NO147978B - PROCEDURE FOR CLEANING AN INSULIN-Aqueous ETHANOLIC EXTRACTS FROM PANCREAS Glands - Google Patents
PROCEDURE FOR CLEANING AN INSULIN-Aqueous ETHANOLIC EXTRACTS FROM PANCREAS Glands Download PDFInfo
- Publication number
- NO147978B NO147978B NO772468A NO772468A NO147978B NO 147978 B NO147978 B NO 147978B NO 772468 A NO772468 A NO 772468A NO 772468 A NO772468 A NO 772468A NO 147978 B NO147978 B NO 147978B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- insulin
- ethanol
- gel
- extract
- aqueous
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 24
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 title claims description 12
- 239000000469 ethanolic extract Substances 0.000 title description 4
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 title description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 title 1
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 156
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 78
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 78
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 77
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 54
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 22
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 13
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 claims description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 8
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 4
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N Epichlorohydrin Chemical compound ClCC1CO1 BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 3
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims description 3
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 3
- -1 hydroxypropyl groups Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 7
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 6
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 6
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004810 partition chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 2
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101710114386 Insulin-like protein Proteins 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 108700022849 desamido- insulin Proteins 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- PSLIMVZEAPALCD-UHFFFAOYSA-N ethanol;ethoxyethane Chemical compound CCO.CCOCC PSLIMVZEAPALCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ROAYSRAUMPWBQX-UHFFFAOYSA-N ethanol;sulfuric acid Chemical compound CCO.OS(O)(=O)=O ROAYSRAUMPWBQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000007863 gel particle Substances 0.000 description 1
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til rensing av en insulinholdig vandig-etanolisk råekstrakt fra pankreaskjertler, hvilken fremgangsmåte er verdifull som rensningstrinn ved opparbeidelsen av ekstrakten til rent monokomponent-insulin. The present invention relates to a method for purifying an insulin-containing aqueous ethanol crude extract from pancreatic glands, which method is valuable as a purification step in the processing of the extract into pure monocomponent insulin.
Betegnelsen "råinsulinekstrakt" benyttes her i den van- The term "crude insulin extract" is used here in the usual
lige betydning, dvs. den ekstrakt som fås ved å behandle pankreaskjertler med et vannholdig organisk oppløsningsmiddel, særlig vandig etanol, vanligvis med en konsentrasjon på equal meaning, i.e. the extract obtained by treating pancreatic glands with an aqueous organic solvent, especially aqueous ethanol, usually with a concentration of
60-80%, og omfatter også ekstrakter som foruten å være befridd for fett har vært underkastet forskjellige behandlinger, f.eks. utfeining av proteiner som er forskjellige fra insulin, ved pH-endring, den såkalte pH 8 feining, og eventuelt omvendt osmose, dog således at insulinet under disse behandlinger er forblitt i væskefase. Betegnelsen omfatter således ikke insulinholdige oppløsninger dannet ved oppløsning av fra den opprinnelige ekstrakt isolert, renset, fast insulin i et opp-løsningsmiddel. 60-80%, and also includes extracts which, in addition to being freed from fat, have been subjected to various treatments, e.g. removal of proteins that are different from insulin, by pH change, the so-called pH 8 removal, and possibly reverse osmosis, however, so that during these treatments the insulin remains in the liquid phase. The term thus does not include insulin-containing solutions formed by dissolving purified, solid insulin isolated from the original extract in a solvent.
Det er nu almindelig antatt at antigenisiteten hos insulinpreparater i overveiende grad skyldes urenheter i preparatene, mens man tidligere har vært av den oppfatning at insulin-antistoffene ble fremkalt av insulinet som sådant. Disse urenheter kan være insulinfremmede ledsageproteiner fra pankreas, proinsulin som er insulinets forstadium, intermediær insulin, dimeren, arginin-insulin, etylesterinsulin, desamido-insulin, deamidert i forskjellig grad, andre insulin-modifikasjoner og farvede stoffer. It is now generally assumed that the antigenicity of insulin preparations is predominantly due to impurities in the preparations, whereas previously it was believed that the insulin antibodies were induced by the insulin as such. These impurities can be insulin-promoted companion proteins from the pancreas, proinsulin which is the precursor of insulin, intermediate insulin, the dimer, arginine insulin, ethyl ester insulin, desamido insulin, deamidated to varying degrees, other insulin modifications and colored substances.
Man bestreber seg derfor på å fremstille insulinpreparater bestående av rent insulin, såkalt monokomponent-insulin, Efforts are therefore being made to produce insulin preparations consisting of pure insulin, so-called monocomponent insulin,
fritt for urenheter og ledsagestoffer av enhver art. free from impurities and accompanying substances of any kind.
Man har for dette formål foreslått å underkaste på konvensjonell måte fremstilt amorft eller krystallinsk insulin, en vidtgående ytterligere rensning, f.eks. ved ionebytter-behandling, gelfiltrering under anvendelse av en såkalt molekylsikt eller fordelings-kromatografi. For this purpose, it has been proposed to subject conventionally produced amorphous or crystalline insulin to extensive further purification, e.g. by ion exchange treatment, gel filtration using a so-called molecular sieve or partition chromatography.
Rensning ved fordelings-kromatografi er f.eks. beskrevet Purification by partition chromatography is e.g. described
i tysk offentliggjørelsesskrift 2.212.695. Det er derfra kjent å underkaste en oppløsning dannet ved oppløsning av fast, in German publication document 2,212,695. From there it is known to subject a solution formed by dissolving solid,
ennu urent insulin i et vandig oppløsningsmiddelsystem som still impure insulin in an aqueous solvent system which
foruten alkoholer med 4-5.karbonatomer inneholder karboksyl-syrer med 1-3 karbonatomer og/eller ammoniakk eller en organisk base med en pK -verdi mellom ca. 5,1 og 11, fordelings-kromatografi, idet det som gel anvendes Sephadex LH-20. besides alcohols with 4-5 carbon atoms contains carboxylic acids with 1-3 carbon atoms and/or ammonia or an organic base with a pK value between approx. 5.1 and 11, partition chromatography, using Sephadex LH-20 as gel.
Den nevnte gel er dekstran, tverrbundet med epiklorhydrin og inneholdende hydroksypropylgrupper som ved eterbindinger er knyttet til dekstrankjedenes glukoseenheter. The aforementioned gel is dextran, cross-linked with epichlorohydrin and containing hydroxypropyl groups which are linked by ether bonds to the glucose units of the dextran chains.
Rensningen ved gelfiltrering er bl.a. beskrevet i US-patentskrift 3.876.623. Det er derfra kjent å rense et alkalimetall- eller ammoniuminsulin under anvendelse av en gel med nærmere angitte egenskaper med hensyn til vannopptagelsesevne (water regain value) og partikkelstørrelse. Fremgangsmåten er kun anvendelig til rensing av alkalimetall-eller ammoniuminsolin med en renhet på minst ca. 80%; dvs. at insulininnholdet, derunder insulinlignende proteiner med hypoglykemisk virkning, i det minste må utgjøre 80% av den totale mengde tilstedeværende proteiner. Som gel nevnes bi.a. tverrbundet dekstran og derunder Sephadex-serien fra Pharmacia Fine Chemicals. Det nevnes ikke bestemte represen-tanter for denne serie. The purification by gel filtration is i.a. described in US Patent 3,876,623. From there, it is known to purify an alkali metal or ammonium insulin using a gel with specified properties with regard to water regain value and particle size. The method is only applicable to the purification of alkali metal or ammonium insulin with a purity of at least approx. 80%; i.e. that the insulin content, including insulin-like proteins with a hypoglycaemic effect, must at least make up 80% of the total amount of proteins present. As a gel, bi.a. cross-linked dextran and below it the Sephadex range from Pharmacia Fine Chemicals. No specific representatives are mentioned for this series.
Videre er rensning ved gelfiltrering beskrevet i en artikkel av Charles J. Epstein og Christian B. Anfinsen i Biochemistry 2, 461-464 (1963). Frosne pankreaskjertler fra okse eller kalv ble ekstrahert med svovelsyre-etanol efterfulgt av etanol-eter-utfelling. Det utfelte materiale ble efter lufttørring oppløst i NH4HC0.j-oppløsning, og oppløsningen ble efter sentrifugering påført en med NH4HC03~oppløsning ekvilibrert Sephadex G-50 kolonne, og det ble eluert med NH^HCO^-oppløsning. Den insulinholdige utfelning betegnes Furthermore, purification by gel filtration is described in an article by Charles J. Epstein and Christian B. Anfinsen in Biochemistry 2, 461-464 (1963). Frozen bovine or calf pancreatic glands were extracted with sulfuric acid-ethanol followed by ethanol-ether precipitation. The precipitated material was dissolved in NH 4 HCO 3 solution after air drying, and the solution was applied after centrifugation to a Sephadex G-50 column equilibrated with NH 4 HCO 3 solution, and it was eluted with NH 4 HCO 3 solution. The insulin-containing precipitate is termed
av forfatterne "Crude Extract", men det er, som det vil fremgå, ikke tale om en råinsulinekstrakt i den i foreliggende beskrivelse benyttede betydning av ordet (en ekstrakt inneholdende insulin som ikke har vært utfelt). by the authors "Crude Extract", but it is not, as will be seen, a crude insulin extract in the meaning of the word used in the present description (an extract containing insulin that has not been precipitated).
I en artikkel "Super-ren insulin" i tidsskriftet In an article "Super-pure insulin" in the journal
"Dansk Kemi" (1974), hefte 10, side 14-15 nevnes kort at rensningen av insulinholdige ekstrakter kan skje ved om-krystallisasjon, og at visse nye produkter dessuten renses ved ionebytting og geifiltrering. Det er således ikke tale om gelfiltrering av en råinsulinekstrakt i den i foreliggende "Dansk Kemi" (1974), volume 10, pages 14-15 briefly mentions that the purification of insulin-containing extracts can be done by recrystallization, and that certain new products are also purified by ion exchange and gel filtration. It is thus not a question of gel filtration of a crude insulin extract in the present case
beskrivelse benyttede betydning av dette ord. I artikkelen nevnes intet om arten av den anvendte gel, og heller ikke arten av det anvendte svellemiddel og elueringsmiddel er omtalt. description used meaning of this word. In the article, nothing is mentioned about the nature of the gel used, nor is the nature of the swelling agent and eluent used.
De høyrensede insuliner som fås ved de ovenfor omtalte kjente rensningsmetoder, viser en sterk nedgang i antigenisitet, men ikke en fullstendig fjernelse av denne. Årsaken til dette er utvilsomt at det til tross for rensningstrinnene i de rensede preparater finnes stoffer som er forskjellige fra insulin. The highly purified insulins obtained by the above-mentioned known purification methods show a strong decrease in antigenicity, but not a complete removal of this. The reason for this is undoubtedly that despite the purification steps in the purified preparations there are substances that are different from insulin.
Vi har tidligere utviklet en fremgangsmåte til fremstilling av meget rent monokomponent-insulin, jfr. beskrivelsen til ålment tilgjengelig norsk patentansøkning 77.0119), We have previously developed a method for the production of very pure monocomponent insulin, cf. the description of generally available Norwegian patent application 77.0119),
tysk off.skrift nr. 27 01 092 og belgisk patent nr. 850.387. German official document no. 27 01 092 and Belgian patent no. 850,387.
Den nevnte fremgangsmåte er basert på den erkjennelse at noen av de urenheter som finnes i insulin ved anvendelse av de konvensjonelle fremgangsmåter, dannes under selve utvinningen av insulinet, hvorfor det er vesentlig å utføre utvinningen av insulinet på en slik måte at insulinet, fra ekstraksjonen av pankreaskjertlene inntil oppnåelse av det endelige produkt, kun utsettes for betingelser av en slik art at de ikke bevirker dannelsen av nedbrytningsprodukter, aggregater osv. The aforementioned method is based on the recognition that some of the impurities found in insulin when using the conventional methods are formed during the actual extraction of the insulin, which is why it is essential to carry out the extraction of the insulin in such a way that the insulin, from the extraction of until the final product is obtained, the pancreatic glands are only exposed to conditions of such a nature that they do not cause the formation of degradation products, aggregates, etc.
Fremgangsmåten er karakteristisk ved at den av pankreas-kjertlene fremstilte insulinholdige ekstrakt opparbeides til rent insulin på en slik måte at insulinet holdes i oppløst tilstand under hele opparbeidelsesprosessen inntil den endelige utvinning derav, idet de ikke ønskede stoffer fra begynnelsen til avslutningen av prosessen fjernes fra de forskjellige anvendte oppløsningsmidler. The method is characterized by the fact that the insulin-containing extract produced by the pancreatic glands is processed into pure insulin in such a way that the insulin is kept in a dissolved state during the entire processing process until its final extraction, with the unwanted substances from the beginning to the end of the process being removed from the different solvents used.
Ved den nevnte fremgangsmåte er det ikke tale om en rensning av selve insulinet, men det skjer en rensning av den utvundne insulinekstrakt for de oppløste urenheter og fett og uønskede proteinstoffer og derivater av insulin, inntil det rene insulin er alene tilbake i ekstrakten (eller i en annen vandig fase) . In the aforementioned method, there is no question of a purification of the insulin itself, but a purification of the extracted insulin extract from the dissolved impurities and fat and unwanted protein substances and derivatives of insulin, until only the pure insulin remains in the extract (or in another aqueous phase).
Fremgangsmåten kan f.eks. utføres ved at man underkaster ekstrakten en behandling for fjernelse av fett, bestående i avkjøling av ekstrakten til en lav temperatur, f.eks. mellom -25°C og -45°C, efterfulgt av fraskillelse av det krystalliserte fett, konsentrerer ekstrakten ved hjelp av omvendt osmose, The procedure can e.g. is carried out by subjecting the extract to a treatment for the removal of fat, consisting in cooling the extract to a low temperature, e.g. between -25°C and -45°C, followed by separation of the crystallized fat, concentrate the extract by means of reverse osmosis,
idet insulinet samtidig skilles fra urenheter i ekstrakten, såvel stoffer med større molekyler enn insulin som stoffer med mindre molekyler enn insulin, vasker det insulinholdige konsentrat fra den omvendte osmose i et anlegg for omvendt osmose for delvis fjernelse av farvede stoffer og salter fra konsentratet, underkaster det rensede konsentrat ytterligere rensning ved hjelp av ionebytting og til slutt utvinner insulinet fra den konsentrerte, rensede oppløsning ved utfeining med metallioner, fortrinnsvis sinkioner, under sterk avkjøling, f.eks. til -30°C til -45°C. while the insulin is simultaneously separated from impurities in the extract, both substances with larger molecules than insulin and substances with smaller molecules than insulin, the insulin-containing concentrate is washed from the reverse osmosis in a reverse osmosis plant for the partial removal of colored substances and salts from the concentrate, subjected the purified concentrate is further purified by ion exchange and finally the insulin is recovered from the concentrated, purified solution by scavenging with metal ions, preferably zinc ions, under strong cooling, e.g. to -30°C to -45°C.
Det er imidlertid vanskelig ved en effektiv separering However, effective separation is difficult
av insulinet i råekstrakten, evnt. for-renset ved utkrystal-lisasjon av fettet ved lav temperatur og omvendt osmose, fra urenheter på ionebytter å unngå tap av insulin, idet det ved lengere separeringstid kan oppstå aggregater insulinmolekylene imellom, hvilke aggregater senere bare vanskelig kan elueres. of the insulin in the crude extract, possibly pre-purified by crystallization of the fat at low temperature and reverse osmosis, from impurities on ion exchangers to avoid loss of insulin, as aggregates can form between the insulin molecules during a longer separation time, which aggregates can later only be difficult to remove eluted.
Vi har derfor satt oss som oppgave å finne frem til We have therefore set ourselves the task of finding out
en rensemetode som kan supplere eller erstatte en behandling av råekstrakten med ionebyttere, slik at det fås en effektiv separering uten tap av insulin eller med et mindre insulintap enn tidligere. a purification method that can supplement or replace a treatment of the crude extract with ion exchangers, so that an effective separation is obtained without loss of insulin or with a smaller loss of insulin than before.
Det. har vist seg at man kan oppnå en rensning av en insulinholdig etanolisk råekstrakt med omtrent 100% insulin-utbytte ved å underkaste ekstrakten gelfiltrering under anvendelse av en spesiell gel og under iakttagelse av særlige betingelser. The. it has been shown that a purification of an insulin-containing crude ethanolic extract with approximately 100% insulin yield can be achieved by subjecting the extract to gel filtration using a special gel and observing special conditions.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen karakteriseres ved at den insulinholdige etanoliske råekstrakt, efter å være blitt avkjølt for å fjerne fett ved krystallisasjon med påfølgende fraskillelse av fettkrystallene fra ekstrakten og eventuelt efter å være blitt ytterligere "for-renset under betingelser hvor insulinet er forblitt i yæskefase, med en etanolkonsentrasjon mellom 60 og 80 vol%, underkastes gelfiltrering på en gel svellet i etanol eller i vandig etanol, fortrinnsvis med en etanolkonsentrasjon på minst 60 vol%, og fortrinnsvis med den samme konsentrasjon og den samme pH-verdi som det benyttede ekstraksjonsmiddel, idet det som elueringsmiddel likeledes benyttes etanol eller vandig etanol, fortrinnsvis med en etanolkonsentrasjon på minst 60 vol%. The method according to the invention is characterized in that the insulin-containing crude ethanolic extract, after being cooled to remove fat by crystallization with subsequent separation of the fat crystals from the extract and possibly after being further "pre-purified under conditions where the insulin has remained in the frozen phase, with an ethanol concentration between 60 and 80 vol%, is subjected to gel filtration on a gel swollen in ethanol or in aqueous ethanol, preferably with an ethanol concentration of at least 60 vol%, and preferably with the same concentration and the same pH value as the extraction agent used, ethanol or aqueous ethanol is also used as an eluent, preferably with an ethanol concentration of at least 60 vol%.
Den anvendte gel er en kuleformet gel som har både hydrofile og lipofile egenskaper. Det er en dekstran tverrbundet med epiklorhydrin og inneholdende hydroksypropylgrupper knyttet til dekstrankjedenes glukoseenheter ved hjelp av eterbindinger, med en eksklusjonsgrense som tilsvarer en molekylvekt på ca. 10.000 og en The gel used is a spherical gel that has both hydrophilic and lipophilic properties. It is a dextran cross-linked with epichlorohydrin and containing hydroxypropyl groups linked to the glucose units of the dextran chains by means of ether bonds, with an exclusion limit corresponding to a molecular weight of approx. 10,000 and one
vannopptagelsesevne på 5,3-6,3 ml/g. Sephadex ® LH-60 fremstilt av Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige, er en slik gel. water absorption capacity of 5.3-6.3 ml/g. Sephadex ® LH-60 manufactured by Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden, is one such gel.
Ved gelfiltreringen ifølge foreliggende oppfinnelse trenger insulinmolekylene inn i gelpartiklene, idet de ligger under gelens eksklusjonsgrense. Ved elueringen oppnås en insulin-fraksjon som er fullstendig fri for farvede stoffer og som ikke inneholder, eller praktisk talt ikke inneholder, proteiner med større molekyler enn insulinet eller med mindre molkyler enn insulinet, men bare inneholder insulinderivater med praktisk talt samme molekylstørrelse som insulinet. Insulinutbyttet er praktisk talt 100%. In the gel filtration according to the present invention, the insulin molecules penetrate into the gel particles, as they lie below the gel's exclusion limit. During the elution, an insulin fraction is obtained which is completely free of colored substances and which does not contain, or practically does not contain, proteins with larger molecules than the insulin or with smaller molecules than the insulin, but only contains insulin derivatives with practically the same molecular size as the insulin. The insulin yield is practically 100%.
Foreliggende fremgangsmåte kan med særlig fordel anvendes The present method can be used with particular advantage
i forbindelse med den i ålment tilgjengelig norsk patentånsøkning 77.0119 beskrevne fremgangsmåte, idet gelfiltreringen supplerer eller delvis erstatter behandlingen med ionebyttere som er beskrevet i nevnte ansøknings beskrivelse. in connection with the method described in the widely available Norwegian patent application 77.0119, in that the gel filtration supplements or partially replaces the treatment with ion exchangers which is described in the said application's description.
Gelfiltreringen ifølge foreliggende oppfinnelse er imidlertid ikke begrenset til anvendelse i forbindelse med nevnte eldre fremgangsmåte, men kan anvendes på en vilkårlig vandig-etanolisk<v >råekstrakt befridd for fett og kan inngå enten som avsluttende rensningstrinn før isoleringen av fast insulin eller som et mellomliggende rensningstrinn. However, the gel filtration according to the present invention is not limited to use in connection with the aforementioned older method, but can be used on an arbitrary aqueous-ethanolic<v>crude extract freed from fat and can be included either as a final purification step before the isolation of solid insulin or as an intermediate purification step .
Med hensyn til den tidligere omtalte fremgangsmåte som With regard to the previously mentioned method which
er kjent fra tysk off.skrift 2.212.695, hvilken fremgangsmåte består i å underkaste en oppløsning dannet ved oppløsning av fast insulin i et vandig oppløsningsmiddelsystem som foruten alkoholer med 4-5 karbonatomer inneholder en karboksylsyre og/eller ammoniakk eller en organisk base, fordelings-kromatografi under anvendelse av Sephadex LH-20, bemerkes at det her er tale om en annen separasjons.teknikk enn gelf iltrer ing . Fremgangsmåten er ikke egnet til- rensning av en insulinholdig råekstrakt, blant annet fordi det må anvendes et oppløsnings-middelsystem som er forskjellig fra de oppløsningsmidler som vanligvis benyttes til ekstraksjon av pankreaskjertler. Man is known from German official publication 2,212,695, which method consists in subjecting a solution formed by dissolving solid insulin in an aqueous solvent system which, in addition to alcohols with 4-5 carbon atoms, contains a carboxylic acid and/or ammonia or an organic base, distribution -chromatography using Sephadex LH-20, it is noted that this is a different separation technique than gel filtration. The method is not suitable for the purification of an insulin-containing crude extract, partly because a solvent system must be used which is different from the solvents usually used for the extraction of pancreatic glands. Mon
vil også bemerke at Sephadex LH-20 adskiller seg fra Sephadex <®>LH-60 ved å ha en lavere eksklusjonsgrense enn denne siste, jfr. offentliggjørelsesskriftet side 4, tredje hele avsnitt, slik at insulinmolekylene ikke vil trenge inn i gelen. will also note that Sephadex LH-20 differs from Sephadex <®>LH-60 by having a lower exclusion limit than the latter, cf. publication document page 4, third full paragraph, so that the insulin molecules will not penetrate the gel.
Ved rensningen ifølge oppfinnelsen av en råinsulinekstrakt kan man gå frem på følgende måte: Man bringer gelen til å svelle i etanol eller vandig etanol, fortrinnsvis med en etanolkonsentrasjon på minst 60 vol.%, f.eks. en blanding svarende til den som ble anvendt til ekstraksjonen av pankreas-kjertlene, eller eventuelt en blanding med litt høyere konsentrasjon av det organiske opp-løsningsmiddel. In the purification according to the invention of a crude insulin extract, one can proceed in the following way: The gel is brought to swell in ethanol or aqueous ethanol, preferably with an ethanol concentration of at least 60 vol.%, e.g. a mixture similar to that used for the extraction of the pancreatic glands, or possibly a mixture with a slightly higher concentration of the organic solvent.
Kolonnen tilberedes på vanlig måte, råekstrakten - med en etanolkonsentrasjon mellom 60 og 80 vol% - påføres og kolonnen gjennomstrømmes med elueringsmidlet, dvs. etanol eller vandig etanol. Elueringsmidlet kan være det samme som svellemidlet. The column is prepared in the usual way, the crude extract - with an ethanol concentration between 60 and 80 vol% - is applied and the column is flowed through with the eluent, i.e. ethanol or aqueous ethanol. The eluent may be the same as the swelling agent.
pH-verdien i den flytende fase i Sephadex-laget er for-trinnvis mellom 3 og 8. (Eluater med en pH-verdi under ca. 3 The pH value in the liquid phase in the Sephadex layer is preferably between 3 and 8. (Eluates with a pH value below approx. 3
er for sure til at de direkte kan påføres ionebyttere, og ved pH-verdier over 8 vil insulinet delvis ødelegges). are too acidic to be directly applied to ion exchangers, and at pH values above 8 the insulin will be partially destroyed).
Insulinet elueres og fraksjonen oppsamles. Den er helt fri for farvede stoffer. Det oppnås et praktisk talt 100% utbytte av insulin. The insulin is eluted and the fraction collected. It is completely free of colored substances. A practically 100% yield of insulin is achieved.
For oppnåelse av rent monokomponent-insulin renses eluatet ytterligere, f.eks. med ionebytter, og til slutt isoleres insulinet, f.eks. ved feining. To obtain pure monocomponent insulin, the eluate is further purified, e.g. with ion exchange, and finally the insulin is isolated, e.g. by sifting.
Eksempel Example
En insulinholdig råekstrakt - oppnådd ved å behandle frosne findelte pankreaskjertler fra griser med 85% etanol surgjort til en pH-verdi på ca. 3 med f^SO^ (2 liter 85% etanol/ 1 kg kjertler, hvilket sammen med vannet i kjertlene gir en vandig 65%ig etanolekstrakt), fjerne fett fra ekstrakten ved avkjøling til -30°C efterfulgt av fraskillelse av de dannede fettkrystaller og konsentrere til 1/10 av det opprinnelige volum ved omvendt osmose - ble underkastet gelfiltrering på følgende måte: 50 liter av ovennevnte konsentrat ble påført en kolonne (diameter 45 cm, høyde 75 cm) av Sephadex ® LH-60 svellet i og ekvilibrert med 65% etanol (acetatbuffer, ionestyrke 0,025, pH-verdi 7,3). An insulin-containing crude extract - obtained by treating frozen finely divided pancreatic glands from pigs with 85% ethanol acidified to a pH value of approx. 3 with f^SO^ (2 liters of 85% ethanol/ 1 kg of glands, which together with the water in the glands gives an aqueous 65% ethanol extract), remove fat from the extract by cooling to -30°C followed by separation of the formed fat crystals and concentrate to 1/10 of the original volume by reverse osmosis - was subjected to gel filtration as follows: 50 liters of the above concentrate was applied to a column (diameter 45 cm, height 75 cm) of Sephadex ® LH-60 swollen in and equilibrated with 65% ethanol (acetate buffer, ionic strength 0.025, pH value 7.3).
Elueringen ble utført med et elueringsmiddel som var det samme som svellemidlet. The elution was carried out with an eluent which was the same as the swelling agent.
De fraksjoner som inneholdt insulintoppen, ble samlet. The fractions containing the insulin peak were pooled.
De var fullstendig befridd for farvede stoffer og inneholdt ingen eller praktisk talt ingen proteiner med større molekyler enn insulin eller med mindre molekyler enn insulin. They were completely freed from colored substances and contained no or practically no proteins with molecules larger than insulin or with molecules smaller than insulin.
Claims (4)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
NO772468A NO147978C (en) | 1977-07-12 | 1977-07-12 | PROCEDURE FOR CLEANING AN INSULIN-Aqueous ETHANOLIS EXTRACT FROM PANCREATIC Glands |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
NO772468A NO147978C (en) | 1977-07-12 | 1977-07-12 | PROCEDURE FOR CLEANING AN INSULIN-Aqueous ETHANOLIS EXTRACT FROM PANCREATIC Glands |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO772468L NO772468L (en) | 1979-01-15 |
NO147978B true NO147978B (en) | 1983-04-11 |
NO147978C NO147978C (en) | 1983-08-03 |
Family
ID=19883628
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO772468A NO147978C (en) | 1977-07-12 | 1977-07-12 | PROCEDURE FOR CLEANING AN INSULIN-Aqueous ETHANOLIS EXTRACT FROM PANCREATIC Glands |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
NO (1) | NO147978C (en) |
-
1977
- 1977-07-12 NO NO772468A patent/NO147978C/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NO772468L (en) | 1979-01-15 |
NO147978C (en) | 1983-08-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4129560A (en) | Process for the purification of high molecular weight peptides using non-ionic detergents | |
US4861870A (en) | Process for purifying anthracyclinone glycosides by selective adsorption on resins | |
US4400471A (en) | Preparation and crystallization of Fraction I protein from plant sources | |
EP0011231B1 (en) | Process for the preparation of cold-insoluble globulin and medicament containing it | |
CN101455287A (en) | Melittin purification method | |
CA1089448A (en) | Process for purifying glucagon | |
KR880012753A (en) | How to prepare active forms of protein | |
CN106749626B (en) | Method for extracting albumin and globulin from bovine serum and method for utilizing bovine serum | |
NO147978B (en) | PROCEDURE FOR CLEANING AN INSULIN-Aqueous ETHANOLIC EXTRACTS FROM PANCREAS Glands | |
Hochstein | Alkaloids of Rauwolfia sellowii | |
EP0013826A1 (en) | Process for purifying insulin and insulin so prepared | |
EP0000439B1 (en) | Method of purifying an insulin-containing aqueous ethanolic raw extract from pancreas glands | |
EP3110839B1 (en) | Extraction process to obtain hcg having a high biological activity | |
EP0089218B1 (en) | A process for purifying human chorionic gonadotropin | |
US4197238A (en) | Method of preparation of human albumin using polyethylene glycol | |
US5684155A (en) | Process for the extraction and purification of alkaloids | |
CN110760493B (en) | Method for preparing papain by combining aqueous two-phase extraction and ultrafiltration | |
US2834713A (en) | Preparation of enzyme extracts from liver | |
US3875138A (en) | Process for recovering glucagon | |
US2974088A (en) | Method of preparing growth hormone | |
GB1581824A (en) | Preparation of insulin | |
Jackson et al. | Preparation and partial characterization of crystalline human insulin | |
FI58260B (en) | FOER REFRIGERATION FOR RENTING INSULIN | |
EP0137506B1 (en) | Extraction of teichmonycin a2 from whole culture fermentation broth | |
AU2020102054A4 (en) | An extracting technology and an additives of metabolite |