NO149864B

NO149864B - IMMUNOLOGICAL REAGENT.

Info

Publication number: NO149864B
Application number: NO760203A
Authority: NO
Inventors: Carlton Deaton
Original assignee: Cooper Lab
Priority date: 1975-01-29
Filing date: 1976-01-22
Publication date: 1984-03-26
Also published as: DK16976A; SE7600232L; NL183852C; FR2299645A1; FR2299645B1; IL48804A; IL48804A0; BR7600322A; JPS51101121A; DE2602068A1; NL183852B; NL7600697A; SE441392B; DK150809C; NO149864C; ES444543A1; NO760203L; DK150809B; CA1080619A; GB1540097A

Description

Denne oppfinnelse angår generelt et immunologisk reagens This invention relates generally to an immunological reagent

som er i stand til å forsterke en immunologisk felningsreaksjon. Mer spesielt angår oppfinnelsen en immunologisk reagensoppløsning som kan anvendes ved en rekke forskjellige immunologiske målemetoder . which is capable of enhancing an immunological response. More particularly, the invention relates to an immunological reagent solution that can be used in a number of different immunological measurement methods.

Det eksisterer tallrike immunologiske målemetoder med sterkt varierende metodikk, som gjør det nødvendig på et eller annet trinn ved målingen og for varierende formål, å gjøre så mye som mulig av antigen-antistoff-komplekset uoppløselig. Uoppløseliggjørelse av komplekser spiller f.eks. en viktig rolle ved slike illustrerende, viktige vanlige immunologiske målemetoder som elektroforetisk analyse, enzymatisk måling, radioimmunologisk måling (RIA) og nefelometriske målinger, og mye arbeid har vært rettet mot ut-vikling av midler for å øke uoppløseligheten av kompleksene for å forbedre disse målinger. Normalt er uoppløseliggjørelse av kompleksene nødvendig for å isolere det immunologiske reaksjonsprodukt fra de uomsatte immunologiske reagenser som er med ved en spesiell måling, slik at enten det isolerte reaksjonsprodukt eller de uomsatte reagenser kan analyseres separat for å gi en meningsfyllt diagnostisk måling. There are numerous immunological measurement methods with widely varying methodologies, which make it necessary at some stage of the measurement and for varying purposes to render as much as possible of the antigen-antibody complex insoluble. Insolubilization of complexes plays e.g. an important role in such illustrative, important common immunological measurement methods as electrophoretic analysis, enzymatic measurement, radioimmunological measurement (RIA) and nephelometric measurements, and much work has been directed towards the development of agents to increase the insolubility of the complexes in order to improve these measurements . Normally, insolubilization of the complexes is necessary to isolate the immunological reaction product from the unreacted immunological reagents involved in a particular measurement, so that either the isolated reaction product or the unreacted reagents can be analyzed separately to provide a meaningful diagnostic measurement.

For en immunologisk målemetode som f.eks. omfatter en nefelometrisk analyse, er det kjent å fortynne måleprøver med en oppløsning av polyetylenglykol-polymer før både inkubering av prøven og avlesning på detnefelometriske instrument. Selv om polyetylenglykol forbedrer den nefelometriske analyse ved å øke konsentrasjonen av suspenderte partikler, og derved forbedre analysen, står man imidlertid tilbake med det problem at til-fredsstillende analyse av mange biologiske komponenter ikke kan foretas på grunn av utilstrekkelig prøveområde eller følsomhet på grunn av utilstrekkelig konsentrasjon av suspenderte partikler i måleprøven. Det generelle formål med foreliggende oppfinnelse er å løse det ovennevnte problem ved å tilveiebringe et forbedret immunologisk reagens som er effektivt til i vesentlig grad å øke uoppløseliggjørelsen av antistoff-antigen-komplekser utover det som kan oppnås med polyetylenglykol alene, og derved øke konsentrasjonen av suspenderte partikler i måleprøven, for å tillate analyse av biologiske bestanddeler som ikke er mulig med polyetylenglykol alene, uavhengig av om nefelometriske eller andre målemetoder anvendes. For an immunological measurement method such as e.g. includes a nephelometric analysis, it is known to dilute measuring samples with a solution of polyethylene glycol polymer before both incubation of the sample and reading on the nephelometric instrument. Although polyethylene glycol improves the nephelometric analysis by increasing the concentration of suspended particles, thereby improving the analysis, one is however left with the problem that satisfactory analysis of many biological components cannot be carried out due to insufficient sample area or sensitivity due to insufficient concentration of suspended particles in the measurement sample. The general object of the present invention is to solve the above problem by providing an improved immunological reagent which is effective to substantially increase the insolubilization of antibody-antigen complexes beyond what can be achieved with polyethylene glycol alone, thereby increasing the concentration of suspended particles in the measurement sample, to allow analysis of biological constituents that are not possible with polyethylene glycol alone, regardless of whether nephelometric or other measurement methods are used.

Mer spesielt tilveiebringes i henhold til oppfinnelsen et immunologisk reagens for undersøkelse av antigen-antistoff-reaksjoner ved inkubering av materialet som skal undersøkes, More particularly, according to the invention, an immunological reagent is provided for examining antigen-antibody reactions by incubating the material to be examined,

i nærvær av reagenset som nedsetter oppløseligheten av antigen-antistof f-komplekset , og det karakteriseres ved at reagenset inneholder fra 3 til 6 vekt% av en blanding inneholdende 10 til 90 vekt% polyetylenglykol og 90 til 10 vekt% av et ikke-ionisk overflateaktivt middel valgt fra a) en blokk-kopolymer av etylenoksyd og polyoksypropylen, in the presence of the reagent that reduces the solubility of the antigen-antibody f complex, and it is characterized by the reagent containing from 3 to 6% by weight of a mixture containing 10 to 90% by weight of polyethylene glycol and 90 to 10% by weight of a non-ionic surfactant agent selected from a) a block copolymer of ethylene oxide and polyoxypropylene,

b) lineære, primære, alifatiske oksyalkylerte alkoholer, b) linear, primary, aliphatic oxyalkylated alcohols,

c) glycerol-monostearat, c) glycerol monostearate,

d) polyoler med formelen d) polyols of the formula

e) alkylarylsulfonater. e) alkylaryl sulfonates.

Nevnte vandige oppløsning inneholder ved bruk 3 til 6 vekt% Said aqueous solution contains, when used, 3 to 6% by weight

av blandingen og har i dette område en beregnet HLB- (hydrofil-lipofil balanse) verdi i området fra 0,7 til 1,7. Det skal legges merke til at den vandige oppløsning, når den ikke er "i bruk", f.eks. ved en immunologisk målemetode, kan ha en blandingskonsentrasjon som er under 3% eller mer enn 6% og allikevel være egnet for oppfinnelsens formål, forutsatt at blandingens konsentrasjon før eller "ved bruk" reguleres for å gi en konsentrasjon i området mellom 3 og 6%. Med uttrykket "ved bruk" som her anvendt, skal det derfor forstås et reagens hvor konsentrasjonen av blandingen ikke nødvendigvis opprinnelig må være i området mellom 3 og 6%, så lenge som konsentrasjons-området, hvis det er utenfor det spesifiserte området fra 3 til 6%, reguleres innenfor disse grenser under eller før måleprosessen. of the mixture and in this range has a calculated HLB (hydrophilic-lipophilic balance) value in the range from 0.7 to 1.7. It should be noted that the aqueous solution, when not "in use", e.g. by an immunological measurement method, can have a mixture concentration that is below 3% or more than 6% and still be suitable for the purposes of the invention, provided that the concentration of the mixture before or "during use" is regulated to give a concentration in the range between 3 and 6% . With the expression "in use" as used here, is therefore to be understood a reagent where the concentration of the mixture does not necessarily initially have to be in the range between 3 and 6%, as long as the concentration range, if it is outside the specified range from 3 to 6%, is regulated within these limits during or before the measurement process.

Man får således også en immunologisk målemetode som omfatter omsetning mellom et antistoff og et antigen for å danne et antistoff-antigen-kompleks, ved at det anvendes et reagens ifølge oppfinnelsen for i vesentlig utstrekning å øke graden av uoppløseliggjørelse av antigen-antistoff-komplekset som dannes ved reaksjonen. One thus also obtains an immunological measuring method which includes reaction between an antibody and an antigen to form an antibody-antigen complex, by using a reagent according to the invention to substantially increase the degree of insolubilization of the antigen-antigen complex which formed by the reaction.

Reagenset kan hensiktsmessig innføres i prøvemediet The reagent can be suitably introduced into the test medium

for utførelse av en nefelometrisk, enzymatisk, elektroforetisk eller radioimmunologisk målning. for carrying out a nephelometric, enzymatic, electrophoretic or radioimmunological measurement.

Når det f.eks. utføres en nefelometrisk målemetode for analyse av biologiske bestanddeler i form av antistoff-antigen-komplekser, inkuberes først reagenset og suspenderte partikler av de biologiske bestanddeler, hvorefter den nefelometriske analyse foretaes. I henhold til denne metode bringes en lyskilde til å passere gjennom en flytende måleprøve, hvorved lysstrålene rettes gjennom de suspenderte partikler. Når disse lysstrålene treffer partiklene, spres eller diffunderes de med en hvilken som helst forhåndsbestemt vinkel, f.eks. en rett vinkel, fra kilden og oppfanges av fotoceller. Dette spredte lys omdannes til et elektrisk signal som er direkte proporsjonal med When it e.g. if a nephelometric measuring method is carried out for the analysis of biological components in the form of antibody-antigen complexes, the reagent and suspended particles of the biological components are first incubated, after which the nephelometric analysis is carried out. According to this method, a light source is made to pass through a liquid measuring sample, whereby the light rays are directed through the suspended particles. When these light rays hit the particles, they are scattered or diffused at any predetermined angle, e.g. a right angle, from the source and is picked up by photocells. This scattered light is converted into an electrical signal that is directly proportional to

partikkelkonsentrasjonen som derved måles nøyaktig på en skala på et instrument. the particle concentration which is thereby accurately measured on a scale on an instrument.

Eksempler på instrumenter som er egnet for nefelometriske analyser, er Hyland Laser Nephelometer PDQ (Hyland Laboratories); Aminco-Fluorocolorimeter (American Instrument Company}; Aminco-Bowman Spectrophotofluorometer (SPF): og Auto Analyser II med tilkoblet Fluoronephelometer (Technicon Instruments Corporation). Examples of instruments suitable for nephelometric analysis are the Hyland Laser Nephelometer PDQ (Hyland Laboratories); Aminco-Fluorocolorimeter (American Instrument Company}; Aminco-Bowman Spectrophotofluorometer (SPF): and Auto Analyzer II with attached Fluoronephelometer (Technicon Instruments Corporation).

Ved hjelp av disse nefelometriske prinsipper og utstyr kan den kliniske teknikker foreta en nøyaktig bestemmelse av små konsentrasjoner av en rekke forskjellige spesifikke proteiner, f.eks. immunoglobulinene IgC, IgA, IgM, transferrin, komplement C3, haptoglobin, a^-antitrypsin, (3-lipoprotein, albumin, c^-makroglobulin, a^-syre glykoprotein, og forskjellige andre biologiske bestanddeller så som triglycerider, lipoprot-einer og menneskelige chorione gonadotropiner. Using these nephelometric principles and equipment, the clinical technician can make an accurate determination of small concentrations of a number of different specific proteins, e.g. the immunoglobulins IgC, IgA, IgM, transferrin, complement C3, haptoglobin, α^-antitrypsin, (3-lipoprotein, albumin, c^-macroglobulin, α^-acid glycoprotein, and various other biological components such as triglycerides, lipoproteins and human chorionic gonadotropins.

De viktigste fordeler som oppnåes ved anvendelse av reagenser i henhold til oppfinnelsen er at (a) inkuberingstidene reduseres betydelig og (b) høyere konsentrasjon av uoppløselig-gjorte kompleks-partikler oppnåes ved kortere inkubasjonstid med resulterende forbedret prøveområde og følsomhet. Disse fordeler gjelder for enhver immunologisk prøvemetode som be-gunstiges ved øket uoppløseliggjørelse av antigen-antistoff-komplekset på et eller annet punkt av målningen. Fordelene gjelder også for immunologiske prøvemetoder som er avhengig av et antigen-antistoff-kompleks uoppløseliggjørelsestrinn på et eller annet punkt under måleprosessen. The most important advantages achieved by using reagents according to the invention are that (a) the incubation times are significantly reduced and (b) a higher concentration of insoluble complex particles is achieved with a shorter incubation time with resulting improved sample area and sensitivity. These advantages apply to any immunological test method which is favored by increased insolubilization of the antigen-antibody complex at some point of the measurement. The advantages also apply to immunological assay methods that rely on an antigen-antibody complex insolubilization step at some point during the measurement process.

I tillegg til å inneholde, ved bruk, 3 til 6 vekt% In addition to containing, when used, 3 to 6% by weight

av blandingen av polyetylenglykol og det ikke-ioniske overflateaktive middel, skal den vandige reagens oppløsning, som angitt ovenfor, også ha en beregnet HLB-verdi mellom 0,7 of the mixture of polyethylene glycol and the non-ionic surfactant, the aqueous reagent solution, as indicated above, must also have a calculated HLB value between 0.7

og 1.7. and 1.7.

HLB-verdien er et veletablert mål for den hydrofile-lipofile balanse (derfor "HLB") for et gitt overflateaktivt middel. HLB-systemet for identifikasjon av overflateaktive midler ble utviklet av Atlas Chemical Industries, Inc., og er beskrevet i detalj på sidene 28-36 i Atlas-publikasjonen med tittel "Guide to the Use of Atlas Surfactants and Sorbitol in Cosmetic and Pharmaceutical Products" (1965). Hvert overflateaktive middel er gitt en HLB-verdi. Jo lavere HLB-verdien er, dessto mer lipofilt (eller oljetiltrekkende) er det overflateaktive middel, mens jo høyere verdien er, dessto mer hydro-filt (eller vanntiltrekkende) er det overflateaktive middel. Metoden for fastleggelse av HLB-verdien for et hvilket som helst overflateaktivt middel er velkjent og beskrevet f.eks. i en alminnelig tilgjengelig publikasjon fra Atlas med tittelen "The Atlas HLB System" (Code LD-97). HLB-verdiene for tallrike overflateaktive midler er også publisert i stor utstrekning i litteraturen, særlig litteratur utgitt av fabrikanten av vedkommende overflateaktive middel. The HLB value is a well-established measure of the hydrophilic-lipophilic balance (hence "HLB") for a given surfactant. The HLB system for the identification of surfactants was developed by Atlas Chemical Industries, Inc. and is described in detail on pages 28-36 of the Atlas publication entitled "Guide to the Use of Atlas Surfactants and Sorbitol in Cosmetic and Pharmaceutical Products" (1965). Each surfactant is given an HLB value. The lower the HLB value, the more lipophilic (or oil-attracting) the surfactant is, while the higher the value, the more hydrophilic (or water-attracting) the surfactant is. The method for determining the HLB value for any surfactant is well known and described e.g. in a generally available publication from Atlas entitled "The Atlas HLB System" (Code LD-97). The HLB values for numerous surfactants are also widely published in the literature, particularly literature published by the manufacturer of the surfactant in question.

HLB-verdien for en blanding av overf1ateaktive midler, slik som det er i reagenset ifølge oppfinnelsen, er en funksjon av konsentrasjonen av hvert overflateaktivt middel i blandingen, og således må konsentrasjonen av de enkelte overflateaktive midler taes i betraktning ved beregning av en HLB-verdi for blandingen. HLB-verdien for blandingen beregnes, i overensstem-melse med godtatte publiserte metoder, ved å multiplisere den angitte HLB-verdi for hvert overflateaktivt middel tilstede i blandingen, med dets konsentrasjon i vedkommende preparat, og addering av de individuelle beregnede resultater. Hvis f.eks. reagenset ifølge oppfinnelsen inneholdt 1 vekt% polyetylenglykol (HLB = 20) og 3 vekt% av et ikke-ionisk overflateaktivt middel med en HLB på 30,5, ville HLB-verdien for reagenset bli beregnet som følger: The HLB value for a mixture of surfactants, such as in the reagent according to the invention, is a function of the concentration of each surfactant in the mixture, and thus the concentration of the individual surfactants must be taken into account when calculating an HLB value for the mixture. The HLB value for the mixture is calculated, in accordance with accepted published methods, by multiplying the stated HLB value for each surfactant present in the mixture, by its concentration in the relevant preparation, and adding the individual calculated results. If e.g. the reagent according to the invention contained 1% by weight polyethylene glycol (HLB = 20) and 3% by weight of a non-ionic surfactant with an HLB of 30.5, the HLB value for the reagent would be calculated as follows:

For å bestemme hvorvidt et gitt reagens har en HLB-verdi som faller innenfor området 0,7 til 1,7 ifølge oppfinnelsen, To determine whether a given reagent has an HLB value falling within the range of 0.7 to 1.7 according to the invention,

kan man lett foreta en beregning som beskrevet ovenfor, basert på mengden av hver komponent i blandingen, under anvendelse av enten publiserte HLB-verdier for de aktuelle komponenter eller HLB-verdier som er bestemt i henhold til Atlas-metoden. one can easily make a calculation as described above, based on the amount of each component in the mixture, using either published HLB values for the relevant components or HLB values determined according to the Atlas method.

Foreliggende oppfinnelse går ut på anvendelse av en rekke forskjellige ikke-ioniske overflateaktive midler sammen med polyetylenglykol, forutsatt at (1) blandingen av ikke-ionisk overflateaktivt middel og polyetylenglykol faller innen et område fra 3 til 6 vekt% på det tidspunkt reagenset anvendes ved målningen, og (2) at den beregnede HLB-verdi for reagenset samtidig faller innenfor et område fra 0,7 til 1,7. Hvis blandingen av polyetylenglykol og ikke-ionisk overflateaktivt middel ved bruks-tidspunktet utgjør mindre enn 3% av reagenset, eller hvis reagenset har en HLB lavere enn 0,7, blir det vanskelig å uoppløs-eliggjøre den ønskede mengde av antigen-antistoff-kompleks i den utstrekning som er nødvendig for en vellykket gjennomførelse av den immunologiske målning. Hvis på den annen side blandingen utgjør mer enn 6% av reagenset, eller hvis reagenset har en HLB høyere enn 1,7, vil andre proteiner i tillegg til det ønskede antigen-antistoff-kompleks gjøres uoppløselige, og derved øde-legges målningens selektivitet, og resultatene blir meningsløse. The present invention involves the use of a number of different non-ionic surfactants together with polyethylene glycol, provided that (1) the mixture of non-ionic surfactant and polyethylene glycol falls within a range from 3 to 6% by weight at the time the reagent is used in the measurement , and (2) that the calculated HLB value for the reagent simultaneously falls within a range from 0.7 to 1.7. If the mixture of polyethylene glycol and nonionic surfactant at the time of use constitutes less than 3% of the reagent, or if the reagent has an HLB lower than 0.7, it becomes difficult to insolubilize the desired amount of antigen-antibody complex to the extent necessary for a successful implementation of the immunological measurement. If, on the other hand, the mixture constitutes more than 6% of the reagent, or if the reagent has an HLB higher than 1.7, other proteins in addition to the desired antigen-antibody complex will be rendered insoluble, thereby destroying the selectivity of the measurement, and the results become meaningless.

Reagensoppløsningen kan selvsagt av forskjellige grunner fremstilles og bringes på markedet på en slik måte at det ikke inneholder den fastsatte 3 til 6% blanding av polyetylenglykol og ikke-ionisk overflateaktivt middel, eller ikke har den fastsatte HLB-verdi på 0,7 til 1,7. Dårlig hylle-stabilitet kan være en slik grunn. Som angitt ovenfor, vil imidlertid slike oppløsninger kreve regulering før eller på et eller annet tidspunkt under bruken ved en immunologisk målning, til 3 til 6% området og til en HLB-verdi fra 0,7 til 1,7. Reagenser som ikke inneholder de fastsatte 3 til 6% av nevnte blanding eller ikke har en HLB-verdi fra 0,7 til 1,7, men som lett kan reguleres til disse verdier før eller under den immunologiske prøv-ning, faller av denne grunn inn under oppfinnelsen, selv om de opprinnelig kan være utenfor de spesielle konsentrasjonsparametre og HLB-området som er nødvendig under selve målningsprosessen: Den markedsførte reagensoppløsning kan f.eks. kreve, hvis de spesielle parametre for konsentrasjon og HLB-verdier faller utenfor henholdsvis områdene fra 3 til 6% og 0,7 til 1,7, fortynning, konsentrering eller andre reguleringstrinn før eller på et eller annet hensiktsmessig tidspunkt under utførelse av målningen, for å bringe oppløsningen til å inneholde en mengde av blandingen på 3 til 6% og en beregnet HLB-verdi fra 0,7 til The reagent solution can of course for various reasons be prepared and brought to the market in such a way that it does not contain the prescribed 3 to 6% mixture of polyethylene glycol and non-ionic surfactant, or does not have the prescribed HLB value of 0.7 to 1, 7. Poor shelf stability can be one such reason. As indicated above, however, such solutions will require adjustment prior to or at some point during use in an immunological assay, to the 3 to 6% range and to an HLB value of 0.7 to 1.7. Reagents which do not contain the stipulated 3 to 6% of said mixture or do not have an HLB value from 0.7 to 1.7, but which can easily be adjusted to these values before or during the immunological test, fall for this reason within the scope of the invention, even though they may originally be outside the special concentration parameters and HLB range that are necessary during the measurement process itself: The marketed reagent solution can e.g. require, if the special parameters for concentration and HLB values fall outside the ranges from 3 to 6% and 0.7 to 1.7 respectively, dilution, concentration or other regulatory steps before or at some other appropriate time during the performance of the measurement, for to bring the solution to contain an amount of the mixture of 3 to 6% and a calculated HLB value of from 0.7 to

1,7. I slike tilfeller vil den markedsførte oppløsning fortsatt falle inn under foreliggende oppfinnelse. Således kan reagenset markedsføres med en blandingskonsentrasjon høyere en 6%, f.eks. 8%, og ville da fortynnes enten før eller ved et eller annet egnet tidspunkt under en immunologisk prøvning, til området fra 3 til 6%. Tilsvarende kan reagenset markedsføres med en beregnet HLB-verdi utenfor området 0,7 til 1,7, men med det krav at reagensoppløsningen reguleres før eller ved et eller annet egnet tidspunkt under en immunologisk prøve for å bringe den til en beregnet HLB-verdi i området fra 0,7 til 1,7. 1.7. In such cases, the marketed solution will still fall under the scope of the present invention. Thus, the reagent can be marketed with a mixture concentration higher than 6%, e.g. 8%, and would then be diluted either before or at some suitable time during an immunological test, to the range of 3 to 6%. Similarly, the reagent can be marketed with a calculated HLB value outside the range 0.7 to 1.7, but with the requirement that the reagent solution be adjusted before or at some other suitable time during an immunological test to bring it to a calculated HLB value in the range from 0.7 to 1.7.

Reagenset kan i visse tilfeller fortynnes til de ønskede verdier med det antiserum som skal anvendes ved prøven, mens i andre tilfeller kan det fortynnes med måleprøven eller i noen tilfeller med både måleprøven og antiserum. Det viktige er at på et eller annet tidspunkt under den immunologiske prøvning, vanligvis enten før eller samtidig med antigen-antistoff-reaksjonen, må den nødvendige mengde på 3 til 6% av samlet polyetylenglykol og ikke-ionisk overflateaktivt middel, og den nød-vendige HLB-verdi på 0,7 til 1,7, tilveiebringes for at reagenset ifølge oppfinnelsen skal virke skikkelig ved målningen. Det tidspunkt under måleprosessen hvor disse nødvendige parametre må tilveiebringes, kan variere avhengig av den spesielle metode som anvendes. For en nefelometrisk analyse er det f.eks. hensiktsmessig å fremstille og•markeds føre reagenset ifølge oppfinnelsen med en konsentrasjon av polyetylenglykol og ikke-ionisk overflateaktivt middel på over 6% og med en HLB-verdi utenfor området 0,7 til 1,7. Umiddelbart før bruk ved den nefelometriske analyse fortynnes så reagenset med det antiserum som skal anvendes ved analysen, for å tilveiebringe en konsentrasjon av polyetylenglykol og ikke-ionisk overflateaktivt middel mellom 3 og 6%, fortrinnsvis ca. 4%, og en beregnet HLB-verdi i området 0,7 til 1,7. In certain cases, the reagent can be diluted to the desired values with the antiserum to be used in the test, while in other cases it can be diluted with the measuring sample or in some cases with both the measuring sample and antiserum. The important thing is that at some point during the immunological test, usually either before or simultaneously with the antigen-antibody reaction, the necessary amount of 3 to 6% of total polyethylene glycol and nonionic surfactant, and the necessary HLB value of 0.7 to 1.7 is provided for the reagent according to the invention to work properly in the measurement. The time during the measurement process when these necessary parameters must be provided can vary depending on the particular method used. For a nephelometric analysis, it is e.g. appropriate to produce and market the reagent according to the invention with a concentration of polyethylene glycol and non-ionic surfactant of more than 6% and with an HLB value outside the range 0.7 to 1.7. Immediately before use in the nephelometric analysis, the reagent is then diluted with the antiserum to be used in the analysis, to provide a concentration of polyethylene glycol and non-ionic surfactant between 3 and 6%, preferably approx. 4%, and a calculated HLB value in the range 0.7 to 1.7.

De relative mengdeforhold av polyetylenglykol og ikke-ionisk overflateaktivt middel i. blandingen kan variere innenfor vide grenser, avhengig hovedsakelig av det anvendte overflateaktive middel. Blandingen inneholder fra 10 til 90 vekt% polyetylenglykol og 10 til 90% ikke-ionisk overflateaktivt middel. Fortrinnsvis inneholder blandingen 15-85% polyetylenglykol og 15 til 85% ikke-ionisk overflateaktivt middel. The relative amounts of polyethylene glycol and nonionic surfactant in the mixture can vary within wide limits, depending mainly on the surfactant used. The mixture contains from 10 to 90% by weight polyethylene glycol and 10 to 90% nonionic surfactant. Preferably, the mixture contains 15-85% polyethylene glycol and 15 to 85% nonionic surfactant.

Én eller flere forskjellige former eller typer av polyetylenglykol kan anvendes som polyetylenglykol-komponenten i blandingen. Den anvendte polyetylenglykol-polymer har vanligvis en molekylvekt fra 200 til 10.000, og fortrinnsvis fra 4.000 til 6.000. Disse materialer er kommersielt til-gjengelige, f.eks. "Carbowax" 4000 eller 6000 og PEG 4000 One or more different forms or types of polyethylene glycol may be used as the polyethylene glycol component of the mixture. The polyethylene glycol polymer used usually has a molecular weight of from 200 to 10,000, and preferably from 4,000 to 6,000. These materials are commercially available, e.g. "Carbowax" 4000 or 6000 and PEG 4000

eller 6000. Et molekylvekt-område på ca. 4000 er særlig foretrukket . or 6000. A molecular weight range of approx. 4000 is particularly preferred.

Den ikke-ioniske overflateaktive komponent i The nonionic surfactant component i

blandingen er et ikke-ionisk overflateaktivt middel som i reagensoppløsningen vil gi en beregnet HLB-verdi på 0,7 til 1,7, og fortrinnsvis 0,7 til 1,3, ved en konsentrasjon av blandingen på 3 til 6%. Som en illustrasjon kan HLB-verdiene for det ikke-ioniske overflateaktive middel selv være fra 10 til 30 eller mer. the mixture is a non-ionic surfactant which in the reagent solution will give a calculated HLB value of 0.7 to 1.7, and preferably 0.7 to 1.3, at a concentration of the mixture of 3 to 6%. By way of illustration, the HLB values of the nonionic surfactant itself may be from 10 to 30 or more.

Et særlig foretrukket ikke-ionisk overflateaktivt middel er en blokk-kopolymer av etylenoksyd og polyoksypropylen. Denne særlige polymer og fremstillingen derav er beskrevet i US-patent 2.674.619. Disse blokk-kopolymerer fremstilles generelt ved kondensering av etylenoksyd med polyoksypropylen-polymer og kan representeres ved den følgende strukturformel: A particularly preferred nonionic surfactant is a block copolymer of ethylene oxide and polyoxypropylene. This particular polymer and its preparation are described in US patent 2,674,619. These block copolymers are generally produced by condensation of ethylene oxide with polyoxypropylene polymer and can be represented by the following structural formula:

For oppfinnelsens formål inneholder disse blokk-kopolymerer hensiktsmessig minst 50% etylenoksyd i molekylet og en polyoksypropylen hydrofob grunnstamme med molekylvekt på minst 950, slik som beskrevet i U.S. patent 3.450.502, 3.577.522 og 3.590.125. For the purposes of the invention, these block copolymers suitably contain at least 50% ethylene oxide in the molecule and a polyoxypropylene hydrophobic backbone with a molecular weight of at least 950, as described in U.S. Pat. patents 3,450,502, 3,577,522 and 3,590,125.

Illustrerende eksempler på slike egnede blokk-kopolymerer er F-38 og F-68 "PLURONIC" polyoler. Illustrative examples of such suitable block copolymers are F-38 and F-68 "PLURONIC" polyols.

F-38 inneholder 80% polyoksyetylen F-38 contains 80% polyoxyethylene

hydrofile enheter i molekylet, og den hydrofobe polyoksypropylen-grunnstamme har en molekylvekt på 950. F-38 er et særlig foretrukket ikke-ionisk overflateaktivt middel. F-68 inneholder også 80% polyoksyetylen hydrofile enheter i molekylet, men den hydrofobe grunnstamme har en molekylvekt på 1.750. Den totale molekylvekt for disse to "PLURONIC" polyoler er henholdsvis 4.750 og 8.750. "PLURONIC" L-125 er også funnet egnet. En ytterligere beskrivelse av disse polyoler finnes i publikasjonen fra Wyandotte Chemicals Corporation, "The Pluronic Grid" sjette utgave. hydrophilic units in the molecule, and the hydrophobic polyoxypropylene backbone has a molecular weight of 950. F-38 is a particularly preferred nonionic surfactant. F-68 also contains 80% polyoxyethylene hydrophilic units in the molecule, but the hydrophobic backbone has a molecular weight of 1,750. The total molecular weight for these two "PLURONIC" polyols are respectively 4,750 and 8,750. "PLURONIC" L-125 has also been found suitable. A further description of these polyols can be found in the Wyandotte Chemicals Corporation publication, "The Pluronic Grid" Sixth Edition.

Når det gjelder "PLURONIC" ikke-ioniske overflateaktive midler, foretrekkes generelt en blanding bestående av 20 In the case of "PLURONIC" nonionic surfactants, a mixture consisting of 20

til 40 vekt% polyetylenglykol og 80 til 60% blokk-kopolymer av etylenoksyd og polyoksypropylen-polymer. to 40% by weight polyethylene glycol and 80 to 60% block copolymer of ethylene oxide and polyoxypropylene polymer.

En meget foretrukket reagensoppløsning inneholder ca. A highly preferred reagent solution contains approx.

en vektdel polyetylenglykol med en molekylvekt på ca. 4000 og ca. tre vektdeler av "PLURONIC" F-38 materialet. Denne opp-løsning kan fremstilles i et salt oppløsningsmiddel (f.eks. 0,9% NaCl) enten ved, over eller under den ønskede mengde på 3 til 6%, og reguleres derefter, hvis nødvendig, til den ønskede mengde på 3 til 6%. Fortrinnsvis fremstilles oppløsningen som en 8% opp-løsning av polymerblandingen i saltvann, som derefter fortynnes med antiserum (se eksemplene 1 og 5) eller et annet egnet for-tynningsmiddel før bruk ved en immunologisk prøvning. Det fortynnede reagens inneholder således ca. 1% polyetylenglykol og 3% F-38. Dets HLB-verdi på 1,115 kan beregnes som følger: one part by weight of polyethylene glycol with a molecular weight of approx. 4000 and approx. three parts by weight of the "PLURONIC" F-38 material. This solution can be prepared in a saline solvent (e.g. 0.9% NaCl) either at, above or below the desired amount of 3 to 6%, and then adjusted, if necessary, to the desired amount of 3 to 6%. Preferably, the solution is prepared as an 8% solution of the polymer mixture in saline, which is then diluted with antiserum (see Examples 1 and 5) or another suitable diluent before use in an immunological test. The diluted reagent thus contains approx. 1% polyethylene glycol and 3% F-38. Its HLB value of 1.115 can be calculated as follows:

HLB for PEG fra litteraturen er 20 The HLB for PEG from the literature is 20

<XX>HLB for F-38 fra litteraturen er 30,5 <XX>HLB for the F-38 from the literature is 30.5

De andre ikke-ioniske overflateaktive midler som The other nonionic surfactants such as

kan anvendes sammen med polyetylenglykolen i reagensoppløs- can be used together with the polyethylene glycol in the reagent solution

ningen ifølge oppfinnelsen, tilveiebringer også den ønskede HLB-verdi på 0,7 til 1,7 ved en konsentrasjon av blandingen på 3 til 6%. F.eks. er "Tetronic"-serien av ikke-ioniske overflateaktive midler, som er beskrevet i detalj i BASF Wyandotte brosjyren med tittelen "Technical Data on Tetronic Series Nonionic Surfactants" og i US-patent 2.979.528, funnet ning according to the invention, also provides the desired HLB value of 0.7 to 1.7 at a concentration of the mixture of 3 to 6%. E.g. is the "Tetronic" series of nonionic surfactants, which are described in detail in the BASF Wyandotte brochure entitled "Technical Data on Tetronic Series Nonionic Surfactants" and in US Patent 2,979,528, found

å være ganske egnet, særlig de som er identifisert som "Tetronic" 707, 908, 1107, 1307 og 1508. "Tetronic"- to be quite suitable, especially those identified as "Tetronic" 707, 908, 1107, 1307 and 1508. "Tetronic"-

produktene er basert på etylendiamin og har den generelle formel: the products are based on ethylenediamine and have the general formula:

Molekylvektområdet for "Tetronic"-produktene kan variere fra ca. 1.650 til over 26.000. De særlig foretrukne "Tetronic" overflateaktive midler har molekylvekter i området fra 15.000 til 27.000 og HLB-verdier fra 20 til 30,5. Mengde-forholdet av polyetylenglykol til "Tetronic" overflateaktivt middel i blandingen kan variere i stor utstrekning som nevnt ovenfor. The molecular weight range for the "Tetronic" products can vary from approx. 1,650 to over 26,000. The particularly preferred "Tetronic" surfactants have molecular weights in the range from 15,000 to 27,000 and HLB values from 20 to 30.5. The quantity ratio of polyethylene glycol to "Tetronic" surfactant in the mixture can vary widely as mentioned above.

En annen gruppe egnede ikke-ioniske overflateaktive Another group of suitable non-ionic surfactants

midler er "Plurafac"-produktene, særlig de som er identifisert som "Plurafac" 17R8, 25R8, D25, A38 og A39. "Plurafac"-produktene er lineære, primære, alifatiske, oksyalkylerte alkoholer som er beskrevet mer detaljert i BASF Wyandotte brosjyren med tittelen "Technical Data on Typical Physical Properties of Plurafac Nonionic Surfactants". De foretrukne "Plurafac"-produkter har HLB-verdier fra 10 til 20 og kan varieres i meget varierende forhold sammen med polyetylenglykol. agents are the "Plurafac" products, particularly those identified as "Plurafac" 17R8, 25R8, D25, A38 and A39. The "Plurafac" products are linear, primary, aliphatic, oxyalkylated alcohols which are described in more detail in the BASF Wyandotte brochure entitled "Technical Data on Typical Physical Properties of Plurafac Nonionic Surfactants". The preferred "Plurafac" products have HLB values from 10 to 20 and can be varied in widely varying proportions together with polyethylene glycol.

Andre egnede ikke-ioniske overflateaktive midler omfatter glycerol-monostearat og gruppen alkylarylsulfonater. Et foretrukket glycerol-monostearat er tilgjengelig under navnet "Arlacel" 165 (HLB = 11,0), mens et typisk egnet alkylaryl-sulfonat også er tilgjengelig under handelsnavnet "G-3300" Other suitable nonionic surfactants include glycerol monostearate and the group of alkylarylsulfonates. A preferred glycerol monostearate is available under the name "Arlacel" 165 (HLB = 11.0), while a typically suitable alkylaryl sulfonate is also available under the trade name "G-3300"

(HLB = 11,7). Alle disse overflateaktive midler tilveiebringer et reagens som ved anvendelse ved en immunologisk prøvemetode med et innhold på 3 (HLB = 11.7). All of these surfactants provide a reagent which, when used in an immunological test method with a content of 3

til 6% av en blanding av polyetylenglykol og overflateaktivt middel, har en beregnet HLB-verdi basert på verdiene for de enkelte komponenter tilstede i oppløsningen på 0,7 til 1,7, to 6% of a mixture of polyethylene glycol and surfactant, has a calculated HLB value based on the values for the individual components present in the solution of 0.7 to 1.7,

og gir den virkning at uoppløseligheten av det ønskede antigen-antistof f-kompleks økes i den utstrekning som er nødvendig for å forbedre prøvemetoden, og uten å gjøre uønskede komponenter uoppløselige eller på annen måte påvirke måleprosessen i uhel- and gives the effect that the insolubility of the desired antigen-antibody complex is increased to the extent necessary to improve the test method, and without making undesired components insoluble or otherwise adversely affecting the measurement process

dig retning. you direction.

Selvsagt kan mer enn ett ikke-ionisk overflateaktivt Of course, more than one nonionic surfactant can

middel være tilstede sammen med polyetylenglykolen, forutsatt at den fastsatte konsentrastjon av blandingen og oppløsningens HLB-verdi oppnåes. agent be present together with the polyethylene glycol, provided that the prescribed concentration of the mixture and the HLB value of the solution are achieved.

Ved valg av et ikke-ionisk overflateaktivt middel til When choosing a non-ionic surfactant to

bruk ifølge oppfinnelsen, bør man anvende et som også har evnen til å gi en klar reagensoppløsning, i det minste når reagens-oppløsningen først anvendes ved den immunologiske prøvning. use according to the invention, one should use one which also has the ability to provide a clear reagent solution, at least when the reagent solution is first used in the immunological test.

Dette er for å sikre at reagenset ikke innvirker på prøveres-ultatene eller frembringer ikke-spesifikk felning av komponenter av den biologiske prøve eller biologiske reagenser som anvendes i målesystemet. This is to ensure that the reagent does not influence the sample results or produce non-specific precipitation of components of the biological sample or biological reagents used in the measurement system.

Reagenssystemet ifølge oppfinnelsen kan anvendes i ut-strakt grad ved forbedring av vanlige immunologiske prøvemetoder som på et eller annet tidspunkt, av en eller annen grunn, krever uoppløseliggjørelse av antigen-antistoff-komplekset som dannes under prøveprosessen ved antigen-antistoff-reaksjonen. Slike målemetoder er velkjente for fagfolk og skal her ikke beskrives i detalj. Anvendbarheten og nytten av foreliggende oppfinnelse ved disse forskjellige målemetoder, og detaljer vedrørende hvor-dan reagenset ifølge oppfinnelsen skal anvendes ved slike metoder, vil være åpenbare for fagfolk på grunnlag av denne beskrivelse og skal derfor ikke gjentaes i noen utstrekning her. F.eks. kan reagenset ifølge oppfinnelsen anvendes for å forbedre ethvert system som er avhengig av utfelning av antigen-antistoff-komplekser for å gi en klar væske på toppen, for fluorescens eller kolori-metrisk påvisning. Reagenset bør også kunne anvendes for å fjerne innvirkende stoffer som finnes i biologiske væsker eller reagenser The reagent system according to the invention can be used to a large extent in the improvement of common immunological test methods which at one time or another, for one reason or another, require insolubilization of the antigen-antibody complex which is formed during the test process by the antigen-antibody reaction. Such measurement methods are well known to professionals and shall not be described in detail here. The applicability and usefulness of the present invention in these different measurement methods, and details regarding how the reagent according to the invention is to be used in such methods, will be obvious to those skilled in the art on the basis of this description and shall therefore not be repeated to any extent here. E.g. the reagent of the invention can be used to improve any system that relies on the precipitation of antigen-antibody complexes to provide a clear liquid on top, for fluorescence or colorimetric detection. The reagent should also be able to be used to remove interfering substances found in biological fluids or reagents

(f.eks. lipider, salter og fremmede proteiner) for nefelometri, enzymatiske eller andre målesystemer. Dette oppnåes ved å fjerne reagensene fra reaksjonsoppløsningen for å vaske og suspendere disse reagenser på nytt. (e.g. lipids, salts and foreign proteins) for nephelometry, enzymatic or other measurement systems. This is achieved by removing the reagents from the reaction solution to wash and resuspend these reagents.

Spesielt kan reagenset ifølge oppfinnelsen anvendes for In particular, the reagent according to the invention can be used for

å øke den relative konsentrasjon av uoppløselige antigen-antistoff-komplekser og øke et gitt målesystems prøveområde og følsomhet. Disse prinsipper kan anvendes på kvantitativ lysspredning fra immun-komplekser ved nefelometri, og dette er for tiden en foretrukket utførelsesform for oppfinnelsen. Nefelometriske analyser hvor man anvender reagenset ifølge oppfinnelsen, er særlig nyttige ved analyse av forskjellige immunoglobuliner. Imidlertid kan andre prøvesystemer som er basert på utfelning av antistoffer, ut-nytte disse reagenser, så som radioimmunodiffusjon (RID), enzymatiske analyser og forskjellige typer av elektroforetiske teknikker så som immunoelektroforese (IEP), motelektroforese (CEP) og elektroimmunodiffusjon (EID). to increase the relative concentration of insoluble antigen-antibody complexes and to increase the sample range and sensitivity of a given measurement system. These principles can be applied to quantitative light scattering from immune complexes by nephelometry, and this is currently a preferred embodiment of the invention. Nephelometric analyzes using the reagent according to the invention are particularly useful when analyzing different immunoglobulins. However, other test systems based on antibody precipitation may utilize these reagents, such as radioimmunodiffusion (RID), enzymatic assays and various types of electrophoretic techniques such as immunoelectrophoresis (IEP), counterelectrophoresis (CEP) and electroimmunodiffusion (EID).

Reagenset ifølge oppfinnelsen kan f.eks. anvendes for å forbedre immunologiske prøvninger som ér avhengig av den primære innvirkning av antigen-antistoff-samutfellingsteknikk som vanligvis anvendes ved radioimmunomålinger (RIA). Denne forbedrede uoppløselighet som oppnåes ifølge oppfinnelsen, kan også utnyttes for forskjellige metoder for å binde antistoffer eller antigen til inerte partikler som anvendes som bærer ved RIA, nefelometrisk og fluorometrisk målning på en måte som lett vil forståes av fagfolk. The reagent according to the invention can e.g. are used to improve immunological assays that rely on the primary impact of the antigen-antibody co-precipitation technique commonly used in radioimmunoassays (RIA). This improved insolubility achieved according to the invention can also be utilized for various methods of binding antibodies or antigen to inert particles used as carriers in RIA, nephelometric and fluorometric measurement in a manner that will be easily understood by those skilled in the art.

Tallrike radioimmunomålninger er anvendt for å bestemme kvantitativt relativt små konsentrasjoner av biologiske bestanddeler som finnes i kroppsvæsker. Isotop-merket antigen eller antistoff bringes til å reagere med det homologe antigen eller antiserum for å danne merkede immun-antigen-antistoff-komplekser. Disse komplekser må derefter normalt gjøres'uoppløselige ved hjelp av en uoppløselig bærer, felningsreagens eller på annen kjent metode. Det frie eller ureagerte, merkede antigen eller antistoff kan fjernes ved forskjellige vaskemetoder. Den radioaktive konsentrasjon av de utfelte komplekser bestemmes derefter ved gamma-eller væske-scintillasjons telling. Et eksempel på et instrument som anvendes for målninger av denne type, er Auto Gamma Counter Reagenset i henhold til Numerous radioimmunoassays have been used to quantitatively determine relatively small concentrations of biological constituents found in body fluids. Isotopically labeled antigen or antibody is reacted with the homologous antigen or antiserum to form labeled immune-antigen-antibody complexes. These complexes must then normally be rendered insoluble by means of an insoluble carrier, precipitation reagent or by other known methods. The free or unreacted, labeled antigen or antibody can be removed by various washing methods. The radioactive concentration of the precipitated complexes is then determined by gamma or liquid scintillation counting. An example of an instrument used for measurements of this type is the Auto Gamma Counter Reagent according to

oppfinnelsen er nyttig til å forsterke den nødvendige uoppløselig- the invention is useful in enhancing the necessary insoluble

gjørelse av komplekset, slik at analysen forbedres. Det føl-gende eksempel 6 illustrerer anvendelse av reagenset ifølge oppfinnelsen ved en radioimmunomålning. making the complex, so that the analysis is improved. The following example 6 illustrates the use of the reagent according to the invention in a radioimmunoassay.

Enzymatiske teknikker er også anvendt for å bestemme kvantitativt små konsentrasjoner av biologiske bestanddeler som finnes i kroppsvæsker. Enzym-merket antigen eller antistoff bringes til å reagere med det spesifikke antistoff eller antigen for å danne immune merkede antigen-antistoff-komplekser. Disse komplekser gjøres uoppløselige ved hjelp av en uoppløselig bærer, et felningsmiddel eller på annet måte. Det frie eller ureagerte enzym-merkede antistoff eller antigen kan fjernes ved forskjellige vaskemetoder. Det bundne eller reagerte enzym kan derefter frem-bringe en reaksjon med et passende substrat for å danne en farvet eller fluorescerende oppløsning på toppen, som kan måles med et spectrofotometer eller fluorometer. Eksempler på instrumenter som er nyttige for dette formål, er Beckman DB Spectrophotometer (tilgjengelig fra Beckman Instruments, Inc.) og Aminco-Bowman Spectrophotofluorometer (tilgjengelig fra American Instrument Company). Reagenset ifølge oppfinnelsen er også nyttig til å forbedre det nødvendige trinn med uoppløseliggjørelse av komplekset slik at analysen forbedres. Enzymatic techniques have also been used to determine quantitatively small concentrations of biological constituents found in body fluids. Enzyme-labeled antigen or antibody is reacted with the specific antibody or antigen to form immune labeled antigen-antibody complexes. These complexes are made insoluble by means of an insoluble carrier, a precipitating agent or by other means. The free or unreacted enzyme-labeled antibody or antigen can be removed by various washing methods. The bound or reacted enzyme can then react with a suitable substrate to form a colored or fluorescent solution on top, which can be measured with a spectrophotometer or fluorometer. Examples of instruments useful for this purpose are the Beckman DB Spectrophotometer (available from Beckman Instruments, Inc.) and the Aminco-Bowman Spectrophotofluorometer (available from American Instrument Company). The reagent according to the invention is also useful in improving the necessary step of insolubilization of the complex so that the analysis is improved.

Nytten av reagenset ved en nefelomtrisk analyse er beskrevet i detalj ovenfor og er videre illustrert i det følgende eksempel 5 . The usefulness of the reagent in a nephelometric analysis is described in detail above and is further illustrated in the following example 5.

Det vil være klart for fagfolk at det forbedrede immunologiske reagens ifølge oppfinnelsen har en omfattende anvendelse på området immunologiske prøvemetoder. Under anvendelse av det forbedrede reagens kan den kliniske teknikker foreta nøyaktig bestemmelse av et bredt område av konsentrasjoner av mange spesifikke proteiner, f.eks. immunoglobulinene IgG, IgA, IgM, transferrin, komplement C2 , haptoglobin, a-^-antitrypsin, 3-lipoprotein, albumin, a^- makroglobulin, a^-syre glykoprotein og forskjellige andre biologiske bestanddeler så som trijodtyonin (T^), tyroksin (T^), triglycerider, menneskelige chorione gonadotropiner, lipo-proteiner, og mange andre , hvis bestemmelse vil dra fordel av den økede uoppløseliggjørelsesvirkning som oppnåes ved hjelp av foreliggende oppfinnelse. It will be clear to those skilled in the art that the improved immunological reagent according to the invention has extensive application in the field of immunological test methods. Using the improved reagent, the clinical technician can accurately determine a wide range of concentrations of many specific proteins, e.g. the immunoglobulins IgG, IgA, IgM, transferrin, complement C2, haptoglobin, a-^-antitrypsin, 3-lipoprotein, albumin, a^- macroglobulin, a^-acid glycoprotein and various other biological components such as triiodothyone (T^), thyroxine (T^), triglycerides, human chorionic gonadotropins, lipoproteins, and many others, the determination of which will benefit from the increased insolubilization effect achieved by the present invention.

På de fleste områder hvor oppfinnelsen kan utnyttes, blandes den ønskede biologiske bestanddel eller bestanddeler med den vandige reagensoppløsning ifølge oppfinnelsen, inkuberes i en forhåndsbestemt periode som f.eks. ved romtemperatur (20-25°C) In most areas where the invention can be utilized, the desired biological component or components are mixed with the aqueous reagent solution according to the invention, incubated for a predetermined period such as e.g. at room temperature (20-25°C)

i ca. 1 time, og derefter foretaes avlesning på et passende instrument, f.eks. et nefelometer ved en nefelometrisk analyse. Resultatene av måleprøvene sammenlignes med referanseprøver for å bestemme den ukjente konsentrasjon. for about. 1 hour, and then a reading is taken on a suitable instrument, e.g. a nephelometer in a nephelometric analysis. The results of the measurement samples are compared with reference samples to determine the unknown concentration.

De følgende eksempler skal tjene til å illustrere oppfinnelsen ytterligere. The following examples shall serve to further illustrate the invention.

EKSEMPEL 1 EXAMPLE 1

En reagensoppløsning fremstilles ved å blande 25 vektdeler polyetylenglykol med en molekylvekt på 4.000 med 75 vektdeler "PLURONIC" F-38, og blandingen oppløses i normalt saltvann (0,9% NaCl) til en konsetnrasjon på 8 vekt% av blandingen. Denne oppløsning kan enten fortynnes, f.eks. med antiserum, til en blandingskonsentrasjon på 4% (HLB-forhol - 1,115) som i trinn 3 av eksempel 5 nedenfor, før inkubering, og anvendes direkte ved en immunologisk målning, eller den kan holdes i 8% formen inntil den er klar til bruk. A reagent solution is prepared by mixing 25 parts by weight of polyethylene glycol with a molecular weight of 4,000 with 75 parts by weight of "PLURONIC" F-38, and the mixture is dissolved in normal saline (0.9% NaCl) to a concentration of 8% by weight of the mixture. This solution can either be diluted, e.g. with antiserum, to a mixture concentration of 4% (HLB ratio - 1.115) as in step 3 of Example 5 below, before incubation, and used directly in an immunological assay, or it can be kept in the 8% form until ready for use .

EKSEMPEL 2 EXAMPLE 2

Eksempel 1 gjentaes, bortsett fra at polyetylenglykol med en molekylvekt på 6.000 anvendes istedenfor en ekvivalent mengde av 4.000 materialet. Example 1 is repeated, except that polyethylene glycol with a molecular weight of 6,000 is used instead of an equivalent amount of the 4,000 material.

EKSEMPEL 3 EXAMPLE 3

Eksempel 1 gjentaes bortsett fra at "PLURONIC" F-68 anvendes istedenfor en ekvivalent mengde av F-38. Example 1 is repeated except that "PLURONIC" F-68 is used instead of an equivalent amount of F-38.

EKSEMPEL 4 EXAMPLE 4

Eksempel 1 gjentaes bortsett fra at "TETRONIC" 707, 908, 1107, 1307, 1508; "PLURAFAC"17R8, 25R8, D25, A38 og A39; "PLURONIC" L125, "ARLACEL" 165; og "G-3300" ble anvendt istedenfor F-38 i varierende mengder i en serie av forsøk for å fremstille en rekke forskjellige reagensoppløsninger. Example 1 is repeated except that "TETRONIC" 707, 908, 1107, 1307, 1508; "PLURAFAC" 17R8, 25R8, D25, A38 and A39; "PLURONIC" L125, "ARLACEL" 165; and "G-3300" was used in place of F-38 in varying amounts in a series of experiments to prepare a variety of different reagent solutions.

EKSEMPEL 5 EXAMPLE 5

De immunologiske reagensoppløsninger fremstilt i eksemplene 1 til 4 anvendes ved separate nefelometriske målninger av immunoglobuliner (IgA, IgG, IgM), komplement C3 og transferrin, idet hver målning utføres som følger: 1. Referanse kontroller //■ 1, VÅ 2, # 3, -/ A 4 , 5, 7^6 (med kjent innhold) for hver av nevnte biologiske bestanddeler fortynnes 1:100 i saltvann. 2. De ukjente prøver fortynnes derefter på samme måte 1:100 i saltvann. 3. Forhåndsfortynnede antiserumer til IgG, IgM, IgA, C3 og transferrin fortynnes hver 1:2 med 8% blandingen av det immunologiske reagens fra eksemplene 1, 2, 3, eller 4 (eftersom det passer) og blandes ved å bli vendt opp ned, for å gi en konsentrasjon på 4% av polyetylenglykol og ikke-ionisk overflateaktivt middel i oppløsningen og en beregnet HLB mellom 0,7 og 1,7 i alle tilfeller. 4. Antiserumet filtreres gjennom et 0,45y "Millipore" filter. 5. En serie av prøverør (10 mm x 75 mm kultur-rør som kan kastes efter bruk), passende merket blindprøve, referanse kontroller nummer #1, #2, #3, 7£ 4 , / A 5, //■ 6 , og ukjente prøver gjøres i stand. 6. Til hvert rør settes 1 ml av den fortynnede blanding av antiserum og reagenset fremstilt i trinn 3. 7. Til det passende rør settes 25pl av referanse og ukjente fortynninger for IgG, IgA og transferrin (100 yl for IgM og C3) . 8. Det passende blindprøverør tilsettes tilsvarende 25 eller 100 )il saltvann. 9. For å oppnå blanding snues rørene opp ned, og de inkuberes i 1 time ved romtemperatur (20-25°C). 10. Blindprøver fremstilles ved å anvende 1 ml av de fil-trerte reagenser fra eksemplene 1 til 4 fremstilt som i trinn 3, bortsett fra at 8% oppløsningen ble fortynnet med saltvann istedenfor antiserum. Blindprøvene anbrin-ges i identisk merkede rør som før trinnene (5 og 6). 11. De samme referanse- og prøvevolumer settes til hver rør som før (trinn 7). 12. Alle rør avleses i "Laser Nephelometer PDQ" (Hyland The immunological reagent solutions prepared in examples 1 to 4 are used in separate nephelometric measurements of immunoglobulins (IgA, IgG, IgM), complement C3 and transferrin, each measurement being carried out as follows: 1. Reference controls //■ 1, VÅ 2, # 3 , -/ A 4 , 5, 7^6 (with known content) for each of the biological components mentioned is diluted 1:100 in salt water. 2. The unknown samples are then diluted in the same way 1:100 in salt water. 3. Prediluted antisera to IgG, IgM, IgA, C3, and transferrin are each diluted 1:2 with the 8% mixture of the immunological reagent from Examples 1, 2, 3, or 4 (as appropriate) and mixed by inversion , to give a concentration of 4% of polyethylene glycol and nonionic surfactant in the solution and a calculated HLB between 0.7 and 1.7 in all cases. 4. The antiserum is filtered through a 0.45 µm "Millipore" filter. 5. A series of test tubes (disposable 10 mm x 75 mm culture tubes), appropriately labeled blank, reference control number #1, #2, #3, 7£ 4 , / A 5, //■ 6 , and unknown samples are prepared. 6. Add 1 ml of the diluted mixture of antiserum and the reagent prepared in step 3 to each tube. 7. Add 25 µl of reference and unknown dilutions for IgG, IgA and transferrin (100 µl for IgM and C3) to the appropriate tube. 8. The appropriate blank test tube is added corresponding to 25 or 100 )l of salt water. 9. To achieve mixing, the tubes are turned upside down, and they are incubated for 1 hour at room temperature (20-25°C). 10. Blank samples are prepared by using 1 ml of the filtered reagents from examples 1 to 4 prepared as in step 3, except that the 8% solution was diluted with saline instead of antiserum. The blank samples are placed in identically labeled tubes as before steps (5 and 6). 11. The same reference and sample volumes are added to each tube as before (step 7). 12. All tubes are read in "Laser Nephelometer PDQ" (Hyland

Laboratories) for relativ prosent lysspredning. Laboratories) for relative percentage light scattering.

13. Blindprøvene avleses og subtraheres elektronisk fra reaksjonsverdiene av instrumentet. 14. Referanseresultatene avmerkes på lineært kurvepapir som relativ prosent lysspredning som funksjon av konsentrasjonen av referansene. 15. De ukjente verdier bestemmes ved avlesning fra refer-ansekurven. 13. The blank samples are read and subtracted electronically from the reaction values of the instrument. 14. The reference results are marked on linear graph paper as relative percent light scattering as a function of the concentration of the references. 15. The unknown values are determined by reading from the reference curve.

De immunologiske reagenser ifølge oppfinnelsen som anvendes ved denne undersøkelse, ga vesentlig bedre utfelning antigen-anti-stof f-kompleksene, mer lineæritet over et større område og høyere følsomhet enn hva som ble oppnådd med et reagens inneholdende polyetylenglykol alene. The immunological reagents according to the invention that are used in this investigation gave significantly better precipitation of the antigen-antibody f-complexes, more linearity over a larger area and higher sensitivity than was achieved with a reagent containing polyethylene glycol alone.

EKSEMPEL 6 EXAMPLE 6

Dette eksempel beskriver anvendelse av det immunologiske reagens ifølge oppfinnelsen ved en radioimmunomålning for bestemmelse av menneskelig tyroid-stimulerende hormon (HTSH). This example describes the use of the immunological reagent according to the invention in a radioimmunoassay for the determination of human thyroid-stimulating hormone (HTSH).

En prøve av det immunologiske reagens ifølge oppfinnelsen ble fremstilt ved å blande 8,4 ml av en 5% oppløsning av polyetylenglykol i 0,9% saltoppløsning med 20 ml av 6% "Pluronic" A sample of the immunological reagent according to the invention was prepared by mixing 8.4 ml of a 5% solution of polyethylene glycol in 0.9% saline with 20 ml of 6% "Pluronic"

F-38 ikke-ionisk overflateaktivt middel. Blandingens volum ble derefter regulert til 30 ml med 0,9% saltoppløsning for å gi en endelig reagenskonsentrasjon på 1,4% polyetylenglykol og 4,2% F-38. F-38 nonionic surfactant. The volume of the mixture was then adjusted to 30 ml with 0.9% saline to give a final reagent concentration of 1.4% polyethylene glycol and 4.2% F-38.

Radioimmunomålningen ble foretatt som følger: The radioimmunoassay was carried out as follows:

0,050 ml av kanin-anti-HTSH absorbert med menneskelig choriont gonadotropin (HCG) ble blandet med 200 ml HTSH standarder av varierende styrke. 0,050 ml fosfat buffer, pH 7,4, ble derefter satt til blandingen, og blandingen ble inkubert i 2 timer ved 37°C. 0.050 ml of rabbit anti-HTSH absorbed with human chorionic gonadotropin (HCG) was mixed with 200 ml of HTSH standards of varying strengths. 0.050 ml of phosphate buffer, pH 7.4, was then added to the mixture, and the mixture was incubated for 2 hours at 37°C.

På dette tidspunkt ble 0,100 ml HTSH merket med I<125> tilsatt, og blandingen ble inkubert videre i 3 timer ved 37°C. 1,0 ml av reagenset ifølge oppfinnelsen fremstilt ovenfor ble derefter tilsatt, og blandingen ble inkubert i 1 time ved romtemperatur. På grunn av fortynning av reagenset ved tilsetning av blandingen ble konsentrasjonen av polyetylenglykol og F-38 redusert fra 1,4 og 4,2% til henholdsvis 1 og 3 vekt%. Blandingen ble sentrifugert ved 1000 x 9 i 10 minutter. Hvis en vasking av de sentrifugerte, faste stoffer er nødvendig, må vaskeoppløsningen inneholde den samme konsentrasjon som reagenset ifølge oppfinnelsen på det tidspunkt reagenset først ble anvendt ved målningen, dvs. 1% polyetylenglykol og 3% F-38. Væsken på toppen ble derefter av-dekantert, og bunnfallet ble tellet. Denne prosess ble gjentatt for en rekke forskjellige HTSH standarder, og man fikk en standard kurve ved å avmerke tellingene oppnådd i forskjellige bunnfall som funksjon av konsentrasjonen av tilsvarende HTSH standard . At this point, 0.100 ml of HTSH labeled with I<125> was added, and the mixture was further incubated for 3 hours at 37°C. 1.0 ml of the reagent of the invention prepared above was then added, and the mixture was incubated for 1 hour at room temperature. Due to dilution of the reagent when adding the mixture, the concentration of polyethylene glycol and F-38 was reduced from 1.4 and 4.2% to 1 and 3% by weight, respectively. The mixture was centrifuged at 1000 x 9 for 10 minutes. If a washing of the centrifuged solids is necessary, the washing solution must contain the same concentration as the reagent according to the invention at the time the reagent was first used in the measurement, i.e. 1% polyethylene glycol and 3% F-38. The liquid on top was then decanted off, and the precipitate was counted. This process was repeated for a number of different HTSH standards, and a standard curve was obtained by marking off the counts obtained in different precipitates as a function of the concentration of the corresponding HTSH standard.

Efter at standard kurven var oppnådd, ble målningen foretatt på ukjente måleprøver under anvendelse av fremgangsmåten beskrevet ovenfor, bortsett fra at HTSH standarden ble erstattet med måleprøven. HTSH mengden i måleprøven kunne derefter lett bestemmes på grunnlag av posisjonen av bunnfall-tellingen på standard kurven., After the standard curve had been obtained, the measurement was made on unknown test samples using the method described above, except that the HTSH standard was replaced with the test sample. The HTSH amount in the measurement sample could then be easily determined on the basis of the position of the precipitate count on the standard curve.,

Anvendelse av reagensoppløsningen ifølge oppfinnelsen Use of the reagent solution according to the invention

øket mengden av bunnfall som ble dannet i forhold til det som oppnåes med et reagens inneholdende polyetylenglykol alene, og resulterte i en forbedret radioimmunomålning. increased the amount of precipitate formed compared to that obtained with a reagent containing polyethylene glycol alone, and resulted in an improved radioimmunoassay.

Passende nefelometriske målningsresultater kan også oppnåes uten tilstedeværelse av polyetylenglykol, f.eks. med en vandig oppløsning inneholdende ca. 4 vekt% av blokk-kopolymeren av etylenoksyd og polyoksypropylen-polymer. Blandingen av blokk-kopolymer og polyetylenglykol beskrevet ovenfor, foretrekkes imidlertid for å oppnå optimale resultater. Appropriate nephelometric measurement results can also be obtained without the presence of polyethylene glycol, e.g. with an aqueous solution containing approx. 4% by weight of the block copolymer of ethylene oxide and polyoxypropylene polymer. However, the mixture of block copolymer and polyethylene glycol described above is preferred to obtain optimal results.

Det ble foretatt forsøk for å sammenligne forskjellene Attempts were made to compare the differences

i graden av antigen-antistoff-kompleks-utfeining som ble oppnådd ved en immunologisk reaksjon utført i nærvær av (1) kombinasjonen av polyetylenglykol (PEG) og ikke-ionisk overflateaktivt middel, (2) PEG alene og (3) det ikke-ioniske overflateaktive middel alene. På grunnlag av de data som ble oppnådd med PEG alene og det ikke-ioniske overflateaktive middel alene, ble den ventede virkning av en kombinasjon av PEG og det ikke-ioniske overflateaktive middel beregnet og sammenlignet med den observerte virkning for kombinasjonen av PEG og ikke-ionisk overflateaktivt middel, for å bestemme hvorvidt den observerte virkning var i overens-stemmelse med den beregnede (eller ventede) virkning. in the degree of antigen-antibody complex scavenging achieved by an immunological reaction performed in the presence of (1) the combination of polyethylene glycol (PEG) and nonionic surfactant, (2) PEG alone, and (3) the nonionic surfactant alone. On the basis of the data obtained with PEG alone and the nonionic surfactant alone, the expected effect of a combination of PEG and the nonionic surfactant was calculated and compared with the observed effect of the combination of PEG and non- ionic surfactant, to determine whether the observed effect was in accordance with the calculated (or expected) effect.

Resultatene oppnådd med "Pluronic F-38" som overflateaktivt middel er illustrert i det følgende: The results obtained with "Pluronic F-38" as surfactant are illustrated in the following:

Tilsvarende resultater ble også oppnådd med Corresponding results were also obtained with

"Tetronix 707", "Tetronix 1107", "Tetronix 1307" og "Tetronix 1508" opp til IgG-nivåer på 1200 mg/dl. "Tetronix 707", "Tetronix 1107", "Tetronix 1307" and "Tetronix 1508" up to IgG levels of 1200 mg/dl.

For "Plurafac A-38" ble tilsvarende resultater oppnådd for IgA-nivåer på opptil 600 mg/dl, mens lineariteten opphørte For "Plurafac A-38" similar results were obtained for IgA levels up to 600 mg/dl, while the linearity ceased

ved høyere verdier. at higher values.

Betydningen av disse resultater er at den virkelige kurve som iakttas for polymerblandingen har en sterkt øket linearitet eller kontinuitet sammenlignet med den ventede kurve. Et lineært forhold mellom prosent lysspredning og konsentrasjonen av antigen eller immunokomponenter som analyseres, er av avgjørende betydning for en diagnosemetode som skal være nyttig. Jo bredere det lineære område er, desto bredere er analyse-området. The significance of these results is that the real curve observed for the polymer mixture has a greatly increased linearity or continuity compared to the expected curve. A linear relationship between percent light scattering and the concentration of antigen or immunocomponents being analyzed is of decisive importance for a diagnostic method that should be useful. The wider the linear range, the wider the analysis range.

Claims

1. Immunological reagent for examination of antigen-antibody reactions when incubating the material to be examined, in the presence of the reagent which reduces the solubility of the antigen-antibody complex, characterized in that the reagent contains from 3 to 6% by weight of a mixture containing 10 to 90% by weight of polyethylene glycol and 90 to 10% by weight of a non-ionic surfactant selected from a) a block copolymer of ethylene oxide and polyoxypropylene, b) linear primary aliphatic oxyalkylated alcohols, c) glycerol monostearate, d) polyols of the formula and e) alkylaryl sulfonates.

2. Reagent according to claim 1, characterized in that the mixture is an aqueous solution containing an antiserum.