NO127470B

NO127470B -

Info

Publication number: NO127470B
Application number: NO03923/68A
Authority: NO
Inventors: Harold Benjamin Tillem
Original assignee: Harold Benjamin Tillem
Priority date: 1967-10-05
Filing date: 1968-10-04
Publication date: 1973-06-25
Also published as: DE1773363A1; SE358029B; CH491386A; US3492095A; ES352693A1; BE712385A; IL28990A; NL6813544A; GB1213014A; FR1559272A

Description

Fremgangsmåte ved undersøkelse av blod for Procedure for examination of blood for

påvisning av hemoglobin s. detection of hemoglobin p.

Hemoglobin S ansees for tiden å være et nedarvet genetisk stoff som i heterozygotisk tilstand bare gir små kliniske tegn på sin tilstedeværelse, men som i homozygotisk tilstand gir sterk anemi. Hemoglobin S is currently considered to be an inherited genetic substance which in the heterozygous state gives only slight clinical signs of its presence, but which in the homozygous state causes severe anaemia.

Karakteristiske sigdceller er hovedsakelig blitt funnet hos negre. Homozygotisk hemoglobin S gir en anemi hvis symptomer omfatter sårdannelse i ben og akutte smerteangrep. Den homozygotiske tilstand er i alminnelighet særpreget ved tilstedeværelsen av typiske sigd-formede og havreformede rode legemer. Selv om det hovedsakelig er blitt forbundet med negre, er det tegn som tyder på at de karakteristiske sigdceller kan ha blitt innfort i Afrika fra hord-ost via den tidligere landforbindelse mellom Egypt og Afrika. Det synes imidlertid som om sigdcelleanemi for tiden finnes oftere Characteristic sickle cells have mainly been found in Negroes. Homozygous hemoglobin S causes an anemia whose symptoms include ulceration in the legs and acute pain attacks. The homozygous state is generally characterized by the presence of typical sickle-shaped and oat-shaped red bodies. Although it has been mainly associated with Negroes, there are indications that the characteristic sickle cells may have been introduced into Africa from the Horde via the earlier land connection between Egypt and Africa. However, it seems that sickle cell anemia is currently more common

hos negre eller hos perssoner av blandingsrase med negerblod. in Negroes or in persons of mixed race with Negro blood.

Legen som undersbker en pasient med sigdcelleanemi og som The doctor who examines a patient with sickle cell anemia and who

ikke tenker på denne mulighet, kan, dersom en egnet bloduhdersokelse ikke gj.ennoafor.es, stille feil diagnose da symptomene for sigdcelleanemi er de samme som for underlivssykdommer, giktfeber éiler nevrologiske forstyrrelsex. does not consider this possibility, if a suitable blood test is not carried out, can make a wrong diagnosis as the symptoms for sickle cell anemia are the same as for abdominal diseases, gouty fever and neurological disordersx.

Det er viktig at"også de karakteristiske sigdceller'skål kunne oppdages av eri praktiserende lege da en person med dette særtrekk ikke bor utsettes for lave oxygenforhold. Dette er dessuten også viktig dersom en person med karakteristiske sigdceller gir blod for anvendelse av andre. Det ville ikke være onskelig å gi en blodover-føring fra en person med hemoglobin S til en pasient med for lite oxygen. It is important that "also the characteristic sickle cells' bowl could be detected by a practicing doctor as a person with this characteristic should not be exposed to low oxygen conditions. This is also important if a person with characteristic sickle cells donates blood for use by others. It would not be desirable to give a blood transfusion from a person with hemoglobin S to a patient with too little oxygen.

Forskjellige metoder kan anvendes for bestemmelse av sigdceller. Den enkleste metode er å plasere en bloddråpe på et objektglass, legge på et dekk-glass og forsegle preparatet. :. Ved henstand vil oxygen forbrukes. Sigddannelse vil være synlig under et mikroskop efter et par timer dersom sigdcelleanemi foreligger, og lang-sommere i tilfelle av de karakteristiske sigdceller og kan iakttaes av en fagutdannet person. Sigddannelse vil påskyndes ved å anbringe et stramt gummibånd rundt fingeren og la det være der i ca. 5 minutter for det lages en våtprove. Den sterkeste sigddannelse fåes ved å sette et reduksjonsmiddel, som natriummetabisulfitt (Na2S20^) eller natriumditionitt (^2820^), til blodet. Natriummetabisulfittet anvendes for bedommelsen i overensstemmelse med de folgende trinn: Different methods can be used for the determination of sickle cells. The simplest method is to place a drop of blood on a slide, put on a cover glass and seal the preparation. :. If there is a delay, oxygen will be consumed. Sickling will be visible under a microscope after a few hours if sickle cell anemia is present, and slower in the case of the characteristic sickle cells and can be observed by a trained person. Sickle formation will be accelerated by placing a tight rubber band around the finger and leaving it there for approx. 5 minutes before a wet sample is made. The strongest sickling is obtained by adding a reducing agent, such as sodium metabisulfite (Na2S20^) or sodium dithionite (^2820^), to the blood. The sodium metabisulphite is used for the assessment in accordance with the following steps:

1. En liten dråpe kapillar- eller oxalert blod anbringes på 1. A small drop of capillary or oxalated blood is placed on

et rent objektglass, og to dråper av samme storrelse av en 2$ natriummetabisulfittopploshing settes til objektglasset. 2. Blodet og natriummetabisulfittopplbsningen blandes og dekkes med et glass og får henstå i 30 minutter. 3. Gjennom mikroskopet (hoy torr linse) er det for et trenet bye mulig å oppdage tilstedeværelsen av sigdceller. a clean slide, and two drops of the same size of a 2% sodium metabisulfite solution are added to the slide. 2. The blood and the sodium metabisulphite solution are mixed and covered with a glass and allowed to stand for 30 minutes. 3. Through the microscope (high dry lens) it is possible for a trained bee to detect the presence of sickle cells.

En for tiden anvendt kvalitativ undersøkelse for å skille mellom karakteristiske sigdceller og sigdcelleanemi er Shermans metode. Denne metode gjor bruk av en 10?£ formalinopplbsning. A currently used qualitative examination to distinguish between characteristic sickle cells and sickle cell anemia is Sherman's method. This method makes use of a 10?£ formalin solution.

Trinnene omfatter: The steps include:

1. 2 ml av den 10#-ige formalin-saltvannsopplbsning anbringes 1. 2 ml of the 10# formalin-saline solution is placed

i et lite medinsinglass dekket med et lag av mineralolje. in a small medicine glass covered with a layer of mineral oil.

2. Tomrommet i en 5 ml injeksjonssprbyte fylles med mineralolje, og overskuddet presses ut. 3. En steril nål settes på sproyten og 2 ml blod fjernes ved venepunktur. 4. Nålen får være på sproyten, og det innfores straks 1 ml blod under oljelaget i medinsinglasset. 2. The void in a 5 ml injection syringe is filled with mineral oil, and the excess is squeezed out. 3. A sterile needle is placed on the syringe and 2 ml of blood is removed by venipuncture. 4. The needle must be on the syringe, and 1 ml of blood is immediately introduced under the oil layer in the medicine glass.

5. Det hele omrores med en glass-stav. 5. The whole thing is stirred with a glass rod.

6. Efter at blandingen har fått henstå i 10 minutter, kan en liten mengde av blodblandingen fjernes med en kapLllarpipette. 7. En dråpe av blandingen anbringes så på objektglasset, dekkes med et dekkglass og undersbkes for tilstedeværelse av sigdceller under en sterk forstørrende mikroskoplinse. 6. After the mixture has been allowed to stand for 10 minutes, a small amount of the blood mixture can be removed with a capillary pipette. 7. A drop of the mixture is then placed on the slide, covered with a cover slip and examined for the presence of sickle cells under a high magnification microscope lens.

Resultatet er at det enten vil kunne iakttaes at det ikke foreligger noen sigdceller eller at enthrocytter og den prosentuelle an-del av tilstedeværende krummede enthrocytter vil telles. Dersom l°/ o eller derunder av krummede erythrocytter er tilstede, tyder dette på sigdcellekarakter. Sigdcelleanemi er alltid forbundet med mer enn 1$, som regel 30-60$,krummede erythrocytter. The result is that it will either be possible to observe that there are no sickle cells or that entrocytes and the percentage of curved entrocytes present will be counted. If l°/ o or less of curved erythrocytes are present, this indicates sickle cell character. Sickle cell anemia is always associated with more than 1$, usually 30-60$, curved erythrocytes.

Hemoglobin- elektroforese er selvfolgelig den mest spesifikke metode for bestemmelse av tilstedeværelsen av et unormalt hemoglobin, som hemoglobin S, og for å skille sigdcelleanemi (homozygotisk) Hemoglobin electrophoresis is obviously the most specific method for determining the presence of an abnormal hemoglobin, such as hemoglobin S, and for distinguishing sickle cell anemia (homozygous)

fra sigdcellekarakter (heterozygotisk). from sickle cell character (heterozygous).

En tredje metode for kvalitativ analyse av blodet med hensyn til dets prosentuelle innhold av sigdceller er beskrevet av C.A.J. Goldberg i en artikkel i Clinical Ghemistry, 3, nr. 1. februar 1957, s. 1-19 med tittel "Identification of Hemoglobins" hvor spesielle blodpreparater med folgende krav benyttes: A third method of qualitative analysis of the blood with regard to its percentage content of sickle cells is described by C.A.J. Goldberg in an article in Clinical Ghemistry, 3, No. 1 February 1957, pp. 1-19 entitled "Identification of Hemoglobins" where special blood preparations with the following requirements are used:

Fire eller fem ml oxalert blod anbringes i sentrifugerbr med Four or five ml of oxalated blood is placed in a centrifuge tube with

et rominnhold av 15 ml og sentrifugeres i 10 minutter. a volume of 15 ml and centrifuged for 10 minutes.

Supernatånten fjernes, og 10 ml saltvannsopplosning settes til de sammenpakkede celler. The supernatant is removed, and 10 ml of saline solution is added to the packed cells.

Dette omrores forsiktig og sentrifugeres igjen i 10 minutter. Supernatånten- fjernes igjen, og cellene vaskes tre ganger til, hver gang med 10 ml saltvannsopplosning. This is stirred carefully and centrifuged again for 10 minutes. The supernatant is removed again, and the cells are washed three more times, each time with 10 ml of saline solution.

Dette sentrifugeres igjen i 10 minutter. This is centrifuged again for 10 minutes.

De vaskede, sammenpakkede celler anbringes i graderte sentri-fugeror, og 2 vqlumdeler barbitalbuffer pH 8,6 tilsettes under forsiktig omrøring, .og suspensjonen overfores så til fryselagrings-rbr. De frosne prover får henstå i det minste over natten og må holdes frosne inntil de skal benyttes. The washed, packed cells are placed in graduated centrifuge tubes, and 2 volumes of barbital buffer pH 8.6 are added with gentle stirring, and the suspension is then transferred to a freezer storage container. The frozen samples must remain at least overnight and must be kept frozen until they are to be used.

Hemolyse fåes ved opptining. Et ror opptines i kjoleskapet eller ved værelsetemperatur. Roret kan oppvarmes ved kroppstempera-tur, men bbr avkjbles så snart all is er forsvunnet. Roret kan ikke anbringes i mellomvarmt eller varmt vann for opptining. Haemolysis is obtained by thawing. A rudder is heated in the refrigerator or at room temperature. The rudder can be heated to body temperature, but it is cooled as soon as all the ice has disappeared. The rudder cannot be placed in medium warm or hot water to defrost.

Prbven sentrifugeres i 10 minutter, og det klare hemolysat The sample is centrifuged for 10 minutes, and the clear haemolysate

er da klart for ytterligere undersøkelse. is then ready for further investigation.

En fosfatbuffer fremstilles så ved å opplbse 16,9 gram enbasisk kaliumfosfat (KfLjPO^) og 21,7 gram tobasisk kaliumfosfat (K2HP04) eller 17,7 gram tobasisk natriumfosfat (Na2HP0^) i karbondioxydfritt, destillert vann, og volumet reguleres til 100 ml. A phosphate buffer is then prepared by dissolving 16.9 grams of monobasic potassium phosphate (KfLjPO^) and 21.7 grams of dibasic potassium phosphate (K2HP04) or 17.7 grams of dibasic sodium phosphate (Na2HP0^) in carbon dioxide-free, distilled water, and the volume is adjusted to 100 ml .

1,8 ml av fosfatbufferen, 20 mg natriumhydrosulfitt og 2 ml av den buffererte hemoglobinopplosning settes til et lite reagensglass. 1.8 ml of the phosphate buffer, 20 mg of sodium hydrosulphite and 2 ml of the buffered hemoglobin solution are added to a small test tube.

Reagensglasset blandes og får henstå i 15 minutter. Det dannes et bunnfall som separeres ved å filtrere oppløsningen gjennom "Whatman"-filterpapir nr. 5 eller et tilsvarende filter-papir. The test tube is mixed and allowed to stand for 15 minutes. A precipitate forms which is separated by filtering the solution through "Whatman" No. 5 filter paper or an equivalent filter paper.

3,8 ml av fosfatbufferen og 20 mg natriumhydrosulfitt utmåles i små skåler. 0,2 ml av hemoglobinfiltratet tilsettes så og blandes ved å snu de små skåler opp ned to ganger. Oppløsningens absorpsjons- eller optiske tetthet måles så i et spektrofotometer ved 415 nm. 20 ml destillert vann fylles så i en 25 ml målesylinder, og 0,1 ml hemoglobinopplosning anbringes i sylinderen. Pipetten renses derpå, og sylinderen blandes ved å snues opp ned. Ca. 4 ml av opp-løsningen overfores til en liten skål. 3.8 ml of the phosphate buffer and 20 mg of sodium hydrosulphite are measured out into small bowls. 0.2 ml of the hemoglobin filtrate is then added and mixed by turning the small bowls upside down twice. The absorption or optical density of the solution is then measured in a spectrophotometer at 415 nm. 20 ml of distilled water is then filled into a 25 ml measuring cylinder, and 0.1 ml of hemoglobin solution is placed in the cylinder. The pipette is then cleaned, and the cylinder is mixed by turning it upside down. About. 4 ml of the solution is transferred to a small dish.

Kontrollopplosningens absorpsjon måles så i overensstemmelse med formelen: The absorbance of the control solution is then measured according to the formula:

Opploseligheten av hemoglobin A og F har vist seg å være The solubility of hemoglobin A and F has been shown to be

90$ eller derover ved denne metode. Opplbseligheten av hemoglobin S er meget lav. 90$ or more by this method. The solubility of hemoglobin S is very low.

Alle de tre ovennevnte, kvalitative metoder, d.v.s. Shermans metode, elektroforese og Goldbergs metode, har vesentlige ulemper. De krever en meget lang tid (Goldbergs metode tar minst 24 timer) og fagutdannede personer både for å utfore metoden og for å gjenkjenne resultatene. All three of the above qualitative methods, i.e. Sherman's method, electrophoresis and Goldberg's method, have significant disadvantages. They require a very long time (Goldberg's method takes at least 24 hours) and trained people both to carry out the method and to recognize the results.

Ingen av disse tre metoder vil således være egnet for under-søkelse av et stort antall blodprbver i lbpet av kort tid med et utrenet personale, -^essuten krever alle de ovennevnte metoder et kostbart utstyr. None of these three methods will thus be suitable for examining a large number of blood samples in a short period of time with untrained staff, and all of the above-mentioned methods require expensive equipment.

Den eneste av de tidligere foreslåtte metoder som i virkelig-heten er blitt benyttet for utsiling er den ovennevnte meta-bisulfittundersokelse. Denne undersbkelse krever også minst 30-35 minutter og dessuten en trenet person for observasjon av resultatene. The only one of the previously proposed methods that has actually been used for screening is the above-mentioned meta-bisulphite examination. This examination also requires at least 30-35 minutes and, moreover, a trained person to observe the results.

Dette innebærer at personen må kunne bruke et mikroskop for This means that the person must be able to use a microscope for

å skille mellom sigdceller og normale celler og andre unormale blodceller som kan ligne på sigdceller. I tilfelle av sigdcellekarakter kan dette av og til være et problem da antallet tilstedeværende sigdceller på objektglasset kan være lavt og iakt-tageren kan risikere ikke å gjenkjenne cellenes avslbrende form og således raportere et negativt resultat. Det vil lett kunne skjbnnes at å overse et positivt resultat, d.v.s. tilstedeværelsen av sigdceller, kan være meget farlig. Av og til lar sigdcelle-karakterer seg ikke observere for det er gått 30 minutter, og blodet må undersbkes på ny efter en vesentlig lengre tid. to differentiate between sickle cells and normal cells and other abnormal blood cells that may resemble sickle cells. In the case of sickle cell type, this can occasionally be a problem as the number of sickle cells present on the slide may be low and the observer may risk not recognizing the cells' relaxing shape and thus reporting a negative result. It will easily turn out that overlooking a positive result, i.e. the presence of sickle cells, can be very dangerous. Occasionally, sickle cell characters cannot be observed because 30 minutes have passed, and the blood must be examined again after a significantly longer time.

Et annet viktig problem som er forbundet med visse av under-søkelsene, er at disse krever enten store blodmengder eller ikke kan benytte rent blod. På steder hvor det ikke finnes noe om-stendelig utstyr for behandling av blod, kan det være umulig å benytte enkelte av de ovennevnte undersøkelser, og det kan være nødvendig å sende blodet, selvsagt i en stor mengde, til et sentralt undersokelseslaboratoriumhvor undersøkelsen vil bli utfort. Another important problem associated with certain of the examinations is that these either require large amounts of blood or cannot use pure blood. In places where there is no extensive equipment for the treatment of blood, it may be impossible to use some of the above examinations, and it may be necessary to send the blood, of course in a large quantity, to a central examination laboratory where the examination will be done.

Ved foreliggende oppfinnelse taes det sikte på å tilveiebringe en tominutters undersøkelse for påvisning av tilstedeværelsen av hemoglobin S. Undersøkelsen krever bare 0,02 ml rent blod og kan derfor utfores med en bloddråpe. Den kan dessuten utfores og be-' dommes'av et utrenet personale. Venbst blod er ikke nodvendig, og det kan ved undersøkelsen benyttes blod fra et nålestikk. The present invention aims to provide a two-minute examination for detecting the presence of hemoglobin S. The examination requires only 0.02 ml of pure blood and can therefore be carried out with a drop of blood. It can also be carried out and judged by untrained staff. Venous blood is not necessary, and blood from a needle stick can be used for the examination.

Oppfinnelsen angår således en fremgangsmåte ved undersøkelse av blod for påvisning av hemoglobin S, ved tilsetning av en målt blodmengde til en opplosning av ionisk fosfatbuffer og et reduksjonsmiddel, og fremgangsmåten er særpreget ved at det til opp-løsningen av buffer og reduksjonsmiddel bestående av natriumhydro-sulf itt tilsettes et erythrocyttisk hemolysemiddel, og den erholdte opplosning blandes, og den efter tilsetning av den måte blodmengde erholdte opplosning iakttas efter en forutbestemt tid for å fastslå om opplbsningen er grumse£, og derved at hemoglobin S er tilstede, eller om den erholdte opplosning er gjennomskinnelig, og derved at hemoglobin S ikke er tilstede. The invention thus relates to a method for examining blood for the detection of hemoglobin S, by adding a measured amount of blood to a solution of ionic phosphate buffer and a reducing agent, and the method is characterized by the fact that to the solution of buffer and reducing agent consisting of sodium hydrogen sulphite is added to an erythrocytic hemolytic agent, and the solution obtained is mixed, and the solution obtained after adding the amount of blood is observed after a predetermined time to determine whether the solution is turbid, and thereby that hemoglobin S is present, or whether the solution obtained is translucent, meaning that hemoglobin S is not present.

Denne undersøkelse benytter seg av det samme fenomen som er blitt bemerket i forbindelse med Goldbergs undersøkelse, dvs. at hemoglobin S har en lav ferrohemoglobinopplbselighet til forskjell fra alle andre hemoglobiner, kanskje bortsett fra hemoglobin H. Hemoglobin H forekommer imidlertid så sjeldent at det vil være nærmest uten betydning. Da undersøkelsen dessuten bare benyttes som en forelbbig undersøkelse, efterfblges den som regel, dersom under-søkelsen viser at hemoglobin S er tilstede, av en av de kvantitative undersøkelser som er nevnt ovenfor, sannsynligvis av elektroforese, for å bestemme blodets nøyaktige sammensetning. Når således ferro-hemoglobinopplbseligheten diskuteres, kan det sies at hemoglobin S This investigation makes use of the same phenomenon that has been noted in connection with Goldberg's investigation, i.e. that hemoglobin S has a low ferrohemoglobin solubility in contrast to all other hemoglobins, perhaps except hemoglobin H. However, hemoglobin H occurs so rarely that it will be almost without significance. As the examination is also only used as a preliminary examination, it is usually followed, if the examination shows that hemoglobin S is present, by one of the quantitative examinations mentioned above, probably by electrophoresis, in order to determine the exact composition of the blood. Thus, when ferro-hemoglobin solubility is discussed, it can be said that hemoglobin S

i redusert tilstand er uoppløselig i en fosfatbuffer i nærvær av natriumhydrosulfitt. Det fremstilles en. fosfatbuffer som ifblge den foretrukne utforelsesform består av 16,9 g énbasisk kaliumfosfat og 21,7 g tobasisk kaliumfosfat som fortynnes med destillert vann inntil et volum av 100 ml. Fosfatbufferen har en hby hydrogenionkon-sentrasjon, og oppløsningens pH er 6,5-6,8. 6 g natriumhydrosulfitt settes til fosfatbufferopplosningen. Natriumhydrosulfittet opp-loses i fosfatbufferopplosningen. ved hvirvel- eller hvirvelstrbm-blanding. in the reduced state is insoluble in a phosphate buffer in the presence of sodium hydrosulphite. A is produced. phosphate buffer which according to the preferred embodiment consists of 16.9 g monobasic potassium phosphate and 21.7 g dibasic potassium phosphate which is diluted with distilled water up to a volume of 100 ml. The phosphate buffer has a high hydrogen ion concentration, and the pH of the solution is 6.5-6.8. 6 g of sodium hydrosulphite are added to the phosphate buffer solution. The sodium hydrosulphite is dissolved in the phosphate buffer solution. by vortex or vortex strbm mixing.

Et hurtig erythrocyttisk hemolysemiddel som er istand til å fremkalle flere beskadigelser av erythrocyttmembranen settes så til den resulterende opplosning. Ifblge den foretrukne utforelsesform settes 10 ml av en 2% saponinopplbsning i isotonisk natriumklorid (NaCl) til den på forhånd dannede opplosning. Den erholdte opplosning ble så blandet og fylt i 10 x 75 mm glass idet 2 ml av opp-løsningen ble fylt i hvert glass. A rapid erythrocyte hemolytic agent capable of causing multiple lesions of the erythrocyte membrane is then added to the resulting solution. According to the preferred embodiment, 10 ml of a 2% saponin solution in isotonic sodium chloride (NaCl) is added to the previously formed solution. The resulting solution was then mixed and filled into 10 x 75 mm glasses, 2 ml of the solution being filled into each glass.

0,02 ml rent blod anbringes så i ett av de 10 x 75 mm glass og blandes ved omhvirvling, sidebevegelse eller ved å snues opp ned flere ganger. Det ventes så i hbyst 2 minutter. Dersom oppløsningen i 10 x 75 mm glasset er opalaktig, rbdfarvet og gjennomskinnelig, er resultatet negativt, og det foreligger intet hemoglobin S i det under-søkte blod. For å lette iakttagelsen av resultatene kan det anbringes et hvitt kort med en sort strek bak reagensglasset. Dersom den sorte strek kan sees efter 2 minutter, er resultatet av forsøket negativt. Dersom den sorte linje ikke kan sees, er resultatet posi-r: 0.02 ml of pure blood is then placed in one of the 10 x 75 mm glasses and mixed by swirling, lateral movement or by turning upside down several times. It is then waited for at least 2 minutes. If the solution in the 10 x 75 mm glass is opal, red-coloured and translucent, the result is negative, and there is no hemoglobin S in the examined blood. To facilitate observation of the results, a white card with a black line can be placed behind the test tube. If the black line can be seen after 2 minutes, the result of the experiment is negative. If the black line cannot be seen, the result is posi-r:

tivt og viser at hemoglobin S er tilstede. Resultatet er tydelig og det hvite kort er som regel ikke nodvendig for å iaktta resultatet av undersøkelsen. Det vil forstås at oppløsningen fremstilt i overensstemmelse med den ovennevnte metode vil kunne fylles i 50 reagensglass, og 50 undersøkelser kan således utfores. Det har vist seg at oppløsningen med det erythrocyttiske hemolysemiddel kan holdes nedkjolt i minst 6 uker og at oppløsningen kan holdes i ennu lengre tid dersom det erythrocyttiske hemolysemiddel og reduksjonsmidlet holdes adskilte. Undersøkelsene kan forandres ytterligere ved ganske enkelt å anbringe en dråpe av bufferen, reduksjonsmiddel og hemolysemiddelopplbsning på en glassplate for så å anbringe mindre enn én dråpe blod fra en applikatorstand i oppløsningen. Dersom glassplaten holdes over en bakgrunn med en strek som går gjennom punkter under det sted hvor undersøkelsen utfores, vil streken efter to minutter enten være synlig, dersom resultatet er negativt, eller ikke kunne iakttas på grunn av oppløsningens og blodblandingens grumsethet dersom hemoglobin S er tilstede. Dette muliggjør en masseunder-søkelse av blod på en meget enkel måte. Det vil dessuten forstås at begge de ovennevnte undersøkelser kan utfores av personer uten noen som helst utdannelse for undersøkelse av blod da de bare behbver å dryppe 0,02 ml rent blod inn i en på forhånd fremstilt opplosning og visuelt bestemme hvorvidt den erholdte opplosning er gjennomskinnelig eller grumset og således fastslå om hemoglobin S er tilstede. Oppfinnelsen vil i det efterfolgende bli nærmere beskrevet under henvisning til tegningene som viser foretrukne utforelsesformer. Fig. 1 viser et snitt sett forfra av et undersbkelsesapparat som anvender prinsippene, ifblge.foreliggende oppfinnelse, for tilsetning av fent blod. Fig. 2 viser apparatet ifblge Fig. 1 efter at rent blod med hemoglobin S er blitt satt til undersbkelsesopplbsningen.og har gitt et positivt resultat. Fig. 3 viser sett ovenifra en glassplate som anvendes for masse-undersøkelse av blod for påvisning av nærvær eller fravær av hemoglobin S. tively and shows that hemoglobin S is present. The result is clear and the white card is usually not necessary to observe the result of the examination. It will be understood that the solution prepared in accordance with the above-mentioned method will be able to be filled in 50 test tubes, and 50 examinations can thus be carried out. It has been shown that the solution with the erythrocyte hemolytic agent can be kept chilled for at least 6 weeks and that the solution can be kept for an even longer time if the erythrocyte hemolytic agent and the reducing agent are kept separate. The assays can be further modified by simply placing a drop of the buffer, reducing agent, and hemolytic agent solution on a glass slide and then placing less than one drop of blood from an applicator stick into the solution. If the glass plate is held over a background with a line passing through points below the place where the examination is carried out, the line will either be visible after two minutes, if the result is negative, or cannot be observed due to the turbidity of the solution and the blood mixture if hemoglobin S is present . This enables a mass examination of blood in a very simple way. It will also be understood that both of the above examinations can be carried out by persons without any training whatsoever in the examination of blood as they only need to drop 0.02 ml of pure blood into a previously prepared solution and visually determine whether the obtained solution is translucent or cloudy and thus determine whether hemoglobin S is present. The invention will be described in more detail below with reference to the drawings which show preferred embodiments. Fig. 1 shows a section seen from the front of a dilution apparatus which uses the principles, according to the present invention, for the addition of clotted blood. Fig. 2 shows the apparatus according to Fig. 1 after pure blood with hemoglobin S has been added to the dilution solution and has given a positive result. Fig. 3 shows a top view of a glass plate used for mass examination of blood to detect the presence or absence of hemoglobin S.

Som tidligere forklart benytter foreliggende oppfinnelse seg av fremstilling av fosfatbufferopplbsning ved å blande 21,7 g tobasisk kaliumfosfat (K^HPO^) med 16,9 g enbasisk kaliumfosfat (KHgPO^) og. fortynne med destillert vann inntil 100 ml. As previously explained, the present invention makes use of the production of phosphate buffer solution by mixing 21.7 g of dibasic potassium phosphate (K^HPO^) with 16.9 g of monobasic potassium phosphate (KHgPO^) and. dilute with distilled water up to 100 ml.

Et reduksjonsmiddel i form av 6 g natriumhydrosulfitt blandes A reducing agent in the form of 6 g of sodium hydrosulphite is mixed

så med kaliumfosfatbufferen og opplbses i bufferen ved omhvirvling eller på en annen egnet måte. so with the potassium phosphate buffer and dissolve in the buffer by swirling or in another suitable way.

Hemolysemidlet settes så til opplbsningen av fosfatbuffer og reduksjonsmiddel. Flere typer hemolysemidler er tilgjengelige. Det foretrekkes imidlertid å anvende som hemolysemiddel en 2% saponinopplbsning i isotonisk natriumklorid. Dette har vist seg å være spesielt virksomt for oppnåelse av en hurtig hemolyse. Saponin 2, 2^ 5 2® ±7^ er e^ uttrykk som anvendes i forbindelse med to grupper av planteglucosider som er istand til å hemolysere rode blodlegemer 1 meget sterk fortynning. Hemolysehastigheten ved anvendelse av The hemolytic agent is then added to the solution of phosphate buffer and reducing agent. Several types of hemolytic agents are available. However, it is preferred to use a 2% saponin solution in isotonic sodium chloride as a hemolytic agent. This has proven to be particularly effective in achieving a rapid hemolysis. Saponin 2, 2^ 5 2® ±7^ is an expression used in connection with two groups of plant glucosides which are capable of haemolysing red blood cells in very strong dilution. The rate of hemolysis when using

disse saponiner avhenger i sterk grad av de planter hvorfra et spesielt saponin er blitt fremstilt, av saponinets renhet og eventuelt også av den spesielle plantes vekststed. Det har vist seg at saponiner som markedsfbres under varemerket "Sapolysin", har en god virkning i forbindelse med foreliggende fremgangsmåte. Andre saponiner vil imidlertid også være virksomme i forbindelse med foreliggende fremgangsmåte, bortsett fra at saponiner med en lavere hemolytisk virkning selvfølgelig vil kreve lenger tid for å opplbse den rode cellemembran og frigjbre hemoglobinet. Ventetiden vil da bli lenger enn de to minutter som er nevnt nedenfor. these saponins depend to a great extent on the plants from which a particular saponin has been produced, on the purity of the saponin and possibly also on the place of growth of the particular plant. It has been shown that saponins which are marketed under the trademark "Sapolysin" have a good effect in connection with the present method. However, other saponins will also be effective in connection with the present method, except that saponins with a lower hemolytic effect will of course require a longer time to dissolve the red cell membrane and release the hemoglobin. The waiting time will then be longer than the two minutes mentioned below.

10 ml av den 2%- ige saponinopplbsning i isotonisk natriumklorid blandes med opplbsningen av fosfatbuffer og reduksjonsmiddel. Den erholdte opplosning helles så i 10 x 75 mm reagensglass i mengder av 2 ml. For å lette oppdagelsen av undersøkelsens sluttpunkt anbringes reagensglasset 10 med undersbkelsesopplbsningen 12, som vist på Fig.l, foran et prbvekort l<*>f. Kortet lk har en gjennom sitt sentrum hori- 10 ml of the 2% saponin solution in isotonic sodium chloride is mixed with the solution of phosphate buffer and reducing agent. The obtained solution is then poured into 10 x 75 mm test tubes in amounts of 2 ml. In order to facilitate the detection of the end point of the examination, the test tube 10 with the examination solution 12, as shown in Fig. 1, is placed in front of a test card 1<*>f. The card lk has a through its center hori-

sontal, tverrgående sort strek 16. Det fremgår at prøvestreken 16 sontal, transverse black line 16. It appears that the test line 16

er synlig gjennom oppløsningen 12 og reagensglasset 10. En Sahli-pipette (0,02 ml) 18 anvendes for å tilfore 0,02 ml rent blod i reagensglasset 10 for der å blandes med opplbsninge-n 12. Blodet fra pipetten 18 og oppløsningen 12 blandes så ved hvirvelstrbmbevegelse, sidehvirvling eller ved å snues opp ned flere ganger. Reagensglasset får så henstå i ca. 2 minutter. is visible through the solution 12 and the test tube 10. A Sahli pipette (0.02 ml) 18 is used to introduce 0.02 ml of pure blood into the test tube 10 to mix with the solution 12. The blood from the pipette 18 and the solution 12 then mixed by eddy current movement, side swirling or by turning upside down several times. The test tube is then allowed to stand for approx. 2 minutes.

Dersom efter 2 minutter opplbsningen 12' omfattende blodet og den opprinnelige undersbkelsesopplbsning 12 er uklar eller grumset, som vist på Fig. 2, på grunn av utfelningen forårsaket av uopplbselig-heten til hemoglobin S i en fosfatbuffer i nærvær av natriumhydro-sulf itt, er resultatet positivt og indikerer at hemoglobin S er tilstede. Oppløsningens grumsethet og uklarhet kan lett sees ved at streken 16 ikke lenger er synlig gjennom den nye opplosning 12' og reagensglasset 10. Dersom streken 16 er synlig, betyr dette at resultatet er negativt og 'at intet hemoglobin er tilstede. Det negative resultat kan også sees ved at den erholdte opplosning 12' If after 2 minutes the solution 12' comprising the blood and the original dilution solution 12 is cloudy or turbid, as shown in Fig. 2, due to the precipitation caused by the insolubility of hemoglobin S in a phosphate buffer in the presence of sodium hydrosulphite, the result is positive and indicates that hemoglobin S is present. The turbidity and cloudiness of the solution can easily be seen by the fact that the line 16 is no longer visible through the new solution 12' and the test tube 10. If the line 16 is visible, this means that the result is negative and that no hemoglobin is present. The negative result can also be seen in that the resolution obtained 12'

er opalaktig, rbdfarvet og gjennomskinnelig. is opalescent, rbd colored and translucent.

En fremgangsmåte for masseundersøkelser av blod for påvisning av hemoglobin S er vist på Fig.3. En dråpe av opplbsningen 12 ifblge A procedure for mass examinations of blood for the detection of hemoglobin S is shown in Fig.3. A drop of the solution 12 according to

Fig. 1 omfattende blandingen av fosfatbuffer, reduksjonsmiddel og hemolysemiddel anbringes med forskjellig avstand 20 på en glass-eller gjennomsiktig plate 22. Glassplaten 22 anbringes mot en bakgrunn 2h med vannrette, langsgående streker 26, 28 og 30. Blodprbver settes så til med en applikatorstav som er blitt dyppet i blod, og rbres inn i opplbsningen på stedene 20. Efter 2 minutter iakttas hvert av stedene 20. Dersom strekene 26, 28 eller 30 i forbindelse med et spesielt sted 20 kan sees gjennom blandingen av opplosning og blod, er forsøksresultatet negativt. Hvis den spesielle strek 25, 28 eller 30 i forbindelse med et sted 20 ikke er synlig gjennom blandingen av blod og opplosning, er resultatet positivt. Fig. 1 comprising the mixture of phosphate buffer, reducing agent and hemolytic agent is placed at different distances 20 on a glass or transparent plate 22. The glass plate 22 is placed against a background 2h with horizontal, longitudinal lines 26, 28 and 30. Blood samples are then added with an applicator stick which has been dipped in blood, and is moved into the solution at the sites 20. After 2 minutes each of the sites 20 is observed. If the lines 26, 28 or 30 in connection with a particular site 20 can be seen through the mixture of solution and blood, the test result is negative. If the particular line 25, 28 or 30 in connection with a site 20 is not visible through the mixture of blood and solution, the result is positive.

Det vil forstås at den ovennevnte bufferopplosning kan dannes ved å opplbse 17,7 g tobasisk natriumfosfat i karbondioxydfritt, destillert vann og at resten av fremgangsmåten da vil være den samme og gi lignende resultater. It will be understood that the above-mentioned buffer solution can be formed by dissolving 17.7 g of dibasic sodium phosphate in carbon dioxide-free, distilled water and that the rest of the procedure will then be the same and give similar results.

Claims

1. Procedure for examining blood for the detection of hemoglobin S, by adding a measured amount of blood to a solution of ionic phosphate buffer and a reducing agent, characterized in that an erythrocytic hemolytic agent is added to the solution of buffer and reducing agent consisting of sodium hydrosulphite, and the obtained solution is mixed, and the solution obtained after the addition of the measured amount of blood is observed after a predetermined time to determine whether the solution is cloudy, and thereby that hemoglobin S is present, or whether the solution obtained is translucent, and thereby that hemoglobin S is not present.

2. Method according to claim 1, characterized in that a saponin solution is used as erythrocytic hemolytic agent.

3. Method according to claim 1 or 2, characterized in that a solution consisting of 100 ml of a mixture of the phosphate buffer and the sodium hydrosulfite and 10 ml of a saponin solution is used, the concentration of which is dependent on its erythrocytic hemolysis ability. k.

Method according to claims 1-3, characterized in that the solution of phosphate buffer, reducing agent and erythrocyte hemolytic agent is placed in a transparent container to which 0.02 ml of pure blood is added.

5. Solution for examining pure blood for the detection of hemoglobin S by the method according to claims 1-^f, comprising an ionic, highly concentrated phosphate buffer solution mixed with a reducing agent, characterized in that the reducing agent is sodium hydrosulphite and that the solution also contains an erythrocyte hemolytic agent.

6. Solution according to claim 5, characterized in that the erythrocytic hemolytic agent is a saponin solution.

7. Solution according to claim 6, characterized in that the saponin solution is a 2% saponin solution.

8. Dissolution according to claims 5-7, characterized by that the erythrocytic hemolytic agent solution constitutes 10 volumes of the volume of the solution of the ionic, highly concentrated phosphate buffer and sodium hydrosulphite.