NO124729B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte for fremstilling av rifamycin SV.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av "rifamycin SV ved fermentering ved hjelp av en hittil ukjent mutant av Streptomyces mediterranei, som har den egenskap at den di-rekte fremstiller det nevnte antibiotikum.

I en tidligere publikasjon (Antibiotics Annual 1959-60, 262) har Sensi et al. beskrevet fremstillingen av antibiotikumet rifamycin som består av en blanding av mange forskjellige stoffer med lignende struktur ved å fermentere en stamme av Streptomyces mediterranei. Rifamycin B har vist seg å' være den mest interessante av disse stoffer,

og det har av denne grunn vært forsøkt å øke utbyttet. Resultatene av noen av disse undersøkelser er beskrevet av Margalith et al. i Appl. Microbiol. 9, 325 (1961), hvor det er beskrevet at tilsetningen av

natriumdietylbarbiturat til fermenteringsvæsken gir bedret utbytte og renhet av rifamycin B. En annen publikasjon (Sensi et al., Il Parmaco, Ed. Sei. 16, l65) angår fremstillingen av rifamycin SV, som viste seg å være en av komponentene i rifamycingruppen, og denne forbindelse viste seg å ha høyere antibakteriell virkning og er dessuten et viktig mellomprodukt for syntese av andre rifamycinderivater. Fremgangsmåten omfåtter generelt at rifamycin B underkastes en serie kjemiske reaksjoner hvorved det først oksyderes til rifamycin 0 som deretter hydrolyseres til rifamycin S, hvoretter denne forbindelse ved hjelp av svake reduk-sjonsmidler omdannes til rifamycin SV. Denne syntese er relativt inn-viklet og omfatter en rekke forskjellige trinn med en rekke praktiske problemer som gjør at man får lavt utbytte av det forønskede antibiotikum. Det er følgelig et absolutt behov for en enklere fremgangsmåte for fremstilling av rifamycin SV.

Dette problem er nå blitt løst ved foreliggende fremgangsmåte. Man har funnet at ved å behandle Streptomyces mediterranei med forskjellige mutasjonsfrembringende midler, det være seg fysiske (U.V. stråler etc.) eller kjemiske (sennepsgass, N-metyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidin, etc.) eller biologiske (f.eks. actinofage»), så har man kunnet oppnå mutanter av nevnte mikroorganisme som er istand til å fremstille rifamycin SV sammen med forskjellige varierende mengder av andre rifa-mycinforbindelser.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av rifamycin SV ved dyrking av en mikroorganisme i et vandig næringsmedium som inneholder en assimilerbar karbonkilde, en assimilerbar nitrogenkilde samt essensielle mineralsalter, under aerobe submerse betingelser inntil det oppnåes en vesentlig antibiotisk aktivitet i mediet, hvoretter rifamycin SV utvinnes fra mediet og eventuelt fra myceliet, kjennetegnet ved at det som mikro-organ. :ie anvendes Streptomyces mediterranei ATCC 21271.

De rifamycin SV-produserende mutanter ligger innenfor det man taksonomisk forstår med Streptomyces mediterranei, og deres kultur-karakteristika er praktisk talt de samme. Det oppstår bare visse for-skjeller med hensyn til dannelsen av luftmycelium og med hensyn til fargen av det løselige pigment når man dyrker mutantene på visse repre-sentative kulturmedia. Den følgende tabell gir en sammenligning mellom karakteristika for Streptomyces mediterranei ATCC 13685 og en av de nye mutanter, som har vist seg å være spesielt effektiv for fremstilling av rifamycin SV med høyt utbytte. Denne mutant som har fått det interna-sjonale kodenummer RS20, er blitt deponert ved ATCC og har fått serie-nummer 21271.

De ovennevnte media hadde følgende sammensetning.

Stivelsesagar - Løselig stivelse 10 gram, KgHPC^ 1 gram, MgS0^.7H20 1 gram, NaCl 1 gram, (NH^SO^ 2 gram, CaCO^ 2 gram, FeS<0>4.7H20, MnCl2.4H20, ZnS<O>!|.7H20 hver 0.001 gram, agar "Difco" 20 g, destillert vann til 1000 ml. Etter sterilisering ved 120°C i 20 minutter var pH 6.7 - 6.8.

Ca- malatglukoseagar - Glukose 20 gram, Ca-malat 10 gram, NHjjCl 0.5 gram, K2HP01| 0.5 gram, agar "Difco" 15 gram, destillert

vann til 1000 ml. Etter sterilisering ved 115°C i 15 minutter var pH 6.5.

Ca- malatglycerolagar - Glycerol 10 gram, Ca-malat 10 gram, NH^Cl 0.5 gram, K2HP0^ 0.5 gram, agar "Difco" 15 gram, destillert vann til 1000 ml. Etter sterilisering ved 115°C i 15 minutter var pH 6.5 - 6.6

Bennett- agar - Glukose 10 gram, gjærekstrakt 1 gram, kjøtt-ekstrakt 1 gram, "N-Z-amin A" 2 gram, agar 15 gram, destillert vann til 1000 ml. Etter sterilisering var pH 6.7 - 6.8.

Fremgangsmåten både med hensyn til fermenteringen og ekstraksjonen er i alt vesentlig den samme som er blitt beskrevet for fremstilling av rifamycin B, og omfatter at man dyrker den nevnte mutant av Streptomyces mediterranei i et næringsmedium inneholdende assimiler-bart karbon og nitrogen samt essensielle mineralsalter inntil man oppnår en vesentlig antibiotisk virkning av nevnte medium, hvoretter rifamycin SV ekstraheres fra dette medium. Mer spesielt dyrkes nevnte mutant i et omrørt og gjennomluftet medium med en temperatur varierende fra 25° til 37°C, mest foretrukket ca. 28°C. Som karbonkilde kan man f.eks. anvende følgende karbohydrater og karbonderivater: glukose, galaktose, laktose, sukrose, maltose, glycerol, mannitol. Anvendbare

nitrogenkilder er f.eks. aminosyrer og blandinger av disse, peptider, prot. i.ner og deres hydrolysater som pepton, gjærekstrakt, soyabønnemel, maisstøpevann, kjøttekstrakt, vandige fraksjoner fra forskjellige typer korn etc. Fermenteringen kan utføres i et tidsrom varierende fra 96 - l80 timer. Start-pH som vanligvis er justert til omkring 6.2 - 6.4, synker under fermenteringen til 5.5 til 6.0. Man oppnår vanligvis de beste resultater etter ca. 180 timers fermentering. Man oppnår på dette tidspunkt et utmerket utbytte av det ønskede antibiotikum.

Etter fermenteringen kan rifamycin SV isoleres ved hjelp av følgende fremgangsmåte. Fermenteringsmediet filtreres ved en pH på 6.4 - 6.6. Filtratet surgjøres raskt, fortrinnsvis til en pH lavere enn 5, for derved å sikre den beste stabilitet for de antibiotiske stoffer. Stoffene ekstraheres med vannublandbare løsningsmidler som kloroform, butanol, etyl-, propyl-, butyl- eller amylacetat. Volum-forholdet medium til det anvendte løsningsmiddel er avhengig av det valgte løsningsmiddel, men vil vanligvis variere fra 2:1 til 10:1.

Myceliet vil enda inneholde en viss mikrobiologisk aktivitet, bemerkelsesverdig høyere enn det man har observert i forbindelse med fermenteringer for fremstilling av rifamycin B. Denne aktivitet kan ekstraheres fra myceliet ved hjelp av vannublandbare løsningsmid-ler, og disse ekstrakter kan slås sammen med de som allerede inneholder rifamycin. Alternativt kan ekstraksjonen av aktiviteten fra myceliet utføres ved hjelp av et løsningsmiddel som er blandbart med vann, f. eks. aceton. I dette tilfelle blir blandingen filtrert, acetonen for-dampet i vakuum, rifamycinet ekstrahert med et vannublandbart løs-ningsmiddel, hvoretter man fortsetter opparbeidelsen slik det er beskrevet ovenfor.

Så snart mesteparten av det antibiotisk virksomme stoff er blitt overført til løsningsmidlet, blir dette avdestillert i vakuum til tørrhet, fortrinnsvis ved en temperatur under 30°C.

Rensingen av rifamycin SV kan utføres kromatografisk på en kolonne fremstilt ved hjelp av et egnet absorbsjonsmiddel som f.eks. silikagel. Rifamycin-forbindelsene oppløses i et egnet organisk løs-ningsmiddel som aceton, overføres til kolonnen og elueres med en hen-siktsmessig blanding av løsningsmidler som f.eks. aceton og benzen. Separasjonen av rifamycin SV fra de andre rifamycinforbindelsene er vanligvis ganske skarp, ettersom førstnevnte forbindelse har bemerkelsesverdig mobilitet og lett kan følges på kolonnen på grunn av den karakteristiske orange-gule fargen. Eluatet som inneholder rifamycin SV, kan så konsentreres i vakuum til tørrhet. Man oppnår ved dette et krystallinsk gult-orange residuum.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1

En mycelsuspensjon av Streptomyces mediterranei ATCC 13685 behandles med N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin og inokkuleres deretter på Bennett-agar. De kolonier som overlever den mutasjonsfrembringende behandling isoleres og prøves på sin evne til å hemme veksten av Pseudomonas reptilivora NRRL-B6 dyrket på Panassay-frøagar ved pH 7.2. Under disse betingelser er rifamycin B mikrobiologisk inaktivt, og rifamycin SV-produSerende stammer kan velges ut.

En av disse stammer som har fått betegnelsen RS20 dyrkes i 6-8 dager på Bennett-agar og inkuberes ved 28°C. Med den kultur som er fremstilt på agaren, inokkuleres to 500 ml Erlenmeyer-kolber under sterile betingelser. Hver kolbe inneholder 100 ml av et vegetativt medium med følgende sammensetning:

pH ble justert til 7.3 med NaOH.

De inokkulerte kolber ble plasert i en rystemaskin ved 28°C i 72 timer. Innholdet av de to Erlenmeyerkolber ble så brukt som et inokulum ved at de ble heilt over i en 10 liters prefermenteringstank som inneholder 4 liter av ovennevnte vegetative medium. Inkuberingen utføres ved 28°C og omrøring med en hastighet på 750 omdreininger per minutt og en gjennomluftning på 1 v/v/m. Etter 30 timers vekst oppnår man et volum på fra 7 - 10 % med pakkede celler. I neste trinn anvender man en 10 liters glassfermenteringstank som inneholder 4 liter av følgende fermenteringsmedium:

pH justeres til 7.8 med NaOH. Steriliseringen utføres i

60 minutter ved 120°C. Etter steriliseringen er pH 6.4. Man anvender en mengde fra perfermenteringstanken som tilsvarer ca. 5 % av fermen-teringstanken som inokulum.

Fermenteringen utføres ved 2 8°C og en omrøring med en hastighet på 750 omdreininger per minutt og en gjennomluftning med en hastighet på 1 v/v/m. Man anvender silikon A som antiskumningsmiddel. Under fermenteringen blir kulturmediet langsomt karakteristisk rød-brunt. Etter 120 timers vekst oppnår man et volum på 20 - 25 % pakkede celler. Mediets pH er på dette tidspunkt 6.0, Den høyeste antibiotiske aktivitet oppnås etter ca. 180 timers fermentering (2000 y/ ml rifamycin SV). På dette tidspunkt blir mediet høstet.

Eksempel 2

En kultur av Streptomyces mediterranei RS 20 'fremstilt som beskrevet i eksempel 1, ble i kolbe fermentert som det er beskrevet i samme eksempel. For prekulturen ble innholdet av kolben heilt over i en 10 liters glassfermenteringstank som inneholdt 4 liter av følgende medium:

pH ble justert til 7.5. Sterilisering ble utført ved 50 minutter ved 120°C. Etter sterilisering var pH 6,4. Etter 38 timers vekst var volumet av de pakkede celler 6 - 8 % av det totale volum. Man anvendte et inokulum som tilsvarte 10 % for en 20 liters glassfermenteringstank, som inneholdt 10 liter av følgende fermenteringsmedium:

pH ble justert til 7.8 med NaOH. Sterilisering skjer i 50 minutter ved 120°C. Etter sterilisering var pH 6.4. Fermenteringen ble utført ved 28°C i 150 timer. Ved høstingen var fermenterings-mediets pH ca. 6.5. Den endelige antibiotiske aktivitet var 1600 y/ ml rifamycin SV.

Produktet ble ekstrahert, «renset ved kromatografiske metoder og så utkrystallisert slik det er beskrevet tidligere. Kromatografel-ingen ble utført ved å bruke silisiumdioksydgel 0.05 - 0.20 mm, rå-produktet av rifamycin ble oppløst i aceton og så eluert med en benzen-acetonblanding på 1:1. Det således rensede produkt hadde kjemiske og fysikalske karakteristika for rifamycin SV. Forbindelsen begynner å dekomponere ved 140°C. [a]p° = -3.9° (c = 1 % i metanol).

I.R. spektret hadde følgende absorbsjonsbånd:

3440, 2920 ("Nujol"), 2850 ("Nujol"), 1700, 1658, I605, 1545, 1464 ("Nujol"), 1415, 1375 ("Nujol"), 1325, 1290, 1260, 1218, 1197, 1164, 1125, 1115, 1102, 1083, 1050, 1020, 976, 962, 950, 930, 915, 898, 871, 845, 830, 801, 785, 772, 760, 750, 717, 703 cm"<1>.

Det synlige og ultrafiolette spektrum som ble opptatt i en fosfatbuffer med pH på 7.3, hadde absorbsjonsmaksima ved 223 mu, 314 my og 445 mu.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av rifamycin SV ved dyrking av en mikroorganisme i et vandig næringsmedium som inneholder en assimilerbar karbonkilde, en assimilerbar nitrogenkilde samt essensielle mineralsalter, under aerobe submerse betingelser inntil det oppnås en vesentlig antibiotisk aktivitet i mediet, hvoretter rifamycin SV utvinnes fra mediet og eventuelt fra myceliet, karakterisert v e d at det som mikroorganisme anvendes Streptomyces mediterranei ATCC 21271.