NO157982B

NO157982B - PROCEDURE FOR PURIFICATION OF PURIFIED ALUMINUM BY FRACTURED CRYSTALLIZATION.

Info

Publication number: NO157982B
Application number: NO793930A
Authority: NO
Inventors: Robert Kimball Dawless; Robert Ernest Graziano; Arthur Angelo Bonarett
Original assignee: Aluminum Co Of America
Priority date: 1978-12-26
Filing date: 1979-12-03
Publication date: 1988-03-14
Also published as: FR2445381A1; NZ192417A; US4221590A; IT7951157A0; GB2041007B; GB2041007A; CH642999A5; CA1121604A; NL7909256A; NO157982C; DE2951706A1; AU521857B2; JPS5812328B2; FR2445381B1; NO793930L; IT1164030B; JPS5589439A; AU4902579A

Description

Fremgangsmåte for biosyntetisk fremstilling Procedure for biosynthetic production

av prostaglandiner og beslektede hydroksy-karboksylsyrer. of prostaglandins and related hydroxy-carboxylic acids.

Forelkggende oppfinnelse vedrører en biosyntetisk fremgangsmåte for fremstilling av prostaglandiner og beslektede tera-peutisk virkende hydroksy-karboksylsyrer. The present invention relates to a biosynthetic method for the production of prostaglandins and related therapeutically active hydroxycarboxylic acids.

I den seminale væske fra mennesker og mange dyr er hydroksykarboksylsyrer med farmakodynamiske effekter, som f.eks. hypertensiv eller hypotensiv aktivitet, og en mild muskelstimule-rende aktivitet blitt påvist. Det aktive prinsipp - kalt prostaglandin - viste seg å være tilstede i et antall genitale organer, særlig i prostatakjertler (glandulae vesicalis og ampuILae ductus), men også i andre organer, som f.eks. thymus, iris og lunger. Vesikulære kjertler fra får viste seg å være særlig ri-ke på prostaglandin, men også kjertler fra andre pattedyr viste seg å inneholde vesentlige mengder av prostaglandin. In the seminal fluid from humans and many animals are hydroxycarboxylic acids with pharmacodynamic effects, such as e.g. hypertensive or hypotensive activity, and a mild muscle-stimulating activity has been demonstrated. The active principle - called prostaglandin - was found to be present in a number of genital organs, especially in prostate glands (glandulae vesicalis and ampuILae ductus), but also in other organs, such as e.g. thymus, iris and lungs. Vesicular glands from sheep were found to be particularly rich in prostaglandin, but also glands from other mammals were found to contain significant amounts of prostaglandin.

Det aktive prinsipp, prostaglandinet, har vist seg å inneholde et antall av umettede ikke-aromatiske hydroksykarboksylsyrer som alle er beslektet med den følgende moder-karboksylsyre, 7-(2-oktylcyklopentyl)-heptansyre, som kalles prostansyre: De følgende prostaglandiner er blitt identifisert: Prostaglandin (PGE1) The active principle, the prostaglandin, has been shown to contain a number of unsaturated non-aromatic hydroxycarboxylic acids all of which are related to the following parent carboxylic acid, 7-(2-octylcyclopentyl)heptanoic acid, which is called prostanic acid: The following prostaglandins have been identified : Prostaglandin (PGE1)

lia,15-dihydroksy-9-keto-prost-13-ensyre. 11a,15-dihydroxy-9-keto-prost-13-enoic acid.

Prostaglandin E2 (PGE2) Prostaglandin E2 (PGE2)

lia,15-dihydroksy-9-keto-prosta-5,13-diensyre. 11a,15-dihydroxy-9-keto-prosta-5,13-dienoic acid.

Prostaglandin E3 (PGE3) Prostaglandin E3 (PGE3)

H<3,15-dihydroksy-9-keto-prosta-5,13#17-triensyre. H<3,15-dihydroxy-9-keto-prosta-5,13#17-trienoic acid.

Prostaglandin F, (PGD-^) Prostaglandin F, (PGD-^)

9a,lla-15-trihydroksy-prost-13-ensyre. 9a,lla-15-trihydroxy-prost-13-enoic acid.

Prostaglandin F2a (<P>GF2a) Prostaglandin F2a (<P>GF2a)

9a, Ila,15-trihydroksy-prosta-5,13-diensyre. 9a, 11a,15-trihydroxy-prosta-5,13-dienoic acid.

PGE-^, PGE2' PGE3°9 PGEia v^Ger en sammentrekkende virkning i glatte muskler og en hypotensiv aktivitet, men i alminne-lighet har PGE2 vist seg å være den mest aktive forbindelse. PGE-^, PGE2' PGE3°9 PGEia v^Gives a contractile action in smooth muscles and a hypotensive activity, but in general PGE2 has been shown to be the most active compound.

Prostaglandiner er blitt isolert ved å ekstrahere patte-dyrs kjertelvev, særlig genitale kjertelvev, som f.eks. fra vesikulære kjertler. DBt har vist seg at utbyttet av prostaglandin fra disse kilder kunne økes ved tilsetning av små mengder rensemidler eller spesifikke enzymer, særlig slike med esterase-aktivitet. De økede utbytter ansees å frembringes ved desintegrering av cellemembraner eller ved å frigjøre prostaglandiner som er tilgjengelige i bundet form i vevet. Prostaglandins have been isolated by extracting mammalian glandular tissue, particularly genital glandular tissue, such as from vesicular glands. DBt has shown that the yield of prostaglandin from these sources could be increased by adding small amounts of cleaning agents or specific enzymes, especially those with esterase activity. The increased yields are thought to be produced by disintegration of cell membranes or by releasing prostaglandins that are available in bound form in the tissue.

Denne tilsetning av rensemidler eller spesifikke enzymer som forårsaker et forbedret ekstraksjonsutbytte, represente-rer imidlertid bare en forbedring ved gjenvinningen eller utvin-ningen av det tilstedeværende aktive prinsipp. However, this addition of cleaning agents or specific enzymes which cause an improved extraction yield only represents an improvement in the recovery or recovery of the active principle present.

Ved foreliggende oppfinnelse fremstilles prostaglandiner og beslektede hydroksy-karboksylsyrer ved hjelp av biosynte-tiske fremgangsmåter som er basert på tilsetningen av forløpere til animalsk vev eller aktive fraksjoner herav som er i stand til å syntetisere prostaglandiner eller beslektede hydroksykarboksylsyrer fra disse forløpere. In the present invention, prostaglandins and related hydroxycarboxylic acids are produced using biosynthetic methods which are based on the addition of precursors to animal tissue or active fractions thereof which are capable of synthesizing prostaglandins or related hydroxycarboxylic acids from these precursors.

Foreliggende oppfinnelse går således ut på en fremgangsmåte for biosyntetisk fremstilling av prostaglandiner og beslektede hydroksykarboksylsyrer, og fremgangsmåten er karakterisert ved at fettsyrer med tilstedeværende dobbeltbindinger i cis-konfigurasjon, såkalte alle cis-fettsyrer, og deres salter som har den generelle formel CH, - (CH„) - (CH=CH-CH_) - (CH„) - COOM, som inneholder 18 til 22, fortrinnsvis 20 karbonatomer i molekylet, og hvor M betyr hydrogen eller et alkalimetall, n betyr et helt tall fra 0 til 5, p betyr et helt tall fra 3 til 5 og q fra 0 til 8, inkuberes under aerobe forhold med et prostaglandin-syntetiserende enzymsystem fremstilt fra animalsk vev. The present invention is thus based on a method for the biosynthetic production of prostaglandins and related hydroxycarboxylic acids, and the method is characterized in that fatty acids with present double bonds in cis configuration, so-called all cis fatty acids, and their salts which have the general formula CH, - ( CH„) - (CH=CH-CH_) - (CH„) - COOM, containing 18 to 22, preferably 20 carbon atoms in the molecule, and where M means hydrogen or an alkali metal, n means an integer from 0 to 5, p means an integer from 3 to 5 and q from 0 to 8, is incubated under aerobic conditions with a prostaglandin-synthesizing enzyme system prepared from animal tissue.

Oppfinnelsen omfatter således fremstillingen av prostaglandiner og beslektede hydroksykarboksylsyrer ved omdannelse av visse fettsyrer, eller deres salter som er for-løperforbindelsene ved tilsetning av et prostaglandin-syntetiserende enzym fra ani-malske organer som f.eks. genitale kjertler, thymus, iris og lunger, innvoller eller tarmer, bukspyttkjertler, adrenaler og hjer-ne eller aktive fraksjoner herav, som f.eks» væskeandelen av et vannholdig homogenisat og cellefraksjoner. Omdannelsen bevirkes ved hjelp av de enzymsystemer som er tilgjengelige fra disse organer. The invention thus encompasses the production of prostaglandins and related hydroxycarboxylic acids by converting certain fatty acids, or their salts which are the precursor compounds by adding a prostaglandin-synthesizing enzyme from animal organs such as e.g. genital glands, thymus, iris and lungs, viscera or intestines, pancreas, adrenals and brain or active fractions thereof, such as the liquid portion of an aqueous homogenate and cell fractions. The conversion is effected with the aid of the enzyme systems available from these organs.

Et formål for foreliggende oppfinnelse er således omdannelsen av nevnte fettsyrer til prostaglandiner ved behandling av disse fettsyrer eller deres salter med homogenisater eller skiver av de ovennevnte organer, som f.eks. genitale kjønnsorga-ner og mere spesielt vesikulære kjertler fra. får under fysiolo-giske eller subfysiologiske forhold. An object of the present invention is thus the conversion of said fatty acids into prostaglandins by treating these fatty acids or their salts with homogenates or slices of the above-mentioned organs, such as e.g. genital organs and more particularly vesicular glands from. obtained under physiological or sub-physiological conditions.

Fettsyrene og deres salter som er nevnt ovenfor, omfatter en gruppe som er kjent som essentielle fettsyrer, da disse er nødvendige for mennesker og forskjellige dyr i disses diet, fordi de ikke kan syntetiseres i organismen og mangelsymptomer vil utvikles ved fravær av disse stoffer» Med hensyn til den kjemiske struktur av disse fettsyrer er det blitt påvist at de The fatty acids and their salts mentioned above comprise a group known as essential fatty acids, as these are necessary for humans and various animals in their diet, because they cannot be synthesized in the organism and deficiency symptoms will develop in the absence of these substances" With With regard to the chemical structure of these fatty acids, it has been demonstrated that they

er i besittelse av et såkalt "oversprunget dobbeltbindingssystem", hvor i det minste to cis-etyleniske dobbeltbindinger er tilstede, og i de for-løpere med hvilke det er oppnådd de beste resultater, har alle etyleniske dobbeltbindinger cis-konfigurasjon. Ved ut-trykket oversprunget dobbeltbindingssystem forståes et system av etyleniske dobbeltbindinger som er gjensidig adskilt fra hverand-re med en metylengruppe. is in possession of a so-called "skipped double bond system", where at least two cis-ethylenic double bonds are present, and in the precursors with which the best results have been obtained, all ethylenic double bonds have the cis configuration. The term "skipped double bond system" means a system of ethylenic double bonds which are mutually separated from each other by a methylene group.

Viktige syrer og deres derivater som kan anvendes for biosyntesen som utføres på den nevnte måte, og som skal beskrives nærmere i det følgende, omfatter essentielle fettsyrer somt Important acids and their derivatives which can be used for the biosynthesis carried out in the aforementioned manner, and which will be described in more detail below, include essential fatty acids such as

Homo-^-linolensyre (all-cis-eicosa-8,11-14-triensyre) Homo-^-linolenic acid (all-cis-eicosa-8,11-14-trienoic acid)

Arachidonsyre (all-cis-eicosa-5,8,11,14-tetraensyre) såvel som såkalte all-cis-syrer av lignende sammensetning, så som: All-cis-eicosa-5,8,11,14-17-pentaensyre All-cis-nonadeca-7,10,13-triensyre Arachidonic acid (all-cis-eicosa-5,8,11,14-tetraenoic acid) as well as so-called all-cis-acids of similar composition, such as: All-cis-eicosa-5,8,11,14-17-pentaenoic acid All-cis-nonadeca-7,10,13-trienoic acid

All-cis-nonadeca-4,7,10,13-tetraensyre. All-cis-nonadeca-4,7,10,13-tetraenoic acid.

Skjønt forskjellige essentielle fettsyrer er blitt kjent,og de mangelsykdommer som forårsakes ved deres fravær er Although various essential fatty acids have become known, and the deficiency diseases caused by their absence are

o o

blitt beskrevet i utstrakt grad, så kjenner man ikke deres nøy-aktige funksjon. I betraktning av de forsøk som er beskrevet nedenfor, kan det antas at en av funksjonene av de essentielle fettsyrer er deres virkning som for-løpere for den hormonlignen-de substans PGE» Således virker homo-^-1 i no lens yre som en for-lø-per for PGE2 og PGF^, og arachidonsyren virker som en for-løper for PGE2 og PGF2a/ mens eicosa-5,8,11,14-17-pentaensyre (en ikke-essentiell fettsyre) virker som en for-løper for PGE3 og PGF^ • Den kjensgjerning at PGE2 er langt mer biologisk aktiv enn PGE3 tyder på at i organismen virker de essentielle fettsyrer som en for-løperkilde av vesentlig betydning for prostaglandinene. have been described extensively, their exact function is not known. In view of the experiments described below, it can be assumed that one of the functions of the essential fatty acids is their action as precursors for the hormone-like substance PGE." Thus, homo-^-1 in the kidney acts as a -runs for PGE2 and PGF^, and the arachidonic acid acts as a precursor for PGE2 and PGF2a/ while eicosa-5,8,11,14-17-pentaenoic acid (a non-essential fatty acid) acts as a precursor for PGE3 and PGF^ • The fact that PGE2 is far more biologically active than PGE3 indicates that in the organism the essential fatty acids act as a precursor source of significant importance for the prostaglandins.

Det har vist seg fordelaktig å utføre omdannelsen av fettsyrene eller deres derivater ved en temperatur som fortrinnsvis ligger mellom 10 og 60°C,i en pufferoppløsning med en pH-verdi fra 4 til 10, fortrinnsvis fra 7 til 9, og det har også vist seg at utbyttet kan økes ytterligere ved tilsetning av forskjellige salter, sukkerarter (f.eks. glukose), proteiner (f. It has proven advantageous to carry out the conversion of the fatty acids or their derivatives at a temperature which is preferably between 10 and 60°C, in a buffer solution with a pH value of from 4 to 10, preferably from 7 to 9, and it has also shown say that the yield can be further increased by adding different salts, sugars (e.g. glucose), proteins (e.g.

eks. albumin), aminosyrer, vitaminer, ko-enzymer, visse kofakto-rer som glutathion (gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycin) og antioksydanter slik som propylgallat. Generelt lar man for-løper-materialet og de friske organer eller preparater herav få anled-ning til å reagere i tidsperioder mellom flere minutter og flere timer, og fortrinnsvis i en periode fra 15 til 180 minutter. Som foran nevnt arbeides det under aerobe betingelser, og fortrinnsvis ledes gjennom reaksjonsblandingen en oksygeninneholden-de gass. Ved omdannelse av store mengder av substrater, som f. eks. de nevnte essentielle fettsyrer, anvendes forsøket som er beskrevet i nedenstående eksempel 1, for å bestemme den optimale mengde av for-løpersubstrat som skal tilsettes pr. enhet av massen av friske organer. For dette formål tilsettes forskjellige konsentrasjoner av substrat til en bestemt mengde av friske e.g. albumin), amino acids, vitamins, co-enzymes, certain cofactors such as glutathione (gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine) and antioxidants such as propyl gallate. In general, the precursor material and the healthy organs or preparations thereof are allowed to react for periods of time between several minutes and several hours, and preferably for a period of from 15 to 180 minutes. As mentioned above, work is carried out under aerobic conditions, and an oxygen-containing gas is preferably passed through the reaction mixture. When converting large amounts of substrates, such as e.g. the aforementioned essential fatty acids, the experiment described in example 1 below is used to determine the optimal amount of precursor substrate to be added per unit of the mass of healthy organs. For this purpose, different concentrations of substrate are added to a certain amount of fresh

organer eller preparater herav, og prøver tappes av ved forskjellige tidspunkter. Det er å foretrekke å anvende de hele homogeni-serte organer, selv om aktive fraksjoner kan oppnås ved differen-tiell sentrifugering. Separering ved sentrifugering av homogeni-serte organer i en væskedel og en utfelling gir ikke alltid ønskede aktive fraksjoner. Fra de erholdte data vedrørende omdannel-sesutbyttet kan de optimale reaksjonsforhold fastslås, som da anvendes ved fremstillingene med ikke-radioaktive materialer. Ved disse forsøk kan de kjente fremgangsmåter (såsom bestemmelsen av det ultrafiolette absorpsjonsspektrum ved 278 eller 280 millimikron før og efter tilsetningen av natriumhydroksyd) anvendes for bestemmelsen av mengden av dannete prostaglandiner. organs or preparations thereof, and samples are withdrawn at different times. It is preferable to use the whole homogenized organs, although active fractions can be obtained by differential centrifugation. Separation by centrifugation of homogenized organs in a liquid part and a precipitate does not always give the desired active fractions. From the data obtained regarding the conversion yield, the optimal reaction conditions can be determined, which are then used in the productions with non-radioactive materials. In these experiments, the known methods (such as the determination of the ultraviolet absorption spectrum at 278 or 280 millimicrons before and after the addition of sodium hydroxide) can be used for the determination of the amount of prostaglandins formed.

Det har også vist seg at det oppnås særlig gode utbytter hvis det anvendes et vektforhold av polyen-fettsyre til friske organer av fra 1:1000 til 1:4000, og fortrinnsvis fra 1:2000 til 1:3000. It has also been shown that particularly good yields are obtained if a weight ratio of polyene fatty acid to healthy organs of from 1:1000 to 1:4000, and preferably from 1:2000 to 1:3000, is used.

Sammenlignet med utbyttene som oppnås fra kjertelvev fra pattedyr uten forhåndstilsetning av for-løperne, er utbyttene som oppnås ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen opp til 20 ganger så høye. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gjør det derfor mulig å fremstille prostaglandiner i en målestokk som er nødvendig for deres utnyttelse som terapeutiske midler. Compared to the yields obtained from glandular tissue from mammals without prior addition of the precursors, the yields obtained by the method according to the invention are up to 20 times as high. The method according to the invention therefore makes it possible to produce prostaglandins on a scale that is necessary for their utilization as therapeutic agents.

Biosyntesen i henhold til foreliggende oppfinnelse skal klargjøres ved de følgende eksempler. The biosynthesis according to the present invention shall be clarified by the following examples.

Eksempel I Example I

A. Fremstilling av utgangsmateriale. A. Preparation of starting material.

Metylesteren av all-cis-eicosa-5,8,11,14-tetraynsyre ble redusert med tritiuminneholdende hydrogengass over Lindlars katalysator. Efter rensing med tynt-lag-kromatografi (i det • følgende betegnet som TLK) og forsåpning på vanlig måte, fikk man tritiuminneholdende arachidonsyre med en spesifikk radioak-_2 The methyl ester of all-cis-eicosa-5,8,11,14-tetraynoic acid was reduced with tritium-containing hydrogen gas over Lindlar's catalyst. After purification by thin-layer chromatography (hereinafter referred to as TLK) and saponification in the usual way, tritium-containing arachidonic acid was obtained with a specific radioac-_2

tivitet av 0,91 x 10 milli-Curie (mC) pr. mg. Prøven ble utsatt for gasskromatografisk analyse og viste seg å være 95,6% ren. Det infrarøde absorpsjonsspektrum viste at det ikke var tilstede mer enn 3% trans-figurasjon, og ved hjelp av ultrafiolett absorpsjonsspektrum kunne det ikke oppdages noen konjugering. tivity of 0.91 x 10 milli-Curie (mC) per mg. The sample was subjected to gas chromatographic analysis and proved to be 95.6% pure. The infrared absorption spectrum showed that no more than 3% trans-figuration was present, and by means of the ultraviolet absorption spectrum no conjugation could be detected.

B. 1 mg av tritiuminneholdende arachidonsyre med en aktivitet av 4,1 x 10 tellinger pr. minutt (tpm)(tellingseffektivitet 20,7%) i 20 ml 0,15 molar kaliumfosfatpuffer med en pH = 7,5, ble inkubert i forskjellige perioder ved 37°C med 20 g vesikulære kjertler fra får, som var oppsamlet like efter slaktingen, lag-ret i 1 uke på tørr is og malt i frossen tilstand. B. 1 mg of tritium-containing arachidonic acid with an activity of 4.1 x 10 counts per minute (rpm) (counting efficiency 20.7%) in 20 ml of 0.15 molar potassium phosphate buffer with a pH = 7.5, were incubated for different periods at 37°C with 20 g of vesicular glands from sheep, which had been collected immediately after slaughter , stored for 1 week on dry ice and ground in a frozen state.

I dette og de følgende eksempler ble inkuberingen ut-ført ved den vanlige fremgangsmåte med langsom rysting av reaksjonsblandingen i et kar som var åpent like overfor luften i et apparat som termostatisk ble holdt ved den ønskede inkubasjons-temperatur. In this and the following examples, the incubation was carried out by the usual method with slow shaking of the reaction mixture in a vessel that was open to the air in an apparatus that was thermostatically kept at the desired incubation temperature.

Efter inkuberingen ble det tilsatt 160 ml 96% vandig etanol som inneholdt 15 ml normal saltsyre pr. liter, og prostaglandiner ble isolert ved følgende fremgangsmåte: Efter tilsetningen av den ansyrede etanol lot man opp-usningen stå over natten. Derefter ble oppløsningen filtrert, hvorved man fikk et filtrat og et residuum. Filtreringsresten ble vasket to ganger med ansyret etanol. Filtratet og vaskevæs-ken ble forenet og konsentrert i vakuum under 40°C til omtrent 1/5 av det opprinnelige volum. Det rå-konsentrat som man fikk, ble ansyret med 6-normalsaltsyre til en pH = 3, og derefter ekstrahert tre ganger med ren eter. Eterekstraktene ble forenet og vasket med vann inntil nøytral reaksjon. Ekstraktene som var behandlet på denne måte, ble tørket med natriumsulfat og inndampet til tørrhet i vakuum. Resten ble utsatt for en tretrinns motstrømsfordeling mellom like volumer 66% metanol og lettbensin. 1/20 av materialet (A) som man fikk i den vandige fase efter tretrinns-fordelingen mellom 66% etanol og lettbensin, ble utsatt for (TLK) (tynnskiktkromatografi) på kiselsyregel (G; ex Merck) med oppløsningsmiddelsystemet benzentdioksameddiksyre (20:20:1). Flekker ble gjort synlige ved jodreaksjon, særskilt skrapt av platen efter avdampning av jod og fortynnet med metanol. Metanolen ble inndampet og radioaktiviteten målt med et Packard "Tricarb"-spektrometer. Tabell I viser fordelingen av radioaktiviteten over kromatogrammene efter 5, 15 og 30 minutters inkubering. Fra denne tabell vil det sees at radioaktiviteten efter 30 minutter er blitt utviklet nesten fullstendig innenfor området av RF-verdier mellom 0,50 og 0,62, hvilket område omfatter en saiti-menligningsprøve av ren PGE. After the incubation, 160 ml of 96% aqueous ethanol containing 15 ml of normal hydrochloric acid per litres, and prostaglandins were isolated by the following procedure: After the addition of the anoxylated ethanol, the mixture was allowed to stand overnight. The solution was then filtered, whereby a filtrate and a residue were obtained. The filter residue was washed twice with anoxylated ethanol. The filtrate and washings were combined and concentrated in vacuo below 40°C to approximately 1/5 of the original volume. The crude concentrate obtained was acidified with 6-normal hydrochloric acid to a pH = 3, and then extracted three times with pure ether. The ether extracts were combined and washed with water until neutral reaction. The extracts thus treated were dried with sodium sulfate and evaporated to dryness in vacuo. The remainder was subjected to a three-stage countercurrent distribution between equal volumes of 66% methanol and light petrol. 1/20 of the material (A) obtained in the aqueous phase after the three-step distribution between 66% ethanol and light petrol was subjected to (TLK) (thin layer chromatography) on silica gel (G; ex Merck) with the solvent system benzenedioxaacetic acid (20:20 :1). Spots were made visible by iodine reaction, specially scraped from the plate after evaporation of iodine and diluted with methanol. The methanol was evaporated and the radioactivity measured with a Packard "Tricarb" spectrometer. Table I shows the distribution of the radioactivity over the chromatograms after 5, 15 and 30 minutes of incubation. From this table it will be seen that after 30 minutes the radioactivity has been developed almost completely within the range of RF values between 0.50 and 0.62, which range includes a saiti comparison sample of pure PGE.

En annen 1/20 mengde av materialet A ble utsatt for TLK slik som beskrevet ovenfor. Efter fordampning av metanol ble det tilsatt 2 ml vann, oppløsningen ble ansyret med normal saltsyre, Another 1/20 amount of material A was subjected to TLK as described above. After evaporation of methanol, 2 ml of water was added, the solution was acidified with normal hydrochloric acid,

og ekstrahert med to deler 2 ml eter. Eteren ble fjernet og resten oppløst i 5 ml av en vandig oppløsning som inneholdt 0,9 g/100 ml natriumklorid; 0,02 g/100 ml kaliumklorid; 0,02 g/100 ml kal-siumklorid; 0,01 g/100 ml magnesiumklorid; 0,1 g/100 ml glukose; 0,1 g/100 ml natriumhydrogenkarbbnat og 0,005 g/100 ml natriumdi-hydrogenfosfat. Den biologiske aktivitet ble undersøkt på marsvin-ileum og flekken med Rf 0,60, svarende til PGE, viste sterk aktivitet. and extracted with two portions of 2 ml of ether. The ether was removed and the residue dissolved in 5 ml of an aqueous solution containing 0.9 g/100 ml sodium chloride; 0.02 g/100 ml potassium chloride; 0.02 g/100 ml calcium chloride; 0.01 g/100 ml magnesium chloride; 0.1 g/100 ml glucose; 0.1 g/100 ml sodium bicarbonate and 0.005 g/100 ml sodium dihydrogen phosphate. The biological activity was examined on guinea pig ileum and the stain with Rf 0.60, corresponding to PGE, showed strong activity.

Fra en annen 1/20 av materialet A ble PGE isolert og påny utsatt for TLK, idet det nu ble anvendt kiselsyregel (G; ex Merck) impregnert med 10% sølvnitrat og under anvendelse av opp-løsningsmiddelsysternet etylacetat:eddiksyre:metanol:2,2,4-tri-metylpentan:vann (110:30:35:10:100). Efter fremkalling ble platen skåret opp i forskjellige soner som ble skrapt av, eluert med metanol og radioaktiviteten av disse ble målt. Resultatene av dette forsøk er oppført i tabell 2. From another 1/20 of the material A, PGE was isolated and re-exposed to TLK, now using silicic acid gel (G; ex Merck) impregnated with 10% silver nitrate and using the solvent esterified ethyl acetate:acetic acid:methanol:2, 2,4-trimethylpentane:water (110:30:35:10:100). After development, the plate was cut into different zones which were scraped off, eluted with methanol and the radioactivity of these was measured. The results of this experiment are listed in Table 2.

Den høyeste aktivitet ble funnet ved Rf 0,63, som sva-rer til PGE2- The highest activity was found at Rf 0.63, which corresponds to PGE2-

Disse resultater viser klart at arachidonsyre omdannes til PGE2/ som representeres av følgende reaksjonsskjerna: These results clearly show that arachidonic acid is converted to PGE2/ which is represented by the following reaction nucleus:

En løselig beregning beregnet bare på den radioaktivitet som fin-nes i PGE2/ viser at arachidonsyren er omdannet i det minste med 16% til PGE2- A soluble calculation calculated only on the radioactivity found in PGE2/ shows that the arachidonic acid is converted by at least 16% to PGE2-

Tar man i betraktning tap av materiale under isolerings-prosessen og det faktum at tritium bundet til karbonnummer 9 i arachidonsyren ganske sikkert fjernes fra molekylet, kan det slut-tes at den virkelige omdannelse her er ennu betydelig høyere. Taking into account the loss of material during the isolation process and the fact that the tritium bound to carbon number 9 in the arachidonic acid is quite certainly removed from the molecule, it can be concluded that the real conversion here is even significantly higher.

Eksempel 2 Example 2

0,5 g kaliumarachidonat, oppløst i 2 liter 0,1 mol kaliumfosfatpuffer (pH = 7,5), som inneholdt 5 g kvegserum-albumin, ble inkubert i 2 timer ved 37°C med væskeandelen av et homogenat som man fikk fra 1250 g friske vesikulære kjertler fra får. Denne væskeandel fikk man på følgende måte: De friske kjertler ble malt med 2,5 liter 0,1 mol kaliumfosfatpuffer (pH = 7,5), og det 0.5 g of potassium arachidonate, dissolved in 2 liters of 0.1 mol potassium phosphate buffer (pH = 7.5), containing 5 g of bovine serum albumin, was incubated for 2 hours at 37°C with the liquid portion of a homogenate obtained from 1250 g fresh sheep vesicular glands. This liquid proportion was obtained in the following way: The fresh glands were ground with 2.5 liters of 0.1 mol potassium phosphate buffer (pH = 7.5), and the

erholdte slam ble behandlet i en ultra-sentrifuge i 10 minutter ved 4000 x g ved 2°C. Væskeandelen ble avsifonert og residuet suspendert i 300 ml av den samme puffer og sentrifugert påny. Den resulterende væskeandel ble siffonert av og forenet med den annen del. Den totale opaliserende oppløsning inneholdt 50 g protein-materiale i hvilket det aktive enzymsystem var tilstede. Den totale mengde av prostaglandin E som var tilstede i dette preparat, var mindre enn 50 mg. sludges obtained were processed in an ultra-centrifuge for 10 minutes at 4000 x g at 2°C. The liquid portion was siphoned off and the residue suspended in 300 ml of the same buffer and centrifuged again. The resulting liquid portion was siphoned off and combined with the second portion. The total opalizing solution contained 50 g of protein material in which the active enzyme system was present. The total amount of prostaglandin E present in this preparation was less than 50 mg.

Efter inkuberingen ble tilsatt 15 liter 96% vandig etanol, ansyret med normal saltsyre til pH 4, og utfellingen ble filtrert fra. Oppløsningen ble konsentrert til ca. 1 liter ved destillasjon i vakuum ved en temperatur under 30°C. After the incubation, 15 liters of 96% aqueous ethanol were added, acidified with normal hydrochloric acid to pH 4, and the precipitate was filtered off. The solution was concentrated to approx. 1 liter by distillation in vacuum at a temperature below 30°C.

Residuet ble ekstrahert tre ganger med 500 ml ren eter. The residue was extracted three times with 500 ml of pure ether.

Efter tørkingen over natriumsulfat ble det eteriske ekstrakt inndampet til tørrhet og residuet på ca. 15 g ble fordelt mellom 750 ml vandig metanol og 750 ml lettbensin. After drying over sodium sulfate, the ethereal extract was evaporated to dryness and the residue of approx. 15 g was distributed between 750 ml of aqueous methanol and 750 ml of light petrol.

Den vandige fase ble inndampet til tørrhet i vakuum, og man fikk ca. 3 g av materialet. Dette materiale inneholdt ca. 340 mg prostaglandin The aqueous phase was evaporated to dryness in vacuum, and approx. 3 g of the material. This material contained approx. 340 mg of prostaglandin

Materialet ble renset ved kolonnekromatografi på kiselsyre som var aktivisert ved 115°C før bruken. Substansen ble opp-løst i etylacetat:benzen (30:70) og bragt på en kiselsyrekolonne (30 x 2 cm). Kolonnen ble vasket med etylacetattbenzen (30:70), hvorefter prostaglandin E ble eluert med etylacetat:benzen (60:40). PGE ble bestemt ved behandling av alikvot-deler av fraksjonene The material was purified by column chromatography on silicic acid which had been activated at 115°C before use. The substance was dissolved in ethyl acetate:benzene (30:70) and applied to a silicic acid column (30 x 2 cm). The column was washed with ethyl acetate:benzene (30:70), after which prostaglandin E was eluted with ethyl acetate:benzene (60:40). PGE was determined by processing aliquots of the fractions

ved 0,5 normal natriumhydroksydoppløsning i 50% vandig etanol, hvorefter absorpsjonen ble målt ved 278 millimikron. Efter 30 minutter ble , fraksjonene som inneholdt PGE forenet og inndampet i vakuum. Residuet ble renset ved kromatografi i deler av 1 g på en omvendt fasekolonne (bærerÆsilan-behandlet "HYFLO" supercel - /""HYFLO" supercel" er en diatomé-kiselsyre, som angitt i "Handbook of Material Trade Names" av Zimmerman og Lavine, supplement II, 1957, side II2.7, stasjonær fase: iso-oktanol-kloroform (:1), forholdet mellom den stasjonære fase og den bevegede fase 1:10). Pakkingen av kolonnen bestod av 22,5 g Support med 20 ml stasjonær fase. Utbyttet av praktisk talt rent prostaglandin erholdt at 0.5 normal sodium hydroxide solution in 50% aqueous ethanol, after which absorption was measured at 278 millimicrons. After 30 minutes, the fractions containing PGE were combined and evaporated in vacuo. The residue was purified by chromatography in 1 g portions on a reversed phase column (carrierÆsilan-treated "HYFLO" supercel - /""HYFLO" supercel" is a diatomaceous silicic acid, as stated in the "Handbook of Material Trade Names" by Zimmerman and Lavine , supplement II, 1957, page II2.7, stationary phase: iso-octanol-chloroform (:1), ratio of the stationary phase to the mobile phase 1:10). The packing of the column consisted of 22.5 g of Support with 20 ml of stationary phase. The yield of practically pure prostaglandin obtained

. på denne måte var 250 mg. . in this way was 250 mg.

Eksempel 3 Example 3

Eksempel 2 ble gjentatt, men nu anvendte man aom for-løpermateriale 0,5 g kaliumaalt av homo-y<*->linolensyre (all-cis-eicose-8,11-14-triensyre), som ble omdannet til prostaglandin E^. Det totale utbytte av prostaglandin E^ som man fikk, var 190 mg. Example 2 was repeated, but now 0.5 g of potassium aalt of homo-y<*->linolenic acid (all-cis-eicose-8,11-14-trienoic acid) was used as a precursor material, which was converted to prostaglandin E^ . The total yield of prostaglandin E₂ obtained was 190 mg.

Eksempel 4 Example 4

36 kg vesikulære kjertler av får ble homogenisert i små andeler med et totalvolum på 36 liter 0,1 M fosfatpuffer (pH = 7,5) i en hurtigløpende avkjølt homogenisator ved 0°C. 12 g homo-^-linolensyre ble oppløst i 12 liter 0,15 M glycinepuffer (pH = 9,0) . 3 literdeler av homogenisatet ble tilsatt til 25 liter glycinpuffer, som var blitt bragt til en temperatur av 75°C, i et rustfritt stålkar, og det ble tilsatt 0,5 liter av homo- ^-linolensyre-oppløsningen. Blandingen ble inkubert i 2^ time ved 37°C under omrøring og kontinuerlig gjennomføring av en strøm av oksygen. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 8 N I^SO^ inntil pH var lavere enn 3. På denne måte ble 24 satser inkubert. 36 kg of sheep vesicular glands were homogenized in small portions with a total volume of 36 liters of 0.1 M phosphate buffer (pH = 7.5) in a high-speed cooled homogenizer at 0°C. 12 g of homo-3-linolenic acid were dissolved in 12 liters of 0.15 M glycine buffer (pH = 9.0). 3 parts of the homogenise were added to 25 liters of glycine buffer, which had been brought to a temperature of 75°C, in a stainless steel vessel, and 0.5 liters of the homo-^-linolenic acid solution was added. The mixture was incubated for 2½ hours at 37°C with stirring and a continuous flow of oxygen. The reaction was stopped by the addition of 8 N I^SO^ until the pH was lower than 3. In this way, 24 batches were incubated.

Til reaksjonsblandingen ble tilsatt 240 liter 96% vandig etanol, og man lot den stå natten over» Væskeandelen ble de-kantert fra så godt som mulig og residuet ekstrahert to ganger påny med 120 liter 96% etanol. 240 liters of 96% aqueous ethanol were added to the reaction mixture, and it was left to stand overnight" The liquid portion was decanted from as well as possible and the residue extracted twice again with 120 liters of 96% ethanol.

De forenede alkoholekstrakter ble filtrert og konsentrert ved inndampning under vakuum ved 35°C. Til residuet ble tilsatt en lik volummengde vann og derefter ekstrahert tre ganger med dietyleter. The combined alcohol extracts were filtered and concentrated by evaporation under vacuum at 35°C. An equal volume of water was added to the residue and then extracted three times with diethyl ether.

Eterekstraktene ble forenet, vasket med destillert vann inntil vaskevannets pH-verdi var nesten nøytral og tørket med vannfast natriumsulfat. Hovedmengden av eteren, ble avdampet i vakuum. Residuet, som inneholdt ca. 7 g rå PGE^ i ca. 800 g lipid-materiale, ble kromatografert i andeler av 15-20 g på kolonner (diameter 5 cm) pakket med 150 g kiselsyre (Mallinckrodt 100 mesh analytisk reagent). The ether extracts were combined, washed with distilled water until the pH of the wash water was almost neutral and dried with anhydrous sodium sulfate. The bulk of the ether was evaporated in vacuo. The residue, which contained approx. 7 g raw PGE^ in approx. 800 g of lipid material was chromatographed in portions of 15-20 g on columns (diameter 5 cm) packed with 150 g of silicic acid (Mallinckrodt 100 mesh analytical reagent).

Fraksjonene som inneholdt prostaglandin E, ble eluert med kloroform som inneholdt 2-5% metanol, de ble forenet og re-kromatografert på samme måte. Derefter ble det på denne måte erholdte, fremdeles urene prostaglandin E renset ved kromatografi under anvendelse av det omvendte fasesystem som er beskrevet i eksempel 2. De PGE^-inneholdende fraksjoner ble forenet og opp-løsningene lot man fordampe i vakuum ved en temperatur under 35°C. Det gjenværende materiale ble omkrystallisert fra vandig metanol, og man fikk et utbytte av 4 g ren PGEj_, smeltepunkt 114°C. The fractions containing prostaglandin E were eluted with chloroform containing 2-5% methanol, they were combined and re-chromatographed in the same way. Then the still impure prostaglandin E obtained in this way was purified by chromatography using the reversed phase system described in example 2. The PGE^-containing fractions were combined and the solutions were allowed to evaporate in vacuo at a temperature below 35 °C. The remaining material was recrystallized from aqueous methanol, and a yield of 4 g of pure PGEj_, melting point 114°C, was obtained.

Eksempel 5 Example 5

Vesikulære fårekjertler (250 g) ble homogenisert med 600 ml 0,1 M trikaliumfosfat (pH =7,1) i en hurtigløpende avkjølt homogenisator i løpet av 30 sekunder ved 0°C. Hompgenisatet ble derefter sentrifugert i 10 minutter ved 4000 x g, og væskeandelen ble påny utsatt for en sentrifugering under de samme betingelser. Den grumsete oppløsning man fikk, ble nu sentrifugert i 60 min. ved ca. 100 000 x g. Vesicular sheep glands (250 g) were homogenized with 600 ml of 0.1 M tripotassium phosphate (pH =7.1) in a high-speed cooled homogenizer during 30 seconds at 0°C. The hop genizate was then centrifuged for 10 minutes at 4000 x g, and the liquid portion was again subjected to a centrifugation under the same conditions. The cloudy solution obtained was now centrifuged for 60 min. at approx. 100,000 x g.

Utfelningen ble omrørt med 200 ml puffer pH = 8,0, som inneholdt 0,01 M trikaliumfosfat, 0,001 M dinatriumdihydrogen-etylendiamintetraacetat og 0,001 M cystein, og påny utfelt i 60 minutter ved 100 000 x g. Den vaskede, partikkelformede fraksjon inneholdt ca. 1,9 g protein og bare 1,6 mg prostaglandin E. Den ble suspendert i 100 ml 0,1 M trikaliumfosfat pH = 8,0, og derefter inkubert i 5 minutter ved 30°C med en 0,2 M tris-(hydroksyme-tyl)-aminometan.HCl-puffer (pH = 8,0)-oppløsning som inneholdt 200 mg homo- A-linolensyre, 500 mg redusert glutathion og 75 mg propylgallat. Inkuberingen ble avbrutt ved tilsetning av 0,2 M sitronsyreoppløsning inntil en pH av 3,5 var nådd (ca. 150 ml). Den ansyrede blanding ble ekstrahert to ganger med en lik volummengde dietyleter. I det eteriske ekstrakt var det tilstede 158 mg (67%) prostaglandin E^. The precipitate was stirred with 200 ml of buffer pH = 8.0, containing 0.01 M tripotassium phosphate, 0.001 M disodium dihydrogen-ethylenediaminetetraacetate and 0.001 M cysteine, and precipitated again for 60 minutes at 100,000 x g. The washed, particulate fraction contained approx. . 1.9 g of protein and only 1.6 mg of prostaglandin E. It was suspended in 100 ml of 0.1 M tripotassium phosphate pH = 8.0, and then incubated for 5 minutes at 30°C with a 0.2 M tris-( hydroxymethyl)-aminomethane.HCl buffer (pH = 8.0) solution containing 200 mg of homo-A-linolenic acid, 500 mg of reduced glutathione and 75 mg of propyl gallate. The incubation was interrupted by the addition of 0.2 M citric acid solution until a pH of 3.5 was reached (approx. 150 ml). The acidified mixture was extracted twice with an equal volume of diethyl ether. In the ethereal extract 158 mg (67%) of prostaglandin E^ was present.

Uten tilsetning av propylgallat til inkuberingsblandin-gen fikk man 54 mg (23%) PGE, mens sløyfing av glutathion resul-terte i et utbytte av bare 19 mg (8%). Without the addition of propyl gallate to the incubation mixture, 54 mg (23%) of PGE was obtained, while omitting glutathione resulted in a yield of only 19 mg (8%).

Eksempel 6 Example 6

400 g vesikulære kjertler fra får ble homogenisert med 400 ml vann i en hurtigløpende avkjølt homogenisator og videre fortynnet med 800 ml equa dest. Alle prosesser ble utført ved 0°C. I små andeler ble tilsatt 200 ml (våtvolum) "DOWEX" anionutvekslingsharpiks A.G. 1-X2, 50-100 mesh (nevnte harpiks er i BIORAD-laboratorielisten av 1. mai 1965 på sidene 4 og 5 identifisert som en sterkt basisk anionutvekslingsharpiks, sammensatt 400 g of vesicular glands from sheep were homogenized with 400 ml of water in a fast-running cooled homogenizer and further diluted with 800 ml of equa dest. All processes were carried out at 0°C. In small portions, 200 ml (wet volume) of "DOWEX" anion exchange resin A.G. was added. 1-X2, 50-100 mesh (said resin is identified in the BIORAD Laboratory List of May 1, 1965 on pages 4 and 5 as a strongly basic anion exchange resin, composed of

av en styren-divinylbenzenpolymerlateks, inneholdende 2% divinyl-benzen og som oppviser kvartære ammoniumutvekslingsgrupper), i 0H~ formen mettet med C02 under omrøring og under gjennomføring av en hurtig C02-strøm. Blandingen ble filtrert gjennom et osteklede for å fjerne vedhengende vev og ioneutveksleren. Den grumsete oppløsning som man fikk på denne måte (1,2 liter; pH = 8,2), of a styrene-divinylbenzene polymer latex, containing 2% divinylbenzene and exhibiting quaternary ammonium exchange groups), in the 0H~ form saturated with CO 2 under stirring and passing a rapid CO 2 stream. The mixture was filtered through cheesecloth to remove adherent tissue and the ion exchanger. The cloudy solution obtained in this way (1.2 liters; pH = 8.2),

inneholdt bare noen få mg av endogenøse prostaglandiner. Opp-løsingen ble inkubert aerobisk med 175 mg arachidonsyre oppløst i 400 ml oppløsning, inneholdende 0,05 M trikaliumfosfat, pH = contained only a few mg of endogenous prostaglandins. The solution was incubated aerobically with 175 mg of arachidonic acid dissolved in 400 ml of solution containing 0.05 M tripotassium phosphate, pH =

7,5 og 0,2 M tris(hydroksymetyl)-aminometan.HCl-puffer; pH 7.5 and 0.2 M tris(hydroxymethyl)aminomethane.HCl buffer; pH

9,0 (i et volumforhold lik 1:1) i 30 minutter ved 30°c<. 9.0 (in a volume ratio equal to 1:1) for 30 minutes at 30°c<.

Efter reaksjonen ble blandingen ansyret med 4N svovel-syre inntil pH var lavere enn 3,5, og 250 ml alkohol ble tilsatt, efterfulgt av 2 ekstraheringer med 1 liter eter. Det eteriske ekstrakt inneholdt 65 mg prostaglandin E2 og 14 mg prostaglandin <F>2a' After the reaction, the mixture was acidified with 4N sulfuric acid until the pH was lower than 3.5, and 250 ml of alcohol was added, followed by 2 extractions with 1 liter of ether. The ethereal extract contained 65 mg of prostaglandin E2 and 14 mg of prostaglandin <F>2a'

Eksempel 7 Example 7

Idet man gikk ut fra 400 g kjertler og 20 mg all-cis-7,10,13-nonadecatriensyre og under anvendelse av samme fremgangsmåte som i eksempel 6, fikk man 27 mg Nor-PGE-^ og ca. 5 mg Nor-_GF^a i den eteriske ekstrakt. (Ved Nor-prostaglandiner forståes prostaglandiner i hvilke det er 5 metylengrupper mellom karboksyl-gruppen og cyklopentylgruppen). Starting from 400 g of glands and 20 mg of all-cis-7,10,13-nonadecatrienoic acid and using the same method as in example 6, 27 mg of Nor-PGE-^ and approx. 5 mg Nor-_GF^a in the ethereal extract. (By Nor-prostaglandins is meant prostaglandins in which there are 5 methylene groups between the carboxyl group and the cyclopentyl group).

Efter kromatografisk rensing og omkrystallisering av Nor-PGE^ fra vandig metanol, fikk man 9,6 mg nålformede kryst-aller» Dette materiale ble identifisert ved massespektroskopi som Nor-prostaglandin E^ (molekylvekt 540). After chromatographic purification and recrystallization of Nor-PGE^ from aqueous methanol, 9.6 mg of needle-shaped crystals were obtained. This material was identified by mass spectroscopy as Nor-prostaglandin E^ (molecular weight 540).

Ved gasskromatografi kunne man ikke oppdage noen foru-rensning med PGE, eller PGE_. No contamination with PGE, or PGE_, could be detected by gas chromatography.

Smeltepunktet var 89 C. The melting point was 89 C.

Eksempel 8 Example 8

Et stykke duodenum (65 g våtvekt) av hanfår ble opp-skåret i stykker og homogenisert i en hurtigløpende homogenisator med 200 ml 0,01 M fosfatpuffer (pH=8,0). A piece of duodenum (65 g wet weight) from a male sheep was cut into pieces and homogenized in a high-speed homogenizer with 200 ml of 0.01 M phosphate buffer (pH=8.0).

Homogenisatet ble sentrifugert i 10 minutter ved 4000 The homogenate was centrifuged for 10 min at 4000

x g„ Den grumsete væske ble sentrifugert i 50 minutter ved 100 000 x g. Kaken som man fikk fra den annen sentrifugering, ble suspendert i 12 ml 0,1 M fosfat (pH=8,0). Dette preparat ble anvendt ved de følgende inkuberingerj det inneholdt 30 mg protein pr. ml. En del av enzymoppløsningen (1,5 ml) ble inkubert med 95 mikrogram (1-14 C)-homo-gamma-linolensyre (95 000 tpm) i 1 ml 0,2 M tris(hydroksymetyl)-aminometan.HCl (pH=8,0) i 10 minutter ved 30°C (a). I en annen inkubering (b) ble tilsatt 1 mikromol (0,3 mg) glutation, og den tredje inkubering (c) ble utført i nærvær av 1 mikromol glutathion og 0,5 mikromol (0,1 mg) propylgallat. x g„ The cloudy liquid was centrifuged for 50 minutes at 100,000 x g. The cake obtained from the second centrifugation was suspended in 12 ml of 0.1 M phosphate (pH=8.0). This preparation was used in the following incubations; it contained 30 mg of protein per ml. A portion of the enzyme solution (1.5 ml) was incubated with 95 micrograms (1-14 C)-homo-gamma-linolenic acid (95,000 rpm) in 1 ml of 0.2 M tris(hydroxymethyl)aminomethane.HCl (pH= 8.0) for 10 minutes at 30°C (a). In another incubation (b) 1 micromol (0.3 mg) of glutathione was added, and the third incubation (c) was performed in the presence of 1 micromol of glutathione and 0.5 micromol (0.1 mg) of propyl gallate.

Efter inkuberingen ble blandingene ansyret og ekstrahert med eter. Etter tilsetning av 182 mikrogram PGE^ og 100 mikrogram PGF^, ble de eteriske ekstrakter overført til tørket tilstand. Materialet ble kromatografert på et tynt skikt av kiselsyregel (G; ex Merck) med oppløsningsmiddelsystemet kloroform-metanol,eådiksyre-vann (90:6:1:1 volum) som elueringsmiddel. After incubation, the mixtures were acidified and extracted with ether. After addition of 182 micrograms of PGE^ and 100 micrograms of PGF^, the ethereal extracts were transferred to the dried state. The material was chromatographed on a thin layer of silica gel (G; ex Merck) with the solvent system chloroform-methanol, acetic acid-water (90:6:1:1 volume) as eluent.

PGE^ ble eluert fra kiselsyregelen med metanol og behandlet med 0,5M metanolisk KOH i 10 minutter ved 20°C. Det de-hydratiseringsprodukt som ble dannet på denne måte, ble isolert ved TLK på kiselsyregel (G; ex Merck) med oppløsningsmidlet eter-eddiksyre (100:2). En del av det ble undersøkt med hensyn til radioaktivitet, og i en annen del ble bestemt ekstruksjonen ved 280 millimikron. Det kunne beregnes at det opprinnelige PGE^ hadde den følgende radioaktivitet: PGE^ was eluted from the silica gel with methanol and treated with 0.5M methanolic KOH for 10 minutes at 20°C. The dehydration product thus formed was isolated by TLC on silica gel (G; ex Merck) with the solvent ether-acetic acid (100:2). Part of it was examined for radioactivity, and in another part the extrusion at 280 millimicrons was determined. It could be calculated that the original PGE^ had the following radioactivity:

TLK på kiselsyregel (G; ex Merck) impregnert med sølv-nitrat forårsaket ingen ytterligere senkning i den spesifikke radioaktivitet av det dehydratiserte PGE-^. Ved inkubering med glutathion var således 2,8% av homo-gamma-linolensyren omdannet til prostaglandin E^. TLK on silica gel (G; ex Merck) impregnated with silver nitrate caused no further decrease in the specific radioactivity of the dehydrated PGE-^. When incubated with glutathione, 2.8% of the homo-gamma-linolenic acid was thus converted to prostaglandin E^.

De steder hvor prostaglandiner befant seg, ble bestemt ved å utsette for joddamp, hvoretter man lot joden fordampe, og de soner som inneholdt prostaglandin E og F, ble skrapt av. The sites where prostaglandins were located were determined by exposure to iodine vapor, after which the iodine was allowed to evaporate, and the zones containing prostaglandins E and F were scraped off.

Eksempel 9 Example 9

Partikkelformede fraksjoner av forskjellige organer ble fremstilt ved homogenisering i en 0,05 M kaliumfosfatpuffer, pH 8, ved 0-5°C. Homogenisatet ble sentrifugert to ganger ved 4000 x g og den overliggende væske i 1 time ved 100 000 x g. Sedimentet ble anvendt for inkubasjonene som ble utført ved 30°C i. 15 minutter. Ved disse forsøk ble det tilsatt pr. milligram protein (biuret-reaksjon) 1-2,5 mikrogram (1- 14C)-bis-homo-gamma-linolensyre og 15 mikrogram glutathion. Etter reaksjonen ble inkuberings-blandingen ansyret med 0,2 M sitronsyre, og 500 mikrogram PGE^ ble tilsatt som bærer. PGE^ ble ekstrahert med eter og renset ved Particulate fractions of various organs were prepared by homogenization in a 0.05 M potassium phosphate buffer, pH 8, at 0-5°C. The homogenate was centrifuged twice at 4000 x g and the supernatant for 1 hour at 100,000 x g. The sediment was used for the incubations which were carried out at 30°C for 15 minutes. In these experiments, it was added per milligram protein (biuret reaction) 1-2.5 micrograms (1- 14C)-bis-homo-gamma-linolenic acid and 15 micrograms glutathione. After the reaction, the incubation mixture was acidified with 0.2 M citric acid, and 500 micrograms of PGE 2 was added as a carrier. PGE^ was extracted with ether and purified by

tynnskiktkromatografi, og radioaktiviteten ble bestemt. thin layer chromatography, and the radioactivity was determined.

De følgende resultater ble oppnådd: The following results were obtained:

Lignende resultater fikk man ved å anvende organer Similar results were obtained by using organs

fra marsvin og rotter. from guinea pigs and rats.

Eksempel 10 Example 10

Dette eksempel vedrører omdannelse av en rekke forskjellige karboksylsyrer til prostaglandiner. This example relates to the conversion of a number of different carboxylic acids into prostaglandins.

Vesikulære kjertler fra får (350 g) ble findelt i en Vesicular glands from sheep (350 g) were minced in a

0,1 m fosfatpuffer ved pH 8. Blandingen ble sentrifugert (4000 0.1 m phosphate buffer at pH 8. The mixture was centrifuged (4000

x g), filtrert og sentrifugert påny (55 000 x g). Utfelningen ble lyofilisert etter vaskning og tørket. Utbytte 7 g. Den partikkelformede enzymfraksjon som man fikk på denne måte, ble anvendt ved forskjellige forsøk som vist nedenfors x g), filtered and centrifuged again (55,000 x g). The precipitate was lyophilized after washing and dried. Yield 7 g. The particulate enzyme fraction obtained in this way was used in various experiments as shown below

100 mikrogram fettsyre, 0,65 mikromol glutathion og 100 micrograms of fatty acid, 0.65 micromoles of glutathione and

0,55 mikromol hydrokinon ble oppløst i et prøverør som inneholdt 1 ml 0,2 mol tris-HCl-puffer, pH 8. Røret ble anbragt i et vann-bad ved 37°C og det ble tilsatt 6 mg av den partikkelformede enzymfraksjon (2 mg protein suspendert i 1 ml 0,2 M tris-HCl-puffer). Reaksjonsblandingen ble ansyret etter en inkuberingstid av 30 minutter, ekstrahert med eter og inndampet til tørrhet. Residuet ble oppløst i metanol (1 ml) og i 0,2 ml av oppløsningen ble prostaglandininnholdet bestemt ut fra økningen i absorpsjon ved 278 nanometer efter tilsetning av alkali. Under de beskrevne betingelser hadde alle reaksjonene nådd optimal omdannelse etter en inkuberingstid av 30 minutter. 0.55 micromol hydroquinone was dissolved in a test tube containing 1 ml of 0.2 mol tris-HCl buffer, pH 8. The tube was placed in a water bath at 37°C and 6 mg of the particulate enzyme fraction ( 2 mg of protein suspended in 1 ml of 0.2 M tris-HCl buffer). The reaction mixture was acidified after an incubation time of 30 minutes, extracted with ether and evaporated to dryness. The residue was dissolved in methanol (1 ml) and in 0.2 ml of the solution the prostaglandin content was determined from the increase in absorption at 278 nanometers after the addition of alkali. Under the described conditions, all reactions had reached optimal conversion after an incubation time of 30 minutes.

Resultatene er oppført i tabellform nedenfor: The results are tabulated below:

På lignende måte ble all-cis-nonadeca-4,7,10,13,16-pentaensyre også omdannet til prostaglandiner med små utbytter. Similarly, all-cis-nonadeca-4,7,10,13,16-pentaenoic acid was also converted to prostaglandins in low yields.

Claims

1. Process for the biosynthetic production of prostaglandins and related hydroxycarboxylic acids, characterized in that fatty acids with present double bonds in cis configuration, and their salts, which have the general formula CH0-(CH_) -(CH=CH-CH0) -(CH„ ) -COOM, which contained-3 2 n 2 p 1 2 q where 18 to 22, preferably 20 carbon atoms in the molecule and where M means hydrogen or an alkali metal, n means an integer from 0 to 5, p means an integer from 3 to 5 and q from 0 to 8, is incubated under aerobic conditions with a prostaglandin-synthesizing enzyme system prepared from animal tissue.

2. Method as stated in claim 1, characterized in that the biosynthesis is carried out under aerobic conditions by passing oxygen-containing gases through the reaction mixture.

3. Method as stated in claims 1 and 2, characterized in that the biosynthesis is carried out with the addition of the co-factor glutathione.