NO121175B - - Google Patents
Download PDFInfo
- Publication number
- NO121175B NO121175B NO166298A NO16629867A NO121175B NO 121175 B NO121175 B NO 121175B NO 166298 A NO166298 A NO 166298A NO 16629867 A NO16629867 A NO 16629867A NO 121175 B NO121175 B NO 121175B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- value
- solution
- urokinase
- urine
- adsorbate
- Prior art date
Links
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 42
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 claims description 35
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 claims description 35
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 claims description 35
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 16
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 claims description 16
- 239000000057 synthetic resin Substances 0.000 claims description 16
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 15
- 239000002156 adsorbate Substances 0.000 claims description 14
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 10
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 8
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 claims description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 7
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 6
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 6
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000008151 electrolyte solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 3
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TZCXTZWJZNENPQ-UHFFFAOYSA-L barium sulfate Chemical compound [Ba+2].[O-]S([O-])(=O)=O TZCXTZWJZNENPQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 150000004760 silicates Chemical class 0.000 description 3
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 3
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 2
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 2
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N silicic acid Chemical compound O[Si](O)(O)O RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910052910 alkali metal silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000011978 dissolution method Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- -1 sodium aluminum silicates Chemical class 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 201000005060 thrombophlebitis Diseases 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000010457 zeolite Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- E—FIXED CONSTRUCTIONS
- E04—BUILDING
- E04F—FINISHING WORK ON BUILDINGS, e.g. STAIRS, FLOORS
- E04F15/00—Flooring
- E04F15/18—Separately-laid insulating layers; Other additional insulating measures; Floating floors
- E04F15/20—Separately-laid insulating layers; Other additional insulating measures; Floating floors for sound insulation
-
- E—FIXED CONSTRUCTIONS
- E04—BUILDING
- E04B—GENERAL BUILDING CONSTRUCTIONS; WALLS, e.g. PARTITIONS; ROOFS; FLOORS; CEILINGS; INSULATION OR OTHER PROTECTION OF BUILDINGS
- E04B5/00—Floors; Floor construction with regard to insulation; Connections specially adapted therefor
- E04B5/02—Load-carrying floor structures formed substantially of prefabricated units
- E04B5/04—Load-carrying floor structures formed substantially of prefabricated units with beams or slabs of concrete or other stone-like material, e.g. asbestos cement
-
- E—FIXED CONSTRUCTIONS
- E04—BUILDING
- E04F—FINISHING WORK ON BUILDINGS, e.g. STAIRS, FLOORS
- E04F15/00—Flooring
- E04F15/18—Separately-laid insulating layers; Other additional insulating measures; Floating floors
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Architecture (AREA)
- Civil Engineering (AREA)
- Structural Engineering (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Electromagnetism (AREA)
- Floor Finish (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Fremgangsmåte for utvinning av urokinase av menneskeurin. Procedure for the extraction of urokinase from human urine.
Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for utvinning av urokinase i høyt konsentrert form av menneskeurin. Urokinase kjennes også som den plasminogene aktivator i urin eller som den fibrinolytiske aktivator i urin. The present invention relates to a method for extracting urokinase in highly concentrated form from human urine. Urokinase is also known as the plasminogenic activator in urine or as the fibrinolytic activator in urine.
Ved fremstilling av konsentrater av In the production of concentrates of
urokinase ut fra urin, har man tidligere anvendt adsorpsjon på bariumsulfat eller kalsiumfosfat, eluering av adsorbatet med passende pufferoppløsninger og dialyse (se nedenfor nevnte publikasjoner). Ved disse fremgangsmåter er det imidlertid ikke lyk-kes å fremstille konsentrater av slik ren-hetsgrad at de har kunnet brukes til in-jeksjon uten å bevirke sterkt uttalte og uønskede biologiske bivirkninger. urokinase from urine, adsorption on barium sulphate or calcium phosphate, elution of the adsorbate with suitable buffer solutions and dialysis has previously been used (see publications mentioned below). With these methods, however, it has not been possible to produce concentrates of such purity that they could be used for injection without causing strongly pronounced and undesirable biological side effects.
Det har vist seg at de ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fremstilte konsentrater av urokinase kan injiseres intra-venøst i mennesker uten å fremkalle ska-delige reaksjoner, og at det ved slike in-jeksjoner er mulig å oppløse fibrinøse koa-gulasjoner og å motvirke thrombo-phle-bitis. It has been shown that the concentrates of urokinase produced by the method according to the invention can be injected intravenously into humans without causing harmful reactions, and that with such injections it is possible to dissolve fibrinous coagulations and to counteract thrombo- phle-bitis.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen The method according to the invention
kjennetegnes ved at en uren oppløsning av urokinase vunnet ved eluering av et ved berøring mellom menneskeurin og et adsorpsjonsmiddel oppnådd adsorbat bringes i kontakt med partikler av en kationbyttende kunstharpiks som inneholder en betydelig mengde karboksylgrupper og i for-veien er behandlet med en vandig oppløs-ning med en pH-verdi mellom 5 og 7,5 og en kationkonsentrasjon mellom 0,1 og 1 gramekvivalent pr. liter i en slik mengde og gjennom så lang tid at der er oppstått is characterized by the fact that an impure solution of urokinase obtained by elution of an adsorbate obtained by contact between human urine and an adsorbent is brought into contact with particles of a cation-exchange synthetic resin that contains a significant amount of carboxyl groups and is previously treated with an aqueous solution with a pH value between 5 and 7.5 and a cation concentration between 0.1 and 1 gram equivalent per liters in such a quantity and over such a long period of time that there has been
likevekt mellom nevnte oppløsning og kunstharpiksen, hvorpå det derved dannede adsorbat elueres med en vandig elek-trolytoppløsning med en slik pH-verdi at det resulterende eluat får en pH-verdi mellom 5 og 11. equilibrium between said solution and the artificial resin, whereupon the adsorbate thus formed is eluted with an aqueous electrolyte solution with such a pH value that the resulting eluate has a pH value between 5 and 11.
Ved denne adsorpsjon og eluering opp-nåes der en særlig gunstig rensning av urokinasen når den til eluering anvendte elek-trolytoppløsning enten har en pH-verdi eller en kationkonsentrasjon eller både pH-verdi og kationkonsentrasjon, som er større enn pH-verdien henholdsvis kationkonsen-trasjonen av den oppløsning hvormed kunstharpiksen bragtes i likevekt. With this adsorption and elution, a particularly favorable purification of the urokinase is achieved when the electrolyte solution used for elution either has a pH value or a cation concentration or both pH value and cation concentration, which is greater than the pH value or cation concentration tration of the solution with which the synthetic resin was brought to equilibrium.
Ettersom den mengde uren urokinase-oppløsning som bringes i kontakt med kunstharpiksen er forholdsvis liten på grunn av den forutgående adsorpsjon direkte av urinen, bestemmes pH-verdien i den oppløsning som bringes i kontakt med kunstharpiksen av pH-verdien i den opp-løsning med hvilken kunstharpiksen er behandlet før adsorpsjonen. As the amount of impure urokinase solution brought into contact with the synthetic resin is relatively small due to the prior adsorption directly by the urine, the pH value of the solution brought into contact with the synthetic resin is determined by the pH value of the solution with which the synthetic resin is treated before adsorption.
Det er særlig fordelaktig å fremstille den nevnte urene oppløsning av urokinasen ut fra urinen ved å innstille urinens pH på en verdi mellom 3 og 8, fortrinnsvis mellom 6 og 8, bringe urinen i forbindelse med partikler av silikagel eller et kationbyttende silikat og eluere det derved oppnådde adsorbat med en vandig oppløsning med en slik pH-verdi at det resulterende eluat får en pH-verdi mellom 9 og 11,5. Til den nevnte eluering er fortynnede, vandige oppløsninger av ammoniakk velegnede. It is particularly advantageous to prepare the aforementioned impure solution of the urokinase from the urine by setting the pH of the urine to a value between 3 and 8, preferably between 6 and 8, bringing the urine into contact with particles of silica gel or a cation-exchange silicate and thereby eluting it obtained adsorbate with an aqueous solution with such a pH value that the resulting eluate has a pH value between 9 and 11.5. For the mentioned elution, dilute aqueous solutions of ammonia are suitable.
Det her anvendte ord «silikagel» be-tegner de mer eller mindre fint granulerte produkter som fåes ved behandling av oppløsninger av alkalimetallsilikater med syrer og vasking og tørring av den derved dannede kiselsyre. Blant kationbyttende silikater kan nevnes de kunstige zeolitter som anvendes ved bløtgj øring av vann ved kationbytting, f. eks. «permutittene», dvs. vannholdige natriumaluminiumsilikater, som kan fremstilles ved å smelte en blan-ding av siliciumdioksyd, kaolin og natrium-karbonat eller ved våte prosesser. The word "silica gel" used here denotes the more or less finely granulated products obtained by treating solutions of alkali metal silicates with acids and washing and drying the resulting silicic acid. Among cation-exchange silicates, mention can be made of the artificial zeolites used for softening water by cation exchange, e.g. The "permutites", i.e. hydrous sodium aluminum silicates, which can be produced by melting a mixture of silicon dioxide, kaolin and sodium carbonate or by wet processes.
Adsorpsjonen på silikagel, kationbyttende silikater og de tidligere nevnte kunstharpikser og den etterfølgende eluering av det derved vunne adsorbat utføres fortrinnsvis ved at den urokinaseholdige oppløsning og deretter elueringsoppløsnin-gen passerer gjennom en kolonne som be-står av partikler av adsorpsjonsmaterialet og er anbragt i et rør. Ved eluering av en kolonne som er anvendt til adsorpsjon direkte fra urinen, er det ikke nødvendig, omenn å foretrekke å oppsamle eluatet fraksjonert og fjerne de fraksjoner som bare inneholder ubetydelig mengde urokinase. Under eluering av en kunstharpiks-kolonne ved den annen adsorpsjon er det for å få et tilstrekkelig rent produkt nød-vendig å oppsamle eluatet fraksjonert og forene de fraksjoner som inneholder ho-veddelen av urokinasen. The adsorption on silica gel, cation-exchange silicates and the previously mentioned synthetic resins and the subsequent elution of the adsorbate thus obtained is preferably carried out by the urokinase-containing solution and then the elution solution passing through a column consisting of particles of the adsorption material and placed in a tube . When elution of a column used for adsorption directly from the urine, it is not necessary, although it is preferable to collect the eluate fractionally and remove the fractions which only contain a negligible amount of urokinase. During elution of a synthetic resin column by the second adsorption, in order to obtain a sufficiently pure product, it is necessary to collect the eluate in fractions and combine the fractions containing the main part of the urokinase.
Til direkte adsorpsjon av urokinase fra urinen kan det også anvendes andre uopp-løselige salter enn kationbyttende silikater, fortrinnsvis i form av presipitater. Det er f. eks. kjent at bariumsulfat (von Kaula, J.lab.clin.med., vol. 44, pag. 944 (1954)) og kalsiumfosfat (Lundquist et al., Biochem. J., vol. 59, pag. 69 (1955)) kan anvendes for dette formål. Det har ennvidere nu vist seg at oksycellulose også kan anvendes til den direkte adsorpsjon av urokinase fra urin ved pH-verdier mellom 3 og 7, og at vandige oppløsninger med en pH-verdi mellom 8 og 11 er egnet til eluering av det derved vunne adsorbat. Når de nevnte uoppløselige salter eller oksycellulose anvendes som adsorbent, foretrekkes det å blande dem med urinen i en kolbe med omrører i tilstrekkelig lang tid og deretter å adskille urinen fra adsorbatet, f. eks. ved filtrering. For direct adsorption of urokinase from the urine, insoluble salts other than cation-exchange silicates can also be used, preferably in the form of precipitates. It is e.g. known that barium sulfate (von Kaula, J.lab.clin.med., vol. 44, pag. 944 (1954)) and calcium phosphate (Lundquist et al., Biochem. J., vol. 59, pag. 69 (1955) ) can be used for this purpose. It has also now been shown that oxycellulose can also be used for the direct adsorption of urokinase from urine at pH values between 3 and 7, and that aqueous solutions with a pH value between 8 and 11 are suitable for elution of the thus obtained adsorbate . When the aforementioned insoluble salts or oxycellulose are used as adsorbent, it is preferred to mix them with the urine in a flask with a stirrer for a sufficiently long time and then to separate the urine from the adsorbate, e.g. by filtering.
For å lette den annen adsorpsjons- og elueringsprosess er det hensiktsmessig innen denne å konsentrere den ved eluering av det direkte fra urinen vunne adsorbat oppnådde oppløsning til et volum på mindre enn 10 pst., fortrinnsvis mindre enn 5 pst., av nevnte eluats volum ved felling og gj enoppløsning av urokinasen eller ved frysetørring av oppløsningen og gjenopp-løsningen av det tørrede produkt eller ved begge fremgangsmåter. In order to facilitate the second adsorption and elution process, it is appropriate within this to concentrate the solution obtained by elution of the adsorbate obtained directly from the urine to a volume of less than 10 per cent, preferably less than 5 per cent, of the volume of said eluate by precipitation and re-dissolution of the urokinase or by freeze-drying the solution and re-dissolving the dried product or by both methods.
Den nevnte felling kan fortrinnsvis ut-føres ved innstilling av oppløsningens pH på en verdi under 4, fortrinnsvis mellom 1 og 2, og tilsetning av et av de salter som vanligvis anvendes for felling av proteiner, f. eks. natriumklorid eller ammoniumsulfat, til oppløsningen i en slik mengde at urokinasen felles. En stort sett fullstendig felling krever i alminnelighet at oppløsningen blir mere enn 50 pst. mettet med saltet. Fellingen kan også utføres ved tilsetning av et organisk oppløsningsmiddel, som er blandbart med vann, f. eks. etanol, aceton eller dioksan. Ved anvendelse av etanol vil en sluttkonsentrasjon på 80 volumpro-sent etanol i oppløsningen framkalle en i det vesentlige fullstendig felling av urokinasen. Ved gj enoppløsning av det ved syrning og utsaltning vunne presipitat bør oppløsnin-gens pH innstilles på en verdi mellom 6 og 10, fortrinnsvis mellom 7 og 9. The mentioned precipitation can preferably be carried out by setting the pH of the solution to a value below 4, preferably between 1 and 2, and adding one of the salts that are usually used for precipitation of proteins, e.g. sodium chloride or ammonium sulfate, to the solution in such an amount that the urokinase falls. A largely complete precipitation generally requires the solution to be more than 50 percent saturated with the salt. The precipitation can also be carried out by adding an organic solvent, which is miscible with water, e.g. ethanol, acetone or dioxane. When using ethanol, a final concentration of 80 volume percent ethanol in the solution will induce an essentially complete precipitation of the urokinase. When redissolving the precipitate obtained by acidification and salting out, the pH of the solution should be set to a value between 6 and 10, preferably between 7 and 9.
Ved frysetørring av den oppløsning som fåes ved den siste elueringsprosess kan det lett vinnes et produkt som har et urokinase-innhold på over 3000 enheter pr. mg; en-hetene vil bli definert nedenfor. Produkter av mindre renhet kan ikke anbefales til inj eks j onsf ormål. By freeze-drying the solution obtained in the last elution process, a product can easily be obtained that has a urokinase content of over 3,000 units per mg; the units will be defined below. Products of lower purity cannot be recommended for injection purposes.
Det er hensiktsmessig å dialysere opp-løsningene mot vann før denne frysetør-ring og før en eventuell frysetørring mellom de to adsorpsjonsprosesser for hoved-sakelig å fjerne elektrolyter som er kom-met inn i oppløsningene under de forutgående prosesser. It is appropriate to dialyze the solutions against water before this freeze-drying and before any freeze-drying between the two adsorption processes, mainly to remove electrolytes that have entered the solutions during the preceding processes.
Urokinaseinnholdet ble bestemt ved følgende modifikasjon av Fletchers opp-løsningsmetode (Fletcher, Biochem. J., vol. 56, pag. 677 (1954)): I et 9 x 100 mm reagensglass blandes A) 0,5 ml 0,1 molar fosfatpufferoppløsning med pH = 7,2; B) 0,01—0,1 ml av urokinase-oppløsningen; C) 0,1 ml trombinoppløsning inneholdende 100 NIH-enheter pr. ml; og D) 1,0 ml oksefibrinogenoppløsning. Rea-gensglasset anbringes deretter ved 37° C. Etter 1 minutts forløp er oppløsningen ge-lert til et homogent koagulal, og en glass-kule med en diameter på 7 mm anbringes på overflaten av dette koagulal. Nedbryt-ningstiden måles som den tid, i løpet av hvilken kulen uten noen rystelse av rea-gensglasset når dettes bunn. På grunn av vanskeligheter ved å fremskaffe fibrinogen med reproduserbare ly tiske egenskaper kan ingen enhet defineres bare på grunnlag av den tid det tar å nedbryte den størknede masse. Som følge derav valgtes en arbi-trær mellomverdi oppnådd ved å bestemme verdien for en porsjon av det produkt som var vunnet ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, som standardverdi med dets virkningsgrad uttrykt i arbitrære enheter. Sammenlignet med denne standard fantes normal urin å inneholde ca. 5 av disse arbitrære enheter pr. ml. The urokinase content was determined by the following modification of Fletcher's dissolution method (Fletcher, Biochem. J., vol. 56, pag. 677 (1954)): In a 9 x 100 mm test tube, mix A) 0.5 ml of 0.1 molar phosphate buffer solution with pH = 7.2; B) 0.01-0.1 ml of the urokinase solution; C) 0.1 ml thrombin solution containing 100 NIH units per ml; and D) 1.0 ml bovine fibrinogen solution. The test tube is then placed at 37° C. After 1 minute, the solution has gelled into a homogeneous coagulum, and a glass sphere with a diameter of 7 mm is placed on the surface of this coagulum. The degradation time is measured as the time during which the ball reaches the bottom of the test tube without any shaking. Due to difficulties in obtaining fibrinogen with reproducible lytic properties, no unit can be defined solely on the basis of the time it takes to break down the clotted mass. As a result, an arbi-tree intermediate value obtained by determining the value of a portion of the product obtained by the method according to the invention was chosen as the standard value with its efficiency expressed in arbitrary units. Compared to this standard, normal urine was found to contain approx. 5 of these arbitrary units per ml.
For urins vedkommende gir denne me-tode bare tilnærmelsesvise resultater, og det foretrekkes derfor til bestemmelse av urokinaseinnholdet i urin å anvende den fibrinplatemetode som er beskrevet av S. Miillertz i Acta Physiologica Scandinavia, vol. 25, pag. 93 (1952). In the case of urine, this method only gives approximate results, and it is therefore preferred to use the fibrin plate method described by S. Miillertz in Acta Physiologica Scandinavia, vol. 25, pag. 93 (1952).
Utførelseseksempel. Execution example.
Til 300 1 normal mannsurin tilsattes den nødvendige mengde av en 28 pst. opp-løsning av NaOH for å innstille urinens pH-verdi på 7,5. Derved ble det dannet et voluminøst bunnfall som ikke inneholdt noe urokinase. Presipitatet ble skilt fra urinen ved filtrering. 5 15 pst. saltsyre, 5 1 vann og 5 1 10 pst. oppløsning av NaCl ble ført gjennom en iy2 x 65 cm kolonne av silikagel i den angitte rekkefølge. Derpå førtes den filtrerte urin gjennom kolonnen i en hastighet av 500 ml pr. minutt. Derved absorbertes ca. 90 pst. av urokinasen i urinen på silikagelen, hvilket kunne kon-stateres ved å bestemme urokinaseinnholdet i den filtrerte urin og i den urin som forlater kolonnen, ved hjelp av den nevnte fibrinplatemetode. Derpå ble kolonnen vasket med vann og deretter eluert med en 4 pst. vandig oppløsning av ammoniakk med en hastighet av 150 ml pr. minutt. De første, svakt gullige fraksjoner, ca. 2,0 1 inneholdt ingen urokinase og ble kassert. Deretter oppsamledes ca. 2 1 av et brunlig eluat med et innhold på ca. 70 pst. av urinens urokinasemengde; herunder skjedde en hurtig forandring av pH-verdien. Til eluatet ble tilsatt fast natriumklorid i en mengde på 20 pst. av eluatets vekt, og det ble tilsatt saltsyre til oppløsningen inntil pH-verdien var ca. 1,5. Derved ble det dannet et voluminøst presipitat som inneholdt all urokinasen i oppløsningen. Presipitatet ble skilt fra oppløsningen ved filtrering og ble oppløst i vann ved tilsetning av en for-tynnet oppløsning av NaOH, inntil pH-verdien var ca. 8. Uoppløste stoffer (hoved-sakelig kiselsyre) ble fjernet fra oppløsnin-gen ved sentrifugering, og den rødlig-brune ovenstående væske ble dialysert natten over mot destillert vann. Den dialyserte opp-løsning ble frysetørret, hvorved det ble utvunnet 2—3 g tørt produkt med en aktivitet på 400—700 enheter pr. mg. To 300 1 of normal male urine was added the required amount of a 28% solution of NaOH to adjust the urine's pH value to 7.5. Thereby, a voluminous precipitate was formed which contained no urokinase. The precipitate was separated from the urine by filtration. 5 15% hydrochloric acid, 5 1 water and 5 1 10% solution of NaCl were passed through a 1y2 x 65 cm column of silica gel in the order indicated. The filtered urine was then passed through the column at a rate of 500 ml per minute. minute. This absorbed approx. 90 per cent of the urokinase in the urine on the silica gel, which could be ascertained by determining the urokinase content in the filtered urine and in the urine leaving the column, using the aforementioned fibrin plate method. The column was then washed with water and then eluted with a 4% aqueous solution of ammonia at a rate of 150 ml per minute. minute. The first, slightly yellowish fractions, approx. 2.0 1 contained no urokinase and was discarded. Then collect approx. 2 1 of a brownish eluate with a content of approx. 70 percent of the urinary urokinase amount; below which a rapid change in the pH value occurred. Solid sodium chloride was added to the eluate in an amount of 20 per cent of the eluate's weight, and hydrochloric acid was added to the solution until the pH value was approx. 1.5. Thereby, a voluminous precipitate was formed which contained all the urokinase in the solution. The precipitate was separated from the solution by filtration and was dissolved in water by adding a dilute solution of NaOH, until the pH value was approx. 8. Undissolved substances (mainly silicic acid) were removed from the solution by centrifugation, and the reddish-brown supernatant liquid was dialyzed overnight against distilled water. The dialyzed solution was freeze-dried, whereby 2-3 g of dry product was recovered with an activity of 400-700 units per mg.
Som kationbyttende kunstharpiks til annen adsorpsjonsprosess ble anvendt det undre nevnte «Amberlite IRC/50(XE-97)» forhandlede produkt. Denne kunstharpiks ble siktet på en 200-masket sikt for å fjerne de fineste partikler. 1,00 kg av kunstharpiksen ble vasket med 2x5 liter vann, deretter med 5 liter aceton og endelig med 15 liter vann, hvorpå den ble lufttørret på et sugefilter. Derpå ble den behandlet med en 40 pst.s oppløsning av NaOH inntil suspensjonen av kunstharpikspartiklene hadde en pH verdi på ca. 11, hvoretter den ble vasket med 2 x 10 liter vann. Det ble heldt 5 liter 3-n HC1 gjennom kunstharpiksen på et sugefilter i løpet av 4 timer, hvorpå det ble vasket med 5 liter vann. Tilslutt ble kunstharpiksen behandlet med en puffer - oppløsning inneholdende 5,4 g Na2HP04, 2H2O, 8,5 g NaH2P04 og 5,8 g NaCl pr. liter. Denne oppløsning hadde pH = 6,2 og en kationkonsentrasjon på ca. 0,23 gram ekvi-valenter pr. liter. Av den slik forbehand-lede kunstharpiks ble det suspendert en mengde tilstrekkelig til å danne en 2 x 41 cm kolonne i samme pufferoppløsning, og suspensjonen ble fylt i et kromatografglass og hensto, slik at det kunne sette seg ved tyngdekraftens virkning. Væskeoverskudd ble avtappet, og deretter ble ca. 4 g rå uro-kinas, utvunnet ved den ovenfor beskrevne frysetørring og oppløst i 40 ml av den angitte pufferoppløsning, ført gjennom kolonnen. Så ble kolonnen vasket med 100 ml av pufferoppløsningen, hvorved det meste av proteinene og den farvede sub-stans ble fjernet fra kolonnen. Kolonnen ble deretter eluert med en 0,5 molar opp-løsning av natriumklorid, og eluatetet ble oppsamlet i fraksjoner, hvis urokinase-innhold ble bestemt hver for seg. De fraksjoner som inneholdt hovedparten av urokinasen ble forenet, dialysert mot destillert vann og frysetørret. Derved ble utvunnet ca. 150 mg urokinase med en aktivitet på ca. 10.000 enheter på mg. The above-mentioned "Amberlite IRC/50(XE-97)" marketed product was used as cation-exchange synthetic resin for another adsorption process. This synthetic resin was screened on a 200 mesh sieve to remove the finest particles. 1.00 kg of the synthetic resin was washed with 2x5 liters of water, then with 5 liters of acetone and finally with 15 liters of water, after which it was air-dried on a suction filter. It was then treated with a 40% solution of NaOH until the suspension of the artificial resin particles had a pH value of approx. 11, after which it was washed with 2 x 10 liters of water. 5 liters of 3-n HCl were passed through the synthetic resin on a suction filter during 4 hours, after which it was washed with 5 liters of water. Finally, the synthetic resin was treated with a buffer solution containing 5.4 g Na2H2O4, 2H2O, 8.5 g NaH2P04 and 5.8 g NaCl per litres. This solution had pH = 6.2 and a cation concentration of approx. 0.23 gram equivalents per litres. A quantity sufficient to form a 2 x 41 cm column of the thus pretreated synthetic resin was suspended in the same buffer solution, and the suspension was filled into a chromatograph glass and allowed to settle by gravity. Excess liquid was drained, and then approx. 4 g of crude uro-kinase, recovered by the above-described freeze-drying and dissolved in 40 ml of the indicated buffer solution, passed through the column. Then the column was washed with 100 ml of the buffer solution, whereby most of the proteins and the colored substance were removed from the column. The column was then eluted with a 0.5 molar solution of sodium chloride, and the eluate was collected into fractions, the urokinase content of which was determined separately. The fractions containing the majority of the urokinase were combined, dialyzed against distilled water and freeze-dried. Thereby, approx. 150 mg urokinase with an activity of approx. 10,000 units per mg.
Claims (5)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE917/66A SE314790B (en) | 1966-01-25 | 1966-01-25 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO121175B true NO121175B (en) | 1971-01-25 |
Family
ID=20257299
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO166298A NO121175B (en) | 1966-01-25 | 1967-01-06 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US3494087A (en) |
DE (1) | DE1683059A1 (en) |
DK (1) | DK133705B (en) |
FI (1) | FI44160B (en) |
FR (1) | FR1509430A (en) |
NO (1) | NO121175B (en) |
SE (1) | SE314790B (en) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5403414A (en) * | 1991-09-18 | 1995-04-04 | Corston; Charles | Method and apparatus for construction of flooring to prevent squeaks |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US498344A (en) * | 1893-05-30 | Floor | ||
CA730018A (en) * | 1966-03-15 | Hamilton Kent Manufacturing Co. | Vibration pad | |
US926773A (en) * | 1908-04-27 | 1909-07-06 | Peter Weinkauf | Building material. |
US1937186A (en) * | 1933-01-16 | 1933-11-28 | Herbert J R Barrett | Wall construction |
GB472499A (en) * | 1936-03-27 | 1937-09-24 | Alister Gladstone Macdonald | Improvements in or relating to buildings |
GB554818A (en) * | 1942-09-19 | 1943-07-20 | Charles Bernard Mathews | Improvements in and relating to the construction of flooring |
US2425567A (en) * | 1945-12-15 | 1947-08-12 | Cecil S Robinson | Vibration absorption device |
US2746097A (en) * | 1954-07-19 | 1956-05-22 | Jr Arthur M Tofani | Soundproof building construction |
US2962183A (en) * | 1957-11-14 | 1960-11-29 | Gen Motors Corp | Refrigerator cabinet |
US3332646A (en) * | 1965-11-19 | 1967-07-25 | Louise C Kellett | Machine pad |
-
1966
- 1966-01-25 SE SE917/66A patent/SE314790B/xx unknown
-
1967
- 1967-01-06 NO NO166298A patent/NO121175B/no unknown
- 1967-01-10 DE DE19671683059 patent/DE1683059A1/en active Pending
- 1967-01-12 US US608910A patent/US3494087A/en not_active Expired - Lifetime
- 1967-01-24 FI FI0188/67A patent/FI44160B/fi active
- 1967-01-25 FR FR8798A patent/FR1509430A/en not_active Expired
- 1967-01-25 DK DK44367AA patent/DK133705B/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE1683059A1 (en) | 1970-05-14 |
FR1509430A (en) | 1968-01-12 |
FI44160B (en) | 1971-06-01 |
DK133705B (en) | 1976-07-05 |
DK133705C (en) | 1976-11-22 |
US3494087A (en) | 1970-02-10 |
SE314790B (en) | 1969-09-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
SU688124A3 (en) | Method of separating protein | |
US3842061A (en) | Method for isolation of antithrombin from animal tissue materials by adsorption on sulfated carbohydrate gel | |
US2983647A (en) | Urokinase and method of recovering the same | |
US4303650A (en) | Process for production of erythropoietin | |
NO165621B (en) | PROCEDURE FOR CLEANING PROTEINS FROM MILK AND FROM DERIVATIVES OF MILK. | |
JPH11506603A (en) | Novel factor IX purification method | |
JPH04211372A (en) | Improved method for production of thrombin and highly pure thrombin preparation obtained thereby | |
US4314994A (en) | Process for obtaining a plasminogen activator | |
US3943245A (en) | Purification of plasminogen | |
DK167271B1 (en) | PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF AN ANTITHROMBIN III OR ANTITHROMBIN III HAPERINOID CONCENTRATE | |
JPS6327660B2 (en) | ||
US3808124A (en) | Purification of human plasminogen | |
US4106992A (en) | Purification of urokinase | |
JPS60258123A (en) | Method of obtaining factor xiii specimen and use | |
NO121175B (en) | ||
DE3724726A1 (en) | METHOD FOR PURIFYING THE PLACENTARY TISSUE PROTEIN PP4 | |
DK147266B (en) | METHOD OF CLEANING UROKINASE | |
JPS6144824A (en) | Method of reducing content of ldl and vldl from blood plasmaor blood serum | |
US3819605A (en) | Anticoagulant isolation from pit viper using a modified agarose bed and eluting with a benzamidine solution | |
Nagashima et al. | Coagulating effect on calcium carbonate of sulfated glycoproteins isolated from pathological human bile | |
US3723252A (en) | Method for removing pyrogenic substances out of urokinase | |
CH626263A5 (en) | ||
GB2051103A (en) | Heparin fractions | |
US3033758A (en) | Preparation of levans | |
US3926727A (en) | Urokinase preparations |