other way, for the identification and/or counting and/or study of a whole blood sample with at least white blood cell populations therein including at least a subset of a white blood cell population, characterized by electronic sensing and counting of at least the white blood cell populations and subsets thereof to provide an initial total count, changing at least one of the white blood cell populations or a subset thereof, by attaching microspheres to at least one of said white blood cell populations or a subset thereof, which have a monoclonal antibody specific for said white blood cell populations or a subset thereof bound to them , electronic sensing and counting of at least one of (a) the other white blood cell populations without the changed population or subgroup, (b) the changed white blood cell population or subgroup population, or (c) both the other and the changed white blood cell population the lation, and comparison of said count value with provided or derived from an analysis of at least one of (a) the other white blood cell populations without the shifted population or subset, (b) the shifted white blood cell population or subset population, or (c) both the other and the altered white blood cell population.