NO147978B - Fremgangsmaate til rensning av en insulinholdig vandig-etanolisk raaekstrakt fra pankreaskjertler - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til rensing av en insulinholdig vandig-etanolisk råekstrakt fra pankreaskjertler, hvilken fremgangsmåte er verdifull som rensningstrinn ved opparbeidelsen av ekstrakten til rent monokomponent-insulin.

Betegnelsen "råinsulinekstrakt" benyttes her i den van-

lige betydning, dvs. den ekstrakt som fås ved å behandle pankreaskjertler med et vannholdig organisk oppløsningsmiddel, særlig vandig etanol, vanligvis med en konsentrasjon på

60-80%, og omfatter også ekstrakter som foruten å være befridd for fett har vært underkastet forskjellige behandlinger, f.eks. utfeining av proteiner som er forskjellige fra insulin, ved pH-endring, den såkalte pH 8 feining, og eventuelt omvendt osmose, dog således at insulinet under disse behandlinger er forblitt i væskefase. Betegnelsen omfatter således ikke insulinholdige oppløsninger dannet ved oppløsning av fra den opprinnelige ekstrakt isolert, renset, fast insulin i et opp-løsningsmiddel.

Det er nu almindelig antatt at antigenisiteten hos insulinpreparater i overveiende grad skyldes urenheter i preparatene, mens man tidligere har vært av den oppfatning at insulin-antistoffene ble fremkalt av insulinet som sådant. Disse urenheter kan være insulinfremmede ledsageproteiner fra pankreas, proinsulin som er insulinets forstadium, intermediær insulin, dimeren, arginin-insulin, etylesterinsulin, desamido-insulin, deamidert i forskjellig grad, andre insulin-modifikasjoner og farvede stoffer.

Man bestreber seg derfor på å fremstille insulinpreparater bestående av rent insulin, såkalt monokomponent-insulin,

fritt for urenheter og ledsagestoffer av enhver art.

Man har for dette formål foreslått å underkaste på konvensjonell måte fremstilt amorft eller krystallinsk insulin, en vidtgående ytterligere rensning, f.eks. ved ionebytter-behandling, gelfiltrering under anvendelse av en såkalt molekylsikt eller fordelings-kromatografi.

Rensning ved fordelings-kromatografi er f.eks. beskrevet

i tysk offentliggjørelsesskrift 2.212.695. Det er derfra kjent å underkaste en oppløsning dannet ved oppløsning av fast,

ennu urent insulin i et vandig oppløsningsmiddelsystem som

foruten alkoholer med 4-5.karbonatomer inneholder karboksyl-syrer med 1-3 karbonatomer og/eller ammoniakk eller en organisk base med en pK -verdi mellom ca. 5,1 og 11, fordelings-kromatografi, idet det som gel anvendes Sephadex LH-20.

Den nevnte gel er dekstran, tverrbundet med epiklorhydrin og inneholdende hydroksypropylgrupper som ved eterbindinger er knyttet til dekstrankjedenes glukoseenheter.

Rensningen ved gelfiltrering er bl.a. beskrevet i US-patentskrift 3.876.623. Det er derfra kjent å rense et alkalimetall- eller ammoniuminsulin under anvendelse av en gel med nærmere angitte egenskaper med hensyn til vannopptagelsesevne (water regain value) og partikkelstørrelse. Fremgangsmåten er kun anvendelig til rensing av alkalimetall-eller ammoniuminsolin med en renhet på minst ca. 80%; dvs. at insulininnholdet, derunder insulinlignende proteiner med hypoglykemisk virkning, i det minste må utgjøre 80% av den totale mengde tilstedeværende proteiner. Som gel nevnes bi.a. tverrbundet dekstran og derunder Sephadex-serien fra Pharmacia Fine Chemicals. Det nevnes ikke bestemte represen-tanter for denne serie.

Videre er rensning ved gelfiltrering beskrevet i en artikkel av Charles J. Epstein og Christian B. Anfinsen i Biochemistry 2, 461-464 (1963). Frosne pankreaskjertler fra okse eller kalv ble ekstrahert med svovelsyre-etanol efterfulgt av etanol-eter-utfelling. Det utfelte materiale ble efter lufttørring oppløst i NH4HC0.j-oppløsning, og oppløsningen ble efter sentrifugering påført en med NH4HC03~oppløsning ekvilibrert Sephadex G-50 kolonne, og det ble eluert med NH^HCO^-oppløsning. Den insulinholdige utfelning betegnes

av forfatterne "Crude Extract", men det er, som det vil fremgå, ikke tale om en råinsulinekstrakt i den i foreliggende beskrivelse benyttede betydning av ordet (en ekstrakt inneholdende insulin som ikke har vært utfelt).

I en artikkel "Super-ren insulin" i tidsskriftet

"Dansk Kemi" (1974), hefte 10, side 14-15 nevnes kort at rensningen av insulinholdige ekstrakter kan skje ved om-krystallisasjon, og at visse nye produkter dessuten renses ved ionebytting og geifiltrering. Det er således ikke tale om gelfiltrering av en råinsulinekstrakt i den i foreliggende

beskrivelse benyttede betydning av dette ord. I artikkelen nevnes intet om arten av den anvendte gel, og heller ikke arten av det anvendte svellemiddel og elueringsmiddel er omtalt.

De høyrensede insuliner som fås ved de ovenfor omtalte kjente rensningsmetoder, viser en sterk nedgang i antigenisitet, men ikke en fullstendig fjernelse av denne. Årsaken til dette er utvilsomt at det til tross for rensningstrinnene i de rensede preparater finnes stoffer som er forskjellige fra insulin.

Vi har tidligere utviklet en fremgangsmåte til fremstilling av meget rent monokomponent-insulin, jfr. beskrivelsen til ålment tilgjengelig norsk patentansøkning 77.0119),

tysk off.skrift nr. 27 01 092 og belgisk patent nr. 850.387.

Den nevnte fremgangsmåte er basert på den erkjennelse at noen av de urenheter som finnes i insulin ved anvendelse av de konvensjonelle fremgangsmåter, dannes under selve utvinningen av insulinet, hvorfor det er vesentlig å utføre utvinningen av insulinet på en slik måte at insulinet, fra ekstraksjonen av pankreaskjertlene inntil oppnåelse av det endelige produkt, kun utsettes for betingelser av en slik art at de ikke bevirker dannelsen av nedbrytningsprodukter, aggregater osv.

Fremgangsmåten er karakteristisk ved at den av pankreas-kjertlene fremstilte insulinholdige ekstrakt opparbeides til rent insulin på en slik måte at insulinet holdes i oppløst tilstand under hele opparbeidelsesprosessen inntil den endelige utvinning derav, idet de ikke ønskede stoffer fra begynnelsen til avslutningen av prosessen fjernes fra de forskjellige anvendte oppløsningsmidler.

Ved den nevnte fremgangsmåte er det ikke tale om en rensning av selve insulinet, men det skjer en rensning av den utvundne insulinekstrakt for de oppløste urenheter og fett og uønskede proteinstoffer og derivater av insulin, inntil det rene insulin er alene tilbake i ekstrakten (eller i en annen vandig fase) .

Fremgangsmåten kan f.eks. utføres ved at man underkaster ekstrakten en behandling for fjernelse av fett, bestående i avkjøling av ekstrakten til en lav temperatur, f.eks. mellom -25°C og -45°C, efterfulgt av fraskillelse av det krystalliserte fett, konsentrerer ekstrakten ved hjelp av omvendt osmose,

idet insulinet samtidig skilles fra urenheter i ekstrakten, såvel stoffer med større molekyler enn insulin som stoffer med mindre molekyler enn insulin, vasker det insulinholdige konsentrat fra den omvendte osmose i et anlegg for omvendt osmose for delvis fjernelse av farvede stoffer og salter fra konsentratet, underkaster det rensede konsentrat ytterligere rensning ved hjelp av ionebytting og til slutt utvinner insulinet fra den konsentrerte, rensede oppløsning ved utfeining med metallioner, fortrinnsvis sinkioner, under sterk avkjøling, f.eks. til -30°C til -45°C.

Det er imidlertid vanskelig ved en effektiv separering

av insulinet i råekstrakten, evnt. for-renset ved utkrystal-lisasjon av fettet ved lav temperatur og omvendt osmose, fra urenheter på ionebytter å unngå tap av insulin, idet det ved lengere separeringstid kan oppstå aggregater insulinmolekylene imellom, hvilke aggregater senere bare vanskelig kan elueres.

Vi har derfor satt oss som oppgave å finne frem til

en rensemetode som kan supplere eller erstatte en behandling av råekstrakten med ionebyttere, slik at det fås en effektiv separering uten tap av insulin eller med et mindre insulintap enn tidligere.

Det. har vist seg at man kan oppnå en rensning av en insulinholdig etanolisk råekstrakt med omtrent 100% insulin-utbytte ved å underkaste ekstrakten gelfiltrering under anvendelse av en spesiell gel og under iakttagelse av særlige betingelser.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen karakteriseres ved at den insulinholdige etanoliske råekstrakt, efter å være blitt avkjølt for å fjerne fett ved krystallisasjon med påfølgende fraskillelse av fettkrystallene fra ekstrakten og eventuelt efter å være blitt ytterligere "for-renset under betingelser hvor insulinet er forblitt i yæskefase, med en etanolkonsentrasjon mellom 60 og 80 vol%, underkastes gelfiltrering på en gel svellet i etanol eller i vandig etanol, fortrinnsvis med en etanolkonsentrasjon på minst 60 vol%, og fortrinnsvis med den samme konsentrasjon og den samme pH-verdi som det benyttede ekstraksjonsmiddel, idet det som elueringsmiddel likeledes benyttes etanol eller vandig etanol, fortrinnsvis med en etanolkonsentrasjon på minst 60 vol%.

Den anvendte gel er en kuleformet gel som har både hydrofile og lipofile egenskaper. Det er en dekstran tverrbundet med epiklorhydrin og inneholdende hydroksypropylgrupper knyttet til dekstrankjedenes glukoseenheter ved hjelp av eterbindinger, med en eksklusjonsgrense som tilsvarer en molekylvekt på ca. 10.000 og en

vannopptagelsesevne på 5,3-6,3 ml/g. Sephadex ® LH-60 fremstilt av Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige, er en slik gel.

Ved gelfiltreringen ifølge foreliggende oppfinnelse trenger insulinmolekylene inn i gelpartiklene, idet de ligger under gelens eksklusjonsgrense. Ved elueringen oppnås en insulin-fraksjon som er fullstendig fri for farvede stoffer og som ikke inneholder, eller praktisk talt ikke inneholder, proteiner med større molekyler enn insulinet eller med mindre molkyler enn insulinet, men bare inneholder insulinderivater med praktisk talt samme molekylstørrelse som insulinet. Insulinutbyttet er praktisk talt 100%.

Foreliggende fremgangsmåte kan med særlig fordel anvendes

i forbindelse med den i ålment tilgjengelig norsk patentånsøkning 77.0119 beskrevne fremgangsmåte, idet gelfiltreringen supplerer eller delvis erstatter behandlingen med ionebyttere som er beskrevet i nevnte ansøknings beskrivelse.

Gelfiltreringen ifølge foreliggende oppfinnelse er imidlertid ikke begrenset til anvendelse i forbindelse med nevnte eldre fremgangsmåte, men kan anvendes på en vilkårlig vandig-etanolisk<v >råekstrakt befridd for fett og kan inngå enten som avsluttende rensningstrinn før isoleringen av fast insulin eller som et mellomliggende rensningstrinn.

Med hensyn til den tidligere omtalte fremgangsmåte som

er kjent fra tysk off.skrift 2.212.695, hvilken fremgangsmåte består i å underkaste en oppløsning dannet ved oppløsning av fast insulin i et vandig oppløsningsmiddelsystem som foruten alkoholer med 4-5 karbonatomer inneholder en karboksylsyre og/eller ammoniakk eller en organisk base, fordelings-kromatografi under anvendelse av Sephadex LH-20, bemerkes at det her er tale om en annen separasjons.teknikk enn gelf iltrer ing . Fremgangsmåten er ikke egnet til- rensning av en insulinholdig råekstrakt, blant annet fordi det må anvendes et oppløsnings-middelsystem som er forskjellig fra de oppløsningsmidler som vanligvis benyttes til ekstraksjon av pankreaskjertler. Man

vil også bemerke at Sephadex LH-20 adskiller seg fra Sephadex <®>LH-60 ved å ha en lavere eksklusjonsgrense enn denne siste, jfr. offentliggjørelsesskriftet side 4, tredje hele avsnitt, slik at insulinmolekylene ikke vil trenge inn i gelen.

Ved rensningen ifølge oppfinnelsen av en råinsulinekstrakt kan man gå frem på følgende måte: Man bringer gelen til å svelle i etanol eller vandig etanol, fortrinnsvis med en etanolkonsentrasjon på minst 60 vol.%, f.eks. en blanding svarende til den som ble anvendt til ekstraksjonen av pankreas-kjertlene, eller eventuelt en blanding med litt høyere konsentrasjon av det organiske opp-løsningsmiddel.

Kolonnen tilberedes på vanlig måte, råekstrakten - med en etanolkonsentrasjon mellom 60 og 80 vol% - påføres og kolonnen gjennomstrømmes med elueringsmidlet, dvs. etanol eller vandig etanol. Elueringsmidlet kan være det samme som svellemidlet.

pH-verdien i den flytende fase i Sephadex-laget er for-trinnvis mellom 3 og 8. (Eluater med en pH-verdi under ca. 3

er for sure til at de direkte kan påføres ionebyttere, og ved pH-verdier over 8 vil insulinet delvis ødelegges).

Insulinet elueres og fraksjonen oppsamles. Den er helt fri for farvede stoffer. Det oppnås et praktisk talt 100% utbytte av insulin.

For oppnåelse av rent monokomponent-insulin renses eluatet ytterligere, f.eks. med ionebytter, og til slutt isoleres insulinet, f.eks. ved feining.

Eksempel

En insulinholdig råekstrakt - oppnådd ved å behandle frosne findelte pankreaskjertler fra griser med 85% etanol surgjort til en pH-verdi på ca. 3 med f^SO^ (2 liter 85% etanol/ 1 kg kjertler, hvilket sammen med vannet i kjertlene gir en vandig 65%ig etanolekstrakt), fjerne fett fra ekstrakten ved avkjøling til -30°C efterfulgt av fraskillelse av de dannede fettkrystaller og konsentrere til 1/10 av det opprinnelige volum ved omvendt osmose - ble underkastet gelfiltrering på følgende måte: 50 liter av ovennevnte konsentrat ble påført en kolonne (diameter 45 cm, høyde 75 cm) av Sephadex ® LH-60 svellet i og ekvilibrert med 65% etanol (acetatbuffer, ionestyrke 0,025, pH-verdi 7,3).

Elueringen ble utført med et elueringsmiddel som var det samme som svellemidlet.

De fraksjoner som inneholdt insulintoppen, ble samlet.

De var fullstendig befridd for farvede stoffer og inneholdt ingen eller praktisk talt ingen proteiner med større molekyler enn insulin eller med mindre molekyler enn insulin.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte til rensning av en insulinholdig vandig-etanolisk råekstrakt av pankreaskjertler, karakterisert ved at ekstrakten efter å være blitt avkjølt for å fjerne fett ved krystallisasjon efterfulgt av fraskillelse av fettkrystallene fra ekstrakten og eventuelt efter å være blitt ytterligere for-renset under betingelser hvor insulinet er forblitt i væskefase, med en etanolkonsentrasjon mellom 60 og 80 vol% underkastes gelfiltrering på en gel svellet i etanol eller vandig etanol, hvilken gel er dekstran tverrbundet med epiklorhydrin og inneholdende hydroksypropylgrupper knyttet til dekstrankjedenes glukoseenheter ved hjelp av eterbindinger, med en eksklusjonsgrense som tilsvarer en molekylvekt på ca. 10.000 og en vannopptagelsesevne på 5,3-6,3 ml/g, idet det som elueringsmiddel benyttes etanol eller vandig etanol.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at gelen er blitt svellet i vandig etanol, med en konsentrasjon på minst 60 vol%.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at gelen er blitt svellet iv vandig etanol med samme konsentrasjon og samme pH-verdi som det benyttede ekstraksjonsmiddel.

4. Fremgangsmåte ifølge et av de foregående krav, karakterisert ved at det benyttede elueringsmiddel er vandig etanol med en etanolkonsentrasjon på minst 60 vol%.