NO149604B

NO149604B - ELECTRIC CIRCUIT FOR DIGITALIZATION OF DATA

Info

Publication number: NO149604B
Application number: NO774251A
Authority: NO
Inventors: Kenneth Robson Brown
Original assignee: Ferranti Ltd
Priority date: 1976-12-18
Filing date: 1977-12-12
Publication date: 1984-02-06
Also published as: DE2755492C2; FR2374694A1; DE2755492A1; JPS5395081A; IN147458B; NO774251L; CA1106971A; GB1558092A; FR2374694B1; JPS596395B2; NO149604C

Abstract

Elektrisk krets for digitalisering av data.Electrical circuit for digitization of data.

Description

Fremgangsmåte til stabilisering av antigene viruspreparater. Method for stabilizing antigenic virus preparations.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til stabilisering av labile, antigene The present invention relates to a method for stabilizing labile antigens

viruspreparater. virus preparations.

Da kommersielle viruspreparater har en As commercial virus preparations have a

generell tendens til å svekkes i antigen styrke general tendency to weaken in antigenic strength

under lagring, har det tidligere vært fore-slått å tilsette dem et stabiliserende stoff for during storage, it has previously been suggested to add a stabilizing substance to them

å opprettholde og stabilisere styrken gjennom to maintain and stabilize strength throughout

lengere tid. Forskjellige stabiliseringsmidler longer time. Various stabilizers

har vært beskrevet for dette formål. Således have been described for this purpose. Thus

foreslåes der i henhold til US patentskrift is proposed there according to the US patent

2 879 202 innlemmelse av en seksverdig alkohol 2,879,202 incorporating a hexavalent alcohol

såsom sorbitol for stabilisering av vaksine inneholdende levende vira. Problemet er kompli-sert fordi der ved vaksinefremstilling kan være such as sorbitol for stabilization of vaccine containing live viruses. The problem is complicated because there can be during vaccine production

nødvendig med fremstillingstrinn hvor vaksi-neblandingen frysetørres for å oppnå et ikke-vandig produkt, eller ganske enkelt fryses for required manufacturing steps where the vaccine mixture is freeze-dried to obtain a non-aqueous product, or simply frozen for

å oppnå en tilstand av maksimal stabilitet og to achieve a state of maximum stability and

derpå opptines efter behov. Når mengden av then adjusted as needed. When the amount of

vaksineblanding overskrider den mengde som vaccine mixture exceeds the amount which

kreves for umiddelbar påfylling i begere, hvil-ket som regel vil være tilfelle ved kommersiell required for immediate filling in cups, which will usually be the case in commercial cases

fremstilling, må overskuddet av vaksine fryses påny og oppbevares som sådan, inntil man manufacture, the surplus of vaccine must be frozen again and stored as such, until Mon

har behov for ytterligere vaksine. Dette med-fører uvegerlig et antall av fryse- og opptiningssykluser, hvilke i fravær av et egnet need additional vaccination. This inevitably entails a number of freezing and thawing cycles, which in the absence of a suitable one

stabiliseringsmiddel har en skadelig virkning stabilizer has a harmful effect

og fører til for tidlig tap av antigen styrke. I and leads to premature loss of antigenic strength. IN

denne forbindelse er det kjent at høye konsentrasjoner av salter har skadelig virkning på in this connection, it is known that high concentrations of salts have a harmful effect on

den antigene styrke. Anvendelse av salter som the antigenic strength. Application of salts which

stabiliseringsmidler har derfor vært frarådet. stabilizers have therefore been discouraged.

Saltkonsentrasjon er et særlig problem ved Salt concentration is a particular problem in

tørring da den progressivt øker under bort- drying as it progressively increases during removal

skaffelsen av vann fra det vandige produkt, hvorved de antigene faktorer i økende grad utsettes for mulige skadelige påvirkninger. Til-setning av salter har ytterligere den virkning at den medfører en minskning av temperatu-ren ved hvilken det væskeformige produkt kan overføres til fast tilstand. Likeledes frarådes hygroskopiske materialer, da disse i høy konsentrasjon danner siruper som er vanskelige å behandle, spesielt under tørkeoperasjonen. the acquisition of water from the aqueous product, whereby the antigenic factors are increasingly exposed to possible harmful influences. Addition of salts further has the effect of causing a reduction in the temperature at which the liquid product can be transferred to a solid state. Likewise, hygroscopic materials are not recommended, as these in high concentration form syrups that are difficult to process, especially during the drying operation.

Det har nu imidlertid overraskende vist seg at der ved innlemmelse av en mindre mengde av et bestemt salt, nemlig kalsiumlactobionat, i et flytende virusmateriale, som eventuelt også kan inneholde visse andre materialer med stabiliserende virkning, oppnåes et viruspreparat som kan underkastes sukses-sive fryse- og opptiningsoperasjoner uten vesentlig tap av antigen styrke. However, it has now surprisingly been shown that by incorporating a small amount of a specific salt, namely calcium lactobionate, into a liquid virus material, which may also contain certain other materials with a stabilizing effect, a virus preparation is obtained which can be subjected to successive freezing - and thawing operations without significant loss of antigenic strength.

Ved hjelp av oppfinnelsen skaffes der således en fremgangsmåte til stabilisering av labile, antigene viruspreparater, ved hvilken der til et flytende, antigent virusmateriale eventuelt tilsettes 10—50 g/l protein eller polypeptid eller 20—100 g/l lactose, og som ut-merker seg ved at der til det flytende, antigene virusmateriale tilsettes kalsiumlactobionat i en mengde av minst 1 g/l, og at den erholdte blanding fryses. With the help of the invention, a method for stabilizing labile, antigenic virus preparations is thus obtained, whereby 10-50 g/l protein or polypeptide or 20-100 g/l lactose is optionally added to a liquid, antigenic virus material, and which characterized by the fact that calcium lactobionate is added to the liquid, antigenic virus material in an amount of at least 1 g/l, and that the resulting mixture is frozen.

Produktene som fåes i henhold til oppfinnelsen, og som inneholder kalsiumlactobionat, er antigent stabile og beholder den ønskede styrke gjennom lengre tid. Da tilstedeværelse av salter i vaksiner og antigene materialer vanligvis er ugunstig, er det overraskende at poduktene erholdt ifølge oppfinnelsen som inneholder det tilsatte salt kalsiumlactobionat, er bedre enn tilsvarende preparater som ikke inneholder kalsiumlactobionat; med hensyn til antigenstabilitet. De væskeformige antigener som fåes ifølge oppfinnelsen kan dessuten overføres til et tørt, flaket pulver uten dan-nelse av vanskelig håndterbare siruper eller andre hygroskopiske former. En annen uven-tet fordel består i at produktene som fåes ifølge oppfinnelsen, i motsetning til mange ty-per vaksiner som det i alminnelighet er nød-vendig å fryse og holde ved ekstremt lave temperaturer for å oppnå maksimal stabilitet under lagring, kan holdes i frosset tilstand ved betydelig høyere temperaturer i lang tid uten vesentlig tap av styrke. Eksempelvis må vanlig meslingvaksine, som vanligvis inneholder en liten mengde kalsiumklorid, holdes ved temperaturer lavere enn ca. -4-60°. Ved høyere temperaturer tapes den antigene virkning raskt og så å si fullstendig. I motsetning hertil kan meslingvaksine tilberedt i henhold til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen bekvemt oppbevares ved temperaturer opp til ca. -4-20°. Ved disse høyere temperaturer oppnåes maksimal stabilitet. Dessuten kan produktene erholdt ifølge oppfinnelsen underkastes sukses-sive fryse- og opptiningssykluser, uten tap av noen betydning av antigen styrke. The products obtained according to the invention, which contain calcium lactobionate, are antigenically stable and retain the desired strength over a longer period of time. As the presence of salts in vaccines and antigenic materials is usually unfavorable, it is surprising that the products obtained according to the invention containing the added salt calcium lactobionate are better than corresponding preparations which do not contain calcium lactobionate; with regard to antigen stability. The liquid antigens obtained according to the invention can also be transferred to a dry, flaky powder without the formation of difficult-to-handle syrups or other hygroscopic forms. Another unexpected advantage consists in the fact that the products obtained according to the invention, in contrast to many types of vaccines which it is generally necessary to freeze and keep at extremely low temperatures in order to achieve maximum stability during storage, can be kept in frozen state at significantly higher temperatures for a long time without significant loss of strength. For example, ordinary measles vaccine, which usually contains a small amount of calcium chloride, must be kept at temperatures lower than approx. -4-60°. At higher temperatures, the antigenic effect is lost quickly and, so to speak, completely. In contrast, measles vaccine prepared according to the method according to the invention can be conveniently stored at temperatures up to approx. -4-20°. At these higher temperatures, maximum stability is achieved. Moreover, the products obtained according to the invention can be subjected to successive freezing and thawing cycles, without any significant loss of antigenic strength.

Oppfinnelsen kan anvendes til fremstilling av virusvaksiner innbefattende levende, svek-kede virus-vaksiner og drepte virusvaksiner. Som eksempler på de mange vaksiner oppfinnelsen kan anvendes på, kan nevnes vaksiner mot polyomyelitt, meslinger, smittsom leverbetennelse (hepatitis), gul feber, kusma, hundegalskap og kopper. Slike vaksiner, som for oppfinnelsens formål kan være ustabili-serte eller delvis stabiliserte, kan fremstilles ved hjelp av på området kjente fremgangsmåter. Oppfinnelsen kan også anvendes til stabilisering av utgangsmaterialer for virus-vaksiner, så som viruskultur-filtrater, — sen-trifugater og lignende uferdige virusvaksiner, vaksineblandinger og andre antigene materialer under fremstilling. I det følgende vil oppfinnelsen bli beskrevet med hovedtyngden på ferdige vaksiner og fremstillingen av sådanne, men det vil forstås at oppfinnelsen angår stabiliserte virusmaterialer rent generelt og ikke er begrenset til ferdige vaksiner. The invention can be used for the production of virus vaccines including live, weakened virus vaccines and killed virus vaccines. As examples of the many vaccines the invention can be applied to, vaccines against poliomyelitis, measles, infectious liver inflammation (hepatitis), yellow fever, mumps, rabies and smallpox can be mentioned. Such vaccines, which for the purposes of the invention may be unstabilised or partially stabilised, can be produced using methods known in the field. The invention can also be used to stabilize starting materials for virus vaccines, such as virus culture filtrates, centrifugates and similar unfinished virus vaccines, vaccine mixtures and other antigenic materials under manufacture. In what follows, the invention will be described with the main emphasis on finished vaccines and the production of such, but it will be understood that the invention relates to stabilized virus materials in general and is not limited to finished vaccines.

Kalsiumlaktobionat er et relativt lite kost-bart materiale, og det er å få i handelen i en meget høy renhet. Tekniske kvaliteter kan brukes, men det foretrekkes kvaliteter som kommer opp mot, eller er bedre enn en kvali-tet svarende til den følgende typiske analyse: Calcium lactobionate is a relatively inexpensive material, and it is commercially available in a very high purity. Technical qualities can be used, but qualities that come up to, or are better than, a quality corresponding to the following typical analysis are preferred:

Den mengde kalsiumlactobionat som innblandes i virusproduktene i stabiliseringsøye-med vil variere med arten av vaksinen, den relative labilitet av det tilstedeværende antigen og andre lignende faktorer. Hensiktsmessig innblandes kalsiumlactobionatet i det væskeformige virusmaterialet i form av et tørt pulver eller en fortynnet vandig opplysning, og det blandes grundig ved lav temperatur for å skaffe en homogen suspensjon eller oppløs-ning. I alminnelighet anvendes en konsentrasjon på minst 1 g/l. For maksimal stabilitet foretrekkes en konsentrasjon på 10 g/l. Konsentrasjoner såpass høye som ca. 50 g/l er likeledes tilfredsstillende. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter anvendelse av høyere konsentrasjoner, men det skal bemer-kes at den ønskede stabiliseringsvirkning blir progressivt mindre betydelig eftersom konsen-trasjonen øker. Tørre, stabiliserte produkter fremstilles hensiktsmessig fra de nevnte veske-formige produkter, etter på området kjente fremgangsmåter, ved tørring, såsom frysetør-ring eller lyofilisering. På vektbasis har slike ikke-vandige produkter en høy konsentrasjon av kalsiumlactobionat i forhold til det totale innhold av faste stoffer. The amount of calcium lactobionate incorporated into the virus products for the purpose of stabilization will vary with the nature of the vaccine, the relative lability of the antigen present and other similar factors. Conveniently, the calcium lactobionate is mixed into the liquid virus material in the form of a dry powder or a diluted aqueous solution, and it is thoroughly mixed at low temperature to obtain a homogeneous suspension or solution. In general, a concentration of at least 1 g/l is used. For maximum stability, a concentration of 10 g/l is preferred. Concentrations as high as approx. 50 g/l is also satisfactory. The method according to the invention includes the use of higher concentrations, but it should be noted that the desired stabilization effect becomes progressively less significant as the concentration increases. Dry, stabilized products are suitably prepared from the aforementioned bag-shaped products, according to methods known in the field, by drying, such as freeze-drying or lyophilization. On a weight basis, such non-aqueous products have a high concentration of calcium lactobionate in relation to the total solids content.

I den hensikt å øke den antigene virkning, kan produktene inneholde små mengder av i immunogent henseende forenlig protein eller polypeptid, såsom menneske-albumin, — protamin, — pepton, — eller lignende. Eksempelvis kan der anvendes ca. 10—50 g/l protein eller polypeptid. In order to increase the antigenic effect, the products may contain small amounts of an immunogenically compatible protein or polypeptide, such as human albumin, - protamine, - peptone, - or the like. For example, approx. 10-50 g/l protein or polypeptide.

Før tørringen av det væskeformige produkt kan der til dette, i tillegg til kalsiumlactobionatet, tilsettes en liten mengde lactose, for eksempel ca. 20—100 g/l, fortrinnsvis ca. 50 g/l. Tørretrinnet lettes derved, idet tilset-ningen av lactose fører til et utgangsmateriale som er lettere å bearbeide. Dessuten er tørre produkter inneholdende lactose i alminnelighet mer stabile i antigen henseende enn sådanne produkter uten lactose-innhold. Before drying the liquid product, in addition to the calcium lactobionate, a small amount of lactose, for example approx. 20-100 g/l, preferably approx. 50 g/l. The drying step is thereby facilitated, as the addition of lactose leads to a starting material that is easier to process. Moreover, dry products containing lactose are generally more stable in antigenic terms than such products without lactose content.

I samsvar med vanlig praksis fremstilles produktene fortrinnsvis under aseptiske betingelser, idet der anvendes komponenter som på forhånd er gjort sterile. Steriliteten kan opprettholdes under lagring ved at man inn-blander i produktene et med antigener forlike-lig bakteriedrepende stoff, såsom «Thimerosal»' eller «Benzethoniumklorid». For produkter som er redusert til den tørre, ikke-vandige tilstand, er det imidlertid vanligvis unødven-dig å anvende noe bakteriedrepende middel. Dersom intet annet er spesielt uttrykt, bør de antigene stoffer fortrinnsvis oppbevares koldt (ca. 4°C) der hvor det er mulig i fremstillings-prosessen. In accordance with common practice, the products are preferably manufactured under aseptic conditions, using components that have been made sterile in advance. Sterility can be maintained during storage by mixing into the products a bactericidal substance compatible with antigens, such as "Thimerosal" or "Benzethonium chloride". However, for products that have been reduced to the dry, non-aqueous state, it is usually unnecessary to use any bactericidal agent. If nothing else is specifically stated, the antigenic substances should preferably be stored cold (approx. 4°C) where possible during the manufacturing process.

I det følgende beskrives som eksempler noen utførelsesformer for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen samt en metode for fremstilling av det anvendte vaksinemateriale. a) Fremstilling av vevkulturceller. In the following, some embodiments of the method according to the invention as well as a method for producing the vaccine material used are described as examples. a) Production of tissue culture cells.

Vevkulturceller tilberedt fra kyllingegg Tissue culture cells prepared from chicken eggs

etter 11—12 dagers utvikling under anvendelse av standard trypsiniseringsteknikk, dyrkes i stasjonære flasker (0,84 1, etter forskrift) i 3—5 dager. Vekstmediet for cellene er det syntetiske medium nr. 199. De monocellulare lag vaskes to ganger med porsjoner å 100 ml av medium nr. 199 som er tilsatt 1 mikrogram streptomycin og har en pH-verdi 7,4—7,6. after 11-12 days of development using standard trypsinization techniques, culture in stationary flasks (0.84 L, according to regulations) for 3-5 days. The growth medium for the cells is the synthetic medium No. 199. The monocellular layers are washed twice with portions of 100 ml of medium No. 199 to which 1 microgram of streptomycin has been added and has a pH value of 7.4-7.6.

b) Podning av cellene. b) Inoculation of the cells.

Etter vaskning tilsettes der til hver vev-kulturflaske 50 ml av en oppløsning inneholdende fra 1000 til 10 000 50 % vevkultur-smit-tedoser (TCIDr,„ — Tissue Culture Infectious Doses) av Edmonston-stammen av mesling-virus som er suspendert i medium nr. 199. Virusstammen kan fåes fra Research Division of Infectious Diseases, The Children's Medical Center, Boston, Mass., se American Journal of Public Health, 47:275—282 (1957; Connecticut Medicine, 23 : 561—567 (1959). After washing, 50 ml of a solution containing from 1,000 to 10,000 50% tissue culture infectious doses (TCIDr, — Tissue Culture Infectious Doses) of the Edmonston strain of measles virus suspended in medium is added to each tissue culture bottle No. 199. The virus strain may be obtained from the Research Division of Infectious Diseases, The Children's Medical Center, Boston, Mass., see American Journal of Public Health, 47:275-282 (1957; Connecticut Medicine, 23 : 561-567 (1959) .

c) Inkubasjon. c) Incubation.

De podede kulturer inkuberes stasjonært The inoculated cultures are incubated stationary

ved 32 °C inntil ca. av det monocellu-lære lag er underkastet en cytofatisk virkning, vanligvis fra 7 til 14 dager etter inn-podningen, hvoretter virus-utbyttet er det op-timale. at 32 °C until approx. of the monocellular layer is subjected to a cytophatic effect, usually from 7 to 14 days after inoculation, after which the virus yield is the optimum.

d) Innhøstning. d) Harvesting.

Cellelagene fra de podede kulturer sus-penderes i væskene og oppsamles i en felles, avkjølt beholder. Den resulterende suspensjon sentrifugeres ved 4°C i 10 minutter ved 1500 omdr. pr. minutt. Den overflytende væske fjernes fra de sammenpakkede cellerester og ledes i kald tilstand gjennom et filter av mid-dels kalsinert glass for å fjerne eventuelle gjenværende cellerester. Den således erholdte væske er anvendbar som en vaksine mot meslinger, men den er relativt ustabil hva antigen styrke angår, når den utsettes for langvarig lagring, gjentatte fryse- og opptinings-sykluser, frysetørring, osv. The cell layers from the inoculated cultures are suspended in the liquids and collected in a common, cooled container. The resulting suspension is centrifuged at 4°C for 10 minutes at 1500 rpm. minute. The overflowing liquid is removed from the compacted cell debris and passed in a cold state through a filter of medium calcined glass to remove any remaining cell debris. The liquid thus obtained is usable as a vaccine against measles, but it is relatively unstable in terms of antigenic strength when subjected to long-term storage, repeated freezing and thawing cycles, freeze-drying, etc.

I det følgende beskrives fremstilling av stabiliserte vaksiner mot meslinger fra antigene utgangsmaterialer fremstilt i henhold til den ovenfor beskrevne fremgangsmåte. Videre sammenlignes de antigene egenskaper av ikke-stabiliserte og stabiliserte vaksiner mot meslinger når vaksinene utsettes for forskjellige omgivelsesbetingelser som kan være tilstede under frysing, tørring og lagring. De ikke-stabiliserte vaksiner som ble brukt, var overflytende væsker av den type som ble oppnådd under punkt d), og som det i det nedenstående vil bli omtalt brukt som en «kontrollprøve», samt samme væsker hvortil det ble tilsatt 1 % menneskealbumin, hvilke i det nedenstående vil bli omtalt som «kontrollprøve med albumin». The following describes the production of stabilized vaccines against measles from antigenic starting materials produced according to the method described above. Furthermore, the antigenic properties of non-stabilized and stabilized measles vaccines are compared when the vaccines are exposed to different environmental conditions that may be present during freezing, drying and storage. The non-stabilized vaccines used were superfluid fluids of the type obtained under point d), and which will be referred to below as a "control sample", as well as the same fluids to which 1% human albumin was added, which in the following will be referred to as "control sample with albumin".

Eksempel 1. Example 1.

Fremstilling av stabiliserte vaksiner. Separate alikvotdeler av overflytende mes-lingvirusvæsker erholdt ved fremgangsmåten i henhold til punkt d) ble blandet henholdsvis med 1 % kalsiumlactobionat (raffinert; Sheffield Chemical Div., Sheffield Farms Co., Inc., Norwich, Connecticut); med 1 %, henholdsvis 5 % kalsiumlactobionat og 1 % menneskealbumin; og med 1 % kalsiumlactobionat, 1 % menneskealbumin og 5 % lactose. I samtlige tilfeller ble bestanddelene blandet grundig ved lav temperatur, slik at man fikk en homogen væske. De erholdte produkter hadde følgende sammensetninger beregnet på vaksinens total-volum. Production of stabilized vaccines. Separate aliquots of measles virus supernatants obtained by the method according to point d) were mixed respectively with 1% calcium lactobionate (refined; Sheffield Chemical Div., Sheffield Farms Co., Inc., Norwich, Conn.); with 1%, 5% calcium lactobionate and 1% human albumin, respectively; and with 1% calcium lactobionate, 1% human albumin and 5% lactose. In all cases, the ingredients were mixed thoroughly at a low temperature, so that a homogeneous liquid was obtained. The products obtained had the following compositions calculated on the total volume of the vaccine.

Evnen til å motstå tap av styrke ble prø-vet ved å underkaste vaksinene C og D, samt kontrollvaksinen, en fryse- og tørreprosess ved 0°C under anvendelse av en «Virtis»-tørker, modell P-24-PR, Virtis Company, Inc.; Gardi-ner, N. Y. Styrken ble for hver vaksine bestemt både før og etter prosessen ved smittsomhets-titer (infectivity titer). Denne be-stemmelse ble utført ved at ett-lags kulturer av kyllingfoster-celler ble podet med en alikvotdel av den respektive vaksine og utvik-lingen av flekker ble iakttatt' i henhold til fremgangsmåten beskrevet av Dulbecco et al., J. Exper. Med., 99 : 167, 1954. Smittsomhets-titeren, som er direkte avhengig av den antigene virkning av det innpodede materiale, ut-trykkes i «flekkdannelsesenheter» (PFU-pla-gue formation units) pr. milliliter vaksine. De følgende resultater ble oppnådd. The ability to resist loss of potency was tested by subjecting vaccines C and D, as well as the control vaccine, to a freezing and drying process at 0°C using a "Virtis" dryer, model P-24-PR, Virtis Company , Inc.; Gardiner, N. Y. The strength was determined for each vaccine both before and after the process by infectivity titer. This determination was made by inoculating single-layer cultures of chick embryo cells with an aliquot of the respective vaccine and observing the development of spots according to the method described by Dulbecco et al., J. Exper. Med., 99: 167, 1954. The infectivity titer, which is directly dependent on the antigenic effect of the inoculated material, is expressed in "plague formation units" (PFU-plague formation units) per milliliters of vaccine. The following results were obtained.

Resultatene viser at mens de stabiliserte meslingsvaksiner C og D bare viser et moderat tap av styrke under tørringen, mistet kontrollvaksinen som ikke var tilsatt stabiliseringsmiddel, mer enn 80 % av styrken. The results show that while the stabilized measles vaccines C and D show only a moderate loss of potency during drying, the control vaccine, which had no stabilizer added, lost more than 80% of its potency.

Den stabiliserende virkning når vaksinene ble tørret (ved sublimering i vakuum) og underkastet lagring i syv dager, ble likeledes prøvet. Herunder ble flere porsjoner Vaksine B samt en kontrollprøve inneholdende albumin utsatt for tørketemperaturer i området fra 0° til 4- 40 °C, og lagringstemperaturer på + 15°C og 4- 80°C. Styrken (smittsomhets-titer) ble bestemt før og etter hvert forsøk. Resultatene er oppført i den nedenstående tabell. The stabilizing effect when the vaccines were dried (by sublimation in vacuum) and subjected to storage for seven days was also tested. Below, several portions of Vaccine B as well as a control sample containing albumin were exposed to drying temperatures in the range from 0° to 4- 40 °C, and storage temperatures of + 15°C and 4- 80°C. The strength (infectivity titer) was determined before and after each experiment. The results are listed in the table below.

Disse resultater viser at kontrollvaksinen i samtlige tilfeller taper mer enn 99 % av den opprinnelige styrke. I kontrast til dette viser forsøkene at en vaksine som er stabilisert i henhold til oppfinnelsen, bevarer en betydelig styrke under tørking og lagring. These results show that the control vaccine in all cases loses more than 99% of its original potency. In contrast to this, the experiments show that a vaccine stabilized according to the invention retains a considerable strength during drying and storage.

Det ble videre utført forsøk for å anslå vaksinens evne til å bevare styrken etter gjentatte fryse- og opptinings-sykluser. Herunder ble Vaksine B og en kontrollprøve inneholdende albumin frosset ved —76°C og opp-fint ved +37,5°C gjennom 8 sykluser. Vaksinens styrke ble prøvet før den første syklus og etter den 1., 2., 4. og 8. syklus. Resultatene er oppført i den nedenstående tabell: Disse resultater viser at en vaksine som var stabilisert i henhold til oppfinnelsen, hadde god stabilitet under frysing og opptining. Ennskjønt både den nevnte vaksine og en kontrollvaksine progressivt avtok i styrke med økende antall cykluser, tapte Vaksine B gjen- nomsnittlig bare halvparten så meget i styrke pr. syklus som kontrollprøven med albumin. Experiments were also carried out to estimate the ability of the vaccine to preserve its potency after repeated freezing and thawing cycles. Below, Vaccine B and a control sample containing albumin were frozen at -76°C and thawed at +37.5°C through 8 cycles. The strength of the vaccine was tested before the first cycle and after the 1st, 2nd, 4th and 8th cycle. The results are listed in the table below: These results show that a vaccine that was stabilized according to the invention had good stability during freezing and thawing. Although both the aforementioned vaccine and a control vaccine progressively decreased in potency with increasing number of cycles, Vaccine B again lost on average only half as much in strength per cycle as the control sample with albumin.

Ved ytterligere forsøk ble tørkede produkter prøvet på evne til å motstå tap av styrke under langvarig lagring ved 4°C. Produktene, kontrollprøve og meslingvaksiner A In further tests, dried products were tested for their ability to withstand loss of strength during long-term storage at 4°C. The products, control sample and measles vaccines A

og B, ble etter frysetørring lagret og fra tid til annen prøvet på styrken, med resultater som oppført i nedenstående tabell. and B, after freeze-drying were stored and from time to time tested for strength, with results as listed in the table below.

Resultatene viser at kontrollvaksinen uten stabiliseringsmiddel taper det aller meste av sin antigene virkning etter fire måneders lagring, mens vaksinene fremstilt ifølge oppfinnelsen beholder en betydelig antigen virkning gjennom meget lengere tidsrom. The results show that the control vaccine without stabilizer loses most of its antigenic effect after four months of storage, while the vaccines produced according to the invention retain a significant antigenic effect over much longer periods of time.

I et annet forsøk ble der gjort en sammenligning mellom evnen til å motstå tap av styrke under lagring hos et frosset vaksine-produkt og en kontrollprøve. To temperaturer ble anvendt under frysingen. Resultatene av forsøket er oppført i den nedenstående tabell. In another experiment, a comparison was made between the ability to withstand loss of potency during storage in a frozen vaccine product and a control sample. Two temperatures were used during the freezing. The results of the experiment are listed in the table below.

Disse resultater viser at den ikke-stabili- «Thimerosal» (1 : 10 000). Spesielt kan denne serte kontrollvaksine som lagres ved lav tem- vaksine tilsettes 1 % kalsiumlactobionat og peratur, taper meget i styrke, mens vaksinen 1 % menneskealbumin, hvoretter blandingen ifølge oppfinnelsen under de samme betingel- omrøres koldt til en homogen oppløsning. Opp-ser og innen de eksperimentelle feilgrenser, løsningen oppbevares ved 4°C og fylles på be-bevarer sin opprinnelige styrke uten tap. gere etter behov. These results show that the non-stabili- "Thimerosal" (1 : 10,000). In particular, this serted control vaccine which is stored at a low temperature can be added 1% calcium lactobionate and perature, loses a lot of strength, while the vaccine 1% human albumin, after which the mixture according to the invention under the same conditions is stirred cold to a homogeneous solution. Up-sight and within the experimental error limits, the solution stored at 4°C and refilled retains its original strength without loss. ger as needed.

De som ovenfor beskrevet stabiliserte vak- As described above, the stabilized vak-

siner kan anvendes direkte for immunogene Eksempel 2. can be used directly for immunogenic Example 2.

formål. Et foretrukket produkt er en cellefri purpose. A preferred product is a cell-free one

mesling — vevkulturvæske som er tilsatt 1 % En cellefri overflytende væske fra en kalsiumlactobionat og 1 % menneske-albumin kukoppevirus-vevkultur fremstilles etter føl-og som er frysetørret og pakket under asepti- gende fremgangsmåte: Under anvendelse av ske forhold i enkeltdosebegere i minimum styr- konvensjonell trypsiniseringsteknikk fremstil-keenhet på 1000 PFU. Et slikt produkt, som les 7 dagers ett-lags kulturer av fosterhud fra har høy stabilitet og som kan administreres kveg. Syntetisk medium nr. 199 tilsettes til når det er gjendannet med vann, er funnet å kulturene, og hver kultur innpodes med 50 ml være klinisk effektivt. av en suspensjon inneholdende kukoppevirus measles — tissue culture fluid to which 1% has been added A cell-free supernatant from a calcium lactobionate and 1% human-albumin cowpox virus tissue culture is prepared as follows and which is freeze-dried and packaged under aseptic procedure: Using spoon ratios in single-dose beakers in minimum control - conventional trypsinization technique production unit of 1000 PFU. Such a product, which reads 7-day single-layer cultures of fetal skin from has high stability and can be administered to cattle. Synthetic medium No. 199 is added to when reconstituted with water, the cultures, and each culture is inoculated with 50 ml is found to be clinically effective. of a suspension containing cowpox virus

Den ovenfor beskrevne fremgangsmåte (1000 TCIDS0). De podede kulturer inkuberes kan anvendes til stabilisering også av andre i 4—7 dager, hvoretter væskene innsamles, vaksiner fremstilt av forskjellige utgangs- sammenslåes og sentrifugeres, The method described above (1000 TCIDS0). The inoculated cultures are incubated can be used for stabilization also by others for 4-7 days, after which the fluids are collected, vaccines prepared from different starting- are combined and centrifuged,

materialer for virusvaksiner. Eksempelvis kan I den hensikt å bestemme den stabiliser-man i stedet for meslingvaksine anvende inak- ende virkning av kalsiumlactobionat i kukop-tivert kusmavirusvaksine [100 «kyllingegg- pe-virus-vaksine ble en alikvotdel av den agglutineringsenheter» pr. ml (CCA chicken overflytende væske beholdt uforandret for kon-cell agglutination units per ml)] inneholdende trollformål og en annen alikvotdel stabilisert materials for virus vaccines. For example, in order to determine the stabiliser, instead of the measles vaccine, the inactivating effect of calcium lactobionate can be used in cow-copied mumps virus vaccine [100 "chicken egg virus vaccine became an aliquot of the agglutination units" per ml (CCA chicken supernatant retained unchanged for con- cell agglutination units per ml)] containing spell purpose and another aliquot stabilized

ved tilblanding av kalsiumlactobionat til en konsentrasjon av 1 %. Den resulterende stabiliserte vaksine og kontrollvaksinen ble begge fryst og tørret i et «Virtis»-tørkeapparat. Den antigene styrke målt i smittsomhets-titer ble bestemt før og etter frysetørring. Resultatene er gjengitt nedenfor. by mixing calcium lactobionate to a concentration of 1%. The resulting stabilized vaccine and the control vaccine were both frozen and dried in a "Virtis" dryer. The antigenic strength measured in infectivity titers was determined before and after freeze-drying. The results are reproduced below.

Disse resultater viser at den ikke-stabiliserte kontrollvaksine taper mer enn halvparten av styrken under frysetørring. Under de samme betingelser beholder vaksinen som er stabilisert med kalsium-lactobionat, en høy styrke uten målbare tap. These results show that the non-stabilized control vaccine loses more than half of its potency during freeze-drying. Under the same conditions, the vaccine stabilized with calcium lactobionate retains a high potency without measurable loss.

Den ovenfor beskrevne fremgangsmåte kan anvendes også ved stabilisering av andre antigene materialer. Eksempelvis kan man i stedet for kukoppevirus-væske anvende et vandig medium inneholdende poliomyelittvirus-antigen, såsom et vevkultur-filtrat fra ape-nyrer inneholdende én eller flere av typene 1, 2 eller 3 av poliomyelittvirus, som er drept delvis ved behandling med formaldehyd og delvis ved utsettelse for ultrafiolett lys (se britisk patent nr. 802 048). Videre kan man anvende et sentrifugat av en kulturvæske av den innerste fosterhinne fra kyllinger inneholdende kusmavirus med smittsomhets-titer IO-4 (hemagglutinering). The method described above can also be used for the stabilization of other antigenic materials. For example, instead of cowpox virus liquid, an aqueous medium containing poliomyelitis virus antigen can be used, such as a tissue culture filtrate from monkey kidneys containing one or more of types 1, 2 or 3 of poliomyelitis virus, which has been partially killed by treatment with formaldehyde and partly by exposure to ultraviolet light (see British Patent No. 802,048). You can also use a centrifuge of a culture fluid of the innermost amniotic membrane from chickens containing mumps virus with an infectivity titer of IO-4 (haemagglutination).

Eksempel 3. Example 3.

Meslingvaksiner svarende til de i eksempel 1 beskrevne, men med en lavere konsentrasjon (ned til ca. 0,1 %) kalsiumlactobionat bibe-holder styrke på tilsvarende måte. Dette kan vises ved en sammenligning av ikke-stabiliserte og stabiliserte meslingvaksiner med hensyn til deres bibeholdelse av styrke når de underkastes den i eksempel 1 omtalte fryse-tørring. Tre forskjellige vaksinepreparater ble sammenlignet, nemlig Measles vaccines similar to those described in example 1, but with a lower concentration (down to approx. 0.1%) calcium lactobionate retain potency in a similar way. This can be shown by a comparison of non-stabilized and stabilized measles vaccines with regard to their retention of potency when subjected to the freeze-drying described in Example 1. Three different vaccine preparations were compared, viz

en kontrollprøve, erholdt som tidligere beskrevet under punkt d) og med smittsomhets-titer 81 280 PFU/ml (før tørring) og a control sample, obtained as previously described under point d) and with an infectivity titer of 81,280 PFU/ml (before drying) and

to stabiliserte vaksiner erholdt ved tilset-ning av henholdsvis 0,1 vekt % og 1 vekt % kalsiumlactobionat til kontrollprøven og med samme smittsomhets-titer som kontrollprøven. two stabilized vaccines obtained by adding respectively 0.1% by weight and 1% by weight calcium lactobionate to the control sample and with the same infectivity titer as the control sample.

Efter frysetørring hadde kontrollvaksinen uten stabiliseringsmiddel en titer på bare 740 PFU/ml, mens de stabiliserte vaksiner fortsatt hadde relativt høy titer, nemlig henholdsvis 47 860 og 53 700 PFU/ml. After freeze-drying, the control vaccine without stabilizer had a titer of only 740 PFU/ml, while the stabilized vaccines still had a relatively high titer, namely 47,860 and 53,700 PFU/ml respectively.

Eksempel J/. Example J/.

Poliomyelittvirusvaksine. Poliomyelitis virus vaccine.

En tilførselsbeholdning av vandig, levende, usvekket poliomyelitt virusvaksine (type III, Saukett-stamme) ble fremstilt på konvensjonell måte innebærende dyrkning av virus inoculum på apenyreceller med medium nr. 199 som vedlikeholdsmedium for cellene og på-følgende filtrering av det erholdte viruskultur-medium, hvorved det ble erholdt en virusvæske som var fri for vev. Denne væskes smittsomhets-titer (uttrykt som 50 % vevkultur-smitte-doser, TCIDao -var 10-5>6 og 10-5,7 ved dupli-katprøver efter platetitreringsmetoden (Journal of Immunology, 76, 464—474 (1956)). A stock of aqueous, live, unattenuated poliomyelitis virus vaccine (type III, Saukett strain) was prepared in a conventional manner involving cultivation of virus inoculum on monkey kidney cells with medium No. 199 as maintenance medium for the cells and subsequent filtration of the resulting virus culture medium , whereby a virus fluid was obtained which was free of tissue. The infectivity titer of this fluid (expressed as 50% tissue culture infectious doses, TCIDao -was 10-5>6 and 10-5.7 in duplicate samples by the plate titration method (Journal of Immunology, 76, 464-474 (1956)) .

For å bestemme virkningen av frysetør-ring på smittsomheten (levedyktigheten) av vaksinevæsken med og uten stabilisator ble det utmålt fire like store porsjoner av væsken. Den ene ble anvendt slik den var fremstilt, uten stabilisator, og til de øvrige tre porsjoner ble der tilsatt tre stabiliserende materialer, henholdsvis dimethylsulfoxyd (20 g/l), sorbitol (50 g/l) og kalsiumlactobionat (10 g/l) pluss protein (menneskealbumin; 10 g/l). To determine the effect of freeze-drying on the infectivity (viability) of the vaccine liquid with and without stabilizer, four equal portions of the liquid were measured. One was used as it was prepared, without stabilizer, and three stabilizing materials were added to the other three portions, respectively dimethylsulfoxide (20 g/l), sorbitol (50 g/l) and calcium lactobionate (10 g/l) plus protein (human albumin; 10 g/l).

Et tilstrekkelig antall alikvotprøver av hver av de resulterende fire væsker ble så utmålt for å skaffe: en ikke-fryst kontrollprøve, en fryst kontrollprøve samt kontrollprøver for tørring ved hver av temperaturene 0°C, —76 °C og 20 °C. Duplikatprøver ble valgt for hver av betingelsene unntatt for tørringen ved 20 °C hvor det bare ble anvendt en prøve. Sufficient aliquots of each of the resulting four liquids were then measured to provide: a non-frozen control, a frozen control, and controls for drying at each of 0°C, -76°C, and 20°C. Duplicate samples were selected for each of the conditions except for the drying at 20 °C where only one sample was used.

Prøvene som skulle bearbeides, ble derpå fryst langsomt (5 sekunder) ved —76°C. Prø-vene som skulle tørres, ble derefter tørret ved sublimering under vakuum ved de angitte temperaturer. Tørretiden var 18 timer ved 0°C, 72 timer ved — 76 °C og 12 timer ved 20 °C. Efter behandling ble alle prøver med unntagelse av de ikke-fryste kontrollprøver oppbevart ved —65 °C. The samples to be processed were then frozen slowly (5 seconds) at -76°C. The samples to be dried were then dried by sublimation under vacuum at the indicated temperatures. The drying time was 18 hours at 0°C, 72 hours at -76°C and 12 hours at 20°C. After treatment, all samples, with the exception of the non-frozen control samples, were stored at -65 °C.

Syv dager efter tørring ble samtlige prø-ver, innbefattet kontrollprøvene, prøvet på smittsomhet efter platetitreringsmetoden. Resultatene av disse forsøk, som viser de resulterende smittsomhets-titre (TCID50) var som følger: Seven days after drying, all samples, including the control samples, were tested for infectivity according to the plate titration method. The results of these experiments, showing the resulting infectivity titers (TCID50) were as follows:

Stabilitet — Poliomvelittvirus. Stability — Poliomyelitis virus.

Disse resultater viser at de ikke-tørrede kontrollprøver bibeholdt sin levedyktighet uten noen vesentlig minskning av titeren. Resultatene viser også på den annen side at de tør-rede prøver bibeholdt mindre enn 1 % av den opprinnelige smittsomhet, bortsett fra en sorbitol-stabilisert prøve tørret ved —76°C og de lactobionat-stabiliserte prøver. Av disse unn-tags tilfeller bibeholdt to prøver ca. 1 % av den opprinnelige smittsomhet (den ved —76°C tørrede sorbitol-stabiliserte prøve og den ved 20°C tørrede lactobionat-stabiliserte prøve) mens fire prøver bibeholdt ca. 10 % av den opprinnelige smittsomhet (de lactobionat-stabiliserte prøver som ble tørret ved henholdsvis 0°C og —76°C). These results show that the non-dried control samples retained their viability without any significant decrease in titer. The results also show, on the other hand, that the dried samples retained less than 1% of the original infectivity, except for a sorbitol-stabilized sample dried at -76°C and the lactobionate-stabilized samples. Of these exceptional cases, two samples were retained approx. 1% of the original infectivity (the -76°C-dried sorbitol-stabilized sample and the 20°C-dried lactobionate-stabilized sample) while four samples retained approx. 10% of the original infectivity (the lactobionate-stabilized samples dried at 0°C and -76°C, respectively).

Resultatene viser med andre ord at det er nødvendig med en stabilisator for å bibeholde en vesentlig smittsomhet under forskjellige tørrebetingelser. Videre er det vist at kalsium-lactobionat er en betydelig bedre stabilisator enn de øvrige som ble testet, og at tørring under stabilisering med kalsiumlactobionat kan utføres med godt resultat ved relativt høy temperatur. In other words, the results show that a stabilizer is necessary to maintain a significant infectivity under different drying conditions. Furthermore, it has been shown that calcium lactobionate is a significantly better stabilizer than the others that were tested, and that drying during stabilization with calcium lactobionate can be carried out with good results at a relatively high temperature.

Eksempel 5. Example 5.

RS ( Respiratory Syncytial) virusvaksine. RS (Respiratory Syncytial) virus vaccine.

1 vekt % kalsiumlactobionat innblandes i to forskjellige porsjoner levende vandig RS virusvaksine, hvorav den ene porsjon var funnet å ha en lav smittsomhet-titer på 25 PFU/ml, mens den andre hadde en høy smittsomhets-titer på ca. 10 000 000 PPU/ml. Alikvotdeler av de to vaksine-porsjoner beholdes for kon-trollformål uten at der tilsettes stabilisator 1% by weight calcium lactobionate is mixed into two different portions of live aqueous RS virus vaccine, one portion of which was found to have a low infectivity titer of 25 PFU/ml, while the other had a high infectivity titer of approx. 10,000,000 PPU/ml. Aliquots of the two vaccine portions are kept for control purposes without adding a stabilizer

(kalsiumlactobionat). (calcium lactobionate).

De ikke-stabiliserte og stabiliserte vaksiner oppdeles så i tre alikvotdeler, og hver alikvotdel fryse-tørres ved en bestemt temperatur, nemlig ved henholdsvis 20, —20 og The non-stabilized and stabilized vaccines are then divided into three aliquots, and each aliquot is freeze-dried at a specific temperature, namely at 20, -20 and

—76 °C for vaksinene med lav titer og henholdsvis 20, 0 og —40°C for vaksinene med høy titer. Kontrollprøvene med lav titer og høy titer beholdes i flytende, ikke-tørret tilstand for sammenligning. Efter tørring prøves samtlige prøver på smittsomhets-titer. De føl-gende resultater er typiske: Kalsiumlactobionatets stabiliserende virkning ved frysetørring av RS- virusvaksine ved sublimering i vakuum. -76 °C for the low titer vaccines and 20, 0 and -40 °C respectively for the high titer vaccines. The low titer and high titer controls are kept in a liquid, non-dried state for comparison. After drying, all samples are tested for infectivity titers. The following results are typical: Calcium lactobionate's stabilizing effect during freeze-drying of RS virus vaccine by sublimation in vacuum.

Claims

Method for stabilizing labile, antigenic virus preparations, in which 10-50 g/l protein or polypeptide or 20-100 g/l lactose is optionally added to a liquid, antigenic virus material, characterized in that calcium lactobionate is added to the liquid, antigenic virus material in a

quantity of at least 1 g/l, and that the resulting mixture is frozen.