NO164444B

NO164444B - DEVICE FOR USE IN QUALITATIVE AND / OR QUANTITATIVE DETERMINATION OF A CHEMICAL, BIOCHEMICAL OR BIOLOGICAL COMPONENT IN A SAMPLE.

Info

Publication number: NO164444B
Application number: NO84843322A
Authority: NO
Inventors: Derek Geoffrey Layton; Alan Martin Smith; John Horace Fisher; Robert Martin Pettigrew; Satham Petty-Saphon
Original assignee: Ares Serono Nv
Priority date: 1982-12-21
Filing date: 1984-08-20
Publication date: 1990-06-25
Also published as: NO843322L; NO164444C

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en anordning for kvalitativ og/eller kvantitativ påvisning av kjemiske, biokjemiske eller biologiske bestanddeler i en prøve, slik som angitt i krav l's ingress, samt en fremgangsmåte som angitt i kravene 5-8. The present invention relates to a device for qualitative and/or quantitative detection of chemical, biochemical or biological components in a sample, as stated in the preamble of claim 1, as well as a method as stated in claims 5-8.

Fremgangsmåten er basert på affiniteten av bestanddelen som skal analyseres for et mottagende materiale, eksempelvis en ligand eller en spesiell bindingspartner, hvilket mottagende materiale er belagt på en spesiell overflatetype. The method is based on the affinity of the component to be analyzed for a receiving material, for example a ligand or a special binding partner, which receiving material is coated on a special type of surface.

I henhold til ett trekk ved foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt en fremgangsmåte for kvalitativ og/eller kvantitativ påvisning av en kjemisk, biokjemisk eller biologisk bestanddel i en prøve, under anvendelse av foreliggende anordning, som er særpreget ved det som er angitt i krav l's karakteriserende del, og hvor ytterligere trekk fremgår av kravene 2-4, ved at man a) bringer anordningens belagte overflate i kontakt med prøven, og b) observerer den for-formede overflates optiske egenskaper for å bestemme en kvalitativ og/eller kvantitativ forandring i optiske egenskaper som følge av bestanddelens binding til den tynne film på anordningens overflate. According to one feature of the present invention, a method for the qualitative and/or quantitative detection of a chemical, biochemical or biological component in a sample, using the present device, is provided, which is characterized by what is stated in claim l's characterizing part, and where further features appear from claims 2-4, by a) bringing the device's coated surface into contact with the sample, and b) observing the pre-formed surface's optical properties to determine a qualitative and/or quantitative change in optical properties as a result of the component's binding to the thin film on the device's surface.

I en første utførelsesform av foreliggende fremgangsmåte In a first embodiment of the present method

blir de optiske egenskaper for den for-formede overflate observert før og etter trinn (a) for å bestemme en eventuell forandring i optiske egenskaper som en følge av at bestanddelene blir bundet til det mottagende materiale i det tynne filmbelegg på den for-formede overflate. I en annen utfø-relsesform blir de optiske egenskaper for den for-formede overflate observert under trinn (a) for å bestemme forandringen i optiske egenskaper. the optical properties of the pre-formed surface are observed before and after step (a) to determine any change in optical properties as a result of the constituents being bound to the receiving material in the thin film coating on the pre-formed surface. In another embodiment, the optical properties of the pre-formed surface are observed during step (a) to determine the change in optical properties.

I henhold til et andre trekk ved foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt en anordning for anvendelse i en fremgangsmåte som ovenfor definert, hvilken anordning omfatter et substrat med en forformet overflate som er optisk aktiv med hensyn til bestråling i det minste over et forhåndsbestemt bølgelengde-bånd og minst en forhåndsbestemt del av den for-formede overflate er belagt med en tynn film av et materiale som er i stand til å binde en forhåndsbestemt kjemisk-, biokjemisk- According to a second feature of the present invention, there is provided a device for use in a method as defined above, which device comprises a substrate with a preformed surface which is optically active with regard to irradiation at least over a predetermined wavelength band and at least a predetermined part of the pre-formed surface is coated with a thin film of a material capable of binding a predetermined chemical, biochemical

eller biologisk bestanddel. or biological component.

Den for-formede overflate er fortrinnsvis et gitter. Et enkelt gitter kan anvendes eller overflaten kan omfatte to eller flere gittere anordnet gjensidig i en vinkel. Når det er to slike gittere kan de være gjensidig ortogonale. Profilen av gitteret eller hvert gitter er fordelaktig firkantbølget eller sinusformede. Sagbladede profiler er også mulige men er for tiden ikke foretrukne. The pre-formed surface is preferably a grid. A single grid can be used or the surface can comprise two or more grids arranged mutually at an angle. When there are two such lattices they can be mutually orthogonal. The profile of the grating or each grating is advantageously square wave or sinusoidal. Saw blade profiles are also possible but are currently not preferred.

Den for-formede overflate kan alternativt omfatte en regulær rekke av utstikninger. Med en overflate av denne type vil inn-retningen av toppene av utstikningene og utsparingene derimel-lom tilsvare kanter og fordypninger i en gittertypestruktur. The pre-formed surface can alternatively comprise a regular series of protrusions. With a surface of this type, the alignment of the tops of the protrusions and the recesses therebetween will correspond to edges and recesses in a grid-type structure.

Den tynne film av det mottagende materialet kan være belagt The thin film of the receiving material may be coated

på den for-formede overflate slik at de blir avsatt kun i utsparingene i gitteret eller i fordypningene mellom utstikningene. Et monomolekylært lag av det mottagende materialet vil være tilstrekkelig og generelt foretrukket enten belegget er begren-set til fordypningene eller ikke. on the pre-formed surface so that they are deposited only in the recesses in the grid or in the depressions between the protrusions. A monomolecular layer of the receiving material will be sufficient and generally preferred whether the coating is limited to the recesses or not.

Overflatestrukturen for den for-formede overflate og spesielt dimensjonene for overflatens relieffmønster vil bli valgt i henhold til naturen av bestanddelen som skal analyseres. Generelt er det funnet at tre områder av overflatedybde (topp- til-bunn målinger) er fordelaktige. I den første har gitteret eller hvert av gitterene eller utstikningene en dybde i området 10-50 nm. The surface structure of the pre-formed surface and in particular the dimensions of the surface relief pattern will be chosen according to the nature of the constituent to be analyzed. In general, three ranges of surface depth (top-to-bottom measurements) have been found to be beneficial. In the first, the grid or each of the grids or protrusions has a depth in the range of 10-50 nm.

I den andre er dybdeområdet 50-200 nm; og i den tredje er dybden i området 200-2000 nm. For den første av disse tre områder er stigningen (perioden) for den ene eller hver av gitterene eller periodene for utstikningene fordelaktig større enn deres dybde, strukturen tilsvarer således et grunt gitter. For det andre og tredje området er stigningen (perioden) for den eller hver av gitterene eller periodisiteten for utstikningene fordelaktig In the second, the depth range is 50-200 nm; and in the third the depth is in the range 200-2000 nm. For the first of these three areas, the pitch (period) of one or each of the gratings or the periods of the protrusions is advantageously greater than their depth, the structure thus corresponding to a shallow grating. For the second and third areas, the pitch (period) of the or each of the gratings or the periodicity of the protrusions is advantageous

av same størrelsesorden som deres dybde. of the same order of magnitude as their depth.

I en første gruppe utførelsesformer er den for-formede overflate strukturert slik at den er optisk aktiv med hensyn til stråling hvis bølgelengde ligger i området 700-1500 nm. I In a first group of embodiments, the pre-formed surface is structured so that it is optically active with regard to radiation whose wavelength lies in the range 700-1500 nm. IN

den andre gruppe utførelsesformer er den for-formede overflate strukturert slik at den er optisk aktiv for stråling hvis bølgelengde faller innen området 3500-7000 nm. in the second group of embodiments, the pre-formed surface is structured so that it is optically active for radiation whose wavelength falls within the range of 3500-7000 nm.

Passende er substratet som bærer den for-formede overflate dannet av et plastmateriale. Plastmaterialer som er herdbare ved UV bestråling er foretrukne og spesielt akrylsyre- eller polyestermateriale kan med fordel anvendes. Et for tiden foretrukket plastmateriale er polymetylmetakrylat. Et plastsubstrat som anvendes ved oppfinnelsen har fortrinnsvis en brytningsindeks i området 1,25-1,6 og mere foretrukket en brytningsindeks på ca. 1,4. Et alternativt substrat er plast belagt med' et syntetisk polymert materiale. Suitably, the substrate carrying the pre-shaped surface is formed of a plastic material. Plastic materials that can be cured by UV irradiation are preferred and especially acrylic acid or polyester material can be used with advantage. A currently preferred plastic material is polymethyl methacrylate. A plastic substrate used in the invention preferably has a refractive index in the range 1.25-1.6 and more preferably a refractive index of approx. 1.4. An alternative substrate is plastic coated with a synthetic polymeric material.

Den aktive overflate av substratet (dvs. den overflate som er eller bærer den for-formede overflate) kan utgjøres av et metall eller et metall-lag. Således kan et plastsubstrat, eksempelvis polymetylmetakrylat hvorpå kan være vedheftet et metall-lag som utgjør den forformede overflate (eksempelvis en enkel gitterstruktur med en dybde på ca". 250 nm og en periode på ca. 400 nm),. Med en slik struktur kan plast/metallgrenseflaten være plan eller kan følge overflatestrukturen av selve metall-laget. Det anvendte metall som anvendes for å forme slike lag kan være gull, sølv, kobber eller aluminium. Alternativt kan den aktive overflate av substratet bestå av et uorganisk oksyd eller et lag derav. Det uorganiske oksyd er fortrinnsvis et oksyd av sølv, kobber eller aluminium. Et slikt oksydlag kan tilveiebringes ved å bringe eller tillate oksydasjon av overflaten av et metallsubstrat eller av et metall-lag som vedhefter til et substrat av et annet materiale. Når det finnes et lag av metall elier et lag av et uorganisk oksyd som ovenfor beskrevet har laget fortrinnsvis en tykkelse på 5-50 nm, mere foretrukket 10-30 nm. The active surface of the substrate (ie the surface which is or carries the pre-formed surface) can be made up of a metal or a metal layer. Thus, a plastic substrate, for example polymethyl methacrylate, on which a metal layer can be attached which constitutes the preformed surface (for example a simple lattice structure with a depth of approx. 250 nm and a period of approx. 400 nm). With such a structure, the plastic/metal interface can be flat or can follow the surface structure of the metal layer itself. The metal used to form such layers can be gold, silver, copper or aluminium. Alternatively, the active surface of the substrate can consist of an inorganic oxide or a layer thereof. The inorganic oxide is preferably an oxide of silver, copper or aluminum. Such an oxide layer can be provided by bringing about or allowing oxidation of the surface of a metal substrate or of a metal layer adhering to a substrate of another material. When the there is a layer of metal or a layer of an inorganic oxide as described above preferably has a thickness of 5-50 nm, more preferably 10-30 nm.

Passende er substratet laminært og i strimmelform. Dette mulig-gjør anvendelse av en artikkel i henhold til oppfinnelsen ved utførelse av en analyse. Suitably, the substrate is laminar and in strip form. This enables the use of an article according to the invention when performing an analysis.

Observasjonene av de optiske egenskaper i trinn (c) ved foreliggende fremgangsmåte kan finne sted ved transmisjon eller refleksjon. En sone av den for-formede overflate av substratet kan forbli fri for belegget av det mottagende materialet og fremgangsmåten kan utføres ved at denne sone holdes fri fra prøven, i trinn (b), eller ved å bringe hele den for-formede overflate, innebefattende den nevnte sone, med prøven. The observations of the optical properties in step (c) of the present method can take place by transmission or reflection. A zone of the pre-formed surface of the substrate can remain free of the coating of the receiving material and the method can be carried out by keeping this zone free from the sample, in step (b), or by bringing the entire pre-formed surface, including the said zone, with the sample.

Den sistnevnte teknikk er fordelaktig ved at eventuelle optiske effekter forårsaket av bestanddelene i prøven, bortsett fra den bestanddel som skal analyseres vil innvirke likt på den belagte og ubelagte sone og vil således eliminere hverandre når man utfører en sammenligning mellom den belagte og ubelagte sone. Et tostrålet belysningssystem kan anvendes i trinn (c) ifølge fremgangsmåten hvor en av strålene er rettet på den ubelagte sone av den for-formede overflate og den andre av de to stråler rettes mot en del av den belagte sone av den for-formede overflate. Fortrinnsvis anvendes monokromatisk bestråling. Når substratet og den for-formede overflate utgjøres av et plastmateriale og observasjonene av de optiske egenskaper av overflaten kan utføres ved transmisjon så er det foretrukket at den ubelagte, for-formede overflate, når den betraktes i transmisjon normalt til planet av overflaten bør ha en transmisjon som ikke overstiger 1% for den stråling som anvendes. The latter technique is advantageous in that any optical effects caused by the components in the sample, apart from the component to be analyzed, will affect the coated and uncoated zone equally and will thus cancel each other out when a comparison is made between the coated and uncoated zone. A two-beam lighting system can be used in step (c) according to the method where one of the beams is directed at the uncoated zone of the pre-shaped surface and the other of the two beams is directed at part of the coated zone of the pre-shaped surface. Monochromatic irradiation is preferably used. When the substrate and the pre-formed surface are made of a plastic material and the observations of the optical properties of the surface can be carried out by transmission, then it is preferred that the uncoated, pre-formed surface, when viewed in transmission normal to the plane of the surface, should have a transmission that does not exceed 1% for the radiation used.

For å oppnå optimale resultater når foreliggende fremgangsmåte anvendes for kvantitativ analyse så kan det være fordelaktig å kalibrere det belagte substrat ved først å utføre analysetek-nikken under anvendelse av en prøve som inneholder en kjent andel av bestanddelen som skal analyseres eller bestemmes. In order to achieve optimal results when the present method is used for quantitative analysis, it may be advantageous to calibrate the coated substrate by first performing the analysis technique using a sample containing a known proportion of the component to be analyzed or determined.

Foreliggende oppfinnelse er eksempelvis anvendbar for under-søkelse av en biologisk væske, eksempelvis en blodprøve for spesifikke antigene molekyler. I et slikt tilfelle vil mottagermaterialet som er i stand til å binde bestanddelene som skal bestemmes omfatte antistoffer for det aktuelle antigen. ALfcer-nativt er det mulig å anvende et antigen som mottagende materiale for å undersøke en prøve med hensyn til antilegemer. The present invention is, for example, applicable to the examination of a biological fluid, for example a blood sample for specific antigenic molecules. In such a case, the recipient material capable of binding the constituents to be determined will comprise antibodies for the relevant antigen. Naturally, it is possible to use an antigen as receiving material to examine a sample for antibodies.

Når det mottagende materialet utgjøres av antilegemer er det-foretrukket at disse er monoklonale antilegemer. Antigener og antilegemer forekommer i et vidt område av molekylære dimensjoner og overflatestrukturen av den for-formede overflate vil delvis bestemmes av størrelsen av de aktuelle molekyler. Eksempelvis vil antigener fra parasittinfeksjoner When the receiving material consists of antibodies, it is preferred that these are monoclonal antibodies. Antigens and antibodies occur in a wide range of molecular dimensions and the surface structure of the pre-formed surface will be partly determined by the size of the relevant molecules. For example, antigens from parasitic infections

typisk ligge i størrelsesområdet 0,5-10 um, for disse antigener vil en gitterstigning større enn 6 um og fortrinnsvis større enn 10 pm være ønsket. Generelt er det ønskelig at gitterstig-ningen er av størrelsesorden to ganger antigenstørrelsen. typically lie in the size range 0.5-10 µm, for these antigens a lattice pitch greater than 6 µm and preferably greater than 10 µm will be desired. In general, it is desirable that the lattice pitch is of the order of twice the antigen size.

Oppfinnelsen er også anvendbar for utførelse av bestemmelse av andre kjemiske-, biokjemiske- eller biologiske bestanddeler, eksempelvis ioniske bestanddeler. Oppfinnelsen kan eksempelvis anvendes for å bestemme ioneinnholdet i en prøve. Mottagermaterialet kan eksempelvis være en chelaterende forbindelse eller enzym eller en chelaterende organisme som utgjør en spesifikk bindingspartner av liganden eller ionet som skal bestemmes. Generelt kan enzymet eller organismen være en eller flere av The invention is also applicable for carrying out the determination of other chemical, biochemical or biological components, for example ionic components. The invention can, for example, be used to determine the ion content in a sample. The recipient material can, for example, be a chelating compound or enzyme or a chelating organism that constitutes a specific binding partner of the ligand or ion to be determined. In general, the enzyme or organism may be one or more of

de følgende: et polypeptid, et steroid, et sakkarid eller poly-sakkarid, et proteoglycan, et nukleotid, en nukleinsyre, en protonukleinsyre, en mikrobiell celle eller gjær. the following: a polypeptide, a steroid, a saccharide or polysaccharide, a proteoglycan, a nucleotide, a nucleic acid, a protonucleic acid, a microbial cell or yeast.

Anvendelsen av foreliggende oppfinnelse ligger således ikke bare innen det medisinske diagnosefelt, men også generelt innen feltet prosesskontroll. The application of the present invention is thus not only within the field of medical diagnosis, but also generally within the field of process control.

Den tynne film av mottagende materiale er fortrinnsvis fast bundet til den for-formede overflate av substratet. Mottagermaterialet kan således være bundet med elektrostatiske- eller kovalente bindinger til substratet. The thin film of receiving material is preferably firmly bonded to the pre-formed surface of the substrate. The recipient material can thus be bound by electrostatic or covalent bonds to the substrate.

Observasjon i trinn (b) i henhold til foreliggende fremgangsmåte kan utføres med polarisert lys. I en spesiell teknikk foreligger den for-formede overflate av substratet i form av et enkelt gitter med firkantbølge eller sinusformet profil og de optiske egenskaper av overflaten observeres i trinn (b) ved å overvåke vinkelstillingen ved hvilken det forekommer en skarp reduksjon (dip) i refleksjon når overflaten observeres eller scannes med polarisert bestråling av en forhåndsbestemt bølgelengde. Den anvendte bestråling er .fortrinnsvis lys og polarisasjonen bør være på tvers av sporene i gitteret. Observation in step (b) according to the present method can be carried out with polarized light. In a special technique, the pre-formed surface of the substrate is in the form of a single grating with a square wave or sinusoidal profile and the optical properties of the surface are observed in step (b) by monitoring the angular position at which there is a sharp reduction (dip) in reflection when the surface is observed or scanned with polarized irradiation of a predetermined wavelength. The irradiation used is preferably light and the polarization should be across the slots in the grating.

En for tiden foretrukket anordning i henhold til oppfinnelsen består av en profilert plaststrimmel, fortrinnsvis fremstilt ved hjelp av en presse-støpeteknikk og hvor materialet har en brytningsindeks i størrelsesorden 1,4 og en transmisjon som ikke overstiger 1%. Strimmelprofilen kan være den for et enkelt gitter med kvadratiske spor dimensjonert for null order under-trykkelse over et bølgelengdeområde. Imidlertid kan andre profiler og dimensjoner anvendes om ønsket som muliggjør dif-fraksjonseffektivitet i spesielle ordener til å bli forsterket eller undertrykket. A currently preferred device according to the invention consists of a profiled plastic strip, preferably produced using a press molding technique and where the material has a refractive index of the order of 1.4 and a transmission that does not exceed 1%. The strip profile can be that of a single square slot grating sized for zero order suppression over a wavelength range. However, other profiles and dimensions can be used if desired which enable diffraction efficiency in particular orders to be enhanced or suppressed.

En artikkel i henhold til oppfinnelsen kan ha et antall soner hvorav hver er belagt med et forskjellig mottagermateriale. An article according to the invention can have a number of zones, each of which is coated with a different receiver material.

På denne måte kan én enkelt artikkel, eksempelvis i form av In this way, a single article, for example in the form of

en strimmel anvendes for å bestemme et antall forskjellige bestanddeler, eksempelvis antigener i en blodprøve eller metall-ioner i et biokjemisk fluidum eller i et industrielt avløp. a strip is used to determine a number of different components, for example antigens in a blood sample or metal ions in a biochemical fluid or in an industrial effluent.

For tilfellet med et .gitter med kvadratisk profil og hvis stigningen er d, sporhøyden h og brytningsindeksen n så vil null-ordens diffraktert lys for bølgelengde W bli undertrykket for h = W/2(n-l), mens første ordens avbøyet lys vil avgis ved vinkler gitt av sin 0 = + W/d. For anvendelse ved blodprøvetaging med en gitterstigning på ca. 6 pm og en bølgelengde for lyskilden på 550 nm (grønt) så er h = 0,69 ,um; 0 = + 5,2°. For the case of a .grating with a square profile and if the pitch is d, the slot height h and the refractive index n then the zero-order diffracted light of wavelength W will be suppressed for h = W/2(n-l), while the first-order deflected light will be emitted at angles given by sin 0 = + W/d. For use in blood sampling with a grating pitch of approx. 6 pm and a wavelength for the light source of 550 nm (green) then h = 0.69 .um; 0 = + 5.2°.

Prinsippet for analysemetoden er at mottagermaterialet, eksempelvis antilegemer belagt på gitteret typisk er små molekyler med størrelse på ca. 10 nm og er således for små til å -gi noen størrelse eller formavhengig lysspredning. Imidlertid har antigenene som knyttes til antilegemene, når en blodprøve føres på gitteret, en størrelse av samme størrelsesorden for bølgelengden for det påfallende lys og vil således ha en effekt tilsvarende den som å fylle noen av gitterets spor med vann (brytningsindeks 1,33). Dette betyr lor tilfellet av et gitter med det ovenfor ytre dimensjoner at null-ordens lys ikke lenger undertrykkes men svært lite lys avbrytes til høyere ordener. Generelt vil derfor transmisjonen for gitteret, som normalt ikke overstiger 1%, være direkte avhengig av antall tilstedeværende antigener. The principle of the analysis method is that the recipient material, for example antibodies coated on the grid, are typically small molecules with a size of approx. 10 nm and are thus too small to provide any size- or shape-dependent light scattering. However, the antigens that are linked to the antibodies, when a blood sample is placed on the grid, have a size of the same order of magnitude as the wavelength of the incident light and will thus have an effect similar to that of filling some of the grid's grooves with water (refractive index 1.33). This means, in the case of a grating with the above outer dimensions, that zero-order light is no longer suppressed, but very little light is interrupted to higher orders. In general, therefore, the transmission for the grid, which normally does not exceed 1%, will be directly dependent on the number of antigens present.

Foreliggende fremgangsmåte er således basert på bestemmelse The present method is thus based on determination

av forandringen i optiske egenskaper, dvs. transmisjon eller refleksjonsegenskaper for gitteret. Av denne grunn vil et gitter belagt med antistoff over hele dets areale og påfør- of the change in optical properties, i.e. transmission or reflection properties of the grating. For this reason, a grid coated with antibody over its entire area and applied

ing på en del av dette arealet med en prøve lett gjøre det mulig at denne forandring kan bestemmes kvantitativt. En tilsvarende effekt oppnås fortrinnsvis ved å belegge kun en del av gitteret med antistoff, da antigenene ikke vil tiltrekkes inn i og fastholdes i sporene i det ubelagte området. Fortrinnsvis i forbindelse med det sistnevnte delvis belagte gitter vil et tostrålet belysningssystem anvendes. Lyskilden kan være en glødelampe som avgir lys påfallende gitteret via et filter. Innfallsvinkelen og det monokromatiske (eller tilnærmet monokromatiske) lys på gitteret er fortrinnsvis 0° (dvs. normalt til gitteret) og for det ovenfor eksempli-fiserte gitter vil 0-ordens avbøyet lys bli oppsamlet ved hjelp av en linse og rettet mot en fotodetektor, mens høyere ordens avbøyet lys vil bli avskjermet under anvendelse av en blender. En hensikt med oppfinnelsen er å tilveiebringe et billig, forbelagt gitter som kan ha bred anvendelse for dia-gnostiske formål, vanligvis i en praktiserende leges kontor men også eventuelt i hjemmet. For dette formå,l vil antistoff være fast bundet til plastgitteret, eksempelvis ved elektro-statisk binding hvilket sikrer at det kan oppnå et praktisk talt permanent belegg forutsatt at egnet eller egnet behandlet plastmateriale velges for fremstilling av gitteret. Da hensikten vanligvis vil være å påvise et spesifikt antigen så kan gitteret være belagt med et spesifikt antistoff, eksempelvis et mono-klont antistoff som tiltrekker seg og kun fastholder det aktuelle antigen. Således kan en rekke undersøkelser med et antall selektivt belagte gittere muliggjøre kvantitativ ing on part of this area with a sample easily make it possible for this change to be determined quantitatively. A similar effect is preferably achieved by coating only part of the grid with antibody, as the antigens will not be attracted into and retained in the grooves in the uncoated area. Preferably, in connection with the latter partially coated grid, a two-beam lighting system will be used. The light source can be an incandescent lamp which emits light striking the grid via a filter. The angle of incidence and the monochromatic (or nearly monochromatic) light on the grating is preferably 0° (i.e. normal to the grating) and for the grating exemplified above, the 0-order deflected light will be collected by means of a lens and directed towards a photodetector, while higher order deflected light will be shielded using an aperture. One purpose of the invention is to provide a cheap, pre-coated grid which can be widely used for diagnostic purposes, usually in a practitioner's office but also possibly in the home. For this purpose, the antibody will be firmly bound to the plastic grid, for example by electrostatic bonding, which ensures that a practically permanent coating can be achieved, provided that suitable or suitably treated plastic material is selected for the manufacture of the grid. As the purpose will usually be to detect a specific antigen, the grid can be coated with a specific antibody, for example a monoclonal antibody that attracts and only retains the antigen in question. Thus, a series of investigations with a number of selectively coated gratings can enable quantitative

bestemmelse av spesifikke antigener for hjelp til diagnose. determination of specific antigens to aid in diagnosis.

Teknikken ved utsmøring på gitteret med prøven krever også visse forholdsregler. Etter avtørking av gitteret med eksempelvis en blodprøve så er det viktig å fjerne et eventuelt over-skudd av prøven for å sikre at en minimal mengde av bærevæsken, minimalt hemoglobin og et minimum av store celler andre enn antigenet holdes tilbake. The technique of smearing the grid with the sample also requires certain precautions. After wiping the grid with, for example, a blood sample, it is important to remove any excess of the sample to ensure that a minimal amount of the carrier fluid, minimal hemoglobin and a minimum of large cells other than the antigen are retained.

Da effekten av absorpsjon av røde celler inneholdende hemoglobin kan minimaliseres ved egnet valgt av bølgelengde for bestrålingen er tilbakeholdelse av bærervæsken som er den neste mulige kilde for påvisningsfeil. For å minimalisere slike feil kan gitteret dimensjoneres for null-ordens under-trykkelse når det er en kontinuerlig væskefilm på toppen av gitteret, hvilket krever en modifikasjon av gitterhøyden for h = W/2 (n-n2), hvor ni er brytningsindeksen for substratet og n2 er brytningsindeksen for væsken. En væske med høy brytningsindeks er ønskelig og et egnet eksempel er glycerol. Utsmøringsteknikken (dvs. trinn (a)) vil innebefatte trinnet As the effect of absorption of red cells containing hemoglobin can be minimized by suitable choice of wavelength for the irradiation, retention of the carrier fluid is the next possible source of detection error. To minimize such errors, the grating can be sized for zero-order suppression when there is a continuous liquid film on top of the grating, which requires a modification of the grating height for h = W/2 (n-n2), where ni is the refractive index of the substrate and n2 is the refractive index of the liquid. A liquid with a high refractive index is desirable and a suitable example is glycerol. The smearing technique (ie, step (a)) will include the step

å vaske gitteret etter avtørkning av prøven med den aktuelle væske. to wash the grid after drying the sample with the relevant liquid.

Et ytterligere trekk som må forstås i denne forbindelse med utsmøringsteknikken er at denne normalt vil resultere i at en liten prosentandel, eksempelvis mindre enn 2% av det totale areal av gitteret vil bære og holde tilbake tiltrukkede antigener. Anvendelse av et diffraksjonsgitter med høy følsom-het vil således lette kravene til belysnings- og detektor-systemet med ekstremt høye krav, hvilket ellers ville være nødvendig for kvantitativt å påvise en så liten tilstedeværelse av antigen, og således gjøre det praktisk mulig å anvende en relativ enkel og billig optik, som kan muliggjøre utstrakt anvendelse. A further feature that must be understood in this connection with the smearing technique is that this will normally result in a small percentage, for example less than 2% of the total area of the grid, carrying and retaining attracted antigens. The use of a diffraction grating with high sensitivity will thus ease the requirements for the lighting and detector system with extremely high requirements, which would otherwise be necessary to quantitatively detect such a small presence of antigen, and thus make it practically possible to use a relatively simple and cheap optics, which can enable extensive application.

Et eksempel på analysemetoden og apparatet i henhold til oppfinnelsen er vist i de vedlagte tegninger, hvori: An example of the analysis method and apparatus according to the invention is shown in the attached drawings, in which:

Fig. 1 viser et optisk belysnings- og påvisningssystem, Fig. 1 shows an optical illumination and detection system,

Fig. 2 viser mer detaljert en utførelsesform av anordningen hvori er innarbeidet et diffraksjonsgitter og som utgjør en del av systemet ifølge fig. 1, Fig. 3 viser et tverrsnitt (ikke i skala) av en andre utfør-elsesform av anordninger hvori er innarbeidet et diffraksjonsgitter, og Fig. 4 viser resultater erholdt med en anordning av typen vist i f ig. 3 . Fig. 2 shows in more detail an embodiment of the device in which a diffraction grating is incorporated and which forms part of the system according to fig. 1, Fig. 3 shows a cross-section (not to scale) of a second embodiment of devices in which a diffraction grating is incorporated, and Fig. 4 shows results obtained with a device of the type shown in fig. 3.

Det skal først henvises til fig. 2 hvor et enkelt diffraksjonsgitter 10, med kvadratisk profil hvis stigning og dybde er lik 800 nm er belagt med et i det vesentlige monomolekylært lag av immobiliserte antistoff 12, fortrinnsvis monoklonale antistoff. Etter påsmøring av en prøve blir et antigen 14, Reference should first be made to fig. 2 where a single diffraction grating 10, with a square profile whose pitch and depth are equal to 800 nm is coated with an essentially monomolecular layer of immobilized antibodies 12, preferably monoclonal antibodies. After smearing a sample, an antigen becomes 14,

som er en bindingspartner til antistoffene tiltrukket og inn-fanget i et spor. Ved dette punkt på gitteret vil null ordens avbøyet lys bli transmittert,' slik som indikert ved 16, i stedet for å bli undertrykket. which is a binding partner for the antibodies attracted and captured in a groove. At this point on the grating, zero-order deflected light will be transmitted, as indicated at 16, instead of being suppressed.

I fig. 1 er vist gitteret 10 under belysning av monokromatisk In fig. 1, the grating 10 is shown under monochromatic illumination

lys 18. Null ordens avbrutt lys oppsamlet av linsen 20 på en fotodetektor 22, mens høyere ordens avbøyet lys avskjermes av blenderen 24. Et tostrålebelysningfisystem, som tidligere beskrevet, generelt er foretrukket, vil arbeide på presis analog måte. light 18. Zero-order interrupted light collected by the lens 20 on a photodetector 22, while higher-order deflected light is screened by the aperture 24. A two-beam illumination system, as previously described, generally preferred, will work in precisely analogous fashion.

Under henvisning til fig. 3 er det vist en anordning i henhold With reference to fig. 3 shows a device according to

til oppfinnelsen i en tilstand etter at den er kontaktet med en prøve i trinn (b) i henhold til foreliggende fremgangsmåte. Anordningen omfatter et substrat 10 dannet av polymetylmetakrylat med- en tykkelse på ca, 1 mm. Den aktive (øvre) overflate av substratet innebefatter et lag 11 av aluminium med en tykkelse på 20 nm. Denne er dekket av en passiv film 13 av aluminiumoksyd med en tykkelse på 1 nm eller mindre. Et monomolekylært lag av antigenmolekyler 12 er kovalent bundet til filmen 13 av aluminiumoksyd og er således immobilisert. Et lag av anti- to the invention in a state after it has been contacted with a sample in step (b) according to the present method. The device comprises a substrate 10 formed of polymethyl methacrylate with a thickness of approx. 1 mm. The active (upper) surface of the substrate includes a layer 11 of aluminum with a thickness of 20 nm. This is covered by a passive film 13 of aluminum oxide with a thickness of 1 nm or less. A monomolecular layer of antigen molecules 12 is covalently bound to the film 13 of aluminum oxide and is thus immobilized. A layer of anti-

stoff 14 er knyttet til antigenlaget 12. Dette lag 14 er substance 14 is linked to the antigen layer 12. This layer 14 is

også monomolekylært og har en tykkelse på ca. 10 nm. also monomolecular and has a thickness of approx. 10 nm.

Isolerte antigener.15 er bundet til antistoffene 14. Substratet 10 med lagene 11, 13, 12 og 14 utgjør en utførelses- Isolated antigens 15 are bound to the antibodies 14. The substrate 10 with the layers 11, 13, 12 and 14 constitutes an embodiment

form av anordningen i henhold til oppfinnelsen. Den for- form of the device according to the invention. The for-

formede overflate er effektivt definert av overflatelaget 13 og foreligger i form av et enkelt gitter med en dybde på 50 nm og med en stigning (periode) på 250 nm. Anordningen observeres, ved utførelse av foreliggende fremgangsmåte med monokromatisk lys som er polarisert i et plan perpendikulært til gitterets linjer. Innfallsvinkelen for belysningen varieres og det er funnet at det er en skarp reduksjon (dip) i reflek-tiviteten ved en vinkel hvis verdi er avhengig av mengden av materialet (antistoff 14) som ligger v° anordningen. Vinkelposisjonen for denne dip og også dens vinkelbredde er sterkt avhengig av mengden av antigener som er knyttet til laget 14 shaped surface is effectively defined by the surface layer 13 and is in the form of a single lattice with a depth of 50 nm and with a pitch (period) of 250 nm. The device is observed, when carrying out the present method with monochromatic light which is polarized in a plane perpendicular to the lines of the grating. The angle of incidence for the illumination is varied and it has been found that there is a sharp reduction (dip) in the reflectivity at an angle whose value is dependent on the amount of the material (antibody 14) that lies in front of the device. The angular position of this dip and also its angular width is strongly dependent on the amount of antigens associated with the layer 14

av antistoff og følgelig tilveiebringer disse parametere et kvantitativt mål for antistoff absorbert fra prøven. of antibody and consequently these parameters provide a quantitative measure of antibody absorbed from the sample.

Fig. 4 viser refleksjonen av anordningen i forhold til innfallsvinkelen for den monokromatiske, polarisert belysning over et lite vinkelområde. Når mengden av antigener som "fanges" av antistofflaget 14 forøkes vil fallet i refleksjon for det første bli mere utpreget og blir deretter bredere og vinkelposisjonen for refleksjonsminimumet forandres, slik som vist i de tre"avsatte kurver. Refleksjonsfallet kan betraktes teoretisk som en plasmon resonans, det er relativt enkelt å påvise en forandring i innfallsvinkelen på ca. 0,1° eller en forandring i resonansbølgelengden på ca. 1 nm. Det er følgelig mulig å påvise forandringer tilsvarende en forøkelse i den midlere tykkelse av antigenlaget 15 på ca. 1 nm. Det vil forstås at når antigenene bindes til laget 14 så er .resultatet ikke adhesjon av et ytterligere lag med jevn tykkelse. Det er likevel funnet at tilstedeværelse av isolerte antigener 15 over antistofflaget 14 oppfører seg omtrent som de var "glattet ut" til et lag hvis midlere tykkelse modifiserer de optiske egenskaper for systemet som et hele. Fig. 4 shows the reflection of the device in relation to the angle of incidence for the monochromatic, polarized lighting over a small angular range. When the amount of antigens that are "captured" by the antibody layer 14 is increased, the drop in reflection will first become more pronounced and then become wider and the angular position of the reflection minimum changes, as shown in the three "deposited" curves. The reflection drop can be considered theoretically as a plasmon resonance , it is relatively easy to detect a change in the angle of incidence of about 0.1° or a change in the resonance wavelength of about 1 nm. It is therefore possible to detect changes corresponding to an increase in the average thickness of the antigen layer 15 of about 1 nm. It will be understood that when the antigens bind to the layer 14, the result is not adhesion of a further layer of uniform thickness. Nevertheless, it has been found that the presence of isolated antigens 15 over the antibody layer 14 behaves much as if they were "smoothed out" to a layer whose average thickness modifies the optical properties of the system as a whole.

Claims

1. Device for use in qualitative and/or quantitative detection of a chemical, biochemical or biological component in a sample, characterized in that it comprises a substrate having a surface with a pre-shaped, periodic relief profile, which is optically active upon irradiation at least over a predetermined band of wavelengths, and at least a predetermined portion of its surface is coated with a thin film of a material capable of binding a predetermined chemical, biochemical or biological component, the substrate possibly being a plastic material which is either formed by pressing in or by casting techniques or which can be cured by means of UV radiation, such as an acrylic acid or a polyester material, or that the substrate is glass coated with a synthetic polymeric material.

2. The device according to claim 1, characterized in that the pre-shaped surface relief profile is in the form of a single grid or two or more grids arranged mutually at an angle, and that each grid has a square wave, is sinusoidal or has a sawtooth profile, or that the pre-shaped surface- reieff profile includes a regular series of protrusions, and that the surface consists of a metal or metal layer, such as gold, silver, copper or aluminum or an oxide of silver, copper or aluminum.

3. Device according to claim 1 or 2, characterized in that the grating or gratings or protrusions have a depth (top to bottom) in the range 10-50 nm, 50-200 nm or 200-2000 nm, and that the pitch (period) of the grating or the gratings or the period for the protrusions are of the same order of magnitude as their depth, and that the surface is preferably structured so that it is optically active in relation to radiation with wavelengths in the range 700-1500 nm, especially 350-700 nm.

4. Device according to any one of claims 1-3, characterized in that the thin film of the material consists of antibodies, in particular monoclonal antibodies, a chelating enzyme or a chelating organism, and that the substrate has a refractive index in the range 1.25-1 ,6.

5. Procedure for using the device according to claims 1-4 for qualitative and/or quantitative determination of a chemical, biochemical or biological component in a sample, characterized by a) bringing the coated surface into contact with the sample, and b) observing the optical properties ':cr the pre-formed surface to determine a qualitative and/or quantitative change in the optical properties as a result of binding of the component on the thin film of material.

6. Method according to claim 5. characterized in that the optical properties of the pre-formed surface are observed before or after step a) to determine the change in the optical properties.

7. Method according to claim 5 or 6, characterized in that the optical properties of the pre-formed surface are followed during step a) to determine the change in optical properties.

8. Method according to claims 5-7, characterized in that in step b) polarized light is used to observe the optical properties of the pre-formed surface by determining the angular position at which a sharp reduction in reflection takes place when the surface is observed or sc is used with irradiation at a predetermined wavelength.