NO164154B

NO164154B - SYNTHETIC STORAGE MEDIUM FOR BLOODS FROM HUMANS, AND PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF SUCH MEDIUM.

Info

Publication number: NO164154B
Application number: NO85852702A
Authority: NO
Inventors: Scott Murphy
Original assignee: Univ Jefferson
Priority date: 1983-11-09
Filing date: 1985-07-04
Publication date: 1990-05-28
Also published as: NO852702L; NO164154C

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et syntetisk medium for lagring a blodplater fra mennesker, samt en fremgangsmåte for fremstilling av et slikt medium. Det henvises til henholdsvis krav 1 og 4. The present invention relates to a synthetic medium for storing platelets from humans, as well as a method for producing such a medium. Reference is made to requirements 1 and 4 respectively.

Blodplater oppnåes som biprodukt fra hel blod-donasjoner Platelets are obtained as a by-product from whole blood donations

og fra blodplate-fereseprosesser. De lagres nå typisk i sitt eget plasma i en plastbeholder hvis vegger er gjennomtrengelige for atmosfæregasser. Det plasma som assosieres med disse blodplater inneholder normalt alle ingrediensene i normalt plasma, pluss citrat, som tilsettes som anti-koaguleringsmiddel, og dekstrose i 5 ganger det fysiologiske nivå. Den økede dekstrose-mengde tilsettes til fordel for røde blodlegemer som krever dette under lagring, og er generelt akseptert å være nød-vendig for lagring av blodplater også. and from platelet pheresis processes. They are now typically stored in their own plasma in a plastic container whose walls are permeable to atmospheric gases. The plasma associated with these platelets normally contains all the ingredients of normal plasma, plus citrate, which is added as an anti-coagulant, and dextrose at 5 times the physiological level. The increased amount of dextrose is added for the benefit of red blood cells which require this during storage, and is generally accepted to be necessary for the storage of platelets as well.

Som vanlig praksis i blodbanker forarbeides donasjoner av As usual practice in blood banks, donations are processed by

en blodenhet (4 50 ml til 67,5 anti-koaguleringsmiddel) ved sentrifugering i tre fraksjoner - røde blodlegemer, plasma og blodplater. Volumet av pakkede røde blodlegemer fra en enhet er tilnærmet 180 ml med et restvolum av plasma og anti-koaguleringsmiddel på ca. 337,5 ml. Som anvendt i resten av denne beskrivelse, inkluderer betegnelsen "plasma" ethvert anti-koaguleringsmiddel som er tilsatt på tidspunktet for dets initielie innsamling. De røde blodlegemer (referert til som pakkede røde blodlegemer) er typisk suspendert i tilnærmet 47,5 ml plasma. Blodplater suspenderes i tilnærmet 50 ml plasma. Dette blodplateholdige produkt refereres typisk til som blod-platekonsentrat. De resterende 240 ml plasma fryses som friskt frosset plasma. a unit of blood (4 50 ml to 67.5 anti-coagulant) by centrifugation into three fractions - red blood cells, plasma and platelets. The volume of packed red blood cells from one unit is approximately 180 ml with a residual volume of plasma and anti-coagulant of approx. 337.5 ml. As used throughout the remainder of this specification, the term "plasma" includes any anticoagulant added at the time of its initial collection. The red blood cells (referred to as packed red blood cells) are typically suspended in approximately 47.5 ml of plasma. Platelets are suspended in approximately 50 ml of plasma. This platelet-containing product is typically referred to as platelet concentrate. The remaining 240 ml of plasma is frozen as fresh frozen plasma.

Nylige fremskritt har gjort det mulig for blodbanker å lagre blodplatekonsentrater ved 22°C i 5 dager, se Murphy et al, "Improved Storage of Platelets for Transfusion in a New Container", Blood 60(1):194-200 (1982); Simon et al, "Extension of Platelet Concentrate Storage", Transfusion, 23 (3):207:212 Recent advances have enabled blood banks to store platelet concentrates at 22°C for 5 days, see Murphy et al, "Improved Storage of Platelets for Transfusion in a New Container", Blood 60(1):194-200 (1982); Simon et al, "Extension of Platelet Concentrate Storage", Transfusion, 23 (3):207:212

(1983). Den utstrakte lagring av blodplater ved 22°C tilveiebringer fleksibiliteten å tillate katalogisering slik at blodplater kan være tilgjengelige på steder som er beliggende langt fra hverandre, når de trenges. Imidlertid krever den ovenfor beskrevne lagringsprosess at blodplater blir suspendert i 50 ml plasma som så infuseres til pasienten sammen med blodplatene. (1983). The extended storage of platelets at 22°C provides the flexibility to allow cataloging so that platelets can be available at widely separated locations when needed. However, the storage process described above requires platelets to be suspended in 50 ml of plasma which is then infused into the patient along with the platelets.

Det er ulemper ved å lagre blodplater' i store volumer plasma som så infuseres til en mottager. Sykdommer kan overføres ved plasma-infusjon. Det er sikkert at hepatitis-B og ikke-A, ikke-B-hepatitis kan overføres ved slike plasma-infusjoner. Det er også sannsynlig at det nylig erkjente "acquired immunodeficiency syndrome" (AIDS) kan overføres via plasma.-infusjon. Pasienter kan også oppvise allergiske reaksjoner overfor plasma som i det minste er plagsomme og av og til fatale. Videre er plasma verdi-fullt fordi det kan fraksjoneres i sine komponenter som albumin og koagulasjonsfaktorer for behandling av spesifikke pasienter. There are disadvantages to storing platelets in large volumes of plasma which are then infused into a recipient. Diseases can be transmitted by plasma infusion. It is certain that hepatitis B and non-A, non-B hepatitis can be transmitted by such plasma infusions. It is also likely that the recently recognized "acquired immunodeficiency syndrome" (AIDS) can be transmitted via plasma infusion. Patients may also experience allergic reactions to plasma that are at least bothersome and occasionally fatal. Furthermore, plasma is valuable because it can be fractionated into its components such as albumin and coagulation factors for the treatment of specific patients.

En milliliter plasma er verd 4-5 cent. Derfor er det plasma One milliliter of plasma is worth 4-5 cents. Therefore it is plasma

som anvendes for å suspendere blodplater verd så meget som $2,50 pr. enhet. Siden 4 millioner enheter blodplater admini-streres pr. år i USA, kan anvendelse av plasma som lagringsmedium for blodplater forbruke opp til $10 millioner årlig av plasma. Videre har anvendelsen av blodplater i USA vært økende som en generell trend. which is used to suspend platelets worth as much as $2.50 per unit. Since 4 million units of platelets are administered per year in the United States, the use of plasma as a storage medium for platelets can consume up to $10 million annually of plasma. Furthermore, the use of platelets in the USA has been increasing as a general trend.

En stor del er kjent hva angår blodplateceller fra mennesker. Generelle artikler som beskriver teknikker, materialer og metoder for lagring av blodplater er beskrevet av Murphy et al i "Improved Storage of Platelets for Transfusion in a New Container", Blood 60(1), juli, 1982; av Murphy i "The Preparation and Storage of Plateléts for Transfusion", Mammon, Barnheart, Lusher and Walsh, PJD Publications Ltd., Westbury, New York A large part is known regarding platelet cells from humans. General articles describing platelet storage techniques, materials and methods are described by Murphy et al in "Improved Storage of Platelets for Transfusion in a New Container", Blood 60(1), July, 1982; by Murphy in "The Preparation and Storage of Platelets for Transfusion", Mammon, Barnheart, Lusher and Walsh, PJD Publications Ltd., Westbury, New York

(1980); av Murphy i "Platelet Transfusion", Progress in Hemostasis and Thrombosis, Vol. III, utgitt av Theodbre H. Spaet, Grune and Stratton, Inc. (1976); og av Murphy et al i "Platelet Storage at 22°C.: Role of Gas Transport Across Plastic Containers in Maintenance of Viability",. Blood 46 { 2) : 209-218 (1975), idet hver av disse publikasjoner herved inkorporeres ved referanse som om de var fullstendig gjengitt her. (1980); by Murphy in "Platelet Transfusion", Progress in Hemostasis and Thrombosis, Vol. III, published by Theodbre H. Spaet, Grune and Stratton, Inc. (1976); and by Murphy et al in "Platelet Storage at 22°C.: Role of Gas Transport Across Plastic Containers in Maintenance of Viability",. Blood 46 (2): 209-218 (1975), id each of these publications is hereby incorporated by reference as if fully reproduced herein.

Det er naturligvis mange dyrkningsmedier og/eller fysiologiske løsninger som ansees akseptable for bruk med hensyn til å opprettholde og/eller dyrke hvirveldyr-celler. Slike løsninger inkluderer Earle's løsning (et vevkultur-medium); Fonio's løsning (brukt for flekkede tilsmøringer av blodplater); Gey's løsning (for dyrkning av dyreceller); Hank's løsning (for dyrkning av dyreceller); Heyem's løsning (et blodfortynnende middel anvendt før telling av røde blodlegemer); Krebs-Ringers løsning (en modifisering av Ringers løsning fremstilt ved å blande NaCl, KC1, CaCl3, MgS04 og fosfat-puffer, pH 7,4); laktert Ringers løsning (inneholdende NaCl, natriumlaktat, CaC^-dihydrat og KC1 i destillert vann); Locke's løsning (for dyrkning av dyreceller); Locke-Ringer løsning (inneholdende NaCl, CaC^/ KC1, MgCl2, NaHCO-j, glukose og vann); Ringers løsning (som ligner blodserum og dets saltbestanddeler, inneholdende 8,6 gram NaCl, 0,3 g KC1 og 0,33 g CaCl2 i hver 1000 ml av destillert vann, anvendt topisk for forbrenninger og sår eller anvendt i kombina-sjon med naturlig forekommende kroppssubstanser, for eksempel blodserum, vevabstrakter og/eller mer komplekse kjemisk de-finerte nukleære løsninger for dyrkning av dyreceller); og Tyrode's løsning (en modifisert Locke's løsning), se Stedman's Medical Dictionary, s. 1300-1301, Williams and Wilkins, There are, of course, many culture media and/or physiological solutions that are considered acceptable for use in maintaining and/or growing vertebrate cells. Such solutions include Earle's solution (a tissue culture medium); Fonio's solution (used for spotted smears of platelets); Gey's solution (for culturing animal cells); Hank's solution (for culturing animal cells); Heyem's solution (a blood thinner used before counting red blood cells); Krebs-Ringer's solution (a modification of Ringer's solution prepared by mixing NaCl, KCl, CaCl3, MgSO4 and phosphate buffer, pH 7.4); lactated Ringer's solution (containing NaCl, sodium lactate, CaCl2 dihydrate and KCl in distilled water); Locke's solution (for culturing animal cells); Locke-Ringer solution (containing NaCl, CaC^/ KC1, MgCl2, NaHCO-j, glucose and water); Ringer's solution (resembling blood serum and its salt constituents, containing 8.6 grams of NaCl, 0.3 g of KCl and 0.33 g of CaCl2 in each 1000 ml of distilled water, applied topically to burns and wounds or used in combination with natural occurring body substances, for example blood serum, tissue extracts and/or more complex chemically defined nuclear solutions for culturing animal cells); and Tyrode's solution (a modified Locke's solution), see Stedman's Medical Dictionary, pp. 1300-1301, Williams and Wilkins,

Baltimore, Maryland (1982). Baltimore, Maryland (1982).

Opprettholdelse og/eller dyrking av levende hvirveldyr-celler skaper forskjellige problemer avhengig av den spesielle type celler som anvendes. Det er for eksempel kjent at blodlegemer, for eksempel blodplater, har mange metabolske egenskaper lik dem som visse andre typer celler har. I Blood 30:151 (1967) for eksempel er det antydet at de metabolske egenskaper ved blodlegemer i noen henseender er lik det tilsvarende hos tumor-celler. På den annen side er en betydelig del av teknikkens stand rettet spesifikt mot problemet med å lagre stabile suspensjoner av blodlegemer, slik som blodplater. Tidligere arbeider an-gående lagring av blodplater har vist at varigheten av blod-plate-lagring er begrenset av den kontinuerlige produksjon av melkesyre fra dekstrose ved hjelp av blodplatene. Selv om dette gir energi for blodplatene, surgjør melkesyren mediet, og denne surhet ødelegger til slutt blodplatene. Det er også blitt vist at blodplater forbruker oksygen under lagring for energiproduk-sjon, og sluttproduktet av denne prosess er en gass, C02, som, til forskjell fra melkesyre, kan unnslippe beholderen som den normalt lagres i, gjennom plastveggene. Produksjonen av CC^ surgjør ikke lagringsmediet for disse blodplater. I tillegg til glykolysen av dekstrose kan fettsyrer og aminosyrer som typisk er til stede i plasmaet anvendes som substrater for oksydativ metabolisme av lagrede plateceller. The maintenance and/or cultivation of living vertebrate cells creates different problems depending on the particular type of cells used. For example, it is known that blood cells, such as platelets, have many metabolic properties similar to those of certain other types of cells. In Blood 30:151 (1967), for example, it is suggested that the metabolic properties of blood cells are in some respects similar to those of tumor cells. On the other hand, a significant part of the prior art is directed specifically at the problem of storing stable suspensions of blood cells, such as platelets. Previous work on the storage of platelets has shown that the duration of platelet storage is limited by the continuous production of lactic acid from dextrose by the platelets. Although this provides energy for the platelets, the lactic acid acidifies the medium, and this acidity eventually destroys the platelets. It has also been shown that platelets consume oxygen during storage for energy production, and the end product of this process is a gas, C02, which, unlike lactic acid, can escape the container in which it is normally stored, through the plastic walls. The production of CC^ does not acidify the storage medium for these platelets. In addition to the glycolysis of dextrose, fatty acids and amino acids that are typically present in the plasma can be used as substrates for oxidative metabolism of stored platelet cells.

Forskjellige teknikker er åpenbart i patentlitteraturen vedrørerende fraksjonering av blod til nyttige sluttprodukter. Various techniques are disclosed in the patent literature relating to the fractionation of blood into useful end products.

I britisk patentskrift nr. 1 283 273 beskrives en fremgangsmåte og apparatur for separering av plasma fra helt blod slik at man får et plasma-sluttprodukt, hvorved de gjenværende blodfrak-sjoner returneres til en donor. I US-patentskrift nr. 4 269 718 (Persidsky) beskrives en fremgangsmåte for sentrifugal-separasjon av blodplater fra blod under anvendelse av saltvann som vaske- og forskyvningsløsning. I Pradis US-patentskrift nr. 4 387 031 beskrives et preparat for separering av erytro-cytter og plasma i blod. British patent document no. 1 283 273 describes a method and apparatus for separating plasma from whole blood so that a plasma end product is obtained, whereby the remaining blood fractions are returned to a donor. US Patent No. 4,269,718 (Persidsky) describes a method for centrifugal separation of platelets from blood using salt water as a washing and displacement solution. In Pradis US patent no. 4 387 031, a preparation for separating erythrocytes and plasma in blood is described.

Patentlitteraturen beskriver også forskjellige konserverings- eller dyrkningsmedier som er angitt å være nyttige i tilknytning til lagring av blodplater. I US-patentskrift nr. 4 390 619 beskrives en ionebytte- The patent literature also describes various preservation or culture media that are indicated to be useful in connection with the storage of platelets. US Patent No. 4,390,619 describes an ion exchange

harpiks for langsom frigjøring av fosfat-puffer. Dette patent inneholder en utstrakt diskusjon av oksydative fosforylering- og glykolysemekanismer hos blodplater og slektskapet mellom disse og blodplatelagring. I US-patentskrifter nr. 2 786 014 og 3 629 071 er det beskrevet forskjellige glukose- og elektrolytt-holdige blodplate-lagringsmedier som ér tenkt brukt ved lagring av blodplater ved temperaturer i området 4-5"C. Likeledes beskriver US-patentskrift nr. 4 152 208 en fremgangsmåte og et medium for lagring av stabiliserte leukocytter som angis å kunne lagres ved temperaturer fra ca. 4 til ca. 30<*>C, som holdes i en basisk saltløsning eller et minimum-essensielt medium som opprettholder levedyktigheten til leukocyttene i blodet. I US-patentskrift nr. 4 267 269 beskrives en lagringsløsning for røde blodlegemer som inneholder' adenin, glukose eller fruktose, natriumklorid og mannitol. US-patentskrifter nr. 3 814 687, 3 850 174 ;og det før nevnte britiske patentskrift nr. 1 283 273 vedrører generelt separering av dannede elementer fra plasma i blodfraksjoneringsprosesser. I US-patentskrift nr. 4 152 208 beskrives et utvalg av leukocytt-konserverende løsninger og anvendelse av slike løsninger i blodfraksjoneringsprosesser, inklusive Eagles' MEM (kolonner 3 og 4) som blant annet inneholder glutamin, leucin, isoleucin, fenylalanin, tyrosin, fosfater og natrium- og kaliumklorider, for anvendelse i tilknytning til anti-koaguleringsmidler såsom natriumcitrat. ;Det henvises også til US-patentskrift nr. 4 205 126. US-patentskrift nr. 3 753 357 beskriver bredt forskjellige konserverings- eller dyrkningsmedier som er nyttige i tilknytning til lagring av blodlegemer. ;Som omtalt i det følgende, benytter én av de foretrukne ut-førelsesformer av foreliggende oppfinnelse et syntetisk lagringsmedium for blodplater som er blitt tilsatt glutamin. Selv om ;de ikke er beslektet med lagring eller dyrkning av blodlegemer, åpenbarer de følgende publikasjoner at glutamin kan være et substrat for oksydativ fosforylering i en viss type av kreft-celler, nemlig HeLa-celler, se "The Continuous Growth of ;Vetebrate Cells in the Absence of Sugar", av Wice et al, ;Journal of Biological Chemistry, 256 (15):7812-7819 (1981); ;"The Penetose Cycle", av Reitzer et al, Journal of Biological Chemistry, 255 (12):5616-5626 (1980); og "Evidence that Glutamlne, Not Sugar is the Major Energy Source for Cultured HeLa Cells", ;av Reitzer et al, Journal of Biological Chemistry, 254 (8): 2669-2676 (1979). Det henvises også til Kuchler, Biochemical Methods and Cell Cultural and Virology, Halstead Press s. 83, 87-88, (1977). ;Til tross for det betydelige arbeid som er nedlagt på dette område, er det fremdeles behov for en enkel, sikker metode som ikke er kostbar, for lagring av blodplater fra mennesker i levedyktig tilstand samtidig som mengden av blodplasma som frigjøres for andre formål, økes. ;Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer som nevnt også en fremgangsmåte for fremstilling av et syntetisk lagringsmedium for blodplater fra mennesker, for opprettholdelse i levedyktig tilstand i 3 til 7 dager. Fortrinnsvis er levedyktigheten minst 5 dager, ved temperaturer på 18-30"C, spesielt 20-24'C og helst ved ca. 22'C. ;Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen går ut på?at det tilveiebringes blodplater fra mennesker, fra et blodplate-konsentrat som omfatter blodplater i blodplasma, idet det syntetiske lagringsmedium skal opprettholde en levedyktighet på 3-7 dager. Ved fremgangsmåten separeres supernatant-plasma fra nevnte konsentrat slik at det blir igjen 1-15 ml plasmaapr. enhet av blodplater slik at det produseres en blodplate^khapp, en pufret Ringers-citrat-løsning tilsettes samt eventueltVet ikke-glykolytisk substrat for oksydativ fosforylering til nevnte blodplate-knapp, idet mengden av nevnte tilsetning reguleres slik at det produseres en"konsentrasjon av glukose i nevnte syntetiske suspensjon ved starten av lagringen på mindre enn 10 mM/1, løsningen agiteres for å resuspendere blodplatene?,og suspensjonen lagres i en oksygen-gjennomtrengelig beholder holdt ved temperaturer i området 20-24°C inntil det er behov for den. ;Den foretrukne Ringers-citrat-løsning pufres for åA opprettholde behov-verdien til en enhet av blodplater ogr;ikke mer enn 15 ml av assosiert plasma ved en pH-verdi i overkant av 6,2 etter 7 dagers lagring sammen med 60 ml pr. enhet avvdette medium i en oksygen-gjennomtrengelig beholder som holdes:ved 22°C. ;Et foretrukket alternativt blodplate-lagringsmediumu omfatter videre et blodplategjennomtrengelig ikke-glykolytisk substrat for oksydativ fosforylerinhg, for eksempel glutamin. Alternative substrater inkluderer oksaloacetat, malat,,fumarat, suksinat, a-ketogluterat, oksalosuksinat, isocitrat, cisakonitat, og/eller en aminosyre som kan omdannes til slike sitronsyre-syklus-intermediater, for eksempel glutamin- eller asparagin-syre. ;Ytterligere alternative substrater inkluderer aminosyrer ;og fettsyrer som gir opphav til acetyl-CoA, inklusive léucin, isoleucin, fenylalanin, tyrosin, acetoeddiksyre, acetonv,og slike fettsyrer som kan metaboliseres ved P-oksydasjon. ;Spesielt foretrukket er for tiden tilsetning av glutamin^som substrat for oksydativ fosforylering. Det er blitt funnet at tilsetning av glutamin som substrat for oksydativ fosforylering kan tøye den aktive metabolisme av lagrede blodplater slik at deres levedyktighet utvides for så lang tid som 7 dager. ;Det syntetiske blodplatelagringsmedium i henhold til foreliggende oppfinnelse frigjør vesentlige mengder av naturlig plasma for annen anvendelse. ;Det primære formål med foreliggende oppfinnelse var å tilveiebringe et sykdomsfritt kunstig lagringsmedium for blodplater som vil tillate lagring i minst 5 dager ved en tempratur på 18-30"C, fortrinnsvis 20-24'C og helst ved 22 °C. Ved slutten av lagringen må blodplatene være levedyktige. ;Med dette menes at en hovedmengde av de lagrede blodplater vil sirkulere normalt etter infusjon til en mottager. Flere studier indikerer at blodplatelevedyktighet har sammenheng med opprettholdelse av normal blodplatemorfologi, se Murphy et al, "Improved Storage of Platelets for Transfusion in a New Container", Blood 60(11:194-200 (1982); Kuniki et al, "A Study of Variables Affecting the Quality of Platelets Stored at 'Room Temperature<1>", Transfusion, 15(5):414-421 (1975); og Holme et al, "Platelet Storage at 22°C: Ef feet of Type of Agitation on Morphology, Viability, and Function in Vitro", Blood 52(2):425-435, (1978). Som deres navn tyder på, sirkulerer blodplater som tynne, kompakte skiver med få prosesser. I de fleste situasjoner har tap av levedyktighet sammenheng med sfære-dannelse, svelling og pseudopod-dannelse. I de forsøk som skal beskrives senere, er blodplatemorfologi anvendt som indeks på levedyktighet. Dette er blitt fullført ved anvendelse av konvensjonell fasemikroskopi. I tillegg er graden av blodplateform-endring som respons på trombin og dispersjonen av størrelsesfordeling ved Coulter-teller målt objektivt. Som rapportert i de ovenfor nevnte artikler av Murphy et al og Holme et al er det vist at disse målinger har sammenheng med mikroskopisk morfologi og levedyktighet in vivo. ;For å opprettholde levedyktigheten må cellen utvikle nytt adenosin-trifosfat (ATP) kontinuerlig for å stille sitt energibehov. To veier er normalt tilgjengelig - glykolyse og oksydativ fosforylering. I glykolyse omdannes et molekyl glykose til 2 molekyler melkesyre for å utvikle 2 molekyler ATP.. Ved oksydasjon kommer glukose, fettsyre eller aminosyre inn i sitronsyre-syklusen og omdannes til karbondioksyd (C02) og vann. Denne rute krever nærvær av et adekvat forråd av oksygen. Det er et meget-mer effektivt system enn glykolyse. Eksempelvis gir oksydativ metabolisme av glukose til C02 og vann 3 6 molekyler av ATP. ;Det er erkjent at blodplater vil stille sitt energibehov på en måte som ikke nødvendigvis er i overensstemmelse med deres langtidslagring i levedyktig tilstand. Når de er gitt adekvat oksygen, produserer blodplater det meste av sitt ATP via oksydasjon, men fortsetter å produsere melkesyre istedenfor å bortlede all metabolisert glukose via den oksydative rute. Under lagringen av blodplater i plasma stiger melkesyre-konsentrasjoner til tilnærmet 2,5 millimolar pr. dag, se Murphy et al, "Platelet Storage at 22°C: Role of Gas Transport Across Plastic Containers in Maintenance of Viability", Blood 46 (2) :209-218 (1975). Dette fører til gradvis fall i pH-verdien. Som angitt i den før nevnte artikkel av Murphy et al, kan en pH-verdi (som startet på 7,2), når melkesyrekonsentrasjonen stiger til over 20 millimolar, nå 6,0. Siden blodplatelevedyktighet irreversibelt går tapt hvis pH-verdien faller til 6,1 eller lavere, er en hovedbegrensende variabel for blodplatelagring pH-verdien, se Murphy et al, "Storage of Platelet Concentrates at 22°C", Blood 35(4):549-557 (1970). Ved denne hastighet av melkesyreproduksjon ville pH-verdien falle meget hurtigere hvis det ikke var for naturlig forekommende plasma-puffere, hovedsakelig natriumbikarbonat. ;Den før nevnte pufrede Ringers-citrat-løsning omfatter 120-300, fortrinnsvis 170-180, helst 175 mekv/1 natrium; 0-10, fortrinnsvis 2-5 og helst 3 mekv/1 kalium; 0-10, fortrinnsvis 2-5 og helst 3,4 mekv/1 kalsium; 80-180, fortrinnsvis 110-125 og helst 117 mekv/1 klorid; 10-35, fortrinnsvis 15-25 og helst fortrinnsvis 21 mekv/1 citrat; og en puffer som er effektiv til å opprettholde pH-verdien til en enhet av blodplater og ikke mer enn 15 ml av nevnte assosierte plasma pr. 60 ml av nevnte medium med en pH-verdi over 6,2 etter 7 dagers lagring i en oksygen-gjennomtrengelig beholder som holdes ved den spesifiserte temperatur, 20-24"C, mest foretrukket ved 22 °C. ;Det foretrukne blodplatelagringsmedium inneholder således natrium, kalium, kalsium og klorid i fysiologiske mengder, i tillegg til en konsentrasjon av citrat som er inkludert for å binde kalsium som ellers kan initiere koagulering. Det antas ikke at dette basiske blodplatelagringsmedium utgjør et eksogent substrat for metabolisme, da det er blitt rapportert at citrat ikke kan komme inn i sitronsyre-syklusen til blodplater, se Tegos et al, "Platelet Glycolysis in Platelet Storage. III. ;The Instability of Platelets to Utilize Exogenous Citrate", Transfusion 19 (5):601-603 (1979). Glukose er ikke blitt in-korporert i det her beskrevne medium, da inkorporering av den ville resultere i obligatorisk produksjon av melkesyre, hvilket ville føre til en uakseptabel senkning av pH-verdien og tap av blodplate-levedyktighet. ;De foretrukne fremgangsmåter i henhold til oppfinnelsen er utarbeidet for å begrense mengden av glukose som er tilgjengelig for lagrede blodplater, og som derfor kan tjene som substrat for melkesyreproduksjon. Mengden av glukoseholdig supernatant-plasma fjernet fra blodplatekonsentratet, og av glukosefritt lagringsmedium tilsatt til blodplatene og resterende assosiert plasma sikrer at konsentrasjonen av glukose i den resulterende syntetiske suspensjon er mindre enn 10* mM/1 når lagringen begynner. Fortrinnsvis utføres ekstraksjonen og lagringsmedium-tilsetningen slik at konsentrasjonen av glukose i den resulterende suspensjon er 5 mM/1 ved lagringens begynnelse. Som forklart i det følgende, tillater denne konsentrasjon av glukose at glykolyse skrider frem inntil ca. 1,5 mM konsentrasjon er blitt oppnådd, hvilket inntreffer etter ca. 3 dagers lagring når de foretrukne metoder og medier som her beskrevet anvendes. resin for slow release of phosphate puffs. This patent contains an extensive discussion of oxidative phosphorylation and glycolysis mechanisms in platelets and the relationship between these and platelet storage. US Patent Nos. 2,786,014 and 3,629,071 describe various glucose- and electrolyte-containing platelet storage media that are intended to be used for storing platelets at temperatures in the range of 4-5"C. Likewise, US Patent No. 4,152,208 a method and a medium for storing stabilized leukocytes which are stated to be able to be stored at temperatures from about 4 to about 30<*>C, which are kept in a basic salt solution or a minimum essential medium which maintains the viability of the leukocytes in the blood. US Patent No. 4,267,269 describes a storage solution for red blood cells containing adenine, glucose or fructose, sodium chloride and mannitol. US Patent Nos. 3,814,687, 3,850,174; and the aforementioned British patent document no. 1 283 273 relates generally to the separation of formed elements from plasma in blood fractionation processes US patent document no. 4 152 208 describes a selection of leukocyte-preserving solutions and the use of such solutions in blood fractionation processes, including Eagles' MEM (columns 3 and 4) which, among other things, contains glutamine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, phosphates and sodium and potassium chlorides, for use in conjunction with anti-coagulants such as sodium citrate. Reference is also made to US Patent No. 4,205,126. US Patent No. 3,753,357 describes a wide variety of preservation or culture media that are useful in connection with the storage of blood cells. As discussed below, one of the preferred embodiments of the present invention utilizes a synthetic platelet storage medium to which glutamine has been added. Although unrelated to the storage or cultivation of blood cells, the following publications reveal that glutamine can be a substrate for oxidative phosphorylation in a certain type of cancer cell, namely HeLa cells, see "The Continuous Growth of Vetebrate Cells in the Absence of Sugar", by Wice et al,; Journal of Biological Chemistry, 256 (15):7812-7819 (1981); ;"The Penetose Cycle", by Reitzer et al, Journal of Biological Chemistry, 255 (12):5616-5626 (1980); and "Evidence that Glutamlne, Not Sugar is the Major Energy Source for Cultured HeLa Cells", by Reitzer et al, Journal of Biological Chemistry, 254 (8): 2669-2676 (1979). Reference is also made to Kuchler, Biochemical Methods and Cell Cultural and Virology, Halstead Press pp. 83, 87-88, (1977). ;Despite the considerable work that has been done in this area, there is still a need for a simple, safe and inexpensive method of storing human platelets in a viable state while increasing the amount of blood plasma released for other purposes . As mentioned, the present invention also provides a method for the production of a synthetic storage medium for platelets from humans, for maintenance in a viable state for 3 to 7 days. Preferably, the viability is at least 5 days, at temperatures of 18-30°C, especially 20-24°C and preferably at about 22°C. The method according to the invention involves providing platelets from humans, from a platelet concentrate comprising platelets in blood plasma, as the synthetic storage medium must maintain a viability of 3-7 days. In the method, supernatant plasma is separated from said concentrate so that 1-15 ml of plasma apr. unit of platelets remain so that it is produced a platelet drop, a buffered Ringer's citrate solution is added as well as possibly a non-glycolytic substrate for oxidative phosphorylation to said platelet button, the amount of said addition being regulated so that a "concentration of glucose is produced in said synthetic suspension at the start of the storage of less than 10 mM/1, the solution is agitated to resuspend the platelets?, and the suspension is stored in an oxygen-permeable container maintained at temperatures of about stored at 20-24°C until needed. ;The preferred Ringers-citrate solution is buffered to maintain the requirement value of one unit of platelets and not more than 15 ml of associated plasma at a pH in excess of 6.2 after 7 days of storage together with 60 ml per . unit of this medium in an oxygen-permeable container maintained at 22°C. A preferred alternative platelet storage medium further comprises a platelet-permeable non-glycolytic substrate for oxidative phosphorylation, such as glutamine. Alternative substrates include oxaloacetate, malate, fumarate, succinate, α-ketoglutarate, oxalosuccinate, isocitrate, cisaconite, and/or an amino acid that can be converted to such citric acid cycle intermediates, for example glutamic or aspartic acid. ;Further alternative substrates include amino acids ;and fatty acids that give rise to acetyl-CoA, including leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, acetoacetic acid, acetonev,and such fatty acids that can be metabolized by P-oxidation. Particularly preferred at present is the addition of glutamine as a substrate for oxidative phosphorylation. It has been found that the addition of glutamine as a substrate for oxidative phosphorylation can stretch the active metabolism of stored platelets so that their viability is extended for as long as 7 days. ;The synthetic platelet storage medium according to the present invention frees significant amounts of natural plasma for other use. ;The primary purpose of the present invention was to provide a disease-free artificial storage medium for platelets which will allow storage for at least 5 days at a temperature of 18-30°C, preferably 20-24°C and preferably at 22°C. At the end of storage, the platelets must be viable. ;By this is meant that a major amount of the stored platelets will circulate normally after infusion into a recipient. Several studies indicate that platelet viability is related to the maintenance of normal platelet morphology, see Murphy et al, "Improved Storage of Platelets for Transfusion in a New Container", Blood 60(11:194-200 (1982); Kuniki et al, "A Study of Variables Affecting the Quality of Platelets Stored at 'Room Temperature<1>", Transfusion, 15(5): 414-421 (1975); and Holme et al, "Platelet Storage at 22°C: Effects of Type of Agitation on Morphology, Viability, and Function in Vitro", Blood 52(2):425-435, (1978) .As their name suggests, platelets circulate as thin, compact disks with few processes. In most situations, loss of viability is associated with sphere formation, swelling and pseudopod formation. In the experiments to be described later, platelet morphology is used as an index of viability. This has been accomplished using conventional phase microscopy. In addition, the degree of platelet shape change in response to thrombin and the dispersion of size distribution by Coulter counter have been measured objectively. As reported in the above-mentioned articles by Murphy et al and Holme et al, it has been shown that these measurements are related to microscopic morphology and viability in vivo. To maintain viability, the cell must develop new adenosine triphosphate (ATP) continuously to meet its energy needs. Two pathways are normally available - glycolysis and oxidative phosphorylation. In glycolysis, a molecule of glucose is converted into 2 molecules of lactic acid to develop 2 molecules of ATP.. During oxidation, glucose, fatty acid or amino acid enter the citric acid cycle and are converted into carbon dioxide (C02) and water. This route requires the presence of an adequate supply of oxygen. It is a much-more efficient system than glycolysis. For example, oxidative metabolism of glucose to C02 and water gives 3 6 molecules of ATP. ;It is recognized that platelets will meet their energy needs in a way that is not necessarily consistent with their long-term storage in a viable state. When given adequate oxygen, platelets produce most of their ATP via oxidation, but continue to produce lactic acid instead of diverting all metabolized glucose via the oxidative route. During the storage of platelets in plasma, lactic acid concentrations rise to approximately 2.5 millimolar per today, see Murphy et al, "Platelet Storage at 22°C: Role of Gas Transport Across Plastic Containers in Maintenance of Viability", Blood 46 (2):209-218 (1975). This leads to a gradual drop in the pH value. As stated in the aforementioned article by Murphy et al, as the lactic acid concentration rises above 20 millimolar, a pH value (which started at 7.2) can reach 6.0. Since platelet viability is irreversibly lost if the pH falls to 6.1 or below, a major limiting variable for platelet storage is the pH, see Murphy et al, "Storage of Platelet Concentrates at 22°C", Blood 35(4):549 -557 (1970). At this rate of lactic acid production, the pH value would drop much faster if it were not for naturally occurring plasma buffers, mainly sodium bicarbonate. ;The aforementioned buffered Ringer's citrate solution comprises 120-300, preferably 170-180, preferably 175 meq/1 sodium; 0-10, preferably 2-5 and preferably 3 meq/1 potassium; 0-10, preferably 2-5 and preferably 3.4 meq/1 calcium; 80-180, preferably 110-125 and preferably 117 meq/1 chloride; 10-35, preferably 15-25 and most preferably 21 meq/1 citrate; and a buffer effective to maintain the pH of a unit of platelets and not more than 15 ml of said associated plasma per 60 ml of said medium with a pH above 6.2 after 7 days of storage in an oxygen-permeable container maintained at the specified temperature, 20-24°C, most preferably at 22°C. Thus, the preferred platelet storage medium contains sodium, potassium, calcium and chloride in physiologic amounts, as well as a concentration of citrate included to bind calcium that might otherwise initiate coagulation.This basic platelet storage medium is not thought to constitute an exogenous substrate for metabolism, as it has been reported that citrate cannot enter the citric acid cycle of platelets, see Tegos et al, "Platelet Glycolysis in Platelet Storage. III. ;The Instability of Platelets to Utilize Exogenous Citrate", Transfusion 19 (5):601-603 (1979). Glucose has not been incorporated into the medium described here, as its incorporation would result in the obligatory production of lactic acid, which would lead to an unacceptable lowering of the pH value and loss of platelet viability. ;The preferred methods according to the invention are designed to limit the amount of glucose available to stored platelets, and which can therefore serve as a substrate for lactic acid production. The amount of glucose-containing supernatant plasma removed from the platelet concentrate, and of glucose-free storage medium added to the platelets and remaining associated plasma ensures that the concentration of glucose in the resulting synthetic suspension is less than 10* mM/1 when storage begins. Preferably, the extraction and storage medium addition are performed so that the concentration of glucose in the resulting suspension is 5 mM/l at the beginning of storage nelze. As explained below, this concentration of glucose allows glycolysis to proceed until approx. 1.5 mM concentration has been achieved, which occurs after approx. 3 days of storage when the preferred methods and media described here are used.

For å opprettholde pH-verdien til den resulterende syntetiske suspensjon av blodplater på et akseptabelt nivå er det ovenfor nevnte medium også satt slik sammen at pH-verdien ved lagringens begynnelse er i overkant av 7,0, fortrinnsvis mellom 7,2 og 7,4. In order to maintain the pH value of the resulting synthetic suspension of platelets at an acceptable level, the above-mentioned medium is also composed so that the pH value at the beginning of storage is in excess of 7.0, preferably between 7.2 and 7.4 .

Som nevnt ovenfor, opprettholder Ringers-citrat-løsningen pH-verdien til suspensjonen over 6,2 etter 7 dagers lagring. Dette foregår fortrinnsvis ved anvendelse av en fosfat-puffer, fortrinnsvis natriumfosfat, som i løsning har en HP04-konsentrasjon på mellom 0 og 100 mekv/1 og fortrinnsvis 8 mekv/1. Som vist i det følgende, er denne pufring tilstrekkelig til å tilpassen den melkesyre som stammer fra metabolisme av blodplate-glykogen såvel som den resterende plasma-glukose som ikke er fjernet under konsentrat-fremstillingen. As mentioned above, the Ringers citrate solution maintains the pH of the suspension above 6.2 after 7 days of storage. This preferably takes place by using a phosphate buffer, preferably sodium phosphate, which in solution has an HP04 concentration of between 0 and 100 meq/1 and preferably 8 meq/1. As shown below, this buffering is sufficient to accommodate the lactic acid originating from the metabolism of platelet glycogen as well as the remaining plasma glucose not removed during the concentrate preparation.

Det foretrekkes for tiden å tilveiebringe et ytterligere blodplate-gjennomtrengelig, ikke-glykolytisk substrat for oksydativ fosforylering til den syntetiske blodplate-suspensjon før lagring. Glutamin er det foretrukne ikke-glykolytiske substrat for oksydativ fosforylering. I en foretrukken utførelsesform kan glutamin inkorporeres som en komponent i blodplate-lagringsmediet i en konsentrasjon av mellom 5 og 25, fortrinnsvis 2 0 mM/1. Alternativt kan andre ikke-glykolytiske substrater for oksydativ fosforylering utvelges fra gruppen som består av oksaloacetat, malat, fumarat, suksinat, a-ketogluterat, oksalosuksinat, isocitrat, cis-akonitat, glutamin, aminosyre-forløpere av sitron-syklusintermediater, amino- og/eller fettsyre-forløpere av acetyl-CoA, og blandinger derav. Slike aminosyre-forløpere av sitronsyre-syklusintermediater inkluderer slike som er valgt fra gruppen som består av glutaminsyre, asparginsyre og blandinger derav. Slike forløpere av acetyl-CoA kan være utvalgt fra gruppen som består av leucin, isoleucin, fenylalanin, tyrosin, acetoeddiksyre, aceton, fettsyrer metabolisert ved ^-oksydasjon og blandinger derav. It is currently preferred to provide an additional platelet-permeable, non-glycolytic substrate for oxidative phosphorylation to the synthetic platelet suspension prior to storage. Glutamine is the preferred non-glycolytic substrate for oxidative phosphorylation. In a preferred embodiment, glutamine may be incorporated as a component of the platelet storage medium at a concentration of between 5 and 25, preferably 20 mM/l. Alternatively, other non-glycolytic substrates for oxidative phosphorylation may be selected from the group consisting of oxaloacetate, malate, fumarate, succinate, α-ketoglutarate, oxalosuccinate, isocitrate, cis-aconitate, glutamine, amino acid precursors of citron cycle intermediates, amino- and/or or fatty acid precursors of acetyl-CoA, and mixtures thereof. Such amino acid precursors of citric acid cycle intermediates include those selected from the group consisting of glutamic acid, aspartic acid and mixtures thereof. Such precursors of acetyl-CoA may be selected from the group consisting of leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, acetoacetic acid, acetone, fatty acids metabolized by ^-oxidation and mixtures thereof.

Det foretrekkes også å tilsette magnesium til lagringsmediet, da dette element er viktig for riktig cellefunksjon. It is also preferred to add magnesium to the storage medium, as this element is important for proper cell function.

Når det anvendes, bør magnesium være til stede i mellom 0-3, fortrinnsvis ca. 2,0 mekv/1. When used, magnesium should be present in between 0-3, preferably approx. 2.0 meq/1.

Oppfinnelsen vil bli forstått bedre av de følgende eksempler: The invention will be better understood from the following examples:

Blodplaterikt plasma (PRP) og blodplatekonsentrater (PC) Platelet Rich Plasma (PRP) and Platelet Concentrates (PC)

ble fremstilt fra helblod-donasjoner som var anti-koagulert med citrat/fosfat/dekstrose (CPD) eller syre/citrat/dekstrose, were prepared from whole blood donations anticoagulated with citrate/phosphate/dextrose (CPD) or acid/citrate/dextrose,

som beskrevet i Blood 52 (2):425-435, med unntagelse av at supernatant-plasmaet ble ekstrahert fra posen som inneholdt blodplate-knapp så fullstendig som mulig, ved anvendelse av en Fenwal-plasma-ekstraktor (Fenwal Laboratories, Deerfield, 111.). Restmengden av plasma varierte fra 4 til 15 ml. 4 5 ml av Ringers løsning (Travenol Laboratories, Inc., Deerfield, 111.) og 15 ml av 2,5 %ig citrat-løsning ble satt til posen som inneholdt blod-plate-knapp. Posen fikk ligge i ro i 45 minutter før den ble anbrakt på en blodplate-agitator (Helmer Labs., St. Paul, Minn.) for resuspensjon. Det foretrekkes å utføre et slikt inkuberings-trinn i minst 3 0 minutter før løsningen agiteres for resuspender-ing av blodplatene. Etter 2 timers agitering var blodplatene fullstendig resuspendert. PC ble deretter overført til en PL/732-beholder (Fenwal, Inc.). Denne beholder er kjent for å gi adekvat oksygen-tilførsel, se Blood, 60(1):194-200 (1982). Diverse supplementer som skulle testes, ble så tilsatt i beholderen, som ble lagret på blodplate-agitatoren ved 22°C. as described in Blood 52 (2):425-435, except that the supernatant plasma was extracted from the bag containing the platelet button as completely as possible, using a Fenwal plasma extractor (Fenwal Laboratories, Deerfield, 111 .). The residual amount of plasma varied from 4 to 15 ml. 4 5 ml of Ringer's solution (Travenol Laboratories, Inc., Deerfield, 111.) and 15 ml of 2.5% citrate solution were added to the bag containing the platelet button. The bag was allowed to rest for 45 minutes before being placed on a platelet agitator (Helmer Labs., St. Paul, Minn.) for resuspension. It is preferred to carry out such an incubation step for at least 30 minutes before the solution is agitated to resuspend the platelets. After 2 hours of agitation, the platelets were completely resuspended. PC was then transferred to a PL/732 container (Fenwal, Inc.). This container is known to provide adequate oxygen supply, see Blood, 60(1):194-200 (1982). Various supplements to be tested were then added to the container, which was stored on the platelet agitator at 22°C.

De endelige medier ble testet (konsentrasjoner som er antydet refererer til slutt-konsentrasjoner): 1. Ringers og citrat bare: Ri- Ci (natrium, 175 mekv/1; kalium, 3 mekv/1; kalsium, 3,4 mekv/1; klorid, 117 mekv/1; citrat, 21 mekv/1). The final media were tested (concentrations indicated refer to final concentrations): 1. Ringer's and citrate only: Ri-Ci (sodium, 175 meq/1; potassium, 3 meq/1; calcium, 3.4 meq/1; chloride, 117 meq/1; citrate, 21 meq/1).

2. Ringers-citrat og fosfat: Ri- Ci- Pho (HP04, 8 mekv/1). 2. Ringers citrate and phosphate: Ri-Ci-Pho (HP04, 8 meq/1).

3. Ringers-citrat, fosfat og glutamin: 3. Ringers citrate, phosphate and glutamine:

Ri- Ci- Pho- Glut (L-glutamin) (GIBCO Labs, Grand Island, N.Y.), 20 mM). Ri-Ci-Pho-Glut (L-glutamine) (GIBCO Labs, Grand Island, N.Y.), 20 mM).

4. Ringers-citrat, fosfat og glukose: 4. Ringers citrate, phosphate and glucose:

Ri- Ci- Pho- Gluc (glukose, 25 mM) .. Ri-Ci-Pho-Gluc (glucose, 25 mM) ..

5. Plasma-kontroll. Noe PC ble resuspendert i plasma på 5. Plasma control. Some PC was resuspended in plasma on

vanlig måte for sammenligningsformål. common way for comparison purposes.

Blodplate-telling, middelplate-volum og dispersjonen (geo-metrisk standardavvik) av størrelsesfordelingen ble bestemt med en Coulter-teller. Platelet count, mean platelet volume and the dispersion (geometric standard deviation) of the size distribution were determined with a Coulter counter.

pC>2 og pH ble bestemt som beskrevet tidligere, ved anvendelse av en pH/blod-gassanalysator. Oksygen-forbrukshastigheten, C(02), (nmol/min/10 9blodplater) ble bestemt ved en "steady state"-teknikk: pC>2 and pH were determined as described previously, using a pH/blood gas analyzer. The oxygen consumption rate, C(02), (nmol/min/10 9 platelets) was determined by a steady state technique:

KC>2 er beholderens kapasitet for C^-transport (nmol/min/atm) . Ovenstående ligning angir at oksygenforbruket til blodplatene inne i beholderen er lik oksygen-fluxen gjennom veggene i beholderen . KC>2 is the container's capacity for C^ transport (nmol/min/atm) . The above equation indicates that the oxygen consumption of the platelets inside the container is equal to the oxygen flux through the walls of the container.

Laktat- og glukose-konsentrasjoner ble bestemt som beskrevet tidligere (se Blood 46 (2): 209-218 (1975)). Grad av blodplate-formendring med trombin (1U pr. ml endelig kons.) ble målt under anvendelse av et Payton-aggregometer. Det ble kvantifi-sert ved ekstinksjonsforholdet Ei200"'' /'E1200' ^vor E1200 representerer ekstinksjonen for blodplatene før tilsetning av trombin, og E^OO"1" ror ekstinks jonen etterpå, se Holme et al, Journal of Lab. and Clin. Medicine, 97 (5):610-622 (1981). Lactate and glucose concentrations were determined as described previously (see Blood 46 (2): 209-218 (1975)). Degree of platelet shape change with thrombin (1U per ml final conc.) was measured using a Payton aggregometer. It was quantified by the extinction ratio Ei200"'' /'E1200' ^where E1200 represents the extinction of the platelets before the addition of thrombin, and E^OO"1" ror the extinction ion afterwards, see Holme et al, Journal of Lab. and Clin Medicine, 97(5):610-622 (1981).

3 ml prøver av PC som skulle studeres, ble tatt på dag 1, 3 ml samples of PC to be studied were taken on day 1,

3, 5 og 7. Sluttvolumene av PC på dag 7 varierte fra 51-58 ml. 3, 5 and 7. Final volumes of PC on day 7 ranged from 51-58 ml.

En nedgang i pH-nivåer under 6,2 ble observert da blodplater ble lagret i det basiske Ringers-citrat-medium, Ri-Ci. A decrease in pH levels below 6.2 was observed when platelets were stored in the basic Ringer's citrate medium, Ri-Ci.

Tilsetning av natriumfosfat, Ri-Ci-Pho, forhindret det meste av dette fall i pH-verdi. Tilsetning av glutamin, Ri, Ci-Pho-Glut endret ikke serie-pH-målingene som ble observert med Ri-Ci-Pho. Imidlertid var pufringskapasiteten til fosfatet ikke tilstrekkelig til å opprettholde pH-verdien hvis glukose ble tilsatt i mediet, Ri-Ci-Pho-Gluc. Nærvær av glukose forårsaket ytterligere melkesyre-akkumulering som gikk over pufringskapasiteten til Ri-Ci-Pho. Disse pH-resultater er angitt i tabell I. Addition of sodium phosphate, Ri-Ci-Pho, prevented most of this drop in pH. Addition of glutamine, Ri, Ci-Pho-Glut did not alter the serial pH measurements observed with Ri-Ci-Pho. However, the buffering capacity of the phosphate was not sufficient to maintain the pH if glucose was added to the medium, Ri-Ci-Pho-Gluc. The presence of glucose caused further lactic acid accumulation that exceeded the buffering capacity of Ri-Ci-Pho. These pH results are listed in Table I.

Følgende tabell bekrefter at melkesyreproduksjonen øket da glukose ble satt til Ri-Ci-løsningen: The following table confirms that lactic acid production increased when glucose was added to the Ri-Ci solution:

Tabell III viser glukose-konsentrasjoner under disse lagringsbetingelser. Det fremgår at glukoseforbruk og laktat-produksjon fortsetter så lenge som glukose er til stede ved konsentrasjonen over 1,5 mM. En slik laktat-produksjon <Jår utover pufringskapasiteten. I Ri-Ci-Pho-Glut opphører laktat-produks jonen på dag 3 fordi substratet er uttømt. Disse resultater viser også det faktum at hvis glukose er til stede, er hastighetene for laktat-produksjon i kunstige medier og i plasma like. Table III shows glucose concentrations under these storage conditions. It appears that glucose consumption and lactate production continue as long as glucose is present at concentrations above 1.5 mM. Such lactate production <Years beyond the buffering capacity. In Ri-Ci-Pho-Glut, lactate production ceases on day 3 because the substrate is depleted. These results also demonstrate the fact that if glucose is present, the rates of lactate production in artificial media and in plasma are similar.

Tabell IV viser at det var en viss nedgang i oksygenforbruk under lagring. Imidlertid var denne nedgang ikke beslektet med fravær av glukose eller plasma i mediet, da den også fant sted hos blodplater lagret i plasma. Resultatene i Ri-Ci-Pho-Glut fastslår at oksygenforbruk fortsetter fra dag 3 til dag 7 når glukose ikke forbrukes. Table IV shows that there was a certain decrease in oxygen consumption during storage. However, this decrease was not related to the absence of glucose or plasma in the medium, as it also occurred in platelets stored in plasma. The results in Ri-Ci-Pho-Glut establish that oxygen consumption continues from day 3 to day 7 when glucose is not consumed.

Morfologien til blodplatene ved lagring i Ringers-citrat-medium med tilsetning av fosfat og glutamin var godt konservert ved dag 3 og 5. En viss blodplate-koagulering var fremtredende ved dag 5. Dette ble reflektert i en 10 % nedgang i blodplate-telling ved det tidspunkt (tabell V). Dette fenomen skred frem etter hvert som lagringen fortsatte utover 5 dager. Et 10 % fall i blodplate-telling ble også observert da blodplatene ble lagret i plasma. Ved anvendelse av fase-mikroskopi fremgikk det at blodplater lagret i Ringers-citrat-mediet med fosfat og glutamin var for det meste skiveformet og hadde intakt intern struktur ved dager 3 og 5. Prosent svellede blodplater med intern desintegrering (ballongformer) var i området 5-10 %, ved 5 dagers lagring. Disse subjektive inntrykk var reflektert i objektive målinger av graden av blodplateform-endring (VI) og dispersjon av Coulter-størrelsesfordeling (tabell VII). The morphology of the platelets when stored in Ringer's citrate medium supplemented with phosphate and glutamine was well preserved at days 3 and 5. Some platelet coagulation was prominent at day 5. This was reflected in a 10% decrease in platelet count at that time (table V). This phenomenon progressed as storage continued beyond 5 days. A 10% drop in platelet count was also observed when the platelets were stored in plasma. Using phase microscopy, it appeared that platelets stored in Ringer's citrate medium with phosphate and glutamine were mostly disc-shaped and had intact internal structure at days 3 and 5. The percentage of swollen platelets with internal disintegration (balloon shapes) was in the range of 5 -10%, for 5 days of storage. These subjective impressions were reflected in objective measurements of the degree of platelet shape change (VI) and dispersion of the Coulter size distribution (Table VII).

I tidligere studier er opprettholdelse av in vivo-levedyktighet blitt observert når dispersjonen er under 2,0 og når graden av formendring er over 1,08, se Blood 60(1):194-200 og Blood 52(2):425-435. I de her beskrevne forsøk var dispersjons-målingene under 2,0, og graden av formendring var nær 1,10 ved dager 3 og 5 da blodplatene ble lagret i Ringers-citrat-medium med fosfat og glutamin. In previous studies, maintenance of in vivo viability has been observed when the dispersion is below 2.0 and when the degree of shape change is above 1.08, see Blood 60(1):194-200 and Blood 52(2):425-435 . In the experiments described here, the dispersion measurements were below 2.0, and the degree of shape change was close to 1.10 on days 3 and 5 when the platelets were stored in Ringer's citrate medium with phosphate and glutamine.

Visse av de ovenfor identifiserte forsøk ble gjentatt under anvendelse av en annen sats av blodplate-knapper. De resterende mengder av plasma i denne gruppe varierte igjen fra 4 til 15 ml. Under disse tester viste det seg at det kan ha vært gjort en feil med hensyn til å beregne konsentrasjonen av fosfat som ble anvendt i de tidligere tester. Som rapportert ovenfor, menes det nå at de ovenfor beskrevne tester ble utført med 8 mekv/1 av fosfat (ikke 50 mekv/1 som tidligere angitt i hovedsøknaden). Certain of the experiments identified above were repeated using a different batch of platelet buttons. The remaining amounts of plasma in this group again varied from 4 to 15 ml. During these tests it turned out that an error may have been made with regard to calculating the concentration of phosphate used in the previous tests. As reported above, it is now believed that the tests described above were carried out with 8 meq/1 of phosphate (not 50 meq/1 as previously stated in the main application).

De følgende tester ble utført som beskrevet ovenfor, med unntagelse av at hver prøve ble observert enten på dag 7 eller dag 8. Som man kan se av de følgende data, bekrefter disse studier de tidligere resultater. Det skal bemerkes under denne spesielle testserie ble pH-verdien med anvendelse av et Ringers-citrat-medium ikke observert å falle under 6,2, men snarere til ca. 6,5, for deretter å stige i påfølgende observasjoner. Allikevel bekrefter disse studier ønskeligheten av å anvende tilsetning av fosfat til Ringers-citrat-løsningen for å opprettholde mediets pH-verdi vesentlig over de nevnte verdier, og bekrefter videre at tilsetningene av glukose, med eller uten fosfat, faller til uakseptabelt lave pH-verdier. The following tests were performed as described above, with the exception that each sample was observed on either day 7 or day 8. As can be seen from the following data, these studies confirm the previous results. It should be noted that during this particular series of tests, the pH using a Ringers citrate medium was not observed to fall below 6.2, but rather to about 6.5, then rising in subsequent observations. Nevertheless, these studies confirm the desirability of using the addition of phosphate to the Ringers-citrate solution to maintain the medium's pH significantly above the mentioned values, and further confirm that the additions of glucose, with or without phosphate, drop to unacceptably low pH values .

Det er således vist at blodplater kan lagres i minst 5 It has thus been shown that platelets can be stored for at least 5

dager i kunstig medium med opprettholdelse av tilfredstillende pH-verdi, oksygenforbruk og morfologi. Disse oppdagelser stemmer overens méd in vivo-levedyktighet og klinisk effektivi-tet slik det er forutsagt ved hjelp av opprettholdt morfologi, days in an artificial medium with the maintenance of a satisfactory pH value, oxygen consumption and morphology. These findings are consistent with in vivo viability and clinical efficacy as predicted by maintained morphology,

se Blood 60(1):194-200; Transfusion 15(5):414-421 og Blood 52(2):425-435. Nødvendigheten av å tilsette en puffer til Ringers-citrat-mediet for å forhindre fall i pH-verdien er see Blood 60(1):194-200; Transfusion 15(5):414-421 and Blood 52(2):425-435. The necessity of adding a buffer to the Ringers-citrate medium to prevent a drop in pH is

vist tydelig. Selv overensstemmelse med fremgangsmåtene i henhold til foreliggende oppfinnelse er det alltid rest-plasma i konsentratet. Det er ikke tilstrekkelig pufringskapasitet i dette rest-plasma til å forhindre pH-fall når glukosen i nevnte plasma omdannes til melkesyre, og det tilsatte citrat tilføyer ikke tilstrekkelig til pufringskapasiteten til mediet. Likeledes er fosfat-tilsetning ikke tilstrekkelig til å opprettholde pH-verdien hvis signifikante tilsetninger av glukose foretas til lagringsmediet, siden slike tilsetninger vil redusere i ytterligere melkesyre-produksjon. shown clearly. Even in accordance with the methods according to the present invention, there is always residual plasma in the concentrate. There is insufficient buffering capacity in this residual plasma to prevent a pH drop when the glucose in said plasma is converted to lactic acid, and the added citrate does not add enough to the buffering capacity of the medium. Likewise, phosphate addition is not sufficient to maintain the pH value if significant additions of glucose are made to the storage medium, since such additions will reduce further lactic acid production.

Glukose er derfor ikke valgt som det primære substrat for blodplate-metabolisme. I stedet er det metaboliske behov hos hver celle blitt tilfredsstilt ved endogene eller eksogene aminosyrer eller fettsyrer som tjener som substrat for oksydativ fosforylering. Våre oppdagelser antyder at blodplater fra mennesker kan holdes i fravær av sukker, akkurat som Wice et al og andre har vist at visse vevkultur-celler, for eksempel HeLa-celler, kan dyrkes med glutamin som hovedenergikilde, se Wice et al, "The Continuous Growth of Vetebrate Cells in the Absence of Sugar", Journal of Biological Chemistry, 256 (15) :7812-7819 (1981); og Reitzer et al, "Evidence that Glutamine, Not Sugar, is the Major Energy Source for Cultured HeLa Cells", Journal of Biological Chemistry, 254 (8):2669-2676 (1979). Glucose is therefore not chosen as the primary substrate for platelet metabolism. Instead, the metabolic needs of each cell have been satisfied by endogenous or exogenous amino acids or fatty acids that serve as substrates for oxidative phosphorylation. Our findings suggest that human platelets can be maintained in the absence of sugar, just as Wice et al and others have shown that certain tissue culture cells, such as HeLa cells, can be grown with glutamine as the main energy source, see Wice et al, "The Continuous Growth of Vertebrate Cells in the Absence of Sugar", Journal of Biological Chemistry, 256 (15):7812-7819 (1981); and Reitzer et al, "Evidence that Glutamine, Not Sugar, is the Major Energy Source for Cultured HeLa Cells", Journal of Biological Chemistry, 254 (8):2669-2676 (1979).

Som vist ovenfor, synes blodplater å ha evne til å gjennom-gå oksydativ metabolisme selv i fravær av sukker. Etter at all glukose er blitt metabolisert i løpet av de første 3 dager av lagringen opprettholdt blodplatene morfologi og fortsatt oksygen-forbruk i ytterligere 4 dager når glutamin var til stede for å komme inn i sitronsyre-syklusen. Det er også overraskende at morfologi og oksygen-forbruk ble opprettholdt til en betydelig grad når glutamin ble utelatt fra Ringers-citrat-fosfat-mediet. Hvis de litteratur-rapporter som antyder at citrat ikke kan anvendes som et eksogent substrat aksepteres, ville det frem-gå at endogene substrater ble anvendt av blodplatene under lagring. As shown above, platelets appear to have the ability to undergo oxidative metabolism even in the absence of sugar. After all glucose has been metabolized during the first 3 days of storage, platelets maintained morphology and continued oxygen consumption for an additional 4 days when glutamine was present to enter the citric acid cycle. It is also surprising that morphology and oxygen consumption were maintained to a significant degree when glutamine was omitted from the Ringers-citrate-phosphate medium. If the literature reports which suggest that citrate cannot be used as an exogenous substrate are accepted, it would appear that endogenous substrates were used by the platelets during storage.

Av ovenstående vil man se at flere nye syntetiske lagrings-medier for blodplater fra mennesker kan anvendes ved en ny fremgangsmåte for forarbeidelse og lagring av blodplater fra mennesker i oksygen-gjennomtrengelige beholdere ved ca. 22°C. Anvendelse av disse materialer og fremgangsmåter skulle resultere i vesentlige besparelser av naturlig plasma som for tiden benyttes til konservering av blodplater under lagring. Det forventes videre at anvendelse av de her beskrevne materialer og fremgangsmåter vil vesentlig redusere sannsynligheten for at sykdom vil bli overført i stor grad via blodplate-transfusjoner. From the above, it will be seen that several new synthetic storage media for human platelets can be used in a new method for processing and storing human platelets in oxygen-permeable containers at approx. 22°C. Application of these materials and methods should result in substantial savings of natural plasma which is currently used for the preservation of platelets during storage. It is further expected that the use of the materials and methods described here will significantly reduce the likelihood that disease will be transmitted to a large extent via platelet transfusions.

Claims

1. Synthetic storage medium for platelets from humans, characterized in that it is glucose-free and contains 170-180 meq/1 sodium; 2-5 meq/1 potassium; 2-5 meq/1 calcium; 110-125 meq/1 chloride; 15-25 meq/1 citrate; and a buffer effective to maintain the pH of a unit of platelets and optionally a platelet-permeable, non-glycotic substrate for oxidative phosphorylation, and no more than 15 ml of associated plasma per 60 ml of said medium with a pH value greater than 6.2 after 7 days of storage in an oxygen-permeable container kept at 20-24°C.

2. Synthetic storage medium for platelets from humans according to claim 1, characterized in that the non-glycolytic substrate is glutamine.

3. Synthetic storage medium as stated in claim 1, characterized in that the non-glycolytic substrate for oxidative phosphorylation is selected from the group consisting of oxaloacetate, malate, fumarate, oxalosuccinate, isocitrate, cis-aconitate, glutamine, amino acid precursors of citric acid cycle intermediates, amino and fatty acid precursors of acetyl-CoA, as well as mixtures thereof.

4. Method for producing a synthetic storage medium for human platelets, obtained from a platelet concentrate comprising platelets in blood plasma, to maintain a viability of 3-7 days, characterized by (a) separating supernatant plasma from said concentrate so that 1-15 ml of plasma remain per unit of platelets so that a platelet button is produced, (b) adding a buffered Ringer's citrate solution and optionally a non-glycolytic substrate for oxidative phosphorylation to said platelet button, the amount of said addition being regulated so that it is produced a concentration of glucose in said synthetic suspension at the start of storage of less than 10 mM/1, (c) agitating said solution to resuspend said platelets, and (d) storing said suspension in an oxygen-permeable container maintained at temperatures in the 20-24'C range until it is needed.

5. Procedure as stated in claim 4, characterized in that glutamine is used as substrate, in an amount of 5-25 mM/1.

6. Procedure as stated in claim 1, characterized in that the amount of supernatant plasma remaining after the separation in step (a) and the amount of solution added in step (b) are regulated to produce a concentration of glucose in such suspension at the start of storage of 5 mM/1 .

7. Procedure as stated in claim 1, characterized in that step (a) includes leaving 4-15 ml of plasma per unit of platelets.