JP4035016B2 - Surface plasmon resonance sensor chip, and sample analysis method and analyzer using the same - Google Patents
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Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、回折格子型の表面プラズモン共鳴センサチップの構造に関し、特に、小型臨床機器やHPLC用検出器に用いて好適のセンサチップの構造に関する。
【0002】
【従来の技術】
従来、生化学や医療検査等の分野においては、化学種,生化学種又は生物種等の検出種を含む試料流体の定量的及び/又は定性的な分析方法として、表面プラズモン共鳴(SPR)を利用した分析方法が知られている。表面プラズモン共鳴は、金属層に光が入射した場合に金属表面に誘起される表面プラズモン波が入射光により生成されたエバネッセント波に共鳴して励起される現象である。表面プラズモン共鳴は入射光の波長及び角度に依存しており、表面プラズモン共鳴が励起されたときには、特定の入射角又は特定の波長を有する光成分の光エネルギーが表面プラズモン波へ移行することにより、対応する入射角又は波長を有する反射光が大きく減少するという特徴がある。
【0003】
表面プラズモン共鳴を起こすためには、特定の表面プラズモン波を有する金属と、表面プラズモン波と共鳴するエバネッセント波を誘起する光学構造とが必要となる。エバネッセント波を誘起する光学構造としては現在二つの構造が知られている。一つはプリズムの全反射を利用した光学構造であり、もう一つは回折格子を利用した光学構造である。上記の金属にこれらの光学構造を組み合わせた素子は一般に表面プラズモン共鳴センサチップ(以下、センサチップ)と呼ばれている。
【0004】
通常、センサチップは基体に金属層を積層した構造を有し、金属層上には、特定の検出種と相互作用して特異的に結合しうる結合物質(リガンド、分子認識素子)が塗布されて固定化される。この結合物質が固定化された金属層の表面に試料を接触させることにより、結合物質に試料中の検出種が捕捉される。表面プラズモン共鳴は金属層の表面における媒質の屈折率にも依存しており、媒質の屈折率が変化すれば波長一定の場合には共鳴角が変化し、また、入射角度一定の場合には共鳴波長が変化する。したがって、反射光の強度に基づき共鳴角或いは共鳴波長を調べることで金属層の表面における媒質の屈折率を分析することができる。この場合、金属層の表面の媒質の屈折率の変化は、結合物質に捕捉される検出種の物質量、すなわち試料中の検出種の濃度の変化に対応していることから、表面プラズモン共鳴が起きる共鳴角或いは共鳴波長を調べることで、試料中の検出種の濃度等を分析することができる。
【0005】
このようなセンサチップのうち、プリズム型のセンサチップは、一般にセンサチップ本体(透明基体上に金属層が積層されたもの)とプリズムとから構成されている。センサチップは基本的には使い捨てであるが、プリズムは高価であるためセンサチップ本体だけでなくプリズムまでも使い捨てにすると測定コストが非常に高くなってしまう。このため、この型のセンサチップでは、一般にセンサチップ本体とプリズムとが別で、使用時にプリズムをセンサチップ本体に密着させてプリズムに光を入射し、反射光を検出し測定するようになっている。
【0006】
一方、回折格子型のセンサチップは、表面に凹凸形状(グレーティング)を有する透明基体上に金属層を積層された構造となっている。凹凸形状上に金属層が積層されることで、金属層の表面にも凹凸形状が現れ、この金属層の表面の凹凸形状が回折格子として機能する。この型のセンサチップは、プリズム型のような高価なプリズムを使用しないため安価であり、使い捨てが可能である。また、プリズム型のようにプリズムとセンサチップ本体を密着させる作業が不要なため、密着度合いのばらつきといった不具合もなく測定値の再現性が良いという利点もある。
【0007】
また、プリズム型のセンサチップではプリズムを入射光及び反射光の経路とするという構造上、ビームの径やビームを照射できる領域に制約があるが、回折格子型のセンサチップにはこのような制約はなく、大径のビームを使用することができ、また任意の位置にビームを照射することができる。したがって、回折格子型のセンサチップはプリズム型に比較して一度に大面積を検査することができ、また、センサチップ上の任意の位置について検査することができるという利点がある。このような利点から、今日、回折格子型のセンサチップに対する期待が高まっている。
【0008】
回折格子型のセンサチップを用いた試料の分析方法としては、入射角度一定の条件で共鳴波長を検出する分析方法と、入射波長一定の条件で共鳴角度を検出する分析方法とが一般的である。このうち、前者の方法では、入射角度の設定によっては共鳴波長が測定器の測定レンジ外になってしまう場合があり、その場合には光学系を再調整する必要が生じる。これに対して後者の方法では、予め測定レンジ内に入るような入射波長を選択することができるので、前者の方法のような問題はない。
【0009】
入射波長一定の条件で共鳴角度を検出する方法には、一般に次の4つの方法が知られている。第1の方法は、入射光の入射角度を変化させながら(これを角度スキャンという)、反射光を検出する検出器の検出角度も同期して変化させていき、共鳴角を検出する方法である。第2の方法は、第1の方法と同様に入射光の角度スキャンを行いながら、角度固定式の検出器(CCD等のアレー型検出器)を用いて反射光を検出し、共鳴角を検出する方法である。
【0010】
第3の方法は、入射光として楔形の光を照射し、検出器の検出角度を反射光の反射角度範囲内で変化させ、共鳴角を検出する方法である。そして、第4の方法は、第3の方法と同様に入射光として楔形の光を照射し、その反射光を角度固定式の検出器を用いて検出し、共鳴角を検出する方法である。
さらに、上記の方法に加え、入射角度,入射波長ともに一定の条件で行う分析方法も知られている。この方法(第5の方法)は、入射角度或いは入射波長に対する反射光の強度分布は、結合物質に捕捉された検出種の量、すなわち試料中の検出種の濃度に応じて変化することから、入射角度,入射波長一定の条件で反射光の強度を計測し、その条件における強度の変化量(試料に接していない状態からの変化量)に基づき濃度等を分析するようにしたものである。
【0011】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記の各分析方法には、それぞれ次のような課題がある。まず、第1,第2の方法では、入射光の角度スキャンを行うために光源の光軸角度を変化させるための駆動機構が必要となり、コストアップを招いてしまう。また、駆動機構を必要とするために装置が大型化してしまい、ホームユースやPOC(ポイントオブケア)等の用途には適用しにくい。また、mdegree単位での角度制御が必要となるため、十分な精度を得るのが難しいという課題もある。さらに、角度スキャンに時間がかかるため、非常に速い反応には追従することができず、リアルタイム測定には不向きである。
【0012】
また、第3,第4の方法では、入射光の角度スキャンの必要はないものの、様々な角度からセンサチップ表面の測定点に光が入射するように、入射光の楔形の頂点を測定点にあてるようにする必要があるため、大面積の測定や一度に複数の測定点を同時に測定する多点同時測定には不向きである。このため、プロテインチップやDNAチップ等の集積化には対応することはできず、上述した回折格子型のセンサチップの利点を十分に生かすことができない。
【0013】
さらに、第5の方法では、第3,第4の方法と同様に入射光の角度スキャンの必要はなく、駆動機構を必要としない精度の高い分析が可能であるものの、表面プラズモン波のスペクトルの形状の特性から測定レンジ(測定許容範囲)が狭く、あまり広い濃度域に対しては有効ではない。このため、測定レンジを超えてしまった場合には、再度入射角度を再調整して反射光の強度変化を計測せねばならないという課題がある。
【0014】
本発明は、このような課題に鑑み創案されたもので、その第1の目的は、簡単な光学系の構成によりリアルタイム測定と大面積の同時測定とを同時に実現可能にした表面プラズモン共鳴センサチップと、それを用いた試料の分析方法及び分析装置を提供することにある。
また、その第2の目的は、反射光の強度の変化量に基づき分析を行う場合において、測定レンジの拡大により広い濃度域の試料にも対応できるようにした表面プラズモン共鳴センサチップと、それを用いた試料の分析方法及び分析装置を提供することにある。
【0015】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、発明者は、光の照射によりエバネッセント波を生じさせる回折格子が形成された回折格子面と、回折格子面に沿って設けられ光の照射により表面に表面プラズモン波を誘起しうる金属層とを備えた回折格子型の表面プラズモン共鳴センサチップにおいて、その回折格子面に光の照射方向に対して角度の分布を持たせることにより、上記の第1,第2の目的をともに達成できることを見出し、本発明を完成した。
【0016】
まず、本発明の第1の表面プラズモン共鳴センサチップ(第1のセンサチップ)は、光の照射により表面に表面プラズモン波を誘起しうる金属層と、上記金属層の近傍に形成され、光の照射によりエバネッセント波を生じさせる回折格子が一定の溝方向及び溝ピッチで形成された複数の回折格子面とを備え、上記各回折格子面は、所定の基準平面に垂直な特定平面に対して垂直で且つ上記基準平面に対してそれぞれ異なる所定の傾斜角度をなして配置されるとともに、それぞれ上記特定平面に垂直な溝方向で回折格子が形成されていることを特徴としている。
【0017】
このような構成により、上記特定平面に平行に一定の方向から光(平行光)を照射したときには、各回折格子面の基準平面に対する傾斜角度に応じて各回折格子面への照射光の入射角度に分布が生じ、各回折格子面から得られる反射光の強度にも分布が生じる。したがって、各回折格子面から得られる反射光の強度と各回折格子面への実質的な入射角度とに基づき、共鳴角度をリアルタイムで算出することが可能になる。つまり、上記のような構成のセンサチップを用いることにより、角度スキャンや楔形の光の照射によることなく、同時に複数の角度から光を照射する場合と同様の効果が得られる。
【0018】
なお、回折格子面が特定平面に平行な方向に複数配置される場合には、特定平面に平行な一の方向から見たときの基準平面に対する傾斜角度が次第に小さくなるように各回折格子面を順に配置するのが好ましい。これにより、各回折格子面からの反射光が交錯することがなく、各回折格子面からの反射光の強度の分析が容易になる。
【0019】
また、上記回折格子面を、光が照射される側に凸の山状に連続して配置することが好ましい。これにより、回折格子面の各位置からの反射光が交錯することがなく、回折格子面の各位置からの反射光の強度の分析が容易になる。
【0020】
また、上記回折格子は、一つの溝のみを有する最小幅に形成され、上記回折格子面の集合により光が照射される側に凸の弧状の曲面が構成されるようにしてもよい。
【0021】
また、回折格子面が集約して配置される回折領域を複数設け、各回折領域には異なる傾斜角度の回折格子面を複数配置するのも好ましい。この場合は、特定平面に平行に一定の方向から光を照射するだけで各回折領域における共鳴角度を同時に検出することができるので、各回折領域に対応して結合物質を固定化することによって多点同時測定を容易に行うことができる。
【0022】
上記の第1のセンサチップにおいて、各回折格子面は試料と接するセンサ面に沿って設けられている。そして、第1のセンサチップを試料の定量的及び/又は定性的な分析に用いる場合には、センサ面に試料中の検出種(化学種,生化学種又は生物種等)と特異的に結合する結合物質(抗原抗体反応、相補的DNA結合、リセプター/リガンド相互作用、酵素/基質相互作用等の相互作用によって検出種を捕捉できる物質)を固定化したものを用いる。特に、多点同時測定用のセンサチップの場合には、各回折領域に対応して結合物質を複数種固定化したものを用いることによって、同時に複数種の検出種について分析が可能になる。
【0023】
また、上記結合物質を上記回折格子面毎に複数種固定化しても良い。
【0024】
また、上記センサ面に、回折格子が形成されていない非回折面を上記各回折格子面と同一平面状に設けてもよい。
また、上記各回折領域に対応して、上記回折格子が形成されていない非回折面が集約した非回折領域を設け、上記非回折領域を構成する各非回折面を、対応する回折領域を構成する各回折格子面の上記基準平面に対する傾斜角度の分布と同一の、上記基準平面に対する傾斜角度の分布を有するよう形成してもよい。
【0025】
また、上記回折面毎に、上記結合物質が固定化された反応領域と、試料中の検出種と特異的な結合を起こさない物質とを固定化するか、或いは何ら物質が固定化されていない非反応領域とを設けても良い。
また、上記各回折領域のうちの一部に、試料中の検出種と特異的に結合する結合物質が固定化された反応領域を設け、他の回折領域には、試料中の検出種と特異的な結合をおこさない物質が固定化されるか、或いは何ら物質が固定化されていない非反応領域を設けてもよい。
【0026】
また、上記回折格子面を溝方向に垂直な方向に並んで配置するとともに、上記センサ面を覆う蓋を設け、上記センサ面と上記蓋との間に、上記回折格子面の配置方向に向けて複数の流路を並べて形成しても良い。
また、上記センサ面を覆う蓋を備えると共に、上記センサ面と上記蓋との間に複数の流路を並列して形成し、上記各流路毎に、上記回折領域を設けてもよい。
【0027】
第1のセンサチップを用いて行う試料の分析方法には、次の8つの方法がある。第1の分析方法は共鳴角度を算出して共鳴角度に基づき試料の分析を行う分析方法であり、この分析方法では、センサ面に試料を接触させて特定平面に平行に一定の入射角度で光を照射するステップ、各回折格子面からの反射光を受光し、受光した各回折格子面からの反射光の強度を計測するステップ、計測された反射光の強度と各回折格子面の基準平面に対する傾斜角度とに基づき共鳴角度を算出するステップ、算出された共鳴角度に基づき試料の定量的及び/又は定性的な分析を行うステップを実行する。
【0028】
この場合、角度スキャンによることなく瞬時に共鳴角度を算出することができるので、リアルタイム測定が可能になるとともに、楔形の光の照射によることなく共鳴角度を算出することができるので、一度に大面積を測定することも可能になる。したがって、回折格子面が集約配置された回折領域が複数設けられた多点同時測定用のセンサチップを用いた場合には、多点同時測定をリアルタイムに行うこともできる。また、光源の光軸は一定でよく且つ平行光でよいので光学系も簡単にすることができる。なお、これらの各ステップは記載順に実行してもよく、同時に実行してもよい。特に、各ステップを同時に実行する場合には、試料中の検出種が結合物質に結合していく様子をリアルタイムでモニタすることができる。
【0029】
この分析方法は、次のような構成を有する分析装置を用いることにより実施することができる。すなわち、この分析装置は、上記の第1のセンサチップをそのセンサ面に試料を接触させた状態で保持手段により保持し、保持手段により保持された状態のセンサチップのセンサ面に向けて特定平面に平行に一定の入射角度で光照射手段により光を照射し、各回折格子面からの反射光を受光手段により受光し、受光した反射光の強度を計測手段によって計測するような装置構成を有している。そして、さらにこの分析装置は、受光手段により受光した反射光から試料を分析するための手段として、算出手段と分析手段とを備えている。算出手段は、計測手段により計測された各回折格子面からの反射光の強度と各回折格子面の基準平面に対する傾斜角度とに基づき共鳴角度を算出する手段であり、分析手段は、算出手段により算出された共鳴角度に基づき試料の定量的及び/又は定性的な分析を行う手段である。
【0030】
第2の分析方法は、共鳴角度を算出して共鳴角度に基づき試料の分析を行う分析方法であり、センサ面に試料を接触させて、特定平面に平行に一定の入射角度で光を照射するステップ、センサ面からの反射光を受光して、各回折格子面からの反射光の強度を計測するステップ、非回折面からの反射光の強度を考慮して、各回折格子面からの反射光の強度を補正するステップ、計測された各回折格子面からの反射光の強度と各回折格子面の基準平面に対する傾斜角度とに基づき、エバネッセント波と表面プラズモン波との共鳴現象が生じる共鳴角度を算出するステップ、算出された共鳴角度に基づき、試料の定量的及び/又は定性的な分析を行うステップを実行する。
【0031】
ここで、補正の際に考慮すべき反射光を反射している非回折面は、補正しようとする反射光が反射している回折格子面と同じ、上記基準平面に対する傾斜角度を有していなくてはならない。したがって、同一平面状に回折格子面と非回折面とが存在していない場合には、各回折格子面に対応する非回折面を特定し、その非回折面からの反射光を考慮して補正を行う必要がある。
【0032】
この場合、第1の分析方法と同様の利点の他、非回折面からの反射光の強度を考慮して各回折格子面からの反射光の強度を補正するため、各回折格子面の表面特性の差による反射光の強度の誤差を補正することができる。
【0033】
なお、表面特性とは、エバネッセント波と表面プラズモン波との共鳴現象以外のセンサチップ表面にかかる要素のうち、センサチップからの反射光強度を弱めるものをいう。例えば、入射光を散乱させる試料溶液の濁りや、試料溶液中に含まれる入射光の吸収物質などの、センサチップからの反射光を弱める要素や、ゆがみ、たわみ、膨潤、収縮など微量な理想平面からの変位のことをいう。また他にも、試料中の成分がセンサチップ表面に非特異的に吸着する場合には、この非特異的に吸着した物質によって入射光は散乱されたり吸収されたりして、センサチップからの反射光の強度は減少する。
【0034】
この分析方法は、次のような構成を有する分析装置を用いることにより実施することができる。すなわち、この分析装置は、上記の第1のセンサチップをそのセンサ面に試料を接触させた状態で保持手段により保持し、保持手段により保持された状態のセンサチップのセンサ面に向けて特定平面に平行に一定の入射角度で光照射手段により光を照射し、各回折格子面からの反射光を受光手段により受光し、受光した反射光の強度を計測手段によって計測するような装置構成を有している。そして、さらにこの分析装置は、受光手段により受光した反射光から試料を分析するための手段として、補正手段と算出手段と分析手段とを備えている。補正手段は、非回折面からの反射光の強度を考慮して、各回折格子面からの反射光の強度を補正する手段であり、算出手段は、補正手段により補正された各回折格子面からの反射光の強度と各回折格子面の基準平面に対する傾斜角度とに基づき共鳴角度を算出する手段であり、分析手段は、算出手段により算出された共鳴角度に基づき試料の定量的及び/又は定性的な分析を行う手段である。
【0035】
第3の分析方法は、共鳴角度を算出して共鳴角度に基づき試料の分析を行う分析方法であり、センサ面に試料を接触させて、特定平面に平行に一定の入射角度で光を照射するステップ、センサ面からの反射光を受光して、各回折格子面からの反射光の強度を計測するステップ、計測された各回折格子面からの反射光の強度と各回折格子面の基準平面に対する傾斜角度とに基づき、エバネッセント波と表面プラズモン波との共鳴現象が生じる共鳴角度を反応領域及び非反応領域のそれぞれについて算出するステップ、算出された反応領域における共鳴角度を非反応領域における共鳴角度を考慮して補正した共鳴角度に基づき、試料の定量的及び/又は定性的な分析を行うステップを実行する。
【0036】
この場合、第1の分析方法と同様の利点の他、反応領域における共鳴角度を非反応領域における共鳴角度で補正するため、反応によって生じる検出種の変化をより正確に分析することができる。
【0037】
なお、この方法における補正は、単なる反射光の強度の補正ではなく、検出しようとする特異的反応ではない要素による共鳴角度のシフトを用いて行う反応量の補正であるため、共鳴角度が求められるならば必ずしも反応領域と非反応領域とが上記基準平面に対して同じ傾斜角度を有していなくてもよい。
【0038】
この分析方法は、次のような構成を有する分析装置を用いることにより実施することができる。すなわち、この分析装置は、上記の第1のセンサチップをそのセンサ面に試料を接触させた状態で保持手段により保持し、保持手段により保持された状態のセンサチップのセンサ面に向けて特定平面に平行に一定の入射角度で光照射手段により光を照射し、各回折格子面からの反射光を受光手段により受光し、受光した反射光の強度を計測手段によって計測するような装置構成を有している。そして、さらにこの分析装置は、受光手段により受光した反射光から試料を分析するための手段として、算出手段と分析手段とを備えている。算出手段は、計測手段により計測された各回折格子面からの反射光の強度と各回折格子面の基準平面に対する傾斜角度とに基づき、エバネッセント波と表面プラズモン波との共鳴現象が生じる共鳴角度を反応領域及び非反応領域それぞれについて算出する手段であり、分析手段は、算出手段により算出された反応領域における共鳴角度を非反応領域における共鳴角度を考慮補正した共鳴角度に基づき試料の定量的及び/又は定性的な分析を行う手段である。
【0039】
第4の方法は、共鳴角度を算出して共鳴角度に基づき試料の分析を行う分析方法であり、この分析方法では、異なる複数の試料を複数の流路に割り当て、各流路に割り当てられた試料を流しながら特定平面に平行に一定の入射角度でセンサ面に光を照射するステップ、センサ面からの反射光を受光して、各回折格子面からの反射光の強度を計測するステップ、計測された各回折格子面からの反射光の強度と回折格子面の基準平面に対する傾斜角度とに基づき、エバネッセント波と表面プラズモン波との共鳴現象が生じている共鳴角度を、各流路を流れる試料毎に算出するステップ、流路毎に算出された共鳴角度に基づき、各流路を流れる試料の定量的及び/又は定性的な分析を行うステップを実行する。
【0040】
この場合、第1の分析方法と同様の利点の他、複数の試料を同時に分析することができるため作業が効率的に行える。また、複数の試料を同じ条件下で分析できるため、試料の違いを明確に分析することができる。
【0041】
この分析方法は、次のような構成を有する分析装置を用いることにより実施することができる。すなわち、この分析装置は、上記の第1のセンサチップを保持手段により保持し、保持手段により保持された状態のセンサチップに、試料導入手段により異なる複数の試料をセンサチップ上の複数の流路に割り当てて導入し、試料導入手段により各流路に試料が導入された状態のセンサチップのセンサ面に向けて特定平面に平行に一定の入射角度で光照射手段により光を照射し、各回折格子面からの反射光を受光手段により受光し、受光した反射光の強度を計測手段によって計測するような装置構成を有している。そして、さらにこの分析装置は、受光手段により受光した反射光から試料を分析するための手段として、算出手段と分析手段とを備えている。算出手段は、計測手段により計測された各回折格子面からの反射光の強度と各回折格子面の基準平面に対する傾斜角度とに基づき、エバネッセント波と表面プラズモン波との共鳴現象が生じる共鳴角度を各流路毎について算出する手段であり、分析手段は、算出手段により算出された各流路における共鳴角度に基づき、各流路を流れる試料の定量的及び/又は定性的な分析を行う手段である。
【0042】
第5の分析方法は、反射光の強度の変化量を測定して強度変化量に基づき試料の分析を行う分析方法であり、この分析方法では、センサ面に試料を接触させて特定平面に平行に一定の入射角度で光を照射するステップ、各回折格子面からの反射光を受光し、受光した各回折格子面からの反射光の強度を計測するステップ、計測された上記各回折格子面からの反射光の強度の、上記センサ面に試料が接触していない状態での反射光の強度に対する変化量を測定するステップ、測定した変化量が所定の測定許容範囲(測定レンジ)内にある回折格子面を選定し、選定した回折格子面からの反射光強度の変化量に基づき試料の定量的及び/又は定性的な分析を行うステップを実行する。
【0043】
これにより、試料の濃度域が広い場合でも測定値が測定レンジ内に入るように光学系を再調整する必要がなく、実質的に測定レンジを拡大することが可能になる。なお、この場合も各ステップは記載順に実行してもよく、同時に実行してもよい。
【0044】
この分析方法は、次のような構成を有する分析装置を用いることにより実施することができる。すなわち、この分析装置は、上記の第1のセンサチップをそのセンサ面に試料を接触させた状態で保持手段により保持し、保持手段により保持された状態のセンサチップのセンサ面に向けて特定平面に平行に一定の入射角度で光照射手段により光を照射し、各回折格子面からの反射光を受光手段により受光し、受光した反射光の強度を計測手段によって計測するような装置構成を有している。そして、さらにこの分析装置は、受光手段により受光した反射光から試料を分析するための手段として、測定手段と分析手段とを備えている。測定手段は、測定手段は、計測装置により計測された各回折格子面からの反射光の強度の、センサ面に試料が接触していない状態での反射光の強度に対する変化量を測定する手段であり、分析手段は、測定した反射光強度の変化量が所定の測定許容範囲内にある回折格子面を選定し、選定した回折格子面からの反射光強度の変化量に基づき試料の定量的及び/又は定性的な分析を行う手段である。
【0045】
第6の分析方法は、反射光の強度の変化量を測定して強度変化量に基づき試料の分析を行う分析方法であり、この分析方法では、センサ面に試料を接触させて特定平面に平行に一定の入射角度で光を照射するステップ、各回折格子面からの反射光を受光し、受光した各回折格子面からの反射光の強度を計測するステップ、計測された上記各非回折格子面からの反射光の強度を考慮して、上記各回折格子面からの反射光の強度を補正するステップ、補正された各回折格子面からの反射光の強度の、上記センサ面に試料が接触していない状態での反射光の強度に対する変化量を測定するステップ、測定した変化量が所定の測定許容範囲(測定レンジ)内にある回折格子面を選定し、選定した回折格子面からの反射光強度の変化量に基づき試料の定量的及び/又は定性的な分析を行うステップを実行する。
【0046】
なお、第2の分析方法と同様に、補正の際に考慮すべき反射光を反射している非回折面は、補正しようとする反射光が反射している回折格子面と同じ、上記基準平面に対する傾斜角度を有していなくてはならない。したがって、同一平面状に回折格子面と非回折面とが存在していない場合には、各回折格子面に対応する非回折面を特定し、その非回折面からの反射光を考慮して補正を行う必要がある。
【0047】
この場合、第5の分析方法と同様の利点の他、非回折面からの反射光の強度を考慮して各回折格子面からの反射光の強度を補正するため、各回折格子面の表面特性の差による反射光の強度の誤差を補正することができる。
【0048】
この分析方法は、次のような構成を有する分析装置を用いることにより実施することができる。すなわち、この分析装置は、上記の第1のセンサチップをそのセンサ面に試料を接触させた状態で保持手段により保持し、保持手段により保持された状態のセンサチップのセンサ面に向けて特定平面に平行に一定の入射角度で光照射手段により光を照射し、各回折格子面からの反射光を受光手段により受光し、受光した反射光の強度を計測手段によって計測するような装置構成を有している。そして、さらにこの分析装置は、受光手段により受光した反射光から試料を分析するための手段として、補正手段と測定手段と分析手段とを備えている。補正手段は、非回折面からの反射光の強度を考慮して、各回折格子面からの反射光の強度を補正する手段であり、測定手段は、補正手段により補正された各回折格子面からの反射光の強度の、センサ面に試料が接触していない状態での反射光の強度に対する変化量を測定する手段であり、分析手段は、測定した反射光強度の変化量が所定の測定許容範囲内にある回折格子面を選定し、選定した回折格子面からの反射光強度の変化量に基づき試料の定量的及び/又は定性的な分析を行う手段である。
【0049】
第7の分析方法は、反射光の強度の変化量を測定して強度変化量に基づき試料の分析を行う分析方法であり、この分析方法では、センサ面に試料を接触させて特定平面に平行に一定の入射角度で光を照射するステップ、各回折格子面からの反射光を受光し、受光した各回折格子面からの反射光の強度を計測するステップ、計測された各回折格子面からの反射光の強度の、センサ面に試料が接触していない状態での反射光の強度に対する変化量を反応領域及び非反応領域のそれぞれについて測定するステップ、測定された反射光強度の変化量が所定の測定許容範囲内にある回折格子面を反応領域及び非反応領域のそれぞれについて選定し、選定された反応領域からの反射光の強度の変化量と選定された非反応領域からの反射光の強度の変化量とに基づき、試料の定量的及び/又は定性的な分析を行うステップを実行する。
【0050】
なお、第3の方法と同様に、この方法における補正は、単なる反射光の強度の補正ではなく、検出しようとする特異的反応ではない要素による共鳴角度のシフトを用いて行う反応量の補正であるため、共鳴角度が求められるならば必ずしも反応領域と非反応領域とが上記基準平面に対して同じ傾斜角度を有していなくてもよい。
【0051】
この場合、第5の分析方法と同様の利点の他、反応領域における共鳴角度を非反応領域における共鳴角度で補正するため、反応によって生じる検出種の変化をより正確に分析することができる。
【0052】
この分析方法は、次のような構成を有する分析装置を用いることにより実施することができる。すなわち、この分析装置は、上記の第1のセンサチップをそのセンサ面に試料を接触させた状態で保持手段により保持し、保持手段により保持された状態のセンサチップのセンサ面に向けて特定平面に平行に一定の入射角度で光照射手段により光を照射し、各回折格子面からの反射光を受光手段により受光し、受光した反射光の強度を計測手段によって計測するような装置構成を有している。そして、さらにこの分析装置は、受光手段により受光した反射光から試料を分析するための手段として、測定手段と分析手段とを備えている。測定手段は、計測装置により計測された各回折格子面からの反射光の強度の、センサ面に試料が接触していない状態での反射光の強度に対する変化量を測定する手段であり、分析手段は、測定した反射光強度の変化量が所定の測定許容範囲内にある回折格子面を反応領域及び非反応領域のそれぞれについて選定し、選定した回折格子面からの反射光強度の変化量と選定された非反応領域からの反射光の強度の変化量とに基づき試料の定量的及び/又は定性的な分析を行う手段である。
【0053】
第8の分析方法は、反射光の強度の変化量を測定して強度変化量に基づき試料の分析を行う分析方法であり、この分析方法では、異なる複数の試料を複数の流路に割り当て、各流路に割り当てられた試料を流しながら特定平面に平行に一定の入射角度でセンサ面に光を照射するステップ、センサ面からの反射光を受光して、各回折格子面からの反射光の強度を計測するステップ、計測された各回折格子面からの反射光の強度の、各流路に試料が流れていない状態での反射光の強度に対する変化量を測定するステップ、計測された反射光強度の変化量が所定の測定許容範囲内にある回折格子面を流路毎に選定し、流路毎に選定された回折格子面からの反射光の強度の変化量に基づき、各流路を流れる試料の定量的及び/又は定性的な分析を行うステップを実行する。
【0054】
この場合、第5の分析方法と同様の利点の他、複数の試料を同時に分析することができるため作業が効率的に行える。また、複数の試料を同じ条件下で分析できるため、試料の違いを明確に分析することができる。
【0055】
この分析方法は、次のような構成を有する分析装置を用いることにより実施することができる。すなわち、この分析装置は、上記の第1のセンサチップを保持手段により保持し、保持手段により保持された状態のセンサチップに、試料導入手段により異なる複数の試料をセンサチップ上の複数の流路に割り当てて導入し、試料導入手段により各流路に試料が導入された状態のセンサチップのセンサ面に向けて特定平面に平行に一定の入射角度で光照射手段により光を照射し、各回折格子面からの反射光を受光手段により受光し、受光した反射光の強度を計測手段によって計測するような装置構成を有している。そして、さらにこの分析装置は、受光手段により受光した反射光から試料を分析するための手段として、測定手段と分析手段とを備えている。測定手段は、計測装置により計測された各回折格子面からの反射光の強度の、上記各流路に試料が流れていない状態での反射光の強度に対する変化量を測定する手段であり、分析手段は、測定した反射光強度の変化量が所定の測定許容範囲内にある回折格子面を流路毎に選定し、選定した回折格子面からの反射光の強度の変化量と基づき、試料の定量的及び/又は定性的な分析を行う手段である。
【0056】
さらに、上述の各分析方法において、表面プラズモン共鳴センサチップ上に試料を導入するに先立ち、物理的及び/又は化学的な作用によって試料を分離する試料分離ステップを行ってもよい。
【0057】
これにより、試料中に検出種以外の不純物が混入していたとしても、分析前に適正に除去することができ、純粋な検出種のみを分析することができる。したがって、正確な分析を行うことが可能となる。
【0058】
また、これらの分析手段で通常用いられている検出方法(吸光度検出、蛍光検出、化学発光検出、示差屈折計検出、電気化学検出など)と組み合わせることにより、各種の存在物質の存在量と、その中での検出対象種の特異的反応計測による測定とを同時に行うことができる。
【0059】
この分析方法は、上述の分析装置の構成に加え、表面プラズモン共鳴センサチップ上に試料を導入するに先立ち、物理的及び/又は化学的な作用によって試料を分離する試料分離手段を有するように構成した分析装置を用いることで実施できる。
【0060】
試料分離手段としては、液体クロマトグラフィー,HPLC,キャピラリー電気泳動,マイクロチップ電気泳動,フローインジェクション或いはマイクロチャネルを用いた分離方法の何れかの手法により試料を分離することが望ましい。
【0061】
また、上述の各分析方法において、検出種が発光物質である場合に、センサ面に光を照射するに先立ち、或いは、センサ面に光を照射して反射光を受光した後、結合物質に結合した発光物質の発光光を検出するステップを備え、分析ステップでは、発光光の検出結果も併せて総合的に試料の定量的及び/又は定性的な分析を行うようにしてもよい。
【0062】
これにより、表面プラズモン共鳴のみでなく、発光現象を利用した分析を行えるようになる。蛍光や燐光等の発光現象は非常に高感度であるため、より微妙な反応も検出することが可能となる。
【0063】
この分析手段は、上述の分析装置の構成に加えて、検出種が発光物質である場合に、受光手段が結合物質に結合した発光物質の発光光も検出可能に構成され、分析手段が、受光手段による発光光の検出結果も併せて総合的に試料の定量的及び/又は定性的な分析を行うように構成した分析装置を用いることで実施できる。
【0064】
また、本発明の第2の表面プラズモン共鳴センサチップ(第2のセンサチップ)は、光の照射により表面に表面プラズモン波を誘起しうる金属層と、金属層の近傍に形成され、光の照射によりエバネッセント波を生じさせる回折格子が一定の溝方向及び溝ピッチで形成された回折格子曲面とを備え、回折格子曲面は光が照射される側に向けて凸の湖上の曲面形状を有し、所定の基準平面に垂直な特定平面に対し垂直に配置されるとともに、特定平面に垂直な溝方向で回折格子が形成されていることを特徴としている。
【0065】
このような構成により、上記特定平面に平行に一定の方向から光(平行光)を照射したときには、照射光の照射位置における接平面の基準平面に対する傾斜角度に応じて、回折格子面への照射光の入射角度に分布が生じ、回折格子面の各位置から得られる反射光の強度にも分布が生じる。したがって、回折格子面の各位置から得られる反射光の強度とその位置における実質的な入射角度とに基づき、共鳴角度をリアルタイムで算出することが可能になる。つまり、上記のような構成のセンサチップを用いることにより、角度スキャンや楔形の光の照射によることなく、所定の広がり角(或いは狭まり角)を有する光を照射する場合と同様の効果が得られる。
【0066】
好ましくは、回折格子面の形状は、光が照射される側に向けて凸の曲面形状とする。これにより、回折格子面の各位置からの反射光が交錯することがなく、回折格子面の各位置からの反射光の強度の分析が容易になる。
また、上記の回折格子面を複数設けるのも好ましい。この場合は、特定平面に平行に一定の方向から光を照射するだけで複数の回折格子面における共鳴角度を同時に検出することができるので、各回折格子面に対応して結合物質を固定化することによって多点同時測定を容易に行うことができる。
【0067】
上記の第2のセンサチップにおいて、回折格子面は試料と接するセンサ面に沿って設けられている。そして、第2のセンサチップを試料の定量的及び/又は定性的な分析に用いる場合には、センサ面に試料中の検出種と特異的に結合する結合物質を固定化したものを用いる。特に、多点同時測定用のセンサチップの場合には、各回折格子面に対応して結合物質を複数種固定化したものを用いることによって、同時に複数種の検出種について分析が可能になる。
【0068】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。
(A)第1実施形態
まず、図1〜図5を用いて本発明の第1実施形態について説明する。
図1に示すように本実施形態にかかるセンサチップ(表面プラズモン共鳴センサチップ)1は、その表面(センサ面)1aを金属層3により被覆され、金属層3上の複数箇所に回折格子が形成された回折領域6が部分的に設けられている。本実施形態では、回折格子が形成されている各回折領域6が多点同時測定による分析時の測定スポットとなる。
【0069】
図2は測定スポット6を拡大して示した斜視図である。図2に示すように測定スポット6は、回折格子が形成された複数の平面(以下、回折格子面)5a〜5iが集約して配置されたものである。各回折格子面5a〜5iは、金属層3上の測定スポット6外の表面を基準平面S0としたとき、この基準平面S0に垂直な特定平面S1に対して垂直で、且つ基準平面S0に対してそれぞれ所定の傾斜角度αa〜αiをなして配置されている。また、各回折格子面5a〜5iには、同一形状(同一溝深さ,溝ピッチ)の回折格子が特定平面S1に垂直な溝方向に形成されている。
【0070】
ここでは、中央の回折格子面5eは基準平面S0に平行に配置されており、残りの回折格子面5a〜5d,5f〜5iは、中央から遠ざかるほど基準平面S0に対する傾斜角度が次第に大きくなるように、言い換えれば、特定平面に平行な一方向Aから見たときの基準平面S0に対する傾斜角度が次第に小さくなるように配置されている(すなわち、αa>αb>αc>αd>αe(αe=0)>αf>αg>αh>αi)。また、各回折格子面5a〜5iは、隣り合う回折格子面同士が連続するように配置されている。
【0071】
この構造によれば、光がセンサチップ1のセンサ面1aに照射されると、照射光はセンサ面1a上の各測定スポット6において回折し、この回折現象によりエバネッセント波が生じる。このとき、測定スポット6への実質的な入射角度は回折格子面5a〜5i毎に異なり、図2において基準平面S0に対する照射光の入射角度をθとしたとき、各回折格子面5a〜5iへの実際の入射角度は、照射方向側の端部にある回折格子面5aから順に、θ−αa,θ−αb,θ−αc,・・・,θ−αiとなる。このように照射光の入射角度が回折格子面5a〜5i毎に異なることにより、回折現象により生じるエバネッセント波の波数も回折格子面5a〜5i毎に異なったものになり、照射光が金属層3に作用することにより金属層3の表面に発生する表面プラズモン波との共鳴(SPR)の度合いも回折格子面5a〜5i毎に異なったものになる。
【0072】
このセンサチップ1は、図4(a)に示す基体2の表面に、まず、図4(b)に示すようにレーザ加工等により凹凸形状が形成された凹凸面4を複数箇所に部分的に形成し、次いで、図4(c)に示すように基体2の表面全面にスパッタリングや蒸着により金属層3を積層することで製造することができる。凹凸面4上に金属層3が積層されることで金属層3の表面にも凹凸面が現れ、この金属層3の表面に現れた凹凸面が回折格子面として機能し、凹凸面4が形成された各回折領域が測定スポット6となる。
【0073】
基体2の材質は、表面に凹凸面4を形成することができ、金属層3を保持できる機械的強度が十分であるならばその材質に限定はない。凹凸面4の形成しやすさからは樹脂が好ましく、アクリル樹脂(ポリメタクリル酸メチルなど)、ポリエステル樹脂(ポリカーボネートなど)、ポリオレフィンなどが好適な材質として挙げられる。
金属層3は、表面プラズモン波を誘起しうるものであればその材質に限定はない。例えば、金,銀,銅,アルミニウムやこれらを含む合金等、或いは銀,銅,アルミニウムの酸化物等を用いることができる。感度や安価な点では銀が好ましいが、安定性の面では金が好ましい。金属層3の厚みは、好ましくは20〜300nmとし、より好ましくは30〜160nmとする。なお、金属層3の厚みが小さい場合には、照射光が金属層3を透過して基体2の表面に達し、照射光が基体2表面の凹凸面4において回折する場合もある。この場合は凹凸面4の凹凸形状も回折格子として機能することになる。
【0074】
基体2に形成する凹凸面4は、上述のレーザ加工の他、所定の凹凸形状を備えた金型をイオンビームを用いて形成し、この金型への射出成型によって基体2とともに成型することも可能である。また、凹凸形状を持たない傾斜角のある平面だけを先に基体2の表面に形成し、その後、その上から透過型凹凸フィルムを貼り付けることでも所望の凹凸面4を形成できる。その他、微細切削技術を用いて凹凸形状を加工したり、平面に対してPDMS(ポリジメチルシロキサン)をマイクロコンタクトプリンティングすることにより凹凸形状を形成したりすることでも所望の凹凸面4を形成することができる。
【0075】
凹凸面4の凹凸形状は、金属層3を積層したときにその表面に所望の回折格子が得られるように金属層3の厚み等を考慮して形成する。凹凸形状としては、矩形波形状,正弦波形状,鋸歯状形状などがあり得るが、好ましくは回折格子の溝深さ(頂から谷底まで)が10〜200nm(より好ましくは30〜120nm)、ピッチ(周期:凹凸の凸から隣接する凸までの距離)が400〜1200nm(照射光の波長と関係する)となるような周期的な凹凸形状とする。
【0076】
一つの測定スポット6に形成する回折格子面の数は、2〜100の範囲、より好ましくは5〜50の範囲とする。回折格子面の基準平面に対する傾斜角度は、−10度〜10度の範囲、好ましくは−5度〜5度の範囲、より好ましくは−3度〜3度の範囲とする。また、隣接する回折格子面間における傾斜角度の変化量は0.001〜1度の範囲、好ましくは0.01〜0.5度の範囲とする。
【0077】
また、回折格子面の大きさは、測定スポット6の数にもよるが、形状が矩形の場合には短辺が5μm〜20mmの範囲、好ましくは20μm〜5mmの範囲とし、形状が円形の場合には直径が5μm〜20mmの範囲、好ましくは20μm〜5mmの範囲とする。そして、測定スポット6の形成密度としては、0.1〜1,000,000個/cm2が好ましく、1〜100,000個/cm2がより好ましい。これにより、1チップあたり、1〜10,000,000個の測定スポット6において多点同時測定が可能になる。
【0078】
次に、本実施形態にかかるセンサチップ1の使用方法について説明する。
センサチップ1を試料の分析に用いる際には、まず、図3に示すように各測定スポット6上に結合物質7を固定化する。この結合物質7は、抗原抗体反応、相補的DNA結合、リセプター/リガンド相互作用、酵素/基質相互作用等の相互作用によって特定の物質と特異的に結合しうる性質を備えた結合物質であり、検出すべき検出種(化学種,生化学種又は生物種等)に応じた結合物質7が選択される。試料中に複数の検出種が含まれる場合には、各検出種に応じた結合物質7がそれぞれ選択されて、それぞれ別々の測定スポット6に固定化される。
【0079】
そして、このように結合物質7が固定化されたセンサチップ1を図5に示す構成の分析装置10にセットして分析を行う。この分析装置10はセンサチップ1を固定するためのホルダ11,光源12,光検出器13及び分析部14から主に構成されている。
ホルダ11には検出種を含む試料流体が通過する流路11aが形成されている。センサチップ1はそのセンサ面1aが流路11aを流れる試料に接するように配置されて固定される。
【0080】
光源12はセンサチップ1のセンサ面1aに向けて光を照射するようにセンサチップ1に対して流路11aを挟んで配置されている。光源12の照射方向は、特定平面S1に平行で、且つ、基準平面S0に対して所定の入射角度θをなすように設定されている。なお、この入射角度θは、各回折格子面5a〜5iからの反射光の強度のうち、最小入射角の回折格子面6aからの反射光の強度が最小となるように調整しておくのが好ましい。光源12としては単色光を発するレーザ光源、特に価格,大きさの点で半導体レーザが好ましく、波長は350〜1300nm程度とするのが好ましい。また、ハロゲン・タングステンランプなどの白色光を干渉フィルターや分光器等で分光して得た単色光を光源として用いることも可能である。
【0081】
光検出器13はセンサチップ1からの反射光を検出する検出器であり、光源12と同様にセンサチップ1に対して流路11aを挟んで配置されている。光検出器13としては、例えばCCD素子を集積したもの、シリコンフォトダイオードアレイ等が好ましい。なお、図中では省略しているが、P偏光のみが表面プラズモン波を共鳴させることができるため、光源12とセンサチップ1との間、またはセンサチップ1と光検出器13との間には、光源12からの照射光、或いはセンサチップ1からの反射光を偏光するための偏光子が設置されている。
【0082】
分析部14は光検出器13からの検出情報に基づき分析処理を行う装置である。分析部14は、本発明にかかる算出手段或いは測定手段、及び分析手段として機能する。以下、分析部14の各機能とあわせて、本実施形態にかかるセンサチップ1を用いた試料の分析手順について、共鳴角度を算出して共鳴角度に基づき試料の分析を行う場合と、反射光の強度の変化量を測定して反射光強度の変化量に基づき試料の分析を行う場合とに分けて具体的に説明する。
【0083】
共鳴角度に基づき試料の分析を行う場合、まず、センサチップ1をホルダ11にセットしてセンサチップ1のセンサ面1aを試料に接触させる(ステップA1)。これによりセンサ面1aの各測定スポット6に固定された結合物質7に試料流体中の検出種が特異的に結合する。そして、結合物質7に結合した検出種の物質量に応じて各測定スポット6の金属層3表面近傍の媒質の屈折率が変化し、各測定スポット6における表面プラズモン波の共鳴条件が変化する。
【0084】
次に、光源12からセンサ面1aに向けて照射光を照射する(ステップA2)。このとき、照射光が全ての測定スポット6を照らすように照射光の太さを調整する。センサ面1aに照射された照射光は各測定スポット6に配置された各回折格子面5a〜5iにおいて回折光を生じさせる。このうち0次の回折光(反射光)を光検出器13によって検出し、検出した反射光の強度を計測する(ステップA3)。したがって、光検出器は受光手段としての役割と計測手段としての役割を果たす。
【0085】
光検出器13により検出された反射光の情報は分析部14に送られる。分析部14は、光検出器13からの反射光の情報から結合物質7が固定された各測定スポット6からの反射光の強度の情報を抽出して、各測定6スポットの回折格子面5a〜5i毎に反射光の強度を検出する。そして、各回折格子面5a〜5iからの反射光の強度に基づき、測定スポット6毎に共鳴角度を算出する。具体的には、測定スポット6毎に反射光の強度が最小となる回折格子面を検出し、その回折格子面への実際の入射角度(基準平面S0への入射角度から傾斜角度を差し引いた角度)を共鳴角度と見なすか、或いは、反射光強度が最小の回折格子面の近傍にある複数の回折格子面の実際の入射角度と、これら回折格子面で得られる反射光強度とに基づき、反射光強度が極小となる共鳴角度を補間計算する。この場合、補間計算の方がより正確に共鳴角度を算出することができる(ステップA4−1)。
【0086】
そして、分析部14は、照射した光の波長と算出した共鳴角度とを検量線(或いは理論的な濃度換算式)に照合して、各測定スポット6に対応する検出種の濃度を分析する。検量線は、濃度既知の試料を用いた試験により各検出種の濃度と共鳴波長及び共鳴角度との関係を予め求めたものであり、算出した各測定スポット6における共鳴角度をこの検量線に照合することで試料流体中の各検出種の濃度を測定できる(ステップA5−1)。
【0087】
このような手法により分析を行うことで、各測定スポット6における共鳴角度を同時に且つリアルタイムで算出することができ、多種の検出種についてのリアルタイム分析が可能になる。
なお、媒質の屈折率変化が非常に大きく(例えば酵素反応により生じるものが表面に沈着する性質を持つ色素のような場合や、結合反応の増感法として金コロイドなどの微粒子を使用する場合など)、回折格子面5a〜5iの角度だけでは共鳴角度のシフトに対応できないときは、入射光の角度を変更することによって対応することができる。
【0088】
一方、反射光強度の変化量に基づき試料の分析を行う場合は、上述のステップA1からステップA3までの処理によりセンサ面1aからの反射光を検出すると、分析部14は、得られた反射光の情報から各測定スポット6からの反射光の情報を抽出して、各測定6スポットの回折格子面5a〜5i毎に反射光の強度を検出する。そして、センサ面1aに試料が接触していない状態に対する反射光強度の変化量を回折格子面5a〜5i毎に測定する(ステップA4−2)。
【0089】
次に、分析部14は、反射光強度の変化量が所定の測定レンジ(測定許容範囲)内にある、すなわちレンジオーバーしていない回折格子面を測定スポット6毎に選定する。そして、選定したレンジオーバーしていない回折格子面からの反射光強度の変化量とその回折格子面の傾斜角度とを検量線(濃度既知の試料を用いた試験により回折格子面への入射角度と反射光強度の変化量との関係を予め求めたもの)に照合して、各スポット6に対応する検出種の濃度を分析する(ステップA5−2)。
【0090】
エバネッセント波の波数は回折格子面への照射光の入射角度に変化することから、反射光強度の変化量も入射角度により変化し、入射角度如何によっては変化量が大きくなりすぎて分析部14に含まれる測定器の測定レンジを越えてしまう場合がある。この場合、従来は、光学系の再調整により入射角度を変更する必要があった。特に多項目測定を行う場合において、検出種間の濃度差が大きい場合には、測定しようとする検出種毎に入射角度を変更しなければならなかった。しかしながら、本実施形態のセンサチップ1には、傾斜角度が異なる複数の回折格子面5a〜5iが設けられているので、照射光の入射角度を変更せずとも別の回折格子面を選定することで実質的に入射角を変更したことになる。つまり、実質的に計測レンジを拡大したことに相当する。その結果、広い計測レンジが必要となる濃度域の広い試料についても対応することが可能となる。
【0091】
以上のように、本実施形態のセンサチップ1を用いて試料の分析を行うことにより、多種の検出種についてのリアルタイム分析が可能になるとともに、濃度域の広い試料についても対応することができるという利点がある。
また、このセンサチップ1を用いた分析装置10には、角度スキャンのための駆動機構を必要とせず、光源(偏光子を含む)12とセンサチップ1と光検出器13だけで光学系が構成できるので、装置の簡素化、小型化及び低コスト化が可能になるという利点もある。
【0092】
近年、特に臨床検査の分野では治療の現場での検査を可能にする小型・簡便操作を特徴とするPOCが重視されており、表面プラズモン共鳴センサチップも免疫検査などに適用が考えられていたが、サイズとコストの点において従来はPOCへの展開は困難であった。しかしながら、この分析装置10によれば、サイズもコストも抑えることができるのでPOCに適用可能なだけでなく、在宅検査などの領域にも適用することができる。さらには、この分析装置10は、HPLCにも好適であり、血液や尿の分析や食品中の栄養分の分析、或いは排水中の化学物質の分析等にも応用することができる。
【0093】
(B)第2実施形態
次に、図6を用いて本発明の第2実施形態について説明する。
本実施形態にかかるセンサチップ21は、その基本構成は第1実施形態と共通しており、表面を金属層23により被覆され、金属層23上の複数箇所に回折格子が形成された回折領域(測定スポット)26が部分的に設けられている。
【0094】
ここでは、測定スポット26は、回折格子が形成された曲面(以下、回折格子面)25からなり、この回折格子面25は、金属層3上の測定スポット26外の表面を基準平面S0としたとき、この基準平面S0に垂直な特定平面S1に対して垂直に配置されている。また、回折格子面25は、センサ面21a側に凸の弧状に形成されており、特定平面S1に垂直な溝方向に回折格子が形成されている。
【0095】
この構造によれば、測定スポット26への実質的な入射角度は回折格子面25上の位置により異なり、図6において基準平面S0に対する照射光の入射角度をθとしたとき、回折格子面25上の各位置への実際の入射角度は、その位置における接平面の基準平面S0に対する傾斜角度をβとすると、θ−βとなる。回折格子面25に接する接平面の傾斜角度は、図6に示すようにβ1(β1>0)からβ2(β2<0)まで連続的に変化することから、回折格子面25への照射光の実質的な入射角度にはθ−β1からθ−β2までの連続的な分布が生じることになり、その結果、回折格子面25の各位置から得られる反射光の強度にも連続的な分布が生じることになる。
【0096】
このような特性により、本実施形態のセンサチップ21を用いて試料の分析を行う場合には、第1実施形態と同様の利点が得られるだけでなく、回折格子面25への照射光の実質的な入射角度が連続的に分布することから、近似や補間計算によることなく共鳴角度を直接検出することができ、より正確な分析が可能になるという利点もある。
【0097】
(C)第3実施形態
次に、図7を用いて本発明の第3実施形態を説明する。
本実施形態に係るセンサチップ31は、その基本構成は第1実施形態と共通しており、表面を金属層33により被膜され、金属層33上の複数箇所に回折格子が形成された回折領域(測定スポット)36が部分的に設けられている。
【0098】
ここでは、測定スポット36は一部に回折格子を形成された回折格子面35a〜35iからなり、この回折格子面35a〜35iの一部には回折格子が形成されていない領域(以下、非回折面という)37a〜37iが形成されている。その他の構成は、第1実施形態と同一である。
【0099】
この構造によれば、測定スポット36の反射光は、回折格子面35a〜35iで反射して表面プラズモン共鳴により強度を弱められた反射光(以下、共鳴反射光という)と、非回折面37a〜37iで反射し、表面プラズモン共鳴の影響を受けていない反射光(以下、基準反射光という)とに別けられる。
【0100】
このような特性により、本実施形態のセンサチップ31を用いて試料の分析を行う場合には、第1実施形態と同様の手法に加え、計測される共鳴反射光の強度を、共鳴反射光が反射した回折格子面と同じ回折格子面にある非回折面で反射した基準反射光の強度で補正するステップを備えることができる。これにより、第1実施形態と同様の利点に加えて、基準反射光の強度による補正によって、各回折格子面間の表面特性による誤差の影響を補正することができ、より正確な分析を行うことが可能となるという利点がある。
【0101】
(D)第4実施形態
次に、図8を用いて本発明の第4実施形態を説明する。
本実施形態に係るセンサチップ41は、その基本構成は第1実施形態と共通しており、表面を金属層43により被膜され、金属層43上の複数箇所に回折格子が形成された回折領域(測定スポット)46が部分的に設けられている。
【0102】
ここでは、測定スポット46上に、結合物質47の他に非結合物質48を固定化する。非結合物質48は、検出すべき検出種と特異的に結合しうる性質を備えない物質である。試料中に複数の検出種が含まれる場合には、各検出種に応じた結合物質47及び非結合物質48がそれぞれ選択されて、それぞれ別々の測定スポット46に固定化してもよい。
【0103】
したがって、結合物質が固定化された領域は反応領域となり、非結合物質が固定化された領域及び結合物質と非結合物質とが共に固定化されていない領域は非反応領域となる。また、金属層43を形成する金属と検出種とが特異的に結合しない場合には、非結合物質48を固定化せずに、結合物質47及び非結合物質48が共に固定化されず金属層43が剥き出しとなっている領域を非反応領域としても良い。
この他の構成は、第1実施形態と同一である。
【0104】
この構造によれば、測定スポット46から反射される反射光は、反応領域で反射される反射光と非反応領域で反射される反射光とに別けられる。反応領域で反射される反射光は試料の定量的及び/又は定性的な要素によって変化するが、非反応領域で反射される反射光は試料の影響を受けず回折格子面の構造によってのみ強度が決定される。
【0105】
このような特性により、本実施形態のセンサチップ41を用いて試料の分析を行う場合には、第1実施形態と同様の手法に加え、反応領域及び非反応領域のそれぞれにおいて表面プラズモン共鳴が発生する共鳴角度を算出するステップと、さらに、反応領域における共鳴角度から反応領域と同じ回折格子面上の非反応領域における共鳴角度を差し引いた共鳴角度を算出するステップとを行う。これにより、検出種が反応領域で結合物質と結合した時の反射光を、反応領域近傍の非反応領域で反射した反射光を基準として分析することができるため、第1実施形態と同様の利点に加えて、検出種が結合物質と特異的に結合することにより生じる変化を確実に分析することができる。
【0106】
(E)第5実施形態
次に、図9を用いて本発明の第5実施形態を説明する。
本実施形態は、第1実施形態の分析装置10の、試料流体が流れる流路11aの上流に、試料流体を分離する分離装置59が設置された構造となっている。
【0107】
分離装置59としては、試料の吸着性や分配係数に応じて分離を行う液体クロマトグラフィーやHPLC(high performance liquid chromatography),試料の電気陰性度に応じて分離を行うキャピラリー電気泳動やマイクロチップ電気泳動,フローインジェクション或いはマイクロチャネルを用いた分離方法などが好適である。
【0108】
マイクロチャネルは何らかのチップ表面に形成された試料が流れる溝のことであるが、この溝の一部にHPLCのカラム充填材に相当するものを詰めたり、溝表面に官能基を備えさせたりすることで、分離が可能となるものである。
【0109】
また、フローインジェクションは試料が流れている状態で様々な反応を起こさせる手法であるが、例えば錯形成反応と溶媒抽出とを行い、試料中の検出種以外の物質を除去する等の処理をして、分離を行うことができる。
【0110】
なお、もちろん上記以外の装置を分離装置として分析装置に取り付けても良い。
【0111】
この装置を用いて分析を行なう場合、酵素やたんぱく質等の検出種を予め分離装置によって純粋な物質ごとに分離することができる。このため、純粋な物質となった検出種を分析することができ、より正確な分析を行うことができる。
【0112】
また、分析手段として通常用いられている検出方法(吸光度検出、蛍光検出、化学発光検出、示差屈折計検出、電気化学検出など)と組み合わせることにより、各種の存在物質の存在量と、その中での検出対象種の特異的反応計測による測定とを同時に行うことができる。
【0113】
(F)第6実施形態
次に、図5を用いて本発明の第6実施形態を説明する。
本実施形態は、第1実施形態と基本的な構成は共通しており、光源12から照射された光はセンサチップで反射し、光検出部13で検出されるよう構成されている。
【0114】
ここでは、検出種は蛍光や燐光などの光を発生しうる発光物質である。例えば、結合物質と反応することや、光源12から供給される光によって励起されることにより発光する発光物質がある。本実施形態では光検出部13がこの発光した光(発光光)を検出できるように構成されている。
【0115】
このような構成により、実施形態1の利点に加え、本実施形態は発光光の検出結果を用いて試料の定量的及び/又は定性的な分析を行うことができ、したがってより正確な分析を行うことができる。特に蛍光などの化学発光は非常に高感度であるため、微小な反応を検出することが可能である。
【0116】
(G)第7実施形態
次に、図10,11を用いて本発明の第7実施形態を説明する。
本実施形態は、第1実施形態と基本的な構成は共通しており、光源12から照射された光はセンサチップ71で反射し、光検出部13で検出されるよう構成されている。
【0117】
ここでは、図10に示すように、試料が流れる流路70が回折格子としての凹凸と直交する向きに複数設けられている。流路70はセンサチップ71表面を覆う蓋72とセンサチップ71との間に設けられ、2本1組でセンサチップ71上の各測定スポット6を通過するよう形成されている。なお、流路70と流路70との間には、試料が混ざらないようにシールが施されている。
また、図11に示すように、分析装置10の流路70の上流に、異なる試料流体それぞれを各流路70に割り当てて、割り当てた試料流体を各流路に導入する試料導入装置79が設置されている。
【0118】
この様な構成により、本実施形態では、第1実施形態と同様の手法に加え、異なる複数の試料を複数の流路70に割り当て、各流路70に割り当てられた試料を流しながらセンサ面に光を照射するステップを備えることができる。
【0119】
このため、第1実施形態の利点に加え、本実施形態は複数の試料を同時に分析することができるため作業が効率的に行える。また、複数の試料を同じ条件下で分析できるため、試料の違いを明確に分析することができる。
【0120】
(H)第8実施形態
次に、図12を用いて本発明の第8実施形態について説明する。
本実施形態にかかるセンサチップ81は、その基本構成は第1実施形態と共通しており、表面を金属層83により被覆され、金属層83上の複数箇所に回折格子が形成された回折領域(測定スポット)87が部分的に設けられている。
【0121】
ここでは、測定スポット87の隣に、測定スポット87の表面の回折格子が形成された面が基準平面S0に対する傾斜角度の分布と同一の、基準平面S0に対する傾斜角度の分布を有する、回折格子が形成されていない平面(以下、非回折面という)を形成された非回折領域88が設けられている。その他の構成は、第1実施形態と同一である。
【0122】
この構造によれば、センサチップ81の反射光は、測定スポット87で反射して表面プラズモン共鳴により強度を弱められた共鳴反射光と、非回折領域88で反射し、表面プラズモン共鳴の影響を受けていない基準反射光とに別けられる。
【0123】
このような特性により、本実施形態のセンサチップ81を用いて試料の分析を行う場合には、第1実施形態と同様の手法に加え、計測される共鳴反射光の強度を、共鳴反射光が反射した測定スポットに対応する非回折領域で反射した基準反射光の強度で補正するステップを備えることができる。これにより、第1実施形態と同様の利点に加えて、基準反射光の強度による補正によって、各測定スポットの表面に設けられた回折格子面間の表面特性による誤差の影響を補正することができ、より正確な分析を行うことが可能となるという利点がある。
【0124】
(I)第9実施形態
次に、図13を用いて本発明の第9実施形態について説明する。
本実施形態にかかるセンサチップ91は、その基本構成は第1実施形態と共通しており、表面を金属層93により被覆され、金属層93上の複数箇所に回折格子が形成された回折領域(測定スポット)96が部分的に設けられている。
【0125】
ここでは、測定スポット96のうちの一部の表面に、結合物質97を固定化し、他の測定スポット96の表面に、非結合物質98を固定化する。非結合物質98は、検出すべき検出種と特異的に結合しうる性質を備えない物質である。試料中に複数の検出種が含まれる場合には、各検出種に応じた結合物質97及び非結合物質98がそれぞれ選択されて、それぞれ別々の測定スポット96に固定化してもよい。
【0126】
したがって、結合物質が固定化された測定スポット表面の結合物質が固定化された領域は反応領域となり、非結合物質が固定化された測定スポット表面の非結合物質が固定化された領域及び結合物質と非結合物質とが共に固定化されていない領域は非反応領域となる。
また、金属層93を形成する金属と検出種とが特異的に結合しない場合には、非結合物質98を固定化せずに、結合物質97及び非結合物質98が共に固定化されず金属層93が剥き出しとなっている領域を非反応領域としても良い。
この他の構成は、第1実施形態と同一である。
【0127】
この構造によれば、測定スポット96から反射される反射光は、反応領域で反射される反射光と非反応領域で反射される反射光とに別けられる。反応領域で反射される反射光は試料の定量的及び/又は定性的な要素によって変化するが、非反応領域で反射される反射光は試料の影響を受けず回折格子面の構造によってのみ強度が決定される。
【0128】
このような特性により、本実施形態のセンサチップ91を用いて試料の分析を行う場合には、第1実施形態と同様の手法に加え、反応領域及び非反応領域のそれぞれにおいて表面プラズモン共鳴が発生する共鳴角度を算出するステップと、さらに、反応領域における共鳴角度から反応領域と同じ回折格子面上の非反応領域における共鳴角度を差し引いた共鳴角度を算出するステップとを行う。これにより、検出種が反応領域で結合物質と結合した時の反射光を、反応領域近傍の非反応領域で反射した反射光を基準として分析することができるため、第1実施形態と同様の利点に加えて、検出種が結合物質と特異的に結合することにより生じる変化を確実に分析することができる。
【0129】
(J)第10実施形態
次に、図11,14を用いて本発明の第10実施形態を説明する。
本実施形態は、第1実施形態と基本的な構成は共通しており、光源12から照射された光はセンサチップ101で反射し、光検出部13で検出されるよう構成されている。
【0130】
ここでは、図14に示すように、センサチップ101表面に試料が流れる流路100が並列に複数設けられている。流路100はセンサチップ101表面を覆う蓋102とセンサチップ101との間に設けられている。なお、流路100と流路100との間には、試料が混ざらないようにシールが施されている。
また、各流路100には第1実施形態と同様の測定スポット6が複数設けられている。
【0131】
また、図11に示すように、分析装置10の流路100の上流に、異なる試料流体それぞれを各流路100に割り当てて、割り当てた試料流体を各流路に導入する試料導入装置79が設置されている。
【0132】
この様な構成により、本実施形態では、第1実施形態と同様の手法に加え、異なる複数の試料を複数の流路100に割り当て、各流路100に割り当てられた試料を流しながらセンサ面に光を照射するステップを備えることができる。
【0133】
このため、第1実施形態の利点に加え、本実施形態は複数の試料を同時に分析することができるため作業が効率的に行える。また、複数の試料を同じ条件下で分析できるため、試料の違いを明確に分析することができる。
【0134】
また、本実施形態と第4実施形態とを組み合わせたり、本実施形態と第9実施形態とを組み合わせたりすることができる。これにより、同一流路上の各回折格子面にそれぞれ反応領域と非反応領域とを形成することが可能となり、非反応領域からの反射光による補正を各流路を流れる試料ごとに行うことができる。
【0135】
(K)その他
以上、本発明の実施の形態について説明したが、本発明は上述の実施の形態に限定されるものではなく本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々変形して実施することができる。
例えば、第1実施形態では中央の回折格子面5eを基準平面S0に平行に配置していたが、図15に示す回折格子面116a〜116eのように、端部の回折格子面116eを基準平面S0に平行に配置して、光の照射方向に向けて回折格子面116a〜116dの傾斜角度を次第に大きくしていくような配置でもよい。ただし、同一の面数の回折格子面を設ける場合には、第1実施形態のように中央の回折格子面5eを中心にして左右に傾斜角度を大きくしていくような配置の方が中央部の出っ張りを低くすることができるので、試料液の流れを妨げることがない。
【0136】
また、各回折格子面は必ずしも連続している必要はなく、図16に示す回折格子面126a〜126eのように、一端は基準面S0と同レベルに配置して他端を立ち上げることにより基準面S0に対して傾斜角度を持たせるようにしてもよい。
また、一つの測定スポットにより多くの回折格子面を配置する場合には、図17に示すように回折格子面136a〜136kを複数列に配置してもよい。これにより、多数の回折格子面136a〜136kをコンパクトに配置することが可能になる。
【0137】
さらに、各実施形態では、特定平面S1に平行な一の方向から見たときの基準平面S0に対する傾斜角度が次第に小さくなるように平面状の回折格子面5a〜5iを順に配置したり、光が照射される側に向けて凸の曲面形状を有する回折格子面25を設けたりしているが、これは各回折格子面5a〜5iからの反射光や、回折格子面25の各位置からの反射光が交錯することを防止するための配置或いは形状である。しかしながら、各回折格子面5a〜5i或いは回折格子面25の各位置からの反射光を区別することができるならば、必ずしもこのような配置或いは形状に限定されるものではない。
【0138】
また、各実施形態では、本発明のセンサチップをセンサ面に測定スポットが複数設けられた多点同時測定用(或いは多項目測定用)のセンサチップとして構成しているが、センサ面全体が一つの測定スポットであるセンサチップにも本発明を適用することは可能である。
さらに、各実施形態では、金属層の表面に回折格子が形成された従来の一般的な構造の回折格子型センサチップに本発明を適用した場合について説明したが、本発明は他の様々な構造の回折格子型センサチップにも適用しうるものである。すなわち、光の照射によりエバネッセント波を生じさせる回折格子が形成された回折格子面と、回折格子面に沿って設けられ光の照射により表面に表面プラズモン波を誘起しうる金属層とを備えたセンサチップであれば、本発明を適用することができる。
【0139】
また、各実施形態を組み合わせて実施することも可能である。例えば、第3実施形態と第6実施形態とを組み合わせて実施したり、第5実施形態と第7実施形態とを組み合わせて実施したりしても良い。
【0140】
特に、第3実施形態及び/又は第8実施形態と、第4実施形態及び/又は第9実施形態とを組み合わせて、非回折面による補正と非反応領域による補正とを共に行うようにすることは、正確な分析をより確実に行うことができるため好ましい。即ち、反応領域からの反射光に対し非回折面による補正を行って共鳴角を算出し、さらに、非反応領域からの反射光に対し非回折面による補正を行って共鳴角を算出して、両者の共鳴角から真の特異的反応に由来する共鳴角シフト量と検出種濃度とを算出することができるのである。
【0141】
また、第4実施形態及び第9実施形態においては、非結合物質としては検出種と特異的反応を起こさない性質を持つ物質を、検出種に応じて選択する場合と、検出種に関係なく同一の物質を使う場合がある。
【0142】
検出種に応じて非結合物質を選択する場合には、第4実施形態のように、同一回折格子面に結合物質と非結合物質との両方を固定化することが好ましい。しかし、センサチップを製造する手間を考慮すると、第9実施形態のように、結合物質が固定化された測定スポットの隣に存在する測定スポットに非結合物質を固定化して、結合物質が固定化された測定スポットの隣に存在する測定スポット自体を非反応領域とする方が有利である。
【0143】
一方、全ての検出種に対して同一の物質を非反応物質として用いる場合には、ブロッキング剤として使用されているBSA(bovine serum albumin)や、ゼラチンなどを使用することができる。この場合には、第9実施形態のように、センサチップ上の1以上の測定スポットのすべての回折格子面に非反応物質を固定化し、その測定スポット自体を非反応領域とする方が製造上有利である。
【0144】
【実施例】
以下に本発明を実施例を用いて説明するが、その要旨の範囲を越えない限り本発明は実施例に限定されるものではない。
【0145】
(実施例1)
平板状のポリカーボネート製の基体の表面に、溝ピッチ約870nm,溝深さ約40nmの凹凸形状を形成し、この凹凸形状を回折格子とし、さらに基体の表面に厚さ約80nmで金を蒸着して、センサチップを作成した。
続いて、このセンサチップを、15mm×25mmの矩形に形成し、回折格子が長さ25mmの辺と平行になるようにした。形成したセンサチップを図18に示した。
【0146】
次いで、センサチップの長さ15mmの辺の、一端からの距離がそれぞれ約5.5mm,4mm,5.5mmである点を含む、センサチップの長さ25mmの辺に平行な直線を折り目として、このセンサチップを約0.8°ずつ折り曲げた。つまり、図19に示すように、5.5mm×25mmの矩形の領域(以下、領域Aという)と4mm×25mmの矩形の領域(以下、領域Bという)とが、長さ25mmの辺を接しており、領域Bの領域Aと逆側には、領域Bと5.5mm×25mmの矩形の領域(以下、領域Cという)とが、長さ25mmの辺を接している。また、領域Bは、基準面に対し0°を保ち、領域Cは領域Bに対して約0.8°の角度をなし、領域Aは領域Bに対して約−0.8°の角度をなすように折り曲げた。したがって、領域Aと領域Cとがなす角度が約1.6°となっている。さらに、計測時には試料をセンサチップの凸側の面で測定できるように、回折格子がセンサチップの凸側の面となるようにした。
【0147】
こうして作成したセンサチップの中央部の10mm×10mmの領域を測定スポットとして、共鳴角検出型のSPR測定装置FLEX CHIPSTM Kinetic Analysis System(HTS Biosystems Inc.)で角度スキャンを行いながら反射光の強度を計測した。計測には波長約870nmの光を入射光に用い、試料は精製水を用い、それぞれの領域で任意のポイント3箇所で計測を行った。
【0148】
計測された共鳴角前後での入射光の入射角と反射光強度との関係を、図20に示す。各グラフにおいて、反射光強度が最小となる角度が共鳴角である。それぞれの領域の計測結果を表1に示す。なお、SDは標準偏差,CVは変動係数である。
【表1】
【0149】
なお、領域Aにおける3箇所の測定ポイントをそれぞれA−1,A−2,A−3と表記し、同様に領域Bおける3箇所の測定ポイントをそれぞれB−1,B−2,B−3、領域Cおける3箇所の測定ポイントをそれぞれC−1,C−2,C−3と表記した。
表1に示すように、それぞれの領域の共鳴角の平均は、領域Aが21.641°、領域Bが20.791°、領域Cが19.860°となった。
【0150】
次に、図18のような、上記のセンサチップを折り曲げず平板状のままとしたセンサチップを別途作成し、領域A,B,Cと同様に共鳴角検出型のSPR測定装置FLEX CHIPSTM Kinetic Analysis Systemで角度スキャンを行いながら反射光の強度を計測した。入射光には波長約870nmの光を用いた。試料は精製水を用いた。以下、平板状のセンサチップの測定スポットを領域Dという。この計測においては、領域Dの400箇所のポイントで計測を行った。
【0151】
計測された共鳴角前後での入射光の入射角と反射光強度との関係を図21に示す。また、計測結果を表2に示す。
【表2】
図21にあるように、領域Dでは共鳴角は全てのポイントで同じ角度となっていた。また、共鳴角の平均は、表2のように20.832°となった。
【0152】
領域A,B,C,Dにおいて、領域内の回折格子は同じ溝ピッチと溝深さとを有しており、また計測した試料も同じ精製水であるため、各領域の共鳴角は本来同一の角度となるはずである。しかし、領域A,B,Cでは、角度を導入していない領域Dに比べて、それぞれ−0.809°,0.041°,0.972°の角度を有するため、共鳴角が見かけ上変化したように測定された。
以上の結果から、回折格子面に傾斜角度を導入することにより、回折格子面に入射する入射光の入射角を変えることができたことが確認された。
【0153】
(実施例2)
実施例1と同様に、平板状のポリカーボネート製の基体の表面に、溝ピッチ約870nm,溝深さ約40nmの凹凸形状を形成し、この凹凸形状を回折格子とし、さらに基体の表面に厚さ約80nmで金を蒸着して、センサチップを作成した。このセンサチップを折り曲げ、異なる傾斜角度を持つ面を26面形成した。以下、角度を持つそれぞれの面の領域を、それぞれ水平面に対してなす傾斜角度の小さい順に領域No.1、領域No.2と自然数の番号を付けて呼ぶ。
【0154】
こうして26の異なる傾斜角度を持つ面を形成されたセンサチップを用いて、SPR測定装置FLEX CHIPSTM Kinetic Analysis Systemで角度スキャンを行いながら反射光の強度を計測した。試料は精製水を用いた。入射光としては波長が約870nmの光を用いた。共鳴角を特定し、傾斜角度を有していない実施例1の領域Dの測定結果と比較して、それぞれの領域がどれだけの傾斜角度を有しているかを特定した。測定結果を表3に示す。
【表3】
その結果、それぞれの領域は−0.936°〜0.978°の角度を有していることが判明した。
【0155】
次に、これらのセンサチップを用いて、SPR測定装置FLEX CHIPSTM Kinetic Analysis Systemで波長約870nmの光を入射光とし、濃度が2.5%,5%,10%,20%,30%,40%,50%であるエタノール水溶液をそれぞれ試料として、反射光の強度を計測した。
【0156】
それぞれの領域におけるエタノール濃度と、共鳴角がエタノール濃度の増加によって変化した変化量(以下、シフト量という)とを表4に示す。
【表4】
いずれの領域でも、各エタノール濃度に対して変動係数(CV:coefficient of variation)は1.2%〜6.3%と良好であった。また、いずれの領域でも同量の共鳴角のシフトを示した。
以上の結果から、角度を有する回折格子面でも角度を有さない回折格子面と同等の計測精度を持つことが分かった。
【0157】
(実施例3)
実施例2で取得した計測データのうち、入射光の入射角が21.5°であった際の測定データを選択し、その測定データの中でエタノール濃度が0%,2.5%,5%,10%,20%,30%,40%,50%であるエタノール水溶液それぞれを試料としたときの、反射光強度が最小となる領域の角度を算出した。具体的には、それぞれの領域が有する角度(表3)と、その領域における反射光強度とを用いて、反射光強度が最小となる角度を、回帰計算によって求めた。
【0158】
この結果判明した、エタノール水溶液のエタノール濃度と、反射光強度が最小となる領域の角度、つまり共鳴角のシフト量との関係を図22に示す。
【0159】
一般的に行われている方法、即ち、角度スキャンを行う方法で得られる共鳴角から、エタノール水溶液のエタノール濃度と、領域No.7及び領域No.15の回折格子面における共鳴角のシフト量との関係を調べた。この結果を図23に示す。
【0160】
図22と図23とを比較した結果を表5に示す。
【表5】
比較の結果、図22と図23とが各エタノール濃度に対して同様のシフト量を示していることが判明した。したがって、一般的に行われてきた方法の結果(図23)判明する共鳴角のシフト量が、本発明による回折格子面を保有するセンサチップを用いたことにより、入射光の入射角が一定の測定法で、最小反射強度を与える回折格子面が示す共鳴角の変化という形で得られる事が分かった。
【0161】
(実施例4)
実施例2で取得した計測データのうち、入射光の入射角が21.5°の場合及び入射角が21.0°の場合のデータについて解析した。
【0162】
入射光の入射角が21.5°の場合では、領域No.2,7,10,16,19の反射光強度とエタノール濃度との関係を解析した。その結果を図24及び表6に示す。また、入射光の入射角が21.0°の場合では、領域No.10,13,18,20,22の反射光強度とエタノール濃度との関係を解析した。その結果を図25及び表7に示す。
【0163】
【表6】
【表7】
【0164】
図24から、入射光の入射角が21.5°の場合は、エタノール濃度が0%〜10%の範囲は領域No.2の反射光強度を、エタノール濃度が10%〜30%の範囲は領域No.10の反射光強度を、エタノール濃度が30%〜50%の範囲は領域No.19の反射光強度をそれぞれ用いることで、入射光の入射角が一定であっても広範囲なエタノール濃度域に対して計測が可能になることが確認された。
【0165】
同様に、図25から、入射光の入射角が21.0°の場合は、エタノール濃度が0%〜10%の範囲は領域No.10の反射光強度を、エタノール濃度が10%〜30%の範囲は領域No.18の反射光強度を、エタノール濃度が30%〜50%の範囲は領域No.22の反射光強度をそれぞれ用いることで、入射光の入射角が一定であっても広範囲なエタノール濃度域に対して計測が可能になることが確認された。
【0166】
したがって、従来の角度スキャンを行いながら反射光強度を測定する方法に比べ、入射光の入射角を一定にし、角度スキャンを行わない簡便な計測法でも広範囲な測定が可能であることが分かった。
【0167】
(実施例5)
平板状のポリカーボネート製の基体の表面に、溝ピッチ約870nm,溝深さ約40nmの凹凸形状を形成し、この凹凸形状を回折格子とした。
【0168】
さらに、この基体を、図26に示すように、回折格子と直交する方向の断面が、曲率半径が約1150mmの曲面となり、且つ、回折格子が基体の凸側の面にくるように加工した。次いで、この基体の表面に厚さ約80nmで金を蒸着して、センサチップを作成した。
【0169】
このセンサチップを用いて、共鳴角検出型のSPR測定装置FLEX CHIPSTM Kinetic Analysis System(HTS Biosystems Inc.)で角度スキャンを行いながら反射光の強度を測定した。測定には波長約870nmの光を入射光に用い、試料は精製水を用いた。
【0170】
センサチップ表面の、回折格子に直交する方向に約0.33mm間隔の領域における反射光の共鳴角を検出した結果を表8に示す。
【表8】
各領域間の接面の角度差の合計が0.17°となり、本来両端部の接面がなすべき角度である0.3°よりも小さいため、曲率半径が設計よりも大きくなるよう形成されていたことが推定される。
【0171】
しかし、0.33mm間隔の隣あう領域間の角度は平均0.010°と非常に小さい値に制御されており、曲面を形成した構造であってもセンサチップ表面に回折格子面を形成することができることが確認できた。
【0172】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明によれば、表面プラズモン共鳴センサチップの回折格子面に光の照射方向に対して角度の分布を持たせることにより、平行光を照射した場合でも回折格子面から得られる反射光の強度に分布が生じるので、センサ面全体について回折格子面から得られる反射光の強度と回折格子面への実質的な入射角度とに基づき共鳴角度をリアルタイムで算出することできるという利点がある。つまり、簡単な光学系の構成により、リアルタイム測定と大面積の同時測定とを同時に実現することができるという利点がある。
【0173】
また、本発明によれば、表面プラズモン共鳴センサチップの回折格子面に光の照射方向に対して角度の分布を持たせることにより、ある一方向から光を照射した場合でも回折格子面から得られる反射光の強度に分布が生じるので、反射光の強度の変化量に基づき分析を行う場合において実質的に計測レンジを拡大することができ、広い計測レンジが必要となる濃度域の広い試料についても対応することができるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の第1実施形態にかかるセンサチップの構成を示す模式的な斜視図である。
【図2】図1のセンサチップの要部の構成を示す模式的な斜視図である。
【図3】図1のセンサチップに結合物質を固定化した状態を示す模式的な斜視図である。
【図4】図1のセンサチップの製造方法の一例を示す模式的な斜視図であり、(a)〜(c)の順に製造手順を示している。
【図5】本発明の第1実施形態にかかる分析装置の構成を示す模式的な模式図である。
【図6】本発明の第2実施形態にかかるセンサチップの要部の構成を示す模式的な斜視図である。
【図7】本発明の第3実施形態にかかるセンサチップの要部の構成を示す模式的な斜視図である。
【図8】本発明の第4実施形態にかかるセンサチップに結合物質及び非結合物質を固定化した状態を示す模式的な斜視図である。
【図9】本発明の第5実施形態にかかる分析装置の構成を示す模式的な模式図である。
【図10】本発明の第7実施形態にかかるセンサチップの要部の構成を示す模式的な斜視図である。
【図11】本発明の第7,第10実施形態にかかる分析装置の構成を示す模式的な模式図である。
【図12】本発明の第8実施形態にかかるセンサチップの構成を示す模式的な斜視図である。
【図13】本発明の第9実施形態にかかるセンサチップの構成を示す模式的な斜視図である。
【図14】本発明の第10実施形態にかかるセンサチップの構成を示す模式的な斜視図である。
【図15】図1のセンサチップにかかる回折格子面の配置形態の変形例を示す模式的な斜視図である。
【図16】図1のセンサチップにかかる回折格子面の配置形態の変形例を示す模式的な斜視図である。
【図17】図1のセンサチップにかかる回折格子面の配置形態の変形例を示す模式的な斜視図である。
【図18】本発明の第1実施例にかかるセンサチップの模式的な斜視図である。
【図19】本発明の第1実施例にかかるセンサチップの模式的な斜視図である。
【図20】本発明の第1実施例にかかる、入射光の入射角と反射光強度とを示すグラフである。
【図21】本発明の第1実施例にかかる、入射光の入射角と反射光強度とを示すグラフである。
【図22】本発明の第3実施例にかかる、エタノール水溶液のエタノール濃度と共鳴角のシフト量とを示すグラフである。
【図23】本発明の第3実施例にかかる、エタノール水溶液のエタノール濃度と共鳴角のシフト量とを示すグラフである。
【図24】本発明の第4実施例にかかる、エタノール水溶液のエタノール濃度と反射光強度とを示すグラフである。
【図25】本発明の第4実施例にかかる、エタノール水溶液のエタノール濃度と反射光強度とを示すグラフである。
【図26】本発明の第5実施例にかかるセンサチップの模式的な斜視図である。
【符号の説明】
1,21 センサチップ(表面プラズモン共鳴センサチップ)
1a,21a センサ面
2 基体
3,23 金属層
4 凹凸面
5a〜5i,116a〜116e,126a〜126e,136a〜136k
回折格子面(平面)
6,26 測定スポット
7 結合物質
10 分析装置
11 ホルダ
11a,70 流路
12 光源
13 光検出器
14 分析部
25 回折格子面(曲面)
31 センサチップ
33 金属層
35a〜35i 回折格子面
36 測定スポット
37a〜37i 非回折面
41 センサチップ
43 金属層
46 測定スポット
47 結合物質
48 非結合物質
59 分離装置
72 蓋
79 試料導入装置
71 センサチップ
S0 基準平面
S1 特定平面
81 センサチップ
83 金属層
87 測定スポット
88 非回折領域
91 センサチップ
93 金属層
96 測定スポット
97 結合物質
98 非結合物質
100 流路
101 センサチップ
102 蓋[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to the structure of a diffraction grating type surface plasmon resonance sensor chip, and more particularly to the structure of a sensor chip suitable for use in small clinical instruments and HPLC detectors.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, in fields such as biochemistry and medical examination, surface plasmon resonance (SPR) is used as a quantitative and / or qualitative analysis method for sample fluids containing detection species such as chemical species, biochemical species, or biological species. The analysis method used is known. Surface plasmon resonance is a phenomenon in which, when light is incident on a metal layer, a surface plasmon wave induced on the metal surface is excited by resonating with an evanescent wave generated by the incident light. Surface plasmon resonance depends on the wavelength and angle of incident light, and when surface plasmon resonance is excited, the light energy of a light component having a specific incident angle or specific wavelength shifts to a surface plasmon wave, The reflected light having the corresponding incident angle or wavelength is greatly reduced.
[0003]
In order to cause surface plasmon resonance, a metal having a specific surface plasmon wave and an optical structure that induces an evanescent wave that resonates with the surface plasmon wave are required. Two structures are currently known as optical structures for inducing evanescent waves. One is an optical structure using total reflection of a prism, and the other is an optical structure using a diffraction grating. An element in which these optical structures are combined with the above metal is generally called a surface plasmon resonance sensor chip (hereinafter referred to as a sensor chip).
[0004]
Normally, sensor chips have a structure in which a metal layer is laminated on a substrate, and a binding substance (ligand, molecular recognition element) that can specifically bind by interacting with a specific detection species is applied on the metal layer. Fixed. When the sample is brought into contact with the surface of the metal layer on which the binding substance is immobilized, the detection species in the sample is captured by the binding substance. Surface plasmon resonance also depends on the refractive index of the medium on the surface of the metal layer. If the refractive index of the medium changes, the resonance angle changes when the wavelength is constant, and also when the incident angle is constant. Wavelength changes. Therefore, the refractive index of the medium on the surface of the metal layer can be analyzed by examining the resonance angle or the resonance wavelength based on the intensity of the reflected light. In this case, the change in the refractive index of the medium on the surface of the metal layer corresponds to the change in the amount of the detection species trapped by the binding substance, that is, the change in the concentration of the detection species in the sample. By examining the occurring resonance angle or resonance wavelength, the concentration of the detected species in the sample can be analyzed.
[0005]
Among such sensor chips, a prism type sensor chip is generally composed of a sensor chip body (a metal layer laminated on a transparent substrate) and a prism. The sensor chip is basically disposable. However, since the prism is expensive, if not only the sensor chip body but also the prism is disposable, the measurement cost becomes very high. For this reason, in this type of sensor chip, the sensor chip main body and the prism are generally separate, and when used, the prism is brought into close contact with the sensor chip main body, light is incident on the prism, and reflected light is detected and measured. Yes.
[0006]
On the other hand, the diffraction grating type sensor chip has a structure in which a metal layer is laminated on a transparent substrate having a concavo-convex shape (grating) on the surface. By laminating the metal layer on the concavo-convex shape, the concavo-convex shape also appears on the surface of the metal layer, and the concavo-convex shape on the surface of the metal layer functions as a diffraction grating. This type of sensor chip is inexpensive because it does not use an expensive prism such as a prism type, and can be disposable. Further, since the work of bringing the prism and the sensor chip main body into close contact with each other as in the prism type is unnecessary, there is also an advantage that the reproducibility of the measured value is good without a problem such as a variation in the close contact degree.
[0007]
In addition, the prism type sensor chip has a structure in which the prism is used as a path for incident light and reflected light, but there are restrictions on the beam diameter and the region where the beam can be irradiated. However, the diffraction grating type sensor chip has such restrictions. However, a large-diameter beam can be used, and the beam can be irradiated at an arbitrary position. Therefore, the diffraction grating type sensor chip has an advantage that it can inspect a large area at a time as compared with the prism type and can inspect an arbitrary position on the sensor chip. Due to such advantages, there is an increasing expectation for a diffraction grating type sensor chip today.
[0008]
As a sample analysis method using a diffraction grating type sensor chip, an analysis method for detecting a resonance wavelength under a constant incident angle condition and an analysis method for detecting a resonance angle under a constant incident wavelength condition are generally used. . Among these, in the former method, depending on the setting of the incident angle, the resonance wavelength may be outside the measurement range of the measuring instrument, and in this case, it is necessary to readjust the optical system. On the other hand, in the latter method, since the incident wavelength that falls within the measurement range can be selected in advance, there is no problem like the former method.
[0009]
The following four methods are generally known as methods for detecting the resonance angle under the condition of a constant incident wavelength. The first method is a method of detecting a resonance angle by changing the detection angle of a detector that detects reflected light while changing the incident angle of incident light (this is called angle scanning). . In the second method, the angle of incident light is scanned as in the first method, and the reflected light is detected using a fixed angle detector (array detector such as a CCD) to detect the resonance angle. It is a method to do.
[0010]
The third method is a method of irradiating wedge-shaped light as incident light, changing the detection angle of the detector within the reflection angle range of the reflected light, and detecting the resonance angle. And the 4th method is a method of irradiating wedge-shaped light as incident light similarly to the 3rd method, detecting the reflected light using a fixed angle type detector, and detecting a resonance angle.
Furthermore, in addition to the above method, there is also known an analysis method in which the incident angle and the incident wavelength are both fixed. In this method (fifth method), the intensity distribution of the reflected light with respect to the incident angle or the incident wavelength varies depending on the amount of the detection species trapped by the binding substance, that is, the concentration of the detection species in the sample. The intensity of the reflected light is measured under the condition where the incident angle and the incident wavelength are constant, and the concentration and the like are analyzed based on the intensity change amount (change amount from the state not in contact with the sample).
[0011]
[Problems to be solved by the invention]
However, each analysis method has the following problems. First, the first and second methods require a driving mechanism for changing the optical axis angle of the light source in order to perform an angle scan of incident light, resulting in an increase in cost. In addition, since the drive mechanism is required, the apparatus becomes large, and it is difficult to apply to applications such as home use and POC (point of care). In addition, since angle control in mdegree units is necessary, there is a problem that it is difficult to obtain sufficient accuracy. Furthermore, since the angle scan takes time, it cannot follow a very fast reaction and is not suitable for real-time measurement.
[0012]
In the third and fourth methods, although there is no need to scan the angle of the incident light, the wedge-shaped vertex of the incident light is used as the measurement point so that the light enters the measurement point on the sensor chip surface from various angles. Since it is necessary to make contact, it is not suitable for large area measurement or multi-point simultaneous measurement in which a plurality of measurement points are simultaneously measured. For this reason, it cannot cope with integration of protein chips, DNA chips, etc., and the advantages of the above-described diffraction grating type sensor chip cannot be fully utilized.
[0013]
Further, in the fifth method, as in the third and fourth methods, it is not necessary to scan the angle of the incident light, and it is possible to perform a highly accurate analysis that does not require a driving mechanism, but the spectrum of the surface plasmon wave The measurement range (measurement tolerance) is narrow due to the characteristics of the shape, and it is not effective for a very wide concentration range. For this reason, when the measurement range is exceeded, there is a problem that the incident angle must be readjusted to measure the intensity change of the reflected light.
[0014]
The present invention was devised in view of such problems, and a first object thereof is a surface plasmon resonance sensor chip capable of simultaneously realizing real-time measurement and simultaneous measurement of a large area with a simple optical system configuration. Another object is to provide a sample analysis method and an analysis apparatus using the same.
The second object of the present invention is to provide a surface plasmon resonance sensor chip that can handle samples of a wide concentration range by expanding the measurement range when performing analysis based on the amount of change in the intensity of reflected light. It is an object to provide an analysis method and an analysis apparatus for a sample used.
[0015]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the inventor found that a diffraction grating surface on which a diffraction grating that generates an evanescent wave by light irradiation was formed, and a surface provided along the diffraction grating surface by light irradiation on the surface. In a diffraction grating type surface plasmon resonance sensor chip provided with a metal layer capable of inducing surface plasmon waves, the diffraction grating surface has an angular distribution with respect to the direction of light irradiation, whereby the first, The inventors have found that the second object can be achieved together and have completed the present invention.
[0016]
First, a first surface plasmon resonance sensor chip (first sensor chip) of the present invention is formed in the vicinity of a metal layer capable of inducing a surface plasmon wave on the surface by light irradiation, and near the metal layer. A diffraction grating that generates an evanescent wave by irradiation includes a plurality of diffraction grating surfaces formed with a constant groove direction and groove pitch, and each of the diffraction grating surfaces is perpendicular to a specific plane perpendicular to a predetermined reference plane And with respect to the reference planeDifferentA diffraction grating is formed in a groove direction perpendicular to the specific plane and arranged at a predetermined inclination angle.
[0017]
With such a configuration, when light (parallel light) is irradiated from a certain direction parallel to the specific plane, the incident angle of the irradiation light on each diffraction grating surface according to the inclination angle of each diffraction grating surface with respect to the reference plane Distribution occurs, and distribution also occurs in the intensity of reflected light obtained from each diffraction grating surface. Therefore, the resonance angle can be calculated in real time based on the intensity of the reflected light obtained from each diffraction grating surface and the substantial incident angle on each diffraction grating surface. That is, by using the sensor chip having the above-described configuration, the same effect as that obtained when light is irradiated from a plurality of angles at the same time can be obtained without using angle scanning or wedge-shaped light irradiation.
[0018]
When a plurality of diffraction grating surfaces are arranged in a direction parallel to the specific plane, each diffraction grating surface is set so that the inclination angle with respect to the reference plane when viewed from one direction parallel to the specific plane is gradually reduced. It is preferable to arrange them in order. As a result, the reflected light from each diffraction grating surface does not cross each other, and the intensity of the reflected light from each diffraction grating surface can be easily analyzed.The
[0019]
Moreover, it is preferable to arrange | position the said diffraction grating surface continuously in the convex mountain shape on the side irradiated with light. As a result, the reflected light from each position on the diffraction grating surface is not interlaced, and the analysis of the intensity of the reflected light from each position on the diffraction grating surface is facilitated.The
[0020]
The diffraction grating may be formed to have a minimum width having only one groove, and a convex arcuate curved surface may be formed on the light irradiation side by the set of diffraction grating surfaces.Yes.
[0021]
In addition, it is also preferable to provide a plurality of diffraction areas where the diffraction grating surfaces are collectively arranged, and to arrange a plurality of diffraction grating surfaces with different inclination angles in each diffraction area.Yes.In this case, the resonance angle in each diffraction region can be detected at the same time simply by irradiating light from a certain direction parallel to a specific plane. Simultaneous point measurement can be easily performed.
[0022]
In the first sensor chip, each diffraction grating surface is provided along a sensor surface in contact with the sample. When the first sensor chip is used for quantitative and / or qualitative analysis of the sample, it specifically binds to the detection species (chemical species, biochemical species, or biological species) in the sample on the sensor surface. Using a fixed binding substance (substance capable of capturing a detection species by interactions such as antigen-antibody reaction, complementary DNA binding, receptor / ligand interaction, enzyme / substrate interaction)TheIn particular, in the case of a sensor chip for multipoint simultaneous measurement, it is possible to analyze a plurality of types of detection species at the same time by using a plurality of types of binding substances immobilized corresponding to each diffraction region.The
[0023]
In addition, a plurality of types of the binding substances may be fixed for each diffraction grating surface.Yes.
[0024]
Further, a non-diffractive surface on which no diffraction grating is formed may be provided on the sensor surface in the same plane as each of the diffraction grating surfaces.Yes.
In addition, a non-diffractive region in which non-diffractive surfaces on which the diffraction grating is not formed is aggregated is provided corresponding to each diffraction region, and each non-diffractive surface constituting the non-diffractive region is configured as a corresponding diffraction region Each diffraction grating surface may be formed to have the same inclination angle distribution with respect to the reference plane as the inclination angle distribution with respect to the reference plane.Yes.
[0025]
Further, for each diffraction plane, the reaction region in which the binding substance is immobilized and the substance that does not cause specific binding to the detection species in the sample are immobilized, or no substance is immobilized. A non-reactive area may be provided.Yes.
In addition, a reaction region in which a binding substance that specifically binds to the detection species in the sample is immobilized is provided in a part of each diffraction region, and the detection species in the sample and the specific species are provided in the other diffraction regions. Non-reactive areas may be provided in which substances that do not bind naturally are immobilized, or where no substance is immobilized.Yes.
[0026]
In addition, the diffraction grating surface is arranged in a direction perpendicular to the groove direction, and a lid that covers the sensor surface is provided, and the gap between the sensor surface and the lid is directed toward the arrangement direction of the diffraction grating surface. Multiple channels may be formed side by sideYes.
Further, a lid covering the sensor surface may be provided, and a plurality of flow paths may be formed in parallel between the sensor surface and the lid, and the diffraction region may be provided for each of the flow paths.Yes.
[0027]
There are the following eight methods for analyzing a sample using the first sensor chip. The first analysis method is an analysis method in which a resonance angle is calculated and a sample is analyzed based on the resonance angle. In this analysis method, a sample is brought into contact with a sensor surface and light is emitted at a constant incident angle parallel to a specific plane. Irradiating the reflected light from each diffraction grating surface, measuring the intensity of the reflected light from each received diffraction grating surface, the measured reflected light intensity and the reference plane of each diffraction grating surface A step of calculating a resonance angle based on the tilt angle, and a step of performing a quantitative and / or qualitative analysis of the sample based on the calculated resonance angle.The
[0028]
In this case, since the resonance angle can be calculated instantaneously without using an angle scan, real-time measurement can be performed, and the resonance angle can be calculated without using wedge-shaped light irradiation. Can also be measured. Therefore, when a sensor chip for multipoint simultaneous measurement provided with a plurality of diffraction regions in which diffraction grating surfaces are collectively arranged, multipoint simultaneous measurement can be performed in real time. Further, since the optical axis of the light source may be constant and parallel light may be used, the optical system can be simplified. Each of these steps may be executed in the order of description or may be executed simultaneously. In particular, when each step is executed simultaneously, it is possible to monitor in real time how the detection species in the sample are bound to the binding substance.
[0029]
This analysis method can be implemented by using an analyzer having the following configuration. That is, the analyzer holds the first sensor chip by the holding unit in a state where the sample is in contact with the sensor surface, and the specific plane toward the sensor surface of the sensor chip held by the holding unit. The device has a configuration in which light is emitted from the light irradiating means at a constant incident angle in parallel, the reflected light from each diffraction grating surface is received by the light receiving means, and the intensity of the received reflected light is measured by the measuring means. is doing. The analyzer further includes a calculating means and an analyzing means as means for analyzing the sample from the reflected light received by the light receiving means. The calculating means is means for calculating the resonance angle based on the intensity of the reflected light from each diffraction grating surface measured by the measuring means and the inclination angle of each diffraction grating surface with respect to the reference plane, and the analyzing means is calculated by the calculating means. A means for quantitative and / or qualitative analysis of a sample based on the calculated resonance angle.The
[0030]
The second analysis method is an analysis method in which a resonance angle is calculated and a sample is analyzed based on the resonance angle. The sample is brought into contact with a sensor surface, and light is irradiated at a constant incident angle parallel to a specific plane. Step, receiving the reflected light from the sensor surface, measuring the intensity of the reflected light from each diffraction grating surface, taking into account the intensity of the reflected light from the non-diffractive surface, reflected light from each diffraction grating surface The resonance angle at which the resonance phenomenon between the evanescent wave and the surface plasmon wave occurs is determined based on the step of correcting the intensity of the light, the intensity of the reflected light from each diffraction grating surface, and the inclination angle of each diffraction grating surface with respect to the reference plane. Performing a step of performing a quantitative and / or qualitative analysis of the sample based on the calculated resonance angle.The
[0031]
Here, the non-diffractive surface reflecting the reflected light to be considered in the correction does not have the same inclination angle with respect to the reference plane as the diffraction grating surface on which the reflected light to be corrected is reflected. must not. Therefore, if the diffraction grating surface and the non-diffractive surface do not exist on the same plane, specify the non-diffractive surface corresponding to each diffraction grating surface, and correct it by taking into account the reflected light from the non-diffractive surface Need to do.
[0032]
In this case, in addition to the same advantages as the first analysis method, the intensity of the reflected light from each diffraction grating surface is corrected in consideration of the intensity of the reflected light from the non-diffraction surface. An error in the intensity of the reflected light due to the difference can be corrected.
[0033]
The surface characteristics refer to elements that weaken the reflected light intensity from the sensor chip among elements applied to the sensor chip surface other than the resonance phenomenon between the evanescent wave and the surface plasmon wave. For example, turbidity of the sample solution that scatters incident light, incident light absorbing material contained in the sample solution, elements that weaken the reflected light from the sensor chip, and a small amount of ideal flat surfaces such as distortion, deflection, swelling, and contraction It means the displacement from. In addition, when a component in the sample adsorbs nonspecifically on the surface of the sensor chip, incident light is scattered or absorbed by the nonspecifically adsorbed substance, and reflected from the sensor chip. The light intensity decreases.
[0034]
This analysis method can be implemented by using an analyzer having the following configuration. That is, the analyzer holds the first sensor chip by the holding unit in a state where the sample is in contact with the sensor surface, and the specific plane toward the sensor surface of the sensor chip held by the holding unit. The device has a configuration in which light is emitted from the light irradiating means at a constant incident angle in parallel, the reflected light from each diffraction grating surface is received by the light receiving means, and the intensity of the received reflected light is measured by the measuring means. is doing. The analyzing apparatus further includes a correcting means, a calculating means, and an analyzing means as means for analyzing the sample from the reflected light received by the light receiving means. The correcting means is means for correcting the intensity of the reflected light from each diffraction grating surface in consideration of the intensity of the reflected light from the non-diffraction surface, and the calculating means is based on each diffraction grating surface corrected by the correcting means. Is a means for calculating the resonance angle based on the intensity of the reflected light of each and the inclination angle of each diffraction grating surface with respect to the reference plane, and the analysis means is quantitative and / or qualitative of the sample based on the resonance angle calculated by the calculation means. Is a means of performingThe
[0035]
The third analysis method is an analysis method in which a resonance angle is calculated and a sample is analyzed based on the resonance angle. The sample is brought into contact with the sensor surface, and light is irradiated at a constant incident angle parallel to a specific plane. Step, receiving reflected light from the sensor surface and measuring the intensity of the reflected light from each diffraction grating surface, with respect to the measured reflected light intensity from each diffraction grating surface and the reference plane of each diffraction grating surface Based on the inclination angle, a step of calculating a resonance angle at which the resonance phenomenon of the evanescent wave and the surface plasmon wave occurs for each of the reaction region and the non-reaction region, and calculating the resonance angle in the reaction region as the resonance angle in the non-reaction region. Performing a quantitative and / or qualitative analysis of the sample based on the resonance angle corrected forThe
[0036]
In this case, in addition to the advantages similar to those of the first analysis method, the resonance angle in the reaction region is corrected by the resonance angle in the non-reaction region, so that the change in the detected species caused by the reaction can be analyzed more accurately.
[0037]
The correction in this method is not a simple correction of the intensity of reflected light, but a correction of the reaction amount that is performed using a shift of the resonance angle due to an element that is not a specific reaction to be detected. Therefore, the resonance angle is obtained. Therefore, the reaction region and the non-reaction region do not necessarily have the same inclination angle with respect to the reference plane.
[0038]
This analysis method can be implemented by using an analyzer having the following configuration. That is, the analyzer holds the first sensor chip by the holding unit in a state where the sample is in contact with the sensor surface, and the specific plane toward the sensor surface of the sensor chip held by the holding unit. The device has a configuration in which light is emitted from the light irradiating means at a constant incident angle in parallel, the reflected light from each diffraction grating surface is received by the light receiving means, and the intensity of the received reflected light is measured by the measuring means. is doing. The analyzer further includes a calculating means and an analyzing means as means for analyzing the sample from the reflected light received by the light receiving means. The calculation means calculates the resonance angle at which the resonance phenomenon between the evanescent wave and the surface plasmon wave occurs based on the intensity of the reflected light from each diffraction grating surface measured by the measurement means and the inclination angle of each diffraction grating surface with respect to the reference plane. The analysis means is a means for calculating each of the reaction region and the non-reaction region, and the analysis means quantitatively and / or the sample based on the resonance angle obtained by correcting the resonance angle in the reaction region calculated by the calculation means in consideration of the resonance angle in the non-reaction region. Or a means of qualitative analysis.The
[0039]
The fourth method is an analysis method for calculating a resonance angle and analyzing a sample based on the resonance angle. In this analysis method, a plurality of different samples are assigned to a plurality of flow paths, and assigned to each flow path. A step of irradiating the sensor surface with light at a constant incident angle parallel to a specific plane while flowing the sample, a step of receiving the reflected light from the sensor surface, and measuring the intensity of the reflected light from each diffraction grating surface The sample flowing through each flow path has a resonance angle at which the resonance phenomenon of the evanescent wave and the surface plasmon wave occurs based on the intensity of the reflected light from each diffraction grating surface and the inclination angle of the diffraction grating surface with respect to the reference plane. And a step of performing a quantitative and / or qualitative analysis of a sample flowing through each flow path based on the resonance angle calculated for each flow path.The
[0040]
In this case, in addition to the same advantages as those of the first analysis method, a plurality of samples can be analyzed simultaneously, so that work can be performed efficiently. In addition, since a plurality of samples can be analyzed under the same conditions, the difference between the samples can be clearly analyzed.
[0041]
This analysis method can be implemented by using an analyzer having the following configuration. That is, the analyzer holds the first sensor chip by the holding unit, and passes a plurality of samples different from each other by the sample introduction unit to the sensor chip held by the holding unit. Each sample is irradiated with light by a light irradiation means at a constant incident angle parallel to a specific plane toward the sensor surface of the sensor chip in which the sample is introduced into each flow path by the sample introduction means. The apparatus has a configuration in which reflected light from the grating surface is received by the light receiving means, and the intensity of the received reflected light is measured by the measuring means. The analyzer further includes a calculating means and an analyzing means as means for analyzing the sample from the reflected light received by the light receiving means. The calculation means calculates the resonance angle at which the resonance phenomenon between the evanescent wave and the surface plasmon wave occurs based on the intensity of the reflected light from each diffraction grating surface measured by the measurement means and the inclination angle of each diffraction grating surface with respect to the reference plane. A means for calculating for each flow path, and the analysis means is a means for performing quantitative and / or qualitative analysis of a sample flowing through each flow path based on the resonance angle in each flow path calculated by the calculation means. AhThe
[0042]
The fifth analysis method is an analysis method for measuring the amount of change in intensity of reflected light and analyzing the sample based on the amount of change in intensity. In this analysis method, the sample is brought into contact with the sensor surface and parallel to a specific plane. Irradiating light at a fixed incident angle, receiving reflected light from each diffraction grating surface, measuring the intensity of the reflected light from each received diffraction grating surface, from each measured diffraction grating surface Measuring the amount of change in the intensity of the reflected light with respect to the intensity of the reflected light when the sample is not in contact with the sensor surface, and diffraction in which the measured change is within a predetermined measurement tolerance (measurement range) Select a grating plane and execute a step of quantitative and / or qualitative analysis of the sample based on the amount of change in reflected light intensity from the selected diffraction grating plane.The
[0043]
Thereby, even when the concentration range of the sample is wide, it is not necessary to readjust the optical system so that the measurement value falls within the measurement range, and the measurement range can be substantially expanded. In this case, the steps may be executed in the order of description or may be executed simultaneously.
[0044]
This analysis method can be implemented by using an analyzer having the following configuration. That is, the analyzer holds the first sensor chip by the holding unit in a state where the sample is in contact with the sensor surface, and the specific plane toward the sensor surface of the sensor chip held by the holding unit. The device has a configuration in which light is emitted from the light irradiating means at a constant incident angle in parallel, the reflected light from each diffraction grating surface is received by the light receiving means, and the intensity of the received reflected light is measured by the measuring means. is doing. Further, this analyzer includes a measuring means and an analyzing means as means for analyzing the sample from the reflected light received by the light receiving means. The measuring means is a means for measuring a change amount of the intensity of the reflected light from each diffraction grating surface measured by the measuring device with respect to the intensity of the reflected light when the sample is not in contact with the sensor surface. The analyzing means selects a diffraction grating surface whose measured reflected light intensity change amount is within a predetermined allowable measurement range, and based on the reflected light intensity change amount from the selected diffraction grating surface, quantitative and A means to perform qualitative analysisThe
[0045]
The sixth analysis method is an analysis method in which the amount of change in intensity of reflected light is measured and the sample is analyzed based on the amount of change in intensity. In this analysis method, the sample is brought into contact with the sensor surface and parallel to a specific plane. Irradiating light at a constant incident angle, receiving reflected light from each diffraction grating surface, measuring the intensity of reflected light from each received diffraction grating surface, and measuring each non-diffraction grating surface In consideration of the intensity of the reflected light from the surface, the step of correcting the intensity of the reflected light from each diffraction grating surface, the sample contacting the sensor surface of the intensity of the reflected light from each corrected diffraction grating surface Measuring the amount of change with respect to the intensity of the reflected light in a non-conducting state, selecting a diffraction grating surface whose measured variation is within a predetermined measurement tolerance (measurement range), and reflecting light from the selected diffraction grating surface Based on the amount of intensity change, To perform the steps of performing and / or qualitative analysisThe
[0046]
As in the second analysis method, the non-diffractive surface reflecting the reflected light to be considered at the time of correction is the same as the reference plane, which is the same as the diffraction grating surface reflecting the reflected light to be corrected. Must have an inclination angle with respect to. Therefore, if the diffraction grating surface and the non-diffractive surface do not exist on the same plane, specify the non-diffractive surface corresponding to each diffraction grating surface, and correct it by taking into account the reflected light from the non-diffractive surface Need to do.
[0047]
In this case, in addition to the same advantages as the fifth analysis method, the intensity of the reflected light from each diffraction grating surface is corrected in consideration of the intensity of the reflected light from the non-diffractive surface. An error in the intensity of the reflected light due to the difference can be corrected.
[0048]
This analysis method can be implemented by using an analyzer having the following configuration. That is, the analyzer holds the first sensor chip by the holding unit in a state where the sample is in contact with the sensor surface, and the specific plane toward the sensor surface of the sensor chip held by the holding unit. The device has a configuration in which light is emitted from the light irradiating means at a constant incident angle in parallel, the reflected light from each diffraction grating surface is received by the light receiving means, and the intensity of the received reflected light is measured by the measuring means. is doing. The analyzing apparatus further includes a correcting means, a measuring means, and an analyzing means as means for analyzing the sample from the reflected light received by the light receiving means. The correcting means is means for correcting the intensity of the reflected light from each diffraction grating surface in consideration of the intensity of the reflected light from the non-diffraction surface, and the measuring means is based on each diffraction grating surface corrected by the correcting means. Is a means for measuring the amount of change in the intensity of reflected light with respect to the intensity of the reflected light when the sample is not in contact with the sensor surface. A means to select a diffraction grating surface within a range and perform quantitative and / or qualitative analysis of a sample based on the amount of change in reflected light intensity from the selected diffraction grating surface.The
[0049]
The seventh analysis method is an analysis method for measuring the amount of change in intensity of reflected light and analyzing the sample based on the amount of change in intensity. In this analysis method, the sample is brought into contact with the sensor surface and parallel to a specific plane. Irradiating light at a fixed incident angle, receiving reflected light from each diffraction grating surface, measuring the intensity of reflected light from each received diffraction grating surface, and measuring from each measured diffraction grating surface A step of measuring a change amount of the reflected light intensity with respect to the intensity of the reflected light when the sample is not in contact with the sensor surface for each of the reaction region and the non-reaction region, and the measured change amount of the reflected light intensity is predetermined. Select a diffraction grating surface within the allowable measurement range for each of the reaction region and the non-reaction region, and the amount of change in the intensity of the reflected light from the selected reaction region and the intensity of the reflected light from the selected non-reaction region The amount of change and Based, to perform the steps of performing a quantitative and / or qualitative analysis of a sampleThe
[0050]
As in the third method, the correction in this method is not a simple correction of the intensity of the reflected light, but a correction of the reaction amount that is performed using a shift of the resonance angle due to an element that is not a specific reaction to be detected. Therefore, if the resonance angle is obtained, the reaction region and the non-reaction region do not necessarily have the same inclination angle with respect to the reference plane.
[0051]
In this case, in addition to the advantages similar to those of the fifth analysis method, the resonance angle in the reaction region is corrected by the resonance angle in the non-reaction region, so that the change in the detected species caused by the reaction can be analyzed more accurately.
[0052]
This analysis method can be implemented by using an analyzer having the following configuration. That is, the analyzer holds the first sensor chip by the holding unit in a state where the sample is in contact with the sensor surface, and the specific plane toward the sensor surface of the sensor chip held by the holding unit. The device has a configuration in which light is emitted from the light irradiating means at a constant incident angle in parallel, the reflected light from each diffraction grating surface is received by the light receiving means, and the intensity of the received reflected light is measured by the measuring means. is doing. Further, this analyzer includes a measuring means and an analyzing means as means for analyzing the sample from the reflected light received by the light receiving means. The measuring means is a means for measuring a change amount of the intensity of the reflected light from each diffraction grating surface measured by the measuring device with respect to the intensity of the reflected light when the sample is not in contact with the sensor surface. Selects the diffraction grating surface where the measured reflected light intensity change is within the predetermined measurement tolerance range for each of the reaction region and the non-reactive region, and selects the change in reflected light intensity from the selected diffraction grating surface. Means for quantitative and / or qualitative analysis of the sample based on the amount of change in the intensity of the reflected light from the non-reactive region.The
[0053]
The eighth analysis method is an analysis method in which a change amount of reflected light intensity is measured and a sample is analyzed based on the intensity change amount. In this analysis method, a plurality of different samples are assigned to a plurality of flow paths, A step of irradiating the sensor surface with a constant incident angle parallel to a specific plane while flowing the sample assigned to each flow path, receiving the reflected light from the sensor surface, and reflecting the reflected light from each diffraction grating surface A step of measuring the intensity, a step of measuring a change amount of the intensity of the reflected light from each measured diffraction grating surface with respect to the intensity of the reflected light when the sample does not flow in each flow path, and the measured reflected light A diffraction grating surface whose intensity change amount is within a predetermined measurement allowable range is selected for each flow path, and each flow path is defined based on the amount of change in the intensity of reflected light from the diffraction grating surface selected for each flow path. Quantitative and / or qualitative analysis of flowing samples To perform the stepThe
[0054]
In this case, in addition to the same advantages as the fifth analysis method, a plurality of samples can be analyzed at the same time, so that work can be performed efficiently. In addition, since a plurality of samples can be analyzed under the same conditions, the difference between the samples can be clearly analyzed.
[0055]
This analysis method can be implemented by using an analyzer having the following configuration. That is, the analyzer holds the first sensor chip by the holding unit, and passes a plurality of samples different from each other by the sample introduction unit to the sensor chip held by the holding unit. Each sample is irradiated with light by a light irradiation means at a constant incident angle parallel to a specific plane toward the sensor surface of the sensor chip in which the sample is introduced into each flow path by the sample introduction means. The apparatus has a configuration in which reflected light from the grating surface is received by the light receiving means, and the intensity of the received reflected light is measured by the measuring means. Further, this analyzer includes a measuring means and an analyzing means as means for analyzing the sample from the reflected light received by the light receiving means. The measuring means is a means for measuring the amount of change in the intensity of the reflected light from each diffraction grating surface measured by the measuring device with respect to the intensity of the reflected light in a state where the sample does not flow in each of the flow paths. The means selects a diffraction grating surface in which the amount of change in the measured reflected light intensity is within a predetermined allowable measurement range for each flow path, and based on the amount of change in the intensity of the reflected light from the selected diffraction grating surface, A means of performing quantitative and / or qualitative analysisThe
[0056]
Further, in each analysis method described above, a sample separation step for separating the sample by physical and / or chemical action may be performed prior to introducing the sample onto the surface plasmon resonance sensor chip.Yes.
[0057]
Thereby, even if impurities other than the detection species are mixed in the sample, they can be properly removed before the analysis, and only the pure detection species can be analyzed. Therefore, accurate analysis can be performed.
[0058]
In addition, by combining with the detection methods (absorbance detection, fluorescence detection, chemiluminescence detection, differential refractometer detection, electrochemical detection, etc.) that are usually used in these analytical means, Measurement by the specific reaction measurement of the species to be detected in can be performed simultaneously.
[0059]
This analysis method is configured to have a sample separation means for separating the sample by physical and / or chemical action prior to introducing the sample onto the surface plasmon resonance sensor chip in addition to the configuration of the analysis apparatus described above. Can be implemented by usingThe
[0060]
As a sample separation means, it is desirable to separate the sample by any one of liquid chromatography, HPLC, capillary electrophoresis, microchip electrophoresis, flow injection, or a separation method using a microchannel.Yes.
[0061]
In each of the analysis methods described above, when the detection species is a luminescent substance, it is bound to the binding substance prior to irradiating the sensor surface with light, or after irradiating the sensor surface with light and receiving reflected light. A step of detecting the emitted light of the luminescent material, and in the analyzing step, the sample may be quantitatively and / or qualitatively analyzed together with the detection result of the emitted light.Yes.
[0062]
As a result, not only surface plasmon resonance but also analysis using a light emission phenomenon can be performed. Since luminescence phenomena such as fluorescence and phosphorescence are very sensitive, more delicate reactions can be detected.
[0063]
In addition to the configuration of the analysis device described above, the analyzing means is configured to detect the emitted light of the luminescent substance bound to the binding substance when the detection species is a luminescent substance. This can be implemented by using an analyzer configured to perform quantitative and / or qualitative analysis of the sample comprehensively together with the detection result of the emitted light by the means.The
[0064]
The second surface plasmon resonance sensor chip (second sensor chip) of the present invention is formed in the vicinity of the metal layer capable of inducing a surface plasmon wave on the surface by light irradiation, and in the vicinity of the metal layer. And a diffraction grating curved surface formed with a constant groove direction and groove pitch, the diffraction grating curved surface has a curved surface shape on the convex lake toward the light irradiation side, It is arranged perpendicular to a specific plane perpendicular to a predetermined reference plane, and the diffraction grating is formed in a groove direction perpendicular to the specific plane.The
[0065]
With such a configuration, when light (parallel light) is irradiated from a certain direction parallel to the specific plane, the diffraction grating surface is irradiated according to the inclination angle of the tangential plane with respect to the reference plane at the irradiation position of the irradiation light. Distribution occurs in the incident angle of light, and distribution also occurs in the intensity of reflected light obtained from each position on the diffraction grating surface. Therefore, the resonance angle can be calculated in real time based on the intensity of the reflected light obtained from each position on the diffraction grating surface and the substantial incident angle at that position. That is, by using the sensor chip having the above-described configuration, the same effect as that obtained when light having a predetermined divergence angle (or narrowing angle) is irradiated can be obtained without using angle scanning or wedge-shaped light irradiation. .
[0066]
Preferably, the shape of the diffraction grating surface is a curved surface shape convex toward the side irradiated with light. Thereby, the reflected light from each position on the diffraction grating surface does not intersect, and the analysis of the intensity of the reflected light from each position on the diffraction grating surface becomes easy.
It is also preferable to provide a plurality of diffraction grating surfaces. In this case, the resonance angle in a plurality of diffraction grating surfaces can be detected at the same time simply by irradiating light from a certain direction parallel to a specific plane, so that the binding substance is immobilized corresponding to each diffraction grating surface. Thus, simultaneous multipoint measurement can be easily performed.
[0067]
In the second sensor chip, the diffraction grating surface is provided along the sensor surface in contact with the sample. When the second sensor chip is used for quantitative and / or qualitative analysis of a sample, a sensor surface in which a binding substance that specifically binds to a detection species in the sample is immobilized is used. In particular, in the case of a sensor chip for multipoint simultaneous measurement, it is possible to analyze a plurality of types of detection species at the same time by using a plurality of types of binding substances immobilized corresponding to each diffraction grating surface.
[0068]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
(A) First embodiment
First, a first embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS.
As shown in FIG. 1, a sensor chip (surface plasmon resonance sensor chip) 1 according to the present embodiment has a surface (sensor surface) 1 a covered with a
[0069]
FIG. 2 is an enlarged perspective view showing the
[0070]
Here, the central diffraction
[0071]
According to this structure, when light is irradiated onto the
[0072]
In this
[0073]
The material of the
The
[0074]
The uneven surface 4 formed on the
[0075]
The concavo-convex shape of the concavo-convex surface 4 is formed in consideration of the thickness of the
[0076]
The number of diffraction grating surfaces formed in one
[0077]
The size of the diffraction grating surface depends on the number of
[0078]
Next, a method for using the
When the
[0079]
Then, the
The
[0080]
The
[0081]
The
[0082]
The
[0083]
When analyzing the sample based on the resonance angle, first, the
[0084]
Next, irradiation light is irradiated from the
[0085]
Information on the reflected light detected by the
[0086]
Then, the
[0087]
By performing analysis using such a technique, the resonance angle at each
In addition, the refractive index change of the medium is very large (for example, when a pigment that has the property of being deposited on the surface by an enzyme reaction or when using fine particles such as colloidal gold as a sensitizing method for the binding reaction) ) If the angle of the diffraction grating surfaces 5a to 5i alone cannot cope with the shift of the resonance angle, it can be dealt with by changing the angle of the incident light.
[0088]
On the other hand, when analyzing the sample based on the amount of change in the reflected light intensity, if the reflected light from the
[0089]
Next, the
[0090]
Since the wave number of the evanescent wave changes depending on the incident angle of the irradiation light on the diffraction grating surface, the amount of change in the reflected light intensity also changes depending on the incident angle, and the amount of change becomes too large depending on the incident angle. The measurement range of the measuring instrument included may be exceeded. In this case, conventionally, the incident angle has to be changed by readjustment of the optical system. In particular, when performing multi-item measurement, if the concentration difference between the detection species is large, the incident angle must be changed for each detection species to be measured. However, since the
[0091]
As described above, by analyzing a sample using the
Further, the
[0092]
In recent years, especially in the field of clinical examination, POC characterized by small size and simple operation enabling examination at the site of treatment has been emphasized, and surface plasmon resonance sensor chip has been considered to be applied to immunological examinations etc. Conventionally, it has been difficult to expand to POC in terms of size and cost. However, according to this
[0093]
(B) Second embodiment
Next, a second embodiment of the present invention will be described with reference to FIG.
The basic configuration of the
[0094]
Here, the
[0095]
According to this structure, the substantial incident angle to the
[0096]
Due to such characteristics, when analyzing a sample using the
[0097]
(C) Third embodiment
Next, a third embodiment of the present invention will be described with reference to FIG.
The basic configuration of the
[0098]
Here, the
[0099]
According to this structure, the reflected light of the
[0100]
Due to such characteristics, when the sample is analyzed using the
[0101]
(D) Fourth embodiment
Next, a fourth embodiment of the present invention will be described with reference to FIG.
The basic configuration of the
[0102]
Here, in addition to the binding
[0103]
Therefore, the region where the binding substance is immobilized becomes a reaction region, and the region where the non-binding substance is immobilized and the region where both the binding material and the non-binding material are not immobilized become non-reaction regions. In addition, when the metal forming the
Other configurations are the same as those of the first embodiment.
[0104]
According to this structure, the reflected light reflected from the
[0105]
Due to such characteristics, when analyzing the sample using the
[0106]
(E) Fifth embodiment
Next, a fifth embodiment of the present invention will be described with reference to FIG.
This embodiment has a structure in which a
[0107]
Examples of the
[0108]
A microchannel is a groove on the surface of a chip through which a sample flows. A part of this groove is filled with a column equivalent to an HPLC column, or a functional group is provided on the groove surface. Thus, separation is possible.
[0109]
Flow injection is a technique that causes various reactions while the sample is flowing. For example, complex injection and solvent extraction are performed to remove substances other than the detected species in the sample. Separation can be performed.
[0110]
Of course, a device other than those described above may be attached to the analyzer as a separation device.
[0111]
When analysis is performed using this apparatus, detection species such as enzymes and proteins can be separated in advance for each pure substance by a separation apparatus. For this reason, it is possible to analyze a detection species that has become a pure substance, and to perform a more accurate analysis.
[0112]
In addition, by combining with detection methods commonly used as analytical means (absorbance detection, fluorescence detection, chemiluminescence detection, differential refractometer detection, electrochemical detection, etc.) The measurement by the specific reaction measurement of the species to be detected can be performed simultaneously.
[0113]
(F) Sixth embodiment
Next, a sixth embodiment of the present invention will be described with reference to FIG.
The basic configuration of the present embodiment is the same as that of the first embodiment, and the light emitted from the
[0114]
Here, the detection species is a light-emitting substance that can generate light such as fluorescence or phosphorescence. For example, there is a luminescent substance that emits light by reacting with a binding substance or being excited by light supplied from the
[0115]
With such a configuration, in addition to the advantages of the first embodiment, the present embodiment can perform quantitative and / or qualitative analysis of the sample using the detection result of the emitted light, and thus perform more accurate analysis. be able to. In particular, chemiluminescence such as fluorescence is very sensitive, so that a minute reaction can be detected.
[0116]
(G) Seventh embodiment
Next, a seventh embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS.
The basic configuration of the present embodiment is the same as that of the first embodiment, and the light emitted from the
[0117]
Here, as shown in FIG. 10, a plurality of
Further, as shown in FIG. 11, a
[0118]
With this configuration, in this embodiment, in addition to the same technique as in the first embodiment, a plurality of different samples are assigned to the plurality of
[0119]
For this reason, in addition to the advantages of the first embodiment, this embodiment can analyze a plurality of samples at the same time, so that work can be performed efficiently. In addition, since a plurality of samples can be analyzed under the same conditions, the difference between the samples can be clearly analyzed.
[0120]
(H) Eighth embodiment
Next, an eighth embodiment of the present invention will be described with reference to FIG.
The basic configuration of the
[0121]
Here, next to the
[0122]
According to this structure, the reflected light of the
[0123]
Due to such characteristics, when analyzing a sample using the
[0124]
(I) Ninth embodiment
Next, a ninth embodiment of the present invention will be described with reference to FIG.
The basic configuration of the
[0125]
Here, the binding
[0126]
Therefore, the area where the binding substance is immobilized on the surface of the measurement spot where the binding substance is immobilized becomes the reaction area, the area where the non-binding substance is immobilized on the surface of the measurement spot where the non-binding substance is immobilized, and the binding substance. A region where both the non-binding substance and the non-binding substance are immobilized becomes a non-reactive region.
Further, when the metal forming the
Other configurations are the same as those of the first embodiment.
[0127]
According to this structure, the reflected light reflected from the
[0128]
Due to such characteristics, when analyzing a sample using the
[0129]
(J) Tenth embodiment
Next, a tenth embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS.
The basic configuration of the present embodiment is the same as that of the first embodiment, and the light emitted from the
[0130]
Here, as shown in FIG. 14, a plurality of
Each
[0131]
Further, as shown in FIG. 11, a
[0132]
With this configuration, in this embodiment, in addition to the same technique as in the first embodiment, a plurality of different samples are assigned to the plurality of
[0133]
For this reason, in addition to the advantages of the first embodiment, this embodiment can analyze a plurality of samples at the same time, so that work can be performed efficiently. In addition, since a plurality of samples can be analyzed under the same conditions, the difference between the samples can be clearly analyzed.
[0134]
Further, the present embodiment and the fourth embodiment can be combined, or the present embodiment and the ninth embodiment can be combined. As a result, it is possible to form a reaction region and a non-reaction region on each diffraction grating surface on the same channel, and correction by reflected light from the non-reaction region can be performed for each sample flowing through each channel. .
[0135]
(K) Other
Although the embodiments of the present invention have been described above, the present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications can be made without departing from the spirit of the present invention.
For example, in the first embodiment, the central diffraction
[0136]
Further, each diffraction grating surface does not necessarily have to be continuous. As in the diffraction grating surfaces 126a to 126e shown in FIG. 16, one end is arranged at the same level as the reference plane S0, and the other end is raised to make a reference. An inclination angle may be given to the surface S0.
When many diffraction grating surfaces are arranged in one measurement spot, the diffraction grating surfaces 136a to 136k may be arranged in a plurality of rows as shown in FIG. Thereby, it becomes possible to arrange many diffraction grating surfaces 136a-136k compactly.
[0137]
Furthermore, in each embodiment, the planar diffraction grating surfaces 5a to 5i are sequentially arranged so that the inclination angle with respect to the reference plane S0 when viewed from one direction parallel to the specific plane S1 is gradually reduced, A diffraction grating surface 25 having a convex curved surface shape is provided toward the irradiation side, and this is reflected light from each
[0138]
In each embodiment, the sensor chip of the present invention is configured as a sensor chip for multipoint simultaneous measurement (or for multi-item measurement) in which a plurality of measurement spots are provided on the sensor surface. The present invention can be applied to a sensor chip that is one measurement spot.
Furthermore, in each embodiment, the case where the present invention is applied to a diffraction grating type sensor chip having a conventional general structure in which a diffraction grating is formed on the surface of a metal layer has been described. However, the present invention is not limited to various other structures. This can also be applied to a diffraction grating type sensor chip. That is, a sensor including a diffraction grating surface on which a diffraction grating that generates an evanescent wave by light irradiation is formed, and a metal layer that is provided along the diffraction grating surface and can induce a surface plasmon wave on the surface by light irradiation. The present invention can be applied to a chip.
[0139]
It is also possible to implement the embodiments in combination. For example, the third embodiment and the sixth embodiment may be combined, or the fifth embodiment and the seventh embodiment may be combined.
[0140]
In particular, the third embodiment and / or the eighth embodiment and the fourth embodiment and / or the ninth embodiment are combined to perform both correction by a non-diffractive surface and correction by a non-reactive region. Is preferable because accurate analysis can be performed more reliably. That is, the resonance angle is calculated by correcting the reflected light from the reaction region with the non-diffracting surface, and further, the resonance angle is calculated by correcting the reflected light from the non-reactive region with the non-diffracting surface, The resonance angle shift amount derived from the true specific reaction and the detected species concentration can be calculated from both resonance angles.
[0141]
Further, in the fourth embodiment and the ninth embodiment, the non-binding substance is the same regardless of the detection species when selecting a substance that does not cause a specific reaction with the detection species depending on the detection species. May be used.
[0142]
When a non-binding substance is selected according to the detection species, it is preferable to immobilize both the binding substance and the non-binding substance on the same diffraction grating surface as in the fourth embodiment. However, considering the labor for manufacturing the sensor chip, as in the ninth embodiment, the binding substance is immobilized by immobilizing the non-binding substance in the measurement spot existing next to the measurement spot where the binding substance is immobilized. It is advantageous to make the measurement spot itself adjacent to the measured measurement spot the non-reactive region.
[0143]
On the other hand, when the same substance is used as a non-reacting substance for all detection species, BSA (bovine serum albumin) used as a blocking agent, gelatin or the like can be used. In this case, as in the ninth embodiment, non-reactive substances are immobilized on all diffraction grating surfaces of one or more measurement spots on the sensor chip, and the measurement spots themselves are used as non-reactive areas in terms of manufacturing. It is advantageous.
[0144]
【Example】
The present invention will be described below with reference to examples, but the present invention is not limited to the examples as long as the gist of the present invention is not exceeded.
[0145]
Example 1
An uneven shape with a groove pitch of about 870 nm and a groove depth of about 40 nm is formed on the surface of a flat polycarbonate substrate, and this uneven shape is used as a diffraction grating. A sensor chip was created.
Subsequently, the sensor chip was formed in a 15 mm × 25 mm rectangle so that the diffraction grating was parallel to a side having a length of 25 mm. The formed sensor chip is shown in FIG.
[0146]
Next, a straight line parallel to the side of the sensor chip having a length of 25 mm, including points where the distance from one end of the side of the sensor chip having a length of 15 mm is about 5.5 mm, 4 mm, and 5.5 mm, is taken as a crease, The sensor chip was bent by about 0.8 °. That is, as shown in FIG. 19, a rectangular area of 5.5 mm × 25 mm (hereinafter referred to as area A) and a rectangular area of 4 mm × 25 mm (hereinafter referred to as area B) contact each side having a length of 25 mm. On the opposite side of region A from region A, region B and a rectangular region of 5.5 mm × 25 mm (hereinafter referred to as region C) are in contact with a side having a length of 25 mm. In addition, the region B maintains 0 ° with respect to the reference plane, the region C forms an angle of about 0.8 ° with respect to the region B, and the region A forms an angle of about −0.8 ° with respect to the region B. It was bent as if it were. Therefore, the angle formed by the region A and the region C is about 1.6 °. Further, the diffraction grating is made to be the convex surface of the sensor chip so that the sample can be measured on the convex surface of the sensor chip during measurement.
[0147]
Resonance angle detection type SPR measuring device FLEX CHIPS with a 10 mm × 10 mm area in the center of the sensor chip thus created as a measurement spotTM The intensity of the reflected light was measured while performing an angle scan with Kinetic Analysis System (HTS Biosystems Inc.). For the measurement, light having a wavelength of about 870 nm was used as incident light, and purified water was used as a sample, and measurement was performed at three arbitrary points in each region.
[0148]
FIG. 20 shows the relationship between the incident angle of the incident light and the reflected light intensity before and after the measured resonance angle. In each graph, the angle at which the reflected light intensity is minimum is the resonance angle. Table 1 shows the measurement results for each region. SD is a standard deviation and CV is a coefficient of variation.
[Table 1]
[0149]
Note that the three measurement points in the region A are denoted as A-1, A-2, and A-3, respectively, and similarly, the three measurement points in the region B are denoted as B-1, B-2, and B-3, respectively. The three measurement points in the region C are denoted as C-1, C-2, and C-3, respectively.
As shown in Table 1, the average resonance angles of the respective regions were 21.441 ° in the region A, 20.791 ° in the region B, and 19.860 ° in the region C.
[0150]
Next, as shown in FIG. 18, a sensor chip in which the above-described sensor chip is not bent and remains in a flat plate shape is separately prepared, and the resonance angle detection type SPR measuring device FLEX CHIPS is similarly formed in the regions A, B, and C.TM The intensity of reflected light was measured while performing angle scan with Kinetic Analysis System. Light with a wavelength of about 870 nm was used as incident light. The sample used purified water. Hereinafter, the measurement spot of the flat sensor chip is referred to as a region D. In this measurement, measurement was performed at 400 points in the region D.
[0151]
FIG. 21 shows the relationship between the incident angle of the incident light and the reflected light intensity before and after the measured resonance angle. The measurement results are shown in Table 2.
[Table 2]
As shown in FIG. 21, in the region D, the resonance angle is the same at all points. The average resonance angle was 20.832 ° as shown in Table 2.
[0152]
In the regions A, B, C, and D, the diffraction gratings in the regions have the same groove pitch and groove depth, and the measured sample is the same purified water. Should be an angle. However, since the regions A, B, and C have angles of −0.809 °, 0.041 °, and 0.972 °, respectively, compared to the region D in which no angle is introduced, the resonance angle apparently changes. As measured.
From the above results, it was confirmed that the incident angle of incident light incident on the diffraction grating surface could be changed by introducing an inclination angle into the diffraction grating surface.
[0153]
(Example 2)
Similar to Example 1, a concavo-convex shape with a groove pitch of about 870 nm and a groove depth of about 40 nm is formed on the surface of a flat polycarbonate substrate, this concavo-convex shape is used as a diffraction grating, and the thickness is further increased on the surface of the substrate. A sensor chip was prepared by depositing gold at about 80 nm. This sensor chip was bent to form 26 surfaces having different inclination angles. In the following, the areas of the respective surfaces having angles are designated in the order of the smaller inclination angles formed with respect to the horizontal plane. 1, region no. Called with a natural number of 2.
[0154]
Using the sensor chip formed with the surfaces having 26 different inclination angles in this way, the SPR measuring device FLEX CHIPSTM The intensity of reflected light was measured while performing angle scan with Kinetic Analysis System. The sample used purified water. As incident light, light having a wavelength of about 870 nm was used. The resonance angle was specified and compared with the measurement result of the region D of Example 1 having no inclination angle, the inclination angle of each region was specified. Table 3 shows the measurement results.
[Table 3]
As a result, each region was found to have an angle of -0.936 ° to 0.978 °.
[0155]
Next, using these sensor chips, SPR measurement device FLEX CHIPSTM In the Kinetic Analysis System, light having a wavelength of about 870 nm is used as incident light, and ethanol aqueous solutions having concentrations of 2.5%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, and 50% are used as samples, respectively. Intensity was measured.
[0156]
Table 4 shows the ethanol concentration in each region and the amount of change (hereinafter referred to as a shift amount) in which the resonance angle is changed by increasing the ethanol concentration.
[Table 4]
In any region, the coefficient of variation (CV) was as good as 1.2% to 6.3% for each ethanol concentration. Further, the same amount of resonance angle shift was shown in any region.
From the above results, it was found that even a diffraction grating surface having an angle has the same measurement accuracy as a diffraction grating surface having no angle.
[0157]
(Example 3)
Among the measurement data acquired in Example 2, the measurement data when the incident angle of incident light is 21.5 ° is selected, and the ethanol concentration is 0%, 2.5%, 5 in the measurement data. The angle of the region where the reflected light intensity is minimum when the ethanol aqueous solutions of%, 10%, 20%, 30%, 40% and 50% were used as samples was calculated. Specifically, using the angle (Table 3) of each region and the reflected light intensity in that region, the angle at which the reflected light intensity is minimum was determined by regression calculation.
[0158]
FIG. 22 shows the relationship between the ethanol concentration of the aqueous ethanol solution and the angle of the region where the reflected light intensity is minimum, that is, the shift amount of the resonance angle, which is found as a result.
[0159]
From the resonance angle obtained by a generally performed method, that is, a method of performing an angle scan, the ethanol concentration of the aqueous ethanol solution and the region No. 7 and region no. The relationship with the shift amount of the resonance angle on the 15 diffraction grating surfaces was examined. The result is shown in FIG.
[0160]
Table 5 shows the result of comparison between FIG. 22 and FIG.
[Table 5]
As a result of comparison, it was found that FIGS. 22 and 23 show the same shift amount for each ethanol concentration. Therefore, the resonance angle shift amount which is found as a result of a generally performed method (FIG. 23) uses the sensor chip having the diffraction grating surface according to the present invention, so that the incident angle of the incident light is constant. It was found that the measurement method can be obtained in the form of a change in the resonance angle indicated by the diffraction grating surface giving the minimum reflection intensity.
[0161]
Example 4
Among the measurement data acquired in Example 2, data was analyzed when the incident angle of incident light was 21.5 ° and when the incident angle was 21.0 °.
[0162]
When the incident angle of incident light is 21.5 °, the region No. The relationship between the reflected light intensity of 2, 7, 10, 16, and 19 and the ethanol concentration was analyzed. The results are shown in FIG. When the incident angle of incident light is 21.0 °, the region No. The relationship between the reflected light intensity of 10, 13, 18, 20, and 22 and the ethanol concentration was analyzed. The results are shown in FIG.
[0163]
[Table 6]
[Table 7]
[0164]
From FIG. 24, when the incident angle of incident light is 21.5 °, the range of ethanol concentration from 0% to 10% is the region No. 2, the ethanol concentration in the range of 10% to 30% is region No. 2. No. 10 reflected light intensity, the range of
[0165]
Similarly, from FIG. 25, when the incident angle of incident light is 21.0 °, the range where the ethanol concentration is 0% to 10% is the region No. No. 10 reflected light intensity, the range of ethanol concentration from 10% to 30% is region No. 10. No. 18 reflected light intensity, the range of ethanol concentration from 30% to 50% is region No. It was confirmed that by using each of the reflected light intensities of 22, it was possible to measure in a wide ethanol concentration range even if the incident angle of incident light was constant.
[0166]
Therefore, it was found that, compared with the conventional method of measuring the intensity of reflected light while performing angle scanning, a wide range of measurement is possible even with a simple measurement method in which the incident angle of incident light is constant and no angle scanning is performed.
[0167]
(Example 5)
An uneven shape with a groove pitch of about 870 nm and a groove depth of about 40 nm was formed on the surface of a flat polycarbonate substrate, and this uneven shape was used as a diffraction grating.
[0168]
Further, as shown in FIG. 26, the substrate was processed so that the cross section in the direction perpendicular to the diffraction grating was a curved surface having a curvature radius of about 1150 mm, and the diffraction grating was on the convex surface of the substrate. Subsequently, gold was vapor-deposited with a thickness of about 80 nm on the surface of the substrate to produce a sensor chip.
[0169]
Using this sensor chip, the resonance angle detection type SPR measuring device FLEX CHIPSTM The intensity of reflected light was measured while performing an angle scan with Kinetic Analysis System (HTS Biosystems Inc.). For the measurement, light having a wavelength of about 870 nm was used as incident light, and purified water was used as a sample.
[0170]
Table 8 shows the result of detecting the resonance angle of the reflected light in the region of about 0.33 mm spacing in the direction orthogonal to the diffraction grating on the sensor chip surface.
[Table 8]
The sum of the angle differences of the tangent surfaces between each region is 0.17 °, which is smaller than 0.3 ° which is the angle that the tangent surfaces of both ends should form, so that the radius of curvature is larger than the design. It is estimated that it was.
[0171]
However, the angle between adjacent regions with an interval of 0.33 mm is controlled to an extremely small value of 0.010 ° on average, and a diffraction grating surface should be formed on the sensor chip surface even in a structure with a curved surface. I was able to confirm.
[0172]
【The invention's effect】
As described above in detail, according to the present invention, the diffraction grating surface of the surface plasmon resonance sensor chip has an angular distribution with respect to the light irradiation direction, so that even when parallel light is irradiated, Since the distribution of the intensity of the reflected light is obtained, the resonance angle can be calculated in real time based on the intensity of the reflected light obtained from the diffraction grating surface and the substantial incident angle on the diffraction grating surface for the entire sensor surface. There are advantages. That is, there is an advantage that real-time measurement and simultaneous measurement of a large area can be realized simultaneously with a simple optical system configuration.
[0173]
Further, according to the present invention, the diffraction grating surface of the surface plasmon resonance sensor chip has an angular distribution with respect to the light irradiation direction, so that the light can be obtained from the diffraction grating surface even when light is irradiated from one direction. Since the distribution of reflected light intensity occurs, the measurement range can be substantially expanded when analyzing based on the amount of change in reflected light intensity, and even for samples with a wide concentration range that require a wide measurement range. There is an advantage that it can cope.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic perspective view showing a configuration of a sensor chip according to a first embodiment of the present invention.
2 is a schematic perspective view showing a configuration of a main part of the sensor chip of FIG. 1. FIG.
3 is a schematic perspective view showing a state in which a binding substance is immobilized on the sensor chip of FIG. 1. FIG.
4 is a schematic perspective view showing an example of a manufacturing method of the sensor chip of FIG. 1, and shows manufacturing procedures in the order of (a) to (c). FIG.
FIG. 5 is a schematic diagram showing the configuration of the analyzer according to the first embodiment of the present invention.
FIG. 6 is a schematic perspective view showing a configuration of a main part of a sensor chip according to a second embodiment of the present invention.
FIG. 7 is a schematic perspective view showing a configuration of a main part of a sensor chip according to a third embodiment of the present invention.
FIG. 8 is a schematic perspective view showing a state where a binding substance and a non-binding substance are immobilized on a sensor chip according to a fourth embodiment of the present invention.
FIG. 9 is a schematic diagram showing a configuration of an analyzer according to a fifth embodiment of the present invention.
FIG. 10 is a schematic perspective view showing a configuration of a main part of a sensor chip according to a seventh embodiment of the present invention.
FIG. 11 is a schematic diagram showing a configuration of an analyzer according to seventh and tenth embodiments of the present invention.
FIG. 12 is a schematic perspective view showing a configuration of a sensor chip according to an eighth embodiment of the present invention.
FIG. 13 is a schematic perspective view showing a configuration of a sensor chip according to a ninth embodiment of the present invention.
FIG. 14 is a schematic perspective view showing the configuration of a sensor chip according to a tenth embodiment of the present invention.
15 is a schematic perspective view showing a modification of the arrangement form of the diffraction grating surface according to the sensor chip of FIG. 1. FIG.
FIG. 16 is a schematic perspective view showing a modification of the arrangement form of the diffraction grating surface according to the sensor chip of FIG. 1;
FIG. 17 is a schematic perspective view showing a modification of the arrangement form of the diffraction grating surface according to the sensor chip of FIG. 1;
FIG. 18 is a schematic perspective view of the sensor chip according to the first embodiment of the present invention.
FIG. 19 is a schematic perspective view of the sensor chip according to the first embodiment of the present invention.
FIG. 20 is a graph showing an incident angle of incident light and reflected light intensity according to the first embodiment of the present invention.
FIG. 21 is a graph showing an incident angle of incident light and reflected light intensity according to the first example of the present invention.
FIG. 22 is a graph showing the ethanol concentration of the aqueous ethanol solution and the shift amount of the resonance angle according to the third example of the present invention.
FIG. 23 is a graph showing the ethanol concentration of the aqueous ethanol solution and the resonance angle shift amount according to the third embodiment of the present invention.
FIG. 24 is a graph showing the ethanol concentration and reflected light intensity of an aqueous ethanol solution according to the fourth example of the present invention.
FIG. 25 is a graph showing the ethanol concentration and reflected light intensity of an aqueous ethanol solution according to the fourth example of the present invention.
FIG. 26 is a schematic perspective view of a sensor chip according to a fifth embodiment of the present invention.
[Explanation of symbols]
1,21 Sensor chip (surface plasmon resonance sensor chip)
1a, 21a Sensor surface
2 Base
3,23 metal layer
4 Uneven surface
5a-5i, 116a-116e, 126a-126e, 136a-136k
Diffraction grating surface (plane)
6,26 Measurement spot
7 Binding substances
10 Analyzer
11 Holder
11a, 70 flow path
12 Light source
13 Photodetector
14 Analysis Department
25 Diffraction grating surface (curved surface)
31 Sensor chip
33 metal layers
35a-35i Diffraction grating surface
36 Measurement spot
37a-37i Non-diffractive surface
41 Sensor chip
43 Metal layer
46 Measurement spot
47 binding substances
48 Unbound material
59 Separation device
72 lids
79 Sample introduction device
71 Sensor chip
S0 Reference plane
S1 specific plane
81 Sensor chip
83 Metal layer
87 Measurement spot
88 Non-diffractive region
91 Sensor chip
93 Metal layer
96 measuring spot
97 binding substances
98 Unbound material
100 channels
101 Sensor chip
102 lid
Claims (19)
上記金属層の近傍に形成され、光の照射によりエバネッセント波を生じさせる回折格子が一定の溝方向及び溝ピッチで形成された複数の回折格子面とを備え、
上記各回折格子面は、所定の基準平面に垂直な特定平面に対して垂直で且つ上記基準平面に対してそれぞれ異なる所定の傾斜角度をなして配置されるとともに、それぞれ上記特定平面に垂直な溝方向で上記回折格子が形成されている
ことを特徴とする、表面プラズモン共鳴センサチップ。A metal layer capable of inducing surface plasmon waves on the surface by light irradiation,
A diffraction grating formed in the vicinity of the metal layer and generating an evanescent wave by light irradiation includes a plurality of diffraction grating surfaces formed with a constant groove direction and groove pitch,
Each of the diffraction grating surfaces is disposed perpendicular to a specific plane perpendicular to the predetermined reference plane and at a different predetermined inclination angle with respect to the reference plane, and each groove is perpendicular to the specific plane. A surface plasmon resonance sensor chip, wherein the diffraction grating is formed in a direction.
ことを特徴とする、請求項1記載の表面プラズモン共鳴センサチップ。A plurality of the diffraction grating surfaces are arranged in a direction parallel to the specific plane, and each diffraction grating surface is sequentially arranged so that an inclination angle with respect to the reference plane is gradually reduced when viewed from one direction parallel to the specific plane. The surface plasmon resonance sensor chip according to claim 1, wherein the surface plasmon resonance sensor chip is formed.
ことを特徴とする、請求項1又は2記載の表面プラズモン共鳴センサチップ。3. The surface plasmon resonance sensor chip according to claim 1, wherein the diffraction grating surface is continuously arranged in a convex mountain shape on the light irradiation side.
ことを特徴とする、請求項3記載の表面プラズモン共鳴センサチップ。The diffraction grating surface is formed to have a minimum width having only one groove, and a convex arcuate curved surface is formed on the side irradiated with light by the set of diffraction grating surfaces. The surface plasmon resonance sensor chip described.
ことを特徴とする、請求項1〜4の何れかの項に記載の表面プラズモン共鳴センサチップ。Each diffraction grating surface is formed along a sensor surface in contact with a sample, and a binding substance that specifically binds to a detection species in the sample is immobilized on each sensor surface on each sensor surface. The surface plasmon resonance sensor chip according to any one of claims 1 to 4, wherein the surface plasmon resonance sensor chip is characterized.
ことを特徴とする、請求項1〜6の何れかの項に記載の表面プラズモン共鳴センサチップ。The diffraction grating surface according to claim 1, wherein a plurality of diffraction regions in which the diffraction grating surfaces are aggregated are provided, and a plurality of diffraction grating surfaces having different inclination angles are arranged in each diffraction region. The surface plasmon resonance sensor chip according to the section.
ことを特徴とする、請求項5〜8の何れかの項に記載の表面プラズモン共鳴センサチップ。9. The sensor surface according to claim 5, wherein a non-diffractive surface on which no diffraction grating is formed is provided on the same plane as each of the diffraction grating surfaces. Surface plasmon resonance sensor chip.
ことを特徴とする、請求項5〜8の何れかの項に記載の表面プラズモン共鳴センサチップ。For each diffraction grating surface, a reaction region in which the binding substance is immobilized and a substance that does not specifically bind to the detection species in the sample are immobilized, or no substance is immobilized. The surface plasmon resonance sensor chip according to claim 5, wherein a reaction region is provided.
ことを特徴とする、請求項5〜8の何れかの項に記載の表面プラズモン共鳴センサチップ。The diffraction grating surface is arranged side by side in a direction perpendicular to the groove direction, and includes a lid that covers the sensor surface, and the gap between the sensor surface and the lid is directed toward the arrangement direction of the diffraction grating surface. The surface plasmon resonance sensor chip according to claim 5, wherein a plurality of flow paths are formed in parallel.
上記非回折領域を構成する各非回折面は、対応する回折領域を構成する各回折格子面の上記基準平面に対する傾斜角度の分布と同一の、上記基準平面に対する傾斜角度の分布を有する
ことを特徴とする、請求項7又は8に記載の表面プラズモン共鳴センサチップ。Corresponding to each of the diffraction regions, a non-diffractive region in which non-diffractive surfaces on which the diffraction grating is not formed is aggregated is provided,
Each non-diffractive surface constituting the non-diffractive region has the same inclination angle distribution with respect to the reference plane as that of each diffraction grating surface constituting the corresponding diffraction region with respect to the reference plane. The surface plasmon resonance sensor chip according to claim 7 or 8.
他の回折領域には、試料中の検出種と特異的な結合をおこさない物質が固定化されるか、或いは何ら物質が固定化されていない非反応領域が設けられている
ことを特徴とする、請求項7又は8に記載の表面プラズモン共鳴センサチップ。A reaction region in which a binding substance that specifically binds to the detection species in the sample is immobilized is provided in a part of each of the diffraction regions,
In other diffraction regions, a substance that does not specifically bind to a detection species in a sample is immobilized, or a non-reactive region where no substance is immobilized is provided. The surface plasmon resonance sensor chip according to claim 7 or 8.
上記各流路毎に、上記回折領域が設けられている
ことを特徴とする、請求項7又は8に記載の表面プラズモン共鳴センサチップ。A lid that covers the sensor surface is provided, and a plurality of flow paths are formed in parallel between the sensor surface and the lid,
The surface plasmon resonance sensor chip according to claim 7 or 8, wherein the diffraction region is provided for each of the flow paths.
上記センサ面に試料を接触させて、上記特定平面に平行に一定の入射角度で光を照射するステップと、
上記センサ面からの反射光を受光して、上記各回折格子面からの反射光の強度を計測するステップと、
上記の反射光の強度に基づいて、試料の定量的及び/又は定性的な分析を行うステップとを備えた
ことを特徴とする、分析方法。A method for quantitative and / or qualitative analysis of a sample using the surface plasmon resonance sensor chip according to any one of claims 5 to 10, 12, and 13,
Irradiating light at a constant incident angle in parallel with the specific plane by bringing a sample into contact with the sensor surface;
Receiving reflected light from the sensor surface and measuring the intensity of the reflected light from each diffraction grating surface;
And a step of performing a quantitative and / or qualitative analysis of the sample based on the intensity of the reflected light.
異なる複数の試料を上記複数の流路に割り当て、上記各流路に割り当てられた試料を流しながら上記特定平面に平行に一定の入射角度で上記センサ面に光を照射するステップと、
上記センサ面からの反射光を受光して、上記各回折格子面からの反射光の強度を計測するステップと、
上記の反射光の強度に基づいて、上記各流路を流れる試料の定量的及び/又は定性的な分析を行うステップとを備えた
ことを特徴とする、分析方法。A method for quantitative and / or qualitative analysis of a sample using the surface plasmon resonance sensor chip according to claim 11 or 14,
Assigning a plurality of different samples to the plurality of flow paths, irradiating the sensor surface with light at a constant incident angle parallel to the specific plane while flowing the samples assigned to the flow paths;
Receiving reflected light from the sensor surface and measuring the intensity of the reflected light from each diffraction grating surface;
And a step of performing a quantitative and / or qualitative analysis of the sample flowing through each of the flow paths based on the intensity of the reflected light.
上記センサ面に試料を接触させた状態で上記表面プラズモン共鳴センサチップを保持する保持手段と、
上記表面プラズモン共鳴センサチップが上記保持手段により保持された状態において、上記センサ面に向けて上記特定平面に平行に一定の入射角度で光を照射する光照射手段と、
上記センサ面からの反射光を受光する受光手段と、
上記受光手段により受光した上記各回折格子面からの反射光の強度を計測する計測手段と、
上記の反射光の強度に基づいて、試料の定量的及び/又は定性的な分析を行う分析手段とを備えた
ことを特徴とする、分析装置。An analyzer that performs quantitative and / or qualitative analysis of a sample using the surface plasmon resonance sensor chip according to any one of claims 5 to 10, 12, and 13,
Holding means for holding the surface plasmon resonance sensor chip in a state where the sample is in contact with the sensor surface;
In a state where the surface plasmon resonance sensor chip is held by the holding means, light irradiation means for irradiating light at a constant incident angle parallel to the specific plane toward the sensor surface;
A light receiving means for receiving reflected light from the sensor surface;
Measuring means for measuring the intensity of reflected light from each diffraction grating surface received by the light receiving means;
An analysis apparatus comprising: an analysis unit that performs quantitative and / or qualitative analysis of a sample based on the intensity of the reflected light.
上記表面プラズモン共鳴センサチップを保持する保持手段と、
上記表面プラズモン共鳴センサチップが上記保持手段により保持された状態において、異なる複数の試料を上記複数の流路に割り当て、上記各流路に割り当てられた試料を導入する試料導入手段と、
上記試料導入手段により上記各流路に試料が導入された状態において、上記センサ面に向けて上記特定平面に平行に一定の入射角度で上記センサ面に光を照射する光照射手段と、
上記センサ面からの反射光を受光する受光手段と、
上記受光手段により受光した上記各回折格子面からの反射光の強度を計測する計測手段と、
上記の反射光の強度に基づいて、上記各流路を流れる試料の定量的及び/又は定性的な分析を行う分析手段とを備えた
ことを特徴とする、分析装置。An analyzer for performing quantitative and / or qualitative analysis of a sample using the surface plasmon resonance sensor chip according to claim 11 or 14,
Holding means for holding the surface plasmon resonance sensor chip;
In a state where the surface plasmon resonance sensor chip is held by the holding means, a plurality of different samples are assigned to the plurality of flow paths, and sample introduction means for introducing the samples assigned to the flow paths,
A light irradiating means for irradiating the sensor surface with light at a constant incident angle parallel to the specific plane toward the sensor surface in a state where the sample is introduced into each flow path by the sample introducing means;
A light receiving means for receiving reflected light from the sensor surface;
Measuring means for measuring the intensity of reflected light from each diffraction grating surface received by the light receiving means;
An analysis apparatus comprising: an analysis unit that performs quantitative and / or qualitative analysis of a sample flowing through each of the flow paths based on the intensity of the reflected light.
上記金属層の近傍に形成され、光の照射によりエバネッセント波を生じさせる回折格子が一定の溝方向及び溝ピッチで形成された回折格子曲面とを備え、
上記回折格子曲面は光が照射される側に向けて凸の弧状の曲面形状を有し、所定の基準平面に垂直な特定平面に対し垂直に配置されるとともに、上記特定平面に垂直な溝方向で上記回折格子が形成されている
ことを特徴とする、表面プラズモン共鳴センサチップ。A metal layer capable of inducing surface plasmon waves on the surface by light irradiation,
A diffraction grating formed in the vicinity of the metal layer and generating an evanescent wave by light irradiation is provided with a diffraction grating curved surface formed with a constant groove direction and groove pitch,
The diffraction grating curved surface has an arcuate curved surface convex toward the light irradiation side, and is disposed perpendicular to a specific plane perpendicular to a predetermined reference plane and has a groove direction perpendicular to the specific plane. A surface plasmon resonance sensor chip, wherein the diffraction grating is formed.
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US10431505B2 (en) | 2016-06-07 | 2019-10-01 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Method of inspecting surface having a minute pattern based on detecting light reflected from metal layer on the surface |
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JP2003121349A (en) | 2003-04-23 |
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