NO119673B

NO119673B -

Info

Publication number: NO119673B
Application number: NO169193A
Authority: NO
Inventors: J Perry; H Dyer
Original assignee: Mead Corp
Priority date: 1966-08-15
Filing date: 1967-07-27
Publication date: 1970-06-15
Also published as: ES343539A1; SE340781B; BE701915A; FI47858B; GB1186539A; CH461350A; US3415033A; FI47858C; NL6710999A; BR6791963D0; DK122511B; AT293955B; DE1586192B2; FR1551011A; NL155777B; DE1586192A1

Description

Fremgangsmåte ved fremstilling av cephalosporin C. Procedure for the manufacture of cephalosporin C.

Det er allerede blitt vist at når et næringsmedium forgjæres med en stamme av Cephalosporium I.M.I. 49, 137 (American Type Culture Collection No. 11,550), oppnår mediet antibiotisk aktivitet. Isoleringen av to forskjellige antibiotika fra mediet er allerede beskrevet i detalj. Et av disse to antibiotika er hovedsakelig aktivt overfor grampositive bakterier og er kjent som cephalosporin P. Det annet, kjent som cephalosporin N, er et penicillinasefølsomt materiale, som er aktivt overfor såvel gramnegative som grampositive bakte- It has already been shown that when a nutrient medium is fermented with a strain of Cephalosporium I.M.I. 49, 137 (American Type Culture Collection No. 11,550), the medium achieves antibiotic activity. The isolation of two different antibiotics from the medium has already been described in detail. One of these two antibiotics is mainly active against gram-positive bacteria and is known as cephalosporin P. The other, known as cephalosporin N, is a penicillinase-sensitive material, which is active against both gram-negative and gram-positive bacteria.

rier. riar.

I patenthaverens britiske patent nr. 745 208 er det beskrevet en fermenterings-prosess for fremstilling av cephalosporin N In the patent holder's British patent no. 745 208, a fermentation process for the production of cephalosporin N is described

og metoder ved hvilke cephalosporin N kan oppnås i sterkt renset form. and methods by which cephalosporin N can be obtained in highly purified form.

Nærværende oppfinelse er basert på The present invention is based on

den kjensgjerning at rå preparater av cephalosporin N, når holdt ved en pH-verdi slik at cephalosporin N omdannes til cephalosporin N-penillinsyre (penillic acid), f. eks. fra pH 2,5 til 5,5, gir en blanding av cephalosporin N-penillinisyre med et hittil ukjent antibiotisk materiale. Dette tredje antibiotiske materiale, som i det følgende betegnes som cephalosporin C, er i likhet med cephalosporin N aktivt over- the fact that crude preparations of cephalosporin N, when kept at a pH value such that cephalosporin N is converted into cephalosporin N-penillic acid (penillic acid), e.g. from pH 2.5 to 5.5, gives a mixture of cephalosporin N-penillic acid with a previously unknown antibiotic material. This third antibiotic material, hereinafter referred to as cephalosporin C, is, like cephalosporin N, active over

for grampositive og gramnegative bakterier, men er, til forskjell fra cephalosporin N, ufølsomt for penicillinase fremkalt fra B.substilis. Det er oppløselig i vann og nesten uoppløselig i etanol og eter. Det kan identifiseres fra dets ultrafiolette ab-sorpsj onsspektrum som, med antibiotikum i form av en vandig oppløsning av dets natriumsalt med en spesifikk dreining på for gram-positive and gram-negative bacteria, but is, unlike cephalosporin N, insensitive to penicillinase produced from B. substilis. It is soluble in water and almost insoluble in ethanol and ether. It can be identified from its ultraviolet absorption spectrum which, with the antibiotic in the form of an aqueous solution of its sodium salt with a specific rotation of

[a] ^ + 103° viser et ultrafiolett absorp-sj onsmaksimum på 260 millimikron med [a] ^ + 103° shows an ultraviolet absorption maximum of 260 millimicrons with

Gj enstand for nærværende oppfinnelse General purpose for the present invention

er en fremgangsmåte for fraskillelse og eventuelt rensning av cephalosporin C, som oppnås i blanding med cephalosporin N ved fermentering av en cephalosporium-art, is a method for separating and possibly purifying cephalosporin C, which is obtained in a mixture with cephalosporin N by fermentation of a cephalosporium species,

og fremgangsmåten er karakterisert ved at blandingen av antibiotika adskilles ved oppløsningsmiddelfraksjonering eller ved hjelp av et anionutvekslermateriale, hvis ønsket etter omdannelse av cephalosporin N til sin penillinsyre ved sur pH. Cephalosporin C er aktivt overfor såvel gramnega- and the method is characterized in that the mixture of antibiotics is separated by solvent fractionation or by means of an anion exchange material, if desired after conversion of cephalosporin N to its penillic acid at acidic pH. Cephalosporin C is active against both gram-negative

tive som grampositive bakterier og er sta- tive as Gram-positive bacteria and are sta-

bilt ved pH-verdier fra 2,5 til 5. formed at pH values from 2.5 to 5.

Det er allerede foreslått å rense cephalosporin N ved at man fjerner myceliet fra fermenteringsvæsken, behandler væsken med aktivt kull, eluerer adsorbert materiale fra kullet og bringer dette i kontakt med aluminiumoksyd og vasker ut adsorbert antibiotisk materiale fra aluminium-oksydet. Det er funnet at cephalosporin C er tilstede sammen med cephalosporin N i utvaskningsproduktet oppnådd fra alumi-niumoksydet. Utvaskningsproduktet repre-senterer derfor en potensiell kilde for cephalosporin C. Andre kilder for cephalosporin C er selve fermenteringsvæsken eller rå preparater av cephalosporin N oppnådd ved andre trinn ved rensning ved foran-nevnte prosess eller oppnådd på egnede trinn i andre rensningsprosesser. For fag-mannen vil det ikke være noen vanskelig-het å bestemme ved hvilket rensningstrinn, ved en gitt prosess, cephalosporin N og cephalosporin C kan adskilles. Et rått preparat av cephalosporin N kan, f. eks. utsettes for virkningen av et egnet penicil-linasepreparat eller holdes ved en pH på fra 2.5 til 5 og derpå prøves for restaktiviteten overfor egnede bakterier, f. eks. B. coli. It has already been proposed to purify cephalosporin N by removing the mycelium from the fermentation liquid, treating the liquid with activated charcoal, elution of adsorbed material from the charcoal and bringing this into contact with aluminum oxide and washing out adsorbed antibiotic material from the aluminum oxide. It has been found that cephalosporin C is present together with cephalosporin N in the leachate obtained from the aluminum oxide. The leaching product therefore represents a potential source for cephalosporin C. Other sources for cephalosporin C are the fermentation liquid itself or crude preparations of cephalosporin N obtained in second steps during purification by the above-mentioned process or obtained in suitable steps in other purification processes. For the person skilled in the art, there will be no difficulty in determining at which purification stage, in a given process, cephalosporin N and cephalosporin C can be separated. A crude preparation of cephalosporin N can, e.g. exposed to the action of a suitable penicillinase preparation or kept at a pH of from 2.5 to 5 and then tested for residual activity against suitable bacteria, e.g. B. coli.

Cephalosporin C inneholder karbon, hydrogen, oksygen, nitrogen og svovel, men intet halogen eller fosfor. Elementæranaly-se av natriumsaltet henholdsvis den frie syre har gitt følgende resultater: Cephalosporin C contains carbon, hydrogen, oxygen, nitrogen and sulphur, but no halogen or phosphorus. Elemental analysis of the sodium salt or the free acid has yielded the following results:

Natriumsalt: Sodium salt:

Funnet: C, 39,5, 40,0; H, 4,8, 5,2; N, 8,9; S, 6,2; Na, 4,9 pst. Ekvivalent (titrering) 480 ± 15. Mol.vekt bestemt ved krystallo-grafisk røntgenanalyse 470 ± 15. C1(1H20-OgN.jSNa, 2 H00 krever C, 40,5; N, 8,9; S,'6,7; Na, 4,9 pst. Mol.vekt 473. Found: C, 39.5, 40.0; H, 4.8, 5.2; N, 8.9; S, 6.2; Na, 4.9 percent Equivalent (titration) 480 ± 15. Mol. weight determined by X-ray crystallographic analysis 470 ± 15. C1(1H20-OgN.jSNa, 2 H00 requires C, 40.5; N, 8.9 ; S,'6.7; Na, 4.9 percent Mol.weight 473.

Fri syre: Free acid:

Funnet: C, 44,4; H, 5,6; N, 9,8; S, 7,3 <p>st. C„. H2108N3S . H90 krever C, 44,5; H, 5,3; N, 9,7; S, 7,4 pst. Found: C, 44.4; H, 5.6; N, 9.8; S, 7.3 <p>pc. C„. H2108N3S . H90 requires C, 44.5; H, 5.3; N, 9.7; S, 7.4 per cent.

De analytiske tall sannsynliggjør at cephalosporin C kan ha molekylformelen C1(iH2108NnS. Denne formel er imidlertid bare foreløpig og kan senere behøve revi-sjon. The analytical figures make it probable that cephalosporin C may have the molecular formula C1(iH2108NnS. However, this formula is only provisional and may later require revision.

Cephalosporin C gir ninhydrinreak-sjon. Elektrometrisk titrering angir at den er en monoaminodikarboksylsyre, som har to syregrupper med pH-verdier mindre enn 2.6 og 3,1 og en basisk gruppe med en pK-verdi på 9,8. Når utsatt for jonoforese på papir i en kollidin-acetat-puffer ved pH 7, vandrer den mot anoden med nesten samme hastighet som cephalosporin N. Cephalosporin C produces a ninhydrin reaction. Electrometric titration indicates that it is a monoaminodicarboxylic acid, which has two acid groups with pH values less than 2.6 and 3.1 and a basic group with a pK value of 9.8. When subjected to iontophoresis on paper in a collidine-acetate buffer at pH 7, it migrates towards the anode at almost the same rate as cephalosporin N.

Infrarødspektret for cephalosporin C- The infrared spectrum of cephalosporin C-

natriumsalt (i parafinpasta) viser bånd ved følgende bølgelengder: 2,94 jx, 306 jx (NH), 5,77 u (ester eller laktongruppering), 6,05 |j, og 6,57 u (C=0 av mono-substituert amid), 6,29 |x (-COO-), 7,17 u og 7,36 u (isopropylgruppe). Angivelsene i parante-sene er mulige fortolkninger. Cephalosporin C-natriumsalt viser også et bånd ved 5,61 [.i. Et bånd i dette område vises av cephalosporin N og av natriumbenzylpeni-cillin og er blitt henført, hva sistnevnte forbindelse angår, til C=0 i det kondens-erte (3-laktamtiazolidin-ringsystem (Thompson, Brattain. Randall og Rasmus-sen, The Chemistry of Penicillin, kapitel 13, Princeton University Press, 1949). sodium salt (in paraffin paste) shows bands at the following wavelengths: 2.94 jx, 306 jx (NH), 5.77 u (ester or lactone grouping), 6.05 |j, and 6.57 u (C=0 of mono- substituted amide), 6.29 |x (-COO-), 7.17 u and 7.36 u (isopropyl group). The statements in parentheses are possible interpretations. Cephalosporin C sodium salt also shows a band at 5.61 [.i. A band in this region is shown by cephalosporin N and by sodium benzylpenicillin and has been attributed, as far as the latter compound is concerned, to C=0 in the condensed (3-lactamthiazolidine ring system (Thompson, Brattain, Randall and Rasmussen, The Chemistry of Penicillin, Chapter 13, Princeton University Press, 1949).

Til forskjell fra cephalosporin N og benzylpenicillin, er cephalosporin C stabilt i vandig oppløsning ved pH 2,5. Det inaktiveres imidlertid fort ved pH 12. Etter å være holdt ved pH 12 i 2 timer viser til-baketitrering at to sure grupper per mol er blitt dannet. Under lignende betingelser frigjøres bare en sur gruppe per mol fra cephalosporin N og fra benzylpenicillin. Cephalosporin C er mere stabilt i nærvær av visse tunge metalljoner, som Cu<++>, Pb<++> og Zn++, enn cephalosporin N eller benzylpenicillin. Unlike cephalosporin N and benzylpenicillin, cephalosporin C is stable in aqueous solution at pH 2.5. However, it is quickly inactivated at pH 12. After being kept at pH 12 for 2 hours, back-titration shows that two acidic groups per mole have been formed. Under similar conditions, only one acid group per mole is released from cephalosporin N and from benzylpenicillin. Cephalosporin C is more stable in the presence of certain heavy metal ions, such as Cu<++>, Pb<++> and Zn++, than cephalosporin N or benzylpenicillin.

Ved hydrolyse med syre (N-HC1 i 8 timer ved 110°C) gir cephalosporin C, som cephalosporin N, karbondioksyd og en sur aminosyre som oppfører seg som a-amino-adipinisyre på papirkromatogrammer. Produktet som oppnås ved å la cephalosporin C reagere med l:2:4-fluordinitrobenzol gir et produkt ved hydrolyse som. oppfører seg som dinitrofenylderivatet av a-aminoadipinsyre. Det synes derfor at a-aminogrup-pen i a-aminoadipinsyre er fri i cephalosporin C (da denne aminogruppe viser en pK-verdi på 9,8) og at a-karboksylgruppen også er fri. On hydrolysis with acid (N-HCl for 8 hours at 110°C), cephalosporin C, like cephalosporin N, gives carbon dioxide and an acidic amino acid which behaves as α-amino-adipic acid on paper chromatograms. The product obtained by reacting cephalosporin C with l:2:4-fluorodinitrobenzene yields a product on hydrolysis which. behaves like the dinitrophenyl derivative of α-aminoadipic acid. It therefore appears that the α-amino group in α-aminoadipic acid is free in cephalosporin C (as this amino group shows a pK value of 9.8) and that the α-carboxyl group is also free.

Intet bevis er blitt oppnådd for dannel-sen av en vesentlig mengde penicillamin ('(3-tiolvalin) ved hydrolyse av cephalosporin C, men hydrolyse av produktet oppnådd ved hydrering med Raney-nikkel ga amino-syrer som reagerte som a-aminoadipinsyre henholdsvis valin på papirkromatogrammer. No evidence has been obtained for the formation of a significant amount of penicillamine ('(3-thiovaline) by hydrolysis of cephalosporin C, but hydrolysis of the product obtained by hydration with Raney nickel gave amino acids which reacted as α-aminoadipic acid and valine respectively on paper chromatograms.

Cephalosporin C viser en aktivitet av samme størrelsesorden mot flere grampositive og gramnegative bakterier. Den er mindre effektiv enn cephalosporin N overfor staph.aureus og Salm. typhi in vitro, og viser en aktivitet på 8—10 enheter pr. mg (enheten er den det henvises til av Abraham Newton og Hale, 1954, Biochem. J. 58, 94). Den har en aktivitet lignende den for cephalosporin N overfor stammer av Bact. coli. Cephalosporin C shows an activity of the same order of magnitude against several gram-positive and gram-negative bacteria. It is less effective than cephalosporin N against staph.aureus and Salm. typhi in vitro, and shows an activity of 8-10 units per mg (the unit is that referred to by Abraham Newton and Hale, 1954, Biochem. J. 58, 94). It has an activity similar to that of cephalosporin N against strains of Bact. coli.

Dens giftighet er ennu ikke blitt bestemt ved fullstendige biologiske forsøk, men den antas å være lav da mus kan gis i det minste 10 mg av renset materiale in-travenøst uten å vise tegn til å ta skade herav. Its toxicity has not yet been determined by full biological tests, but it is believed to be low as mice can be given at least 10 mg of purified material intravenously without showing signs of harm.

Cephalosporin C kan skilles ut fra en blanding av dette med cephalosporin N i overensstemmelse med nærværende oppfinnelse ved å utsette blandingen for fordeling mellom to oppløsningsmidler, av hvilke hvert av dem er istand til å oppløse både cephalosporin N og cephalosporin C. Ethvert egnet oppløsningsmiddelsystem kan brukes hvor fordelingskoeffisienten er gunstig ved pH-verdier hvor de to antibiotika er stabile. Cephalosporin N er ustabilt ved pH-verdier lavere enn 5, mens cephalosporin C er stabilt selv ved pH-verdi så lav som 2,5. Hvis derfor aktiviteten av cephalosporin N kan settes ut av betrakt-ning, kan adskillelsen utføres ved pH-verdier ved hvilke cephalosporin C alene er stabilt. Et egnet oppløsningsmiddelsystem er derfor fenol-vann-systemet hvis ene fase består av et fenolanriket sjikt, mens den annen fase representeres av et vann-an-riket sjikt. Ved pH 2,5 er konsentrasjons-forholdet i den vann-anrikede fase til konsentrasjon i den fenol-anrikede fase (K) for cephalosporin N ca. 0,35 og for cephalosporin C ca. 0,2. Ved pH 6 er begge antibiotika tilstede nesten utelukkende i den vann-anrikede fase. Det er imidlertid funnet at fordelingskoeffisienten for et fenol-vann-system kan gjøres tilstrekkelig forskjellig for praktiske formål ved pH-verdier hvor begge antibiotika er stabile, dvs. verdier større enn 5 ved å tilsette til det en liten mengde, f. eks. fra 1 til 10 pst., av en organisk tertiær base, f. eks. dimetyl-anilin, pyridin, et lutidin eller et kollidin. Cephalosporin C may be separated from a mixture thereof with cephalosporin N in accordance with the present invention by subjecting the mixture to partitioning between two solvents, each of which is capable of dissolving both cephalosporin N and cephalosporin C. Any suitable solvent system may be used where the distribution coefficient is favorable at pH values where the two antibiotics are stable. Cephalosporin N is unstable at pH values lower than 5, while cephalosporin C is stable even at pH values as low as 2.5. If therefore the activity of cephalosporin N can be taken out of consideration, the separation can be carried out at pH values at which cephalosporin C alone is stable. A suitable solvent system is therefore the phenol-water system, one phase of which consists of a phenol-rich layer, while the other phase is represented by a water-rich layer. At pH 2.5, the concentration ratio in the water-enriched phase to the concentration in the phenol-enriched phase (K) for cephalosporin N is approx. 0.35 and for cephalosporin C approx. 0.2. At pH 6, both antibiotics are present almost exclusively in the water-enriched phase. However, it has been found that the partition coefficient for a phenol-water system can be made sufficiently different for practical purposes at pH values where both antibiotics are stable, i.e. values greater than 5, by adding to it a small amount, e.g. from 1 to 10 percent, of an organic tertiary base, e.g. dimethylaniline, pyridine, a lutidine or a collidine.

Lignende resultater kan oppnås ikke bare med fenol selv, men med enkle alkylsubstituerte fenoler, som kresol og xylenol. Similar results can be obtained not only with phenol itself, but with simple alkyl-substituted phenols, such as cresol and xylenol.

Adskillelsen av de to antibiotika ved oppløsningsmiddelfraksjonering er en langvarig prosess som omfatter et betrak-telig antall trinn. Hvor det imidlertid ikke er påkrevet å beholde cephalosporin N i aktiv form, kan fraskillelsen av cephalosporin C utføres på langt enklere måte ved å omdanne cephalosporin N i blandingen til cephalosporin-N-penillinsyre og behandle den resulterende blanding for å skille ut cephalosporin C fra denne, f. eks. ved opp-løsningsmiddelfraksjonering, ved adsorp-sjon på et anionutvekslermateriale eller ved en kombinasjon av disse metoder. Den mest egnede måte å omdanne cephalosporin N til dens penillinsyre er å holde blandingen ved en pH ved hvilken cephalosporin N er ustabilt. Omdannelsen kan så-ledes utføres enkelt ved å holde blandingen i 2 timer ved pH 3 og ved en temperatur på 37°C. The separation of the two antibiotics by solvent fractionation is a lengthy process comprising a considerable number of steps. However, where it is not required to retain cephalosporin N in active form, the separation of cephalosporin C can be carried out in a much simpler manner by converting cephalosporin N in the mixture to cephalosporin-N-penillic acid and treating the resulting mixture to separate cephalosporin C from this , e.g. by solvent fractionation, by adsorption on an anion exchange material or by a combination of these methods. The most convenient way to convert cephalosporin N to its penillic acid is to maintain the mixture at a pH at which cephalosporin N is unstable. The conversion can thus be carried out simply by keeping the mixture for 2 hours at pH 3 and at a temperature of 37°C.

De følgende fremgangsmåter for å skille cephalosporin C fra cephalosporin-N-penillinsyre er blitt funnet å gi gode resultater. The following procedures for separating cephalosporin C from cephalosporin-N-penillic acid have been found to give good results.

1. En vandig oppløsning av blandingen tilsettes til en kolonne av en anionutvekslerharpiks, som «Amberlite IR4B (XE-59)», og utvaskningen utføres med en fortynnet syre, en egnet pufferoppløsning som vandig ammoniumformiat eller ammonium-acetat med pH mellom 3,2 og 5,0, eller en vandig oppløsning av en tertiær base, som pyridin, delvis nøytralisert med svovelsyre 1. An aqueous solution of the mixture is added to a column of an anion exchange resin, such as "Amberlite IR4B (XE-59)", and the elution is carried out with a dilute acid, a suitable buffer solution such as aqueous ammonium formate or ammonium acetate with a pH between 3.2 and 5.0, or an aqueous solution of a tertiary base, such as pyridine, partially neutralized with sulfuric acid

eller oksalsyre. Et bånd bestående av cephalosporin N penillinsyre utvaskes fra kolonnen før et bånd bestående av cephalosporin C. 2. En vandig oppløsning av blandingen utsettes i en fordelingsmaskin for mot-strøms-fordeling under svakt sure betingelser i et to-fase oppløsningsmiddelsystem av vann og fenol (eller en egnet substituert fenol som kresol eller en xylenol). Hvis ønsket, kan fordelingskoeffisientene i systemet modifiseres ved tilsetning av en egnet mengde av et organisk oppløsningsmid-del, f. eks. karbontetraklorid. pH for systemet bringes til en pH på fra 2 til 5 ved tilsetning av eddiksyre eller ammonium-acetat eller ammoniumformiatpuffer. Behandlingen fortsettes inntil cephalosporin C og cephalosporin N-penillinsyre har dannet adskilte bånd. Betingelsene ordnes fortrinnsvis slik at cephalosporin C trekkes ut av anordningen i den vandige fase. or oxalic acid. A band consisting of cephalosporin N penillic acid is eluted from the column before a band consisting of cephalosporin C. 2. An aqueous solution of the mixture is subjected to a counter-current distribution machine under slightly acidic conditions in a two-phase solvent system of water and phenol ( or a suitable substituted phenol such as cresol or a xylenol). If desired, the distribution coefficients in the system can be modified by adding a suitable amount of an organic solvent, e.g. carbon tetrachloride. The pH of the system is brought to a pH of from 2 to 5 by adding acetic acid or ammonium acetate or ammonium formate buffer. Treatment is continued until cephalosporin C and cephalosporin N-penillic acid have formed separate bands. The conditions are preferably arranged so that cephalosporin C is extracted from the device in the aqueous phase.

Nærværende oppfinnelse foreskriver også en prosess som gjør det mulig å oppnå både cephalosporin N og cephalosporin C i aktiv tilstand, og som er mindre langvarig enn oppløsningsmiddelfraksjoneringspro-sessen, idet prosessen baseres på to erkjen-nelser, dvs.: a) at når en blanding av de to antibiotika vaskes ut fra et anionutvekslingsmate-riale med en pufferoppløsning med pH 4,5 til 5,5, vaskes begge antibiotika ut i aktiv tilstand, og cephalosporin N har tilbøyelighet til å vaskes ut først; b) at når nevnte pufferoppløsning består av en vandig oppløsning av en svak The present invention also prescribes a process which makes it possible to obtain both cephalosporin N and cephalosporin C in an active state, and which is less lengthy than the solvent fractionation process, the process being based on two findings, i.e.: a) that when a mixture of the two antibiotics washed out from an anion exchange material with a buffer solution of pH 4.5 to 5.5, both antibiotics wash out in the active state, and cephalosporin N tends to wash out first; b) that when said buffer solution consists of an aqueous solution of a weak

tertiær base og svovelsyre eller oksal- tertiary base and sulfuric or oxalic acid

syre, kan de to antibiotika lett gjenvinnes fra utvaskningsproduktet under betingelser som. resulterer i det vesentlige i intet aktivitetstap. acid, the two antibiotics can be readily recovered from the leaching product under conditions such as. results in essentially no loss of activity.

Ifølge nærværende oppfinnelse foreskrives der en fremgangsmåte for behandling av en vandig oppløsning inneholdende både cephalosporin C og cephalosporin N som gir en fraksjon i hvilken forholdet av cephalosporin C til cephalosporin N er stør-re enn i nevnte.vandige oppløsning, og en fraksjon i hvilken forholdet cephalosporin C til cephalosporin N er mindre enn i nevnte vandige oppløsning, hvilken fremgangsmåte består i å bringe nevnte vandige opp-løsning i kontakt med et anionutvekslings-materiale ved en pH på minst 4,9, progres-sivt vaske ut anionutveksilingsmaterialet med en, vandig puffer ved samme pH, f. eks. mellom 4,9 og 8,0, fortrinnsvis med en vandig oppløsning av svovelsyre eller oksalsyre inneholdende tilstrekkelig av en tertiær base oppøselige i disse for å gi en pH på fra 4,9 til 5,5, og samle opp separat en del av utvaskningsproduktet i hvilket forholdet cephalosporin C til cephalosporin N er mindre enn i nevnte vandige oppløsning, og en del av utvaskningsproduktet i hvilket forholdet cephalosporin C til cephalosporin N er større enn i nevnte vandige oppløsning. Det vil forstås at ved pH-ver-diene under 4,9 er det øket sannsynlighet for at cephalosporin N blir av-aktivert på grunn av dets ustabilhet overfor syrer, mens, over pH 8, cephalosporin C har til-bøyelighet til å bli av-aktivert, og ved pH 11 er det fullstendig av-aktivert. I det lavere pH-område kan av-aktiveringen av cephalosporin N forsinkes ved å arbeide ved lave temperaturer, slik at det vil være mulig å arbeide under en pH på 4,9 ved å holde temperaturen under ca. 7° eller 8°C, men, det vil da være noe uunngåelig tap av cephalosporin N. According to the present invention, there is prescribed a method for treating an aqueous solution containing both cephalosporin C and cephalosporin N which gives a fraction in which the ratio of cephalosporin C to cephalosporin N is greater than in said aqueous solution, and a fraction in which the ratio cephalosporin C to cephalosporin N is less than in said aqueous solution, which method consists of contacting said aqueous solution with an anion exchange material at a pH of at least 4.9, progressively washing out the anion exchange material with an aqueous buffers at the same pH, e.g. between 4.9 and 8.0, preferably with an aqueous solution of sulfuric acid or oxalic acid containing sufficient of a tertiary base soluble therein to give a pH of from 4.9 to 5.5, and collecting separately a portion of the leaching product in which the ratio of cephalosporin C to cephalosporin N is less than in said aqueous solution, and a part of the leaching product in which the ratio of cephalosporin C to cephalosporin N is greater than in said aqueous solution. It will be understood that at pH values below 4.9 there is an increased likelihood that cephalosporin N will be deactivated due to its instability towards acids, while, above pH 8, cephalosporin C will tend to be deactivated -activated, and at pH 11 it is completely deactivated. In the lower pH range, the deactivation of cephalosporin N can be delayed by working at low temperatures, so that it will be possible to work below a pH of 4.9 by keeping the temperature below approx. 7° or 8°C, however, there will then be some unavoidable loss of cephalosporin N.

Elueringsmidlet brukt ved utvasking av anionutvekslerkolonnen er fortrinnsvis en oppløsning av svovelsyre eller oksalsyre inneholdende tilstrekkelig av en svak tertiær base som er oppløselig i nevnte oppløsning for å gi en pH på fra 4,9 til 5,5. Den nøy-aktige karakter av den tertiære base er uten betydning. Det er klart, da oppløsnin-gen må pufres, må man bruke en base som er tilstrekkelig svak for bruk i det krevede pH-område. En faktor som skal tas i be-traktning når base velges, er at basen skal ha evne til lett å kunne skilles fra antibiotikaene når disse oppnås i en mere renset form i senere trinn av prosessen. The eluent used in washing out the anion exchange column is preferably a solution of sulfuric acid or oxalic acid containing enough of a weak tertiary base which is soluble in said solution to give a pH of from 4.9 to 5.5. The exact nature of the tertiary base is unimportant. Obviously, as the solution must be buffered, a base must be used that is sufficiently weak for use in the required pH range. A factor that must be taken into account when choosing a base is that the base must have the ability to be easily separated from the antibiotics when these are obtained in a more purified form in later stages of the process.

En egnet måte for å fjerne basen er fordampning. Da antibiotika generelt har tendens til å være termolabile, er det for-delaktig å bruke en base som er flyktig ved relativt lave temperaturer og under slikt vakuum som er egnet i kommersiell måle-stokk. I praksis er pyridin egnet i denne henseende. Kollidin og lutidin har imidlertid også vært brukt som baser og blitt fjernet ved ekstraksjon med et organisk opp-løsningsmiddel, som benzol. A suitable way to remove the base is evaporation. As antibiotics generally tend to be thermolabile, it is advantageous to use a base which is volatile at relatively low temperatures and under such a vacuum that is suitable on a commercial scale. In practice, pyridine is suitable in this respect. However, collidine and lutidine have also been used as bases and have been removed by extraction with an organic solvent such as benzene.

De to produkter fremstilt ved den foretrukne prosess, dvs. et eluat inneholdende overveiende cephalosporin N, og et eluat inneholdende overveiende cephalosporin C, inneholder begge oksalsyre eller svovelsyre. Mens nærværet av disse syrer under senere trinn av rensningen ikke nødvendigvis er skadelige, gjør deres natur det relativt lett å fjerne dem. Begge danner uoppløselige salter med jordalkalimetallene, og ifølge et trekk etter oppfinnelsen kan de derfor bunnfelles fra oppløsningene med et jord-alkalimetallsalt, fortrinnsvis bariumhydr-oksyd. The two products produced by the preferred process, i.e. an eluate containing predominantly cephalosporin N, and an eluate containing predominantly cephalosporin C, both contain oxalic or sulfuric acid. While the presence of these acids during later stages of purification is not necessarily harmful, their nature makes their removal relatively easy. Both form insoluble salts with the alkaline earth metals, and according to a feature of the invention they can therefore be precipitated from the solutions with an alkaline earth metal salt, preferably barium hydroxide.

Behandling med overskudd av jordal-kalimetallhydroksyd for å fjerne oksal- eller svovelsyrer resulterer i omdannelsen av antibiotikaene til et j ordalkalimetallsalt av disse. Antibiotikaene foreskrives vanligvis i form av deres natriumsalter, og, de kan omdannes til denne form ved å bunnfelle jordalkalimetallionene ved å tilsette en ekvivalent mengde av et alkalimetallsulfat, eller mere foretrukket ved å bringe væsken i kontakt med en kationutvekslerharpiks eller en naturlig forekommende zeolitt i natriumtilstand. Treatment with an excess of alkaline earth metal hydroxide to remove oxalic or sulfuric acids results in the conversion of the antibiotics to an alkaline earth metal salt thereof. The antibiotics are usually prescribed in the form of their sodium salts and, they can be converted to this form by precipitating the alkaline earth metal ions by adding an equivalent amount of an alkali metal sulfate, or more preferably by contacting the liquid with a cation exchange resin or a naturally occurring zeolite in the sodium state .

Cephalosporin N som eventuelt blir tilbake i den cephalosporin C-rike fraksjon kan naturligvis fjernes ved å omdanne den til dens penillinsyre med sur hydrolyse eller ved hjelp av et penlcillinasepreparat overfor hvilket cephalosporin C er ufølsom, og adskille penillinsyren fra cephalosporin C. Cephalosporin N that eventually remains in the cephalosporin C-rich fraction can of course be removed by converting it to its penillic acid with acid hydrolysis or with the help of a pencillinase preparation to which cephalosporin C is insensitive, and separating the penillic acid from cephalosporin C.

Etter å være skilt fra cephalosporin N eller penillinsyren kan cephalosporin C renses etter enhver av de metoder som kan brukes for rensning av cephalosporin N. Vanligvis er disse metoder enklere å utføre på grunn av cephalosporin Cs stabilitet i sure oppløsninger. After being separated from cephalosporin N or the penillic acid, cephalosporin C can be purified by any of the methods that can be used for the purification of cephalosporin N. Generally, these methods are easier to perform because of cephalosporin C's stability in acidic solutions.

Hvis rensningen omfatter bruk av am-moniumacetat eller ammoniumf ormiat-puffere kan pufferen fjernes fra den resulterende cephalosporin C-oppløsning ved fordampning av sublimering i høyvakuum eller ved elektroforese (under bruk f. eks. av fire-dels-cellen etter Synge, Biochem. J. If the purification involves the use of ammonium acetate or ammonium formate buffers, the buffer can be removed from the resulting cephalosporin C solution by evaporation by sublimation in high vacuum or by electrophoresis (using, for example, the four-part cell according to Synge, Biochem. J.

1951, 49, 642)), eller ved bruk av en egnet joneutvekslerharpiks. 1951, 49, 642)), or by using a suitable ion exchange resin.

Oppløsninger av fri cephalosporin C oppnådd enten ved bruk av en anionutvekslerkolonne eller ved motstrømsfordel-ing kan fordampes til tørrhet i vakuum, og cephalosporin C føres gjennom en annen anionutvekslerkolonne for å rense den ytterligere. Det rensede cephalosporin C kan omdannes til natriumsalt, hvis ønsket, ved oppløsning i vann og regulering av pH til 6,0 med natriumhydroksyd. Solutions of free cephalosporin C obtained either using an anion exchange column or by countercurrent distribution can be evaporated to dryness in vacuo and the cephalosporin C passed through another anion exchange column to further purify it. The purified cephalosporin C can be converted to the sodium salt, if desired, by dissolving in water and adjusting the pH to 6.0 with sodium hydroxide.

Oppløsninger av natriumsaltet av cephalosporin C, oppnådd ved en av disse metoder, kan avfarges, hvis nødvendig, under bruk av aktiv kull og konsentreres i vakuum. Cephalosporin C-natriumsalt danner monokline krystaller inneholdende krystallvann. Det kan omkrystalliseres fra vandig etanol eller vandig propanol. Ved tørk-ing i vakuum ved romtemperatur mister det krystallvann som hurtig opptas igjen ved utsettelse for laboratorieluft. Solutions of the sodium salt of cephalosporin C, obtained by either of these methods, can be decolorized, if necessary, using activated charcoal and concentrated in vacuo. Cephalosporin C sodium salt forms monoclinic crystals containing water of crystal. It can be recrystallized from aqueous ethanol or aqueous propanol. When drying in a vacuum at room temperature, it loses crystal water, which is quickly absorbed again when exposed to laboratory air.

Oppfinnelsen illustreres av de følgende utførelseseksempler i overensstemmelse med foretrukne fremgangsmåter. The invention is illustrated by the following exemplary embodiments in accordance with preferred methods.

Eksempel 1. Example 1.

Oppløsningsmiddelsystem: Vann mettet med fenol (3,5 1), fenol mettet med vann (0,4 1), karbontetraklorid 0,4 1), 2-4-6-trimetylpyridin (71 ml), 10-n H2S04 (10 ml) blandes og tillates å komme til likevekt ved 3°C. Den vandige fases pH var 6,1 (glasselektrode). Solvent system: Water saturated with phenol (3.5 L), phenol saturated with water (0.4 L), carbon tetrachloride 0.4 L), 2-4-6-trimethylpyridine (71 mL), 10-n H2SO4 (10 mL ) are mixed and allowed to equilibrate at 3°C. The pH of the aqueous phase was 6.1 (glass electrode).

Fordeling: 2-4-6-trimetylpyridinsaltet av rått cephalosporin N (4,4 g), tilsvarende 30 enheter/mg, oppløses i 60 ml av toppfasen og 40 ml av bunnfasen av oppløs-ningsmiddelsystemet og fordeles i en mot-strøms-fordelingsmaskin helt av glass ved 3°C på den måte som er beskrevet av Abraham, Newton og Hale (1954, Biochem. J. 58, 94) og i britisk patent nr. 745 208. Ved slutten av eksperimentet er 95 overføringer blitt utført, som ga 77 uttrukne øvre lag (30 ml) og 17 uttrukne lavere lag (0—16), da en ny porsjon av det øvre lag ikke mer tilsettes til røret 'O' etter den 78de over-førsel. Cephalosporin C identifiseres i fraksjonene 6—16 av de uttrukne lavere lag, og fordelingskoeffisienten Distribution: The 2-4-6-trimethylpyridine salt of crude cephalosporin N (4.4 g), corresponding to 30 units/mg, is dissolved in 60 ml of the top phase and 40 ml of the bottom phase of the solvent system and distributed in a counter-current distribution machine entirely of glass at 3°C in the manner described by Abraham, Newton and Hale (1954, Biochem. J. 58, 94) and in British Patent No. 745,208. At the end of the experiment 95 transfers had been made, which gave 77 withdrawn upper layers (30 ml) and 17 withdrawn lower layers (0-16), as a new portion of the upper layer is no longer added to tube 'O' after the 78th transfer. Cephalosporin C is identified in fractions 6-16 of the extracted lower layers, and the distribution coefficient

for cephalosporin C er 0,12, mens den for cephalosporin N er 0,29. Cephalosporin C gjenvinnes som dets bariumsalt etter metoden beskrevet av Abraham: et al. (1954) for cephalosporin C is 0.12, while that for cephalosporin N is 0.29. Cephalosporin C is recovered as its barium salt by the method described by Abraham: et al. (1954)

under tittelen «Determination of dry weight. System 1. (2) Second withdrawn series (phenol phase»). under the title "Determination of dry weight. System 1. (2) Second withdrawn series (phenol phase»).

Eksempel 2. Example 2.

Rå cephalosporin N (6,9 g), oppnådd ved utvaskning fra aluminiumoksyd som beskrevet i britisk patent nr. 745 208 og som oppviser 20 enheter/mg, oppløses i 110 ml vann. En prøve fjernes derpå for å tjene som blindprøve ved etterfølgende spektroskopiske målinger. 10-n saltsyre Crude cephalosporin N (6.9 g), obtained by leaching from aluminum oxide as described in British Patent No. 745,208 and showing 20 units/mg, is dissolved in 110 ml of water. A sample is then removed to serve as a blank for subsequent spectroscopic measurements. 10-n hydrochloric acid

(vanligvis ca. 1 ml) tilsettes inntil reaksjonen av oppløsningen er mellom pH 2,7 og pH 3,0. Oppløsningen oppvarmes derpå til 37°C og med intervaller på en halv time uttas prøver. Prøvene fortynnes med vann for å gi oppløsninger inneholdende (usually about 1 ml) is added until the reaction of the solution is between pH 2.7 and pH 3.0. The solution is then heated to 37°C and samples are taken at intervals of half an hour. The samples are diluted with water to give solutions containing

0,075 mg/ml, og den optiske tetthet ved 0.075 mg/ml, and the optical density at

240 m|i for disse oppløsninger blir målt i 240 m|i for these solutions is measured in

forhold til en oppløsning av blindprøven in relation to a resolution of the blind test

som er blitt fortynnet på samme måte. Reaksjonen antas å være komplett når ingen ytterligere økning i optisk tetthet ved which has been diluted in the same way. The reaction is assumed to be complete when no further increase in optical density occurs

240 m(.i blir notert (120—180 min). Øknin-gen i tetthet ved 240 nai er vanligvis ca. 0,3 tetthetsenheter når en 1 cm celle og en konsentrasjon på 0,075 mg/ml ble anvendt. Når overføringen av cephalosporin N-komponenten til penillinsyre er komplett, blir oppløsningen frysetørret og det fås 7,0 g av blandingen. 240 m(.i is noted (120-180 min). The increase in density at 240 nai is usually about 0.3 density units when a 1 cm cell and a concentration of 0.075 mg/ml were used. When the transfer of cephalosporin The N-component of penillic acid is complete, the solution is freeze-dried and 7.0 g of the mixture is obtained.

En anionutvekslerharpiks («Amberlite XE 59»), pufret med 0,2 M ammoniumformiat ved pH 3,0—3,2, fremstilles som beskrevet av Hirs, Moore og Stein (1952, J. Biol. Chem., 195, 699). En kolonne 59 x 4 cm pakkes med den pufrede harpiks, og derpå perkoleres 500 ml 0,2 M ammoniumformiat inneholdende 0,5 pst. tiodiglykol ned gjennom kolonnen. An anion exchange resin ("Amberlite XE 59"), buffered with 0.2 M ammonium formate at pH 3.0-3.2, is prepared as described by Hirs, Moore and Stein (1952, J. Biol. Chem., 195, 699) . A column 59 x 4 cm is packed with the buffered resin, and then 500 ml of 0.2 M ammonium formate containing 0.5 percent thiodiglycol is percolated down through the column.

3.5 g av blandingen av cephalosporin C og cephalosporin N-penillinsyre oppløses i 30 ml 0,2 M puffer, og reaksjonen av opp-løsningen justeres til 0,2 pH-enheter over den for pufferen i kolonnen. Denne opp-løsning tilføres kolonnen i 3 x 10 ml porsjoner. Strømningshastigheten i kolonnen er regulert slik at hver 10 ml porsjon tar 10—15 minutter for å synke gjennom kolonnen. Oppløsningen blir derpå vasket inn i kolonnen med 2 x 10 ml av 0,2 M puffer inneholdende 0,5 pst. tiodiglykol. Kolonnen fylles derpå med samme pufferopp-løsning og forbindes til et konstant hovedreservoar. Strømningshastigheten for kolonnen reguleres slik at det samles en 20 ml fraksjon hvert 30. minutt. 3.5 g of the mixture of cephalosporin C and cephalosporin N-penillic acid are dissolved in 30 ml of 0.2 M buffer, and the reaction of the solution is adjusted to 0.2 pH units above that of the buffer in the column. This solution is added to the column in 3 x 10 ml portions. The flow rate in the column is regulated so that each 10 ml portion takes 10-15 minutes to sink through the column. The solution is then washed into the column with 2 x 10 ml of 0.2 M buffer containing 0.5% thiodiglycol. The column is then filled with the same buffer solution and connected to a constant main reservoir. The flow rate of the column is regulated so that a 20 ml fraction is collected every 30 minutes.

Prøver uttas fra hver fjerde fraksjon og fortynnes ti ganger med vann. De optiske tettheter for de fortynnede oppløs-ninger måles ved 240 m|.i i forhold til en lignende fortynnet prøve av pufferoppløs-ningen. Cephalosporin C lokaliseres hovedsakelig i fraksjonene 96 til 118. Samples are taken from every fourth fraction and diluted ten times with water. The optical densities of the diluted solutions are measured at 240 µm relative to a similarly diluted sample of the buffer solution. Cephalosporin C is mainly localized in fractions 96 to 118.

Fraksjonene 96 til 118 slås sammen og konsentreres til ca. 60 ml i en roterende vakuumfordamper ved en temperatur under 25°C. Konsentratet inndampes derpå til en tykk sirup i et frysetørringsapparat. Sirupen vaskes to ganger med aceton for å fjerne tiodiglykolen. En blanding av ammoniumformiat og ammoniumsaltet av cephalosporin C blir tilbake. Ammonium-formiatet kan fjernes ved enten (A) høy-vakuumsublimering eller (B) elektroforese. Fractions 96 to 118 are combined and concentrated to approx. 60 ml in a rotary vacuum evaporator at a temperature below 25°C. The concentrate is then evaporated to a thick syrup in a freeze-drying apparatus. The syrup is washed twice with acetone to remove the thiodiglycol. A mixture of ammonium formate and the ammonium salt of cephalosporin C remains. The ammonium formate can be removed by either (A) high-vacuum sublimation or (B) electrophoresis.

(A) Den faste masse som blir tilbake etter vaskingen med aceton oppløses i noen (A) The solid mass that remains after washing with acetone is dissolved in some

få ml vann og overføres til et sublimer-ingsapparat, Sublimeringen utføres som beskrevet av Hirs, Moore og Stein (1952, J. Biol. Chem. 195, 699). Residuet fra sublimeringen er hovedsakelig ammoniumsaltet av cephalosporin C. Saltet oppløses i 2—3 ml vann, og oppløsningen perkoleres gjennom! en liten kolonne (0,5 x 0,5 cm) med aktivt kull for å fjerne pigment. Når perkolatet tillates å fordampe langsomt, krystalliseres produktet. few ml of water and transferred to a sublimation apparatus. The sublimation is carried out as described by Hirs, Moore and Stein (1952, J. Biol. Chem. 195, 699). The residue from the sublimation is mainly the ammonium salt of cephalosporin C. The salt is dissolved in 2-3 ml of water, and the solution is percolated through! a small column (0.5 x 0.5 cm) of activated charcoal to remove pigment. When the leachate is allowed to evaporate slowly, the product crystallizes.

(B) Den faste masse etter vaskingen med aceton oppløses i 25 ml vann og inn-føres i den nøytrale avdeling i en fire-av-delingscelle (Synge, 1951, Biochem. J. 49, 642). Cellen er utstyrt med en kjølespiral gjennom hvilken alkohol av -h5°C pum-pes. Eddiksyre og ammoniakk-avdelingene skiftes hver 3. time. Avsaltningen er vanligvis fullendt i løpet av 12—16 timer når spenninger opp til 500 volt brukes. Oppløs-ningene fra eddiksyreavdelingene kombineres og fryse-tørkes. Produktet som: består av den frie syre av cephalosporin C for-urenset med spor av eddiksyre, befris for eddiksyre ved å oppløse den i en liten mengde vann, gjenutfelle den med et stort overskudd av aceton og omrøre bunnfallet med tørr aceton. Den frie syre av cephalosporin C oppløses derpå i vann og nøytrali-seres med 2-n NaOH (0,3—0,2 ml). Når tillatt å fordampe langsomt, krystalliseres natriumsaltet. Krystallene befris for enhver ikke-krystallinsk gummi ved å vaske med 70 pst. etanol, og derpå omkrystalliseres fra vandig alkohol. Utbyttet av omkrystallisert materiale er 100 mg. Ved 260 m\ i er lem (B) The solid mass after washing with acetone is dissolved in 25 ml of water and introduced into the neutral compartment of a four-compartment cell (Synge, 1951, Biochem. J. 49, 642). The cell is equipped with a cooling coil through which alcohol of -h5°C is pumped. The acetic acid and ammonia compartments are changed every 3 hours. Desalination is usually completed within 12-16 hours when voltages up to 500 volts are used. The solutions from the acetic acid sections are combined and freeze-dried. The product which: consists of the free acid of cephalosporin C pre-contaminated with traces of acetic acid, is freed from acetic acid by dissolving it in a small amount of water, reprecipitating it with a large excess of acetone and stirring the precipitate with dry acetone. The free acid of cephalosporin C is then dissolved in water and neutralized with 2-n NaOH (0.3-0.2 ml). When allowed to evaporate slowly, the sodium salt crystallizes. The crystals are freed of any non-crystalline gum by washing with 70 per cent ethanol, and then recrystallized from aqueous alcohol. The yield of recrystallized material is 100 mg. At 260 m\ i is limb

Eksempel 3. Example 3.

Oppløsningsmiddelsystem: Vann mettet med fenol (5 1), fenol mettet med vann (4,5 1) og iseddik 0,45 1) blandes og står til likevekt ved 20°C. pH av det øvre lag ved likevekt var 2,6 (glasselektrode). Solvent system: Water saturated with phenol (5 1), phenol saturated with water (4.5 1) and glacial acetic acid 0.45 1) are mixed and allowed to equilibrate at 20°C. The pH of the upper layer at equilibrium was 2.6 (glass electrode).

Fordeling: Enj blanding (7,3 g) av cephalosporin N-penillinsyre og cephalosporin C oppnådd som i eksempel 1 opplø-ses i 80 ml av toppfasen og 40 ml av bunnfasen av oppløsningsmiddelsystemet. Bunnfasen (20 ml) og toppfasen (40 ml) av denne oppløsning anbringes i rør '0' og '1' i en motstrømsfordelingsmaskin av glass (Craig og Craig, 1950 Technique & Organic Chemistry, Vol. 3, Chapter 4). 100 overføringer av topplaget (40 ml) utføres under bruk av basisprosessen, fulgt av 300 uttrekninger av det øvre lag (40 ml) fra rør '100'. Distribution: One mixture (7.3 g) of cephalosporin N-penillic acid and cephalosporin C obtained as in example 1 is dissolved in 80 ml of the top phase and 40 ml of the bottom phase of the solvent system. The bottom phase (20 ml) and top phase (40 ml) of this solution are placed in tubes '0' and '1' in a glass countercurrent distributor (Craig and Craig, 1950 Technique & Organic Chemistry, Vol. 3, Chapter 4). 100 transfers of the top layer (40 ml) are performed using the base process, followed by 300 withdrawals of the top layer (40 ml) from tube '100'.

Analyse av fraksjoner: En prøve (0,2 ml) uttas fra hver tiende fraksjon av de uttrukne serier og fargetettheten som ut-vikes ved oppvarmning med ninhydrin (0,5 ml) måles fotometrisk etter metoden av Moore og Stein, 1948, J. Biol. Chem. 176, 367. Når de optiske tettheter oppnådd på denne måte settes opp mot nummeret av fraksjonen, finnes et bånd inneholdende cephalosporin N-penillinsyre i fraksjonene 51 til 120 og et bånd inneholdende cephalosporin C i fraksjonene 190 til 300. Verdien for fordelingskoeffisienten Analysis of fractions: A sample (0.2 ml) is taken from every tenth fraction of the extracted series and the color density developed by heating with ninhydrin (0.5 ml) is measured photometrically according to the method of Moore and Stein, 1948, J. Biol. Chem. 176, 367. When the optical densities obtained in this way are plotted against the number of the fraction, a band containing cephalosporin N-penillic acid is found in fractions 51 to 120 and a band containing cephalosporin C in fractions 190 to 300. The value of the distribution coefficient

av cephalosporin C, beregnet ut fra belig-genheten av toppen av båndet, er 0,2 og den beregnet for cephalosporin N-penillinsyre ero. 63. of cephalosporin C, calculated from the position of the top of the band, is 0.2 and that calculated for cephalosporin N-penillic acid ero. 63.

De uttatte fraksjoner 200—300 forenes og konsentreres til ca. 500 ml (400 ml vandig og 100 ml fenollag) i en roterende vakuumfordamper. Konsentratet anbringes derpå i en skilletrakt og rystes med 400 ml karbontetraklorid. Etter at lagene er skilt, skilles karbontetrakloridfasen fra den vandige fase ekstraheres tre ganger med et likt volum benzol. Det vandige residuum konsentreres til ca. 100 ml i en roterende fordamper og derpå frysetørkes. Spor av eddiksyre fjernes fra produktet ved å opp-løse det i et lite volum vann og bunnfelle cephalosporin C (fri syre) med et overskudd av aceton. Bunnfallet vaskes med tørr aceton. The extracted fractions 200-300 are combined and concentrated to approx. 500 ml (400 ml aqueous and 100 ml phenolic layer) in a rotary vacuum evaporator. The concentrate is then placed in a separatory funnel and shaken with 400 ml of carbon tetrachloride. After the layers are separated, the carbon tetrachloride phase is separated from the aqueous phase and extracted three times with an equal volume of benzene. The aqueous residue is concentrated to approx. 100 ml in a rotary evaporator and then freeze-dried. Traces of acetic acid are removed from the product by dissolving it in a small volume of water and precipitating cephalosporin C (free acid) with an excess of acetone. The precipitate is washed with dry acetone.

Den fri syre1 oppløses i et lite volum vann og nøytraliseres derpå med 2-n NaOH (0,5—0,6 ml). Natriumsaltet av cephalosporin C krystalliseres når den nøytrali-serte oppløsning får anledning til å fordampe langsomt. Krystallene vaskes med 70 pst. etanol som fjernet ikke-krystallinsk materiale. Utbytte 168 mg. Dette materiale omkrystalliseres fra vandig propanol. The free acid 1 is dissolved in a small volume of water and then neutralized with 2-n NaOH (0.5-0.6 ml). The sodium salt of cephalosporin C crystallizes when the neutralized solution is allowed to evaporate slowly. The crystals are washed with 70% ethanol, which removes non-crystalline material. Yield 168 mg. This material is recrystallized from aqueous propanol.

Eksempel 4. Example 4.

Utgangsmaterialet brukt i dette eksempel er et preparat av cephalosporin N (inneholdende noe cephalosporin C), som er oppnådd ved utvasking fra aluminiumoksyd som beskrevet i britisk patent nr. 745 208. Dets aktivitet er 41 enheter pr. mg. En pufferoppløsning lages ved å tilsette N-pyridin (ca. 450 ml) til 150 ml 2-n svovelsyre inntil pH er 5,0 og fortynne den resulterende oppløsning med vann til 1800 ml. The starting material used in this example is a preparation of cephalosporin N (containing some cephalosporin C), which has been obtained by leaching from alumina as described in British Patent No. 745,208. Its activity is 41 units per mg. A buffer solution is made by adding N-pyridine (about 450 ml) to 150 ml of 2-n sulfuric acid until the pH is 5.0 and diluting the resulting solution with water to 1800 ml.

Preparatet av cephalosporin N (280 mg) oppløses i 2 ml av pufferen og tilsettes til toppen av en kolonne av «Amberlite IR.4B» harpiks (150—200 mesh), 0,9 cm i diameter og 120 cm høy, som er blitt bragt til likevekt med pufferen før bruk. Kolonnen er omgitt av en kappe med rennende vann av +5°C. Utvaskingen med pufferen begynner derpå, og strømningshastigheten er 3 ml pr. time. Utvaskingsproduktet ble oppsamlet i 1 ml fraksj oner ved bruk av en automatisk fraksjonssamler. Hver fraksjon nøytraliseres (pH 6) ved å samle det i et rør inneholdende to dråper pyridin. Antibakteriell aktivitet opptrer i eluatet ved fraksjon 48. Mengden av aktivitet øker sterkt til et maksimum ved fraksjon 58 og synker derpå for å nå null ved fraksjon 90. The preparation of cephalosporin N (280 mg) is dissolved in 2 ml of the puffer and added to the top of a column of "Amberlite IR.4B" resin (150-200 mesh), 0.9 cm in diameter and 120 cm high, which has been brought to equilibrium with the puffer before use. The column is surrounded by a jacket with running water of +5°C. The washout with the puffer then begins, and the flow rate is 3 ml per hour. The leachate was collected in 1 ml fractions using an automatic fraction collector. Each fraction is neutralized (pH 6) by collecting it in a tube containing two drops of pyridine. Antibacterial activity appears in the eluate at fraction 48. The amount of activity increases strongly to a maximum at fraction 58 and then decreases to reach zero at fraction 90.

Fraksjonene 52—65, inneholdende hovedsakelig cephalosporin N, forenes og 0,3-n bariumhydroksydoppløsning tilsettes inntil pH stiger til 7,6. Bunnfallet av ba-riumsulfat fjernes ved sentrifugering, og den overstående oppløsning frysetørkes og gir 100 mg hvitt pulver. For å fjerne til-bakeblivende spor av pyridin oppløses dette i vann (1 ml) og bunnfelles ved tilsetning av 20 ml aceton. Det resulterende bariumsalt av cephalosporin N viser 58 enheter pr. mg. Fractions 52-65, containing mainly cephalosporin N, are combined and 0.3-N barium hydroxide solution is added until the pH rises to 7.6. The precipitate of barium sulphate is removed by centrifugation, and the supernatant solution is freeze-dried to give 100 mg of white powder. To remove remaining traces of pyridine, this is dissolved in water (1 ml) and precipitated by adding 20 ml of acetone. The resulting barium salt of cephalosporin N shows 58 units per mg.

Cephalosporin C konsentreres i fraksjoner 70—90. Disse fraksjoner kombineres og befris for puffer på den måte som beskrevet ovenfor for fraksjonene 52—65. Det resulterende bariumsalt oppløses i vann og oppløsningen perkoleres gjennom en kolonne av kationutvekslerharpiks («Dowex 50») i natriumtilstand, 1,2 cm i diameter og 1,5 cm høy. Perkolatet konsentreres i vakuum til en sirup, da natriumsaltet av cephalosporin C begynner å krystallisere. Etter vasking med 70 pst. vandig etanol for å fjerne ikke-krystallinske urenheter veier produktet 5,5 mg og viser 10 enheter pr. mg. Det viser det karakteristiske ultrafiolette absorpsjonsspektrum for cephalosporin C. Cephalosporin C is concentrated in fractions 70-90. These fractions are combined and freed from puffs in the manner described above for fractions 52-65. The resulting barium salt is dissolved in water and the solution is percolated through a column of cation exchange resin ("Dowex 50") in the sodium state, 1.2 cm in diameter and 1.5 cm high. The leachate is concentrated in vacuo to a syrup, as the sodium salt of cephalosporin C begins to crystallize. After washing with 70% aqueous ethanol to remove non-crystalline impurities, the product weighs 5.5 mg and shows 10 units per mg. It shows the characteristic ultraviolet absorption spectrum of cephalosporin C.

Eksempel 5. Example 5.

Utgangsmaterialet brukt i dette eksempel er et preparat av rått cephalosporin N (2,3 enheter pr. mg) oppnådd ved fordampning av utvaskingsproduktet fra aktivt kull beskrevet i britisk patent nr. 745 208. Pufferen fremstilles ved å tilsette N-pyridin til 150 ml 2-n svovelsyre inntil pH er 5,0 og fortynning av den resulterende oppløsning med vann til 3,6 liter. The starting material used in this example is a preparation of crude cephalosporin N (2.3 units per mg) obtained by evaporation of the leaching product from activated carbon described in British patent no. 745 208. The buffer is prepared by adding N-pyridine to 150 ml 2 -n sulfuric acid until the pH is 5.0 and diluting the resulting solution with water to 3.6 liters.

Det rå cephalosporin N (2 g) oppløses i 8 ml puffer og tilsettes til toppen av en kolonne med «Amberlite IR4B» harpiks (79 pst. 40—60 mesh; 21 pst. 60—100 mesh), 1,95 cm i diameter og 41 cm høy, omgitt av en kappe av rennende vann av +7°C. Utvasking med pufferen begynner derpå, og strømningshastigheten er 9 ml pr. time. Utvaskingsproduktet samles opp i 3 ml fraksjoner, og hver fraksjon nøytraliseres (pH 6) ved å la det dryppe inn i et rør inneholdende 6 dråper pyridin. Antibakteriell virkning viser seg i utvaskingsproduktet ved fraksjon 19, stiger skarpt til et maksimum ved fraksjon 21 og derpå synker grad-vis til null ved fraksjon 100. Fraksjonene 20—40, som1 inneholder cephalosporin N, stort sett fritt for C, samles sammen og befris for puffer på den måte som er beskrevet i det foregående eksempel. Cephalosporin C konsentreres i fraksjonene 40 —100. Disse fraksjoner slås sammen og befris for puffer på vanlig måte. Produktet veier 70 mg. Cephalosporin N fremdeles tilstede i dette produkt inaktiveres ved å holde det i vandig oppløsning ved pH 2,5 i 3 timer ved 37°C. Aktiviteten av det til-bak eblivende materiale, som utelukkende skyldes cephalosporin C, er 0,5 enheter pr. The crude cephalosporin N (2 g) is dissolved in 8 ml of buffer and added to the top of a column of "Amberlite IR4B" resin (79% 40-60 mesh; 21% 60-100 mesh), 1.95 cm in diameter and 41 cm high, surrounded by a mantle of running water of +7°C. Washout with the puffer then begins, and the flow rate is 9 ml per hour. The leaching product is collected in 3 ml fractions, and each fraction is neutralized (pH 6) by letting it drip into a tube containing 6 drops of pyridine. Antibacterial action appears in the leaching product at fraction 19, rises sharply to a maximum at fraction 21 and then gradually decreases to zero at fraction 100. Fractions 20-40, which1 contain cephalosporin N, largely free of C, are collected together and liberated for puffs in the manner described in the preceding example. Cephalosporin C is concentrated in fractions 40-100. These fractions are combined and freed from puffs in the usual way. The product weighs 70 mg. Cephalosporin N still present in this product is inactivated by keeping it in aqueous solution at pH 2.5 for 3 hours at 37°C. The activity of the remaining material, which is solely due to cephalosporin C, is 0.5 units per

mg. Materialet oppnådd på denne måte mg. The material obtained in this way

kunne brukes for isolasjon av det krystallinske natriumsalt av cephalosporin C ved den fremgangsmåte som skal beskrives i eksempel 6. could be used for isolation of the crystalline sodium salt of cephalosporin C by the method to be described in example 6.

Eksempel 6. Example 6.

En vandig oppløsning av rått cephalosporin C utvasket fra en anionutvekslerkolonne og fremdeles innieholdende noe cephalosporin N, surgjøres til pH 2,5 og holdes ved 37°C i 2 timer. Inaktiveringen av cephalosporin N er da komplett. Oppløsningen frysetørkes etter at dets pH er justert til 5,0. Produktet (600 mg, 0,45 enheter pr. mg) tilsettes til 3 ml pyridinacetatpuffer, pH 5,0, 2M eddiksyre (150 ml), N-pyridin (250 ml) og vann (600 ml), og noe uopp-løselig materiale fjernes ved sentrifugering. Den resulterende klare oppløsning (pH 5,0) tilsettes varsomt i to porsjoner til toppen av kolonnen (1,9 x 20 cm) «Amberlite IR4B» (200—400 mesh). Harpiksen pufres til pH 5,0 med pyridinacetat ved å vaske acetatformen av harpiksen med pyridinacetatpuffer fremstilt som ovenfor) på et filter inntil den innstrømmende og ut-strømmende puffer har samme pH, nem-lig 5,0. An aqueous solution of crude cephalosporin C washed from an anion exchange column and still containing some cephalosporin N is acidified to pH 2.5 and kept at 37°C for 2 hours. The inactivation of cephalosporin N is then complete. The solution is freeze-dried after its pH is adjusted to 5.0. The product (600 mg, 0.45 units per mg) is added to 3 ml of pyridine acetate buffer, pH 5.0, 2M acetic acid (150 ml), N-pyridine (250 ml) and water (600 ml), and some insoluble material is removed by centrifugation. The resulting clear solution (pH 5.0) is carefully added in two portions to the top of the column (1.9 x 20 cm) "Amberlite IR4B" (200-400 mesh). The resin is buffered to pH 5.0 with pyridine acetate by washing the acetate form of the resin with pyridine acetate buffer prepared as above) on a filter until the inflowing and outflowing buffer have the same pH, namely 5.0.

Etter at oppløsningen av rått cephalosporin C har strømmet inn i kolonnen tilsettes der to porsjoner på 2 ml pyridinacetatpuffer og derpå forbindes toppen av kolonnen; til et konstant hovedreservoar inneholdende pyridinacetatpuffer. Høyden av reservoaret justeres til å gi den ønskede strømningshastighet (9 ml/time). Denne strømningshastighet oppnås når høyden av pufferen i reservoaret bare er noen få cm over bunnplaten i kolonnen. Det utstrøm-mende samles opp i 3 ml fraksjoner hvert 20. minutt. After the solution of crude cephalosporin C has flowed into the column, two portions of 2 ml of pyridine acetate buffer are added there and then the top of the column is connected; to a constant main reservoir containing pyridine acetate buffer. The height of the reservoir is adjusted to give the desired flow rate (9 ml/hour). This flow rate is achieved when the height of the puffer in the reservoir is only a few cm above the bottom plate of the column. The outflow is collected in 3 ml fractions every 20 minutes.

Forskjellige fraksjoner analyseres ved å måle antibakteriell aktivitet overfor S.typhi av prøver som er nøytralisert med natriumhydroksydoppløsning, og også ved en fotometrisk ninhydrinfremgangsmåte (Moore og Stein, 1948, J. Biol. Chem. 176, 367). Different fractions are analyzed by measuring antibacterial activity against S.typhi of samples neutralized with sodium hydroxide solution, and also by a photometric ninhydrin method (Moore and Stein, 1948, J. Biol. Chem. 176, 367).

Cephalosporin C vaskes ut i fraksjonene 72—108. Disse fraksjoner forenes og konsentreres i vakuum (ved 30°C, badtem-peratur) i en roterende fordamper. Residuet oppløses i et lite volum vann og over-føres til en skål og tørkes natten over i vakuum over KOH og PnO-, hvoretter ingen lukt av pyridin eller eddiksyre kunne spo-res. Det oppløses derpå i et lite volum vann (0.3 ml) og 10 ml aceton tilsettes. Bunnfallet sentrifugeres ned. røres om med noen få ml aceton, om-sentrifugeres og tør-kes i vakuum for å gi et hvittfarget pulver av cephalosporin C. fri syre. Den frie syre onrtløses i vann (2 mil hvorved det fås en onnløsning av pH 3 0. 0.1-n NaOH (0.49 ml) tilsettes omhvggelig fra en byrette inntil nH stieer til 6.5. Den resulterende oppløs-ning av natriumsalt av cephalosporin C frysetørkes. Det tørre materiale krystalliseres ved å oppløses i et lite volum vann og langsom fordampning av oppløsningen. Det tørre krystallinske materiale (39 mg) befris for ikke-krystallinske urenheter ved å vaske det med en liten mengde 70 pst. Cephalosporin C is washed out in fractions 72-108. These fractions are combined and concentrated in vacuum (at 30°C, bath temperature) in a rotary evaporator. The residue is dissolved in a small volume of water and transferred to a dish and dried overnight in vacuum over KOH and PnO-, after which no smell of pyridine or acetic acid could be detected. It is then dissolved in a small volume of water (0.3 ml) and 10 ml of acetone is added. The precipitate is centrifuged down. stirred with a few ml of acetone, re-centrifuged and dried in vacuo to give a white colored powder of cephalosporin C. free acid. The free acid is dissolved in water (2 mils, whereby a neutral solution of pH 3 0 is obtained. 0.1-n NaOH (0.49 ml) is added from a burette until the pH rises to 6.5. The resulting solution of the sodium salt of cephalosporin C is freeze-dried. The dry material is crystallized by dissolving in a small volume of water and slowly evaporating the solution.The dry crystalline material (39 mg) is freed from non-crystalline impurities by washing with a small amount of 70 per cent.

(v/v) etanol. (v/v) ethanol.

Eksempel 7. Example 7.

En oppløsning av rå cephalosporin C vasket ut fra en anionutvekslerkolonne og fremdeles inneholdende noe cephalosporin N surgjøres til pH 2,5. Den holdes derpå ved 37°C i 2 timer, i løpet av hvilken tid all cephalosporin N-aktivitet ødelegges. Oppløsningen frysetørkes derpå etter jus-tering av dens pH til 5,0. Produktet (4 g, 0,08 enheter pr. mg) rystes med 8 ml pyridinacetat, pH 5,0 (se eksempel 6). Noen få dråper pyridin tilsettes for å opprettholde oppløsningens pH ved 5,0. Etter ca. 20 minutter sentrifugeres oppløsningen og den klare ovenstående væske dekanteres. Bunnfallet rystes med ytterligere 4 ml puffer, omsentrifugeres og den annen ovenstående væske (12 ml) overføres i 4 x 3 ml porsjoner til en 2x 42 cm kolonne av «Amberlite IR4B» (79 pst. 40—60 mesh og 2 pst. 60— 100 mesh). Harpiksen pufres med pyridinacetatpuffer (pH 5,0) som beskrevet i eksempel 6. Oppløsningen av rå cephalosporin C blir fulgt av 2 x 3 ml porsjoner pyridinacetatpuffer, og derpå får kolonnen arbeide som beskrevet i eksempel 6. A solution of crude cephalosporin C washed out from an anion exchange column and still containing some cephalosporin N is acidified to pH 2.5. It is then held at 37°C for 2 hours, during which time all cephalosporin N activity is destroyed. The solution is then freeze-dried after adjusting its pH to 5.0. The product (4 g, 0.08 units per mg) is shaken with 8 ml of pyridine acetate, pH 5.0 (see example 6). A few drops of pyridine are added to maintain the pH of the solution at 5.0. After approx. After 20 minutes, the solution is centrifuged and the clear supernatant liquid is decanted. The precipitate is shaken with a further 4 ml of buffer, re-centrifuged and the second supernatant (12 ml) is transferred in 4 x 3 ml portions to a 2 x 42 cm column of "Amberlite IR4B" (79% 40-60 mesh and 2% 60- 100 mesh). The resin is buffered with pyridine acetate buffer (pH 5.0) as described in example 6. The solution of crude cephalosporin C is followed by 2 x 3 ml portions of pyridine acetate buffer, and then the column is allowed to work as described in example 6.

Cephalosporin C finnes i utstrøm-ningsvolum 280 ml til 500 roi. Materialet i utstrømningsvolum 387 — 443 ml befris for pyridinacetatpuffer og bunnfelles med aceton somi beskrevet i eksempel 6, og gir 18 mg urent cephalosporin C, fri syre. Den frie syre oppløses i vann (2,0 ml) og 0,1-n NaOH (0.14 ml) tilsettes inntil pH øker til 6.5. Når denne oppløsning fordampes langsomt, skilles noe av materialet ut i krystallinsk tilstand. Blandingen av krystallinsk og ikke-krystallinsk materiale vaskes med 70 pst. (v/v) etanol på et filter, og gir 2 mg krystallinsk natriumsalt av cephalosporin C. Etanolvaskevæskene gir 14 mg materiale som har 2.5 enheter/mg. Den resterende oppløsning fra utstrøm-ningsvolum 280 ml — 500 ml anslås til å inneholde 23 ml materiale med 2,5 enheter/mg. Cephalosporin C is available in outflow volumes of 280 ml to 500 roi. The material in outflow volume 387 — 443 ml is freed from pyridine acetate buffer and precipitated with acetone as described in Example 6, yielding 18 mg of impure cephalosporin C, free acid. The free acid is dissolved in water (2.0 ml) and 0.1-n NaOH (0.14 ml) is added until the pH increases to 6.5. When this solution evaporates slowly, some of the material separates out in a crystalline state. The mixture of crystalline and non-crystalline material is washed with 70 percent (v/v) ethanol on a filter, yielding 2 mg of the crystalline sodium salt of cephalosporin C. The ethanol washings yield 14 mg of material having 2.5 units/mg. The remaining solution from outflow volume 280 ml — 500 ml is estimated to contain 23 ml of material with 2.5 units/mg.

Det vil forstås at de detaljerte eksemp-ler for foretrukne utførelsesformer bare er gitt i den hensikt å beskrive oppfinnelsen osr at forskjellige avvikelser kan gjøres fra disse uten å fjerne seg fra oppfinnelsens område. Det kan nevnes i denne forbin-deise at ethvert av oppløsningsmiddelsy-stemene brukt ved adskillelse av cephalosporin C fra enten cephalosporin N eller cephalosporin N-penillinsyre ved mot-strømsfordeling kan tilpasses til forde-lingskromatografi, og en av fasene kan ab-sorberes på et underlag som kiselgur, eller de kan brukes i en kolonne til kontinuerlig ekstraksjon med strømmende oppløsnings-middel, slik som beskrevet av Scheibel & Karr (Ind. Eng. Chem. 42, p. 1048 (1950)). It will be understood that the detailed examples of preferred embodiments are only given for the purpose of describing the invention and that various deviations can be made from these without departing from the scope of the invention. It may be mentioned in this connection that any of the solvent systems used in the separation of cephalosporin C from either cephalosporin N or cephalosporin N-penillic acid by countercurrent distribution can be adapted to partition chromatography, and one of the phases can be absorbed on a substrate such as diatomaceous earth, or they can be used in a column for continuous extraction with flowing solvent, as described by Scheibel & Karr (Ind. Eng. Chem. 42, p. 1048 (1950)).

Det er blitt nevnt at cephalosporin C er ufølsomt for penicillinase, dvs. at det i det vesentlige ikke påvirkes av denne. Dette er den mest betydelige fordelaktige egenskap hos det nye antibiotikum da det gjør det anvendelig mot de mikroorganismer som danner penicillinase og som derfor er mere eller mindre resistente overfor penicillin. Cephalosporin C kan derfor virke til å beskytte penicillin mot inaktivering av slike mikroorganismer. It has been mentioned that cephalosporin C is insensitive to penicillinase, i.e. that it is essentially unaffected by this. This is the most significant advantageous feature of the new antibiotic as it makes it applicable against those microorganisms which form penicillinase and which are therefore more or less resistant to penicillin. Cephalosporin C can therefore act to protect penicillin against inactivation by such microorganisms.

Prøver har vist at cephalosporin C i det vesentlige ikke påvirkes av ren penicillinase fremkalt av stammer av B.sub-tilis og B.cereus, og den følgende tabell viser mengdene av forskjellige preparater av penicillinase som er nødvendig for å fremkalle 50 pst. inaktivering uttrykt i den nødvendige mengde for cephalosporin C delt ved den nødvendige mengde for en lik mengde cephalosporin N. Tests have shown that cephalosporin C is essentially unaffected by pure penicillinase produced by strains of B. sub-tilis and B. cereus, and the following table shows the amounts of various preparations of penicillinase required to produce 50 per cent inactivation expressed in the amount required for cephalosporin C divided by the amount required for an equal amount of cephalosporin N.

De lavere relative mengder angitt for mindre ren penicillinasepreparater er mu-ligens avhengige av nærværet av urenheter som har en skadelig effekt på cephalosporin C. The lower relative amounts indicated for less pure penicillinase preparations are possibly dependent on the presence of impurities which have a deleterious effect on cephalosporin C.

Effektiviteten av cephalosporin C overfor forskjellige mikroorganismer er angitt i den følgende tabell, hvilken imidlertid ikke må betraktes som å angi helt ut det bakterielle spektrum og er bare illustrer-ende for den antibiotiske aktivitet slik som den er fastlagt opp til idag. The effectiveness of cephalosporin C against different microorganisms is indicated in the following table, which, however, must not be regarded as indicating the entire bacterial spectrum and is only illustrative of the antibiotic activity as it has been determined to date.

Karakteristikkene for cephalosporin C er gjengitt i de vedføyde tegninger, på hvilke fig. 1 er den ultrafiolette absorp-sjonskurven og The characteristics of cephalosporin C are reproduced in the attached drawings, in which fig. 1 is the ultraviolet absorption curve and

fig. 2 er infrarødtspektrum. fig. 2 is infrared spectrum.

Claims

1. Process for recovering a penicillinase-resistant antibiotic, designated cephalosporin C, from a fermentation product obtained by fermentation of a cephalosporium species on a nutrient medium, said species being one that produces a mixture of cephalosporin N and cephalosporin C, characterized in that the mixture of antibiotics is separated by solvent fractionation or by means of an anion exchange material, if desired, after conversion of cephalosporin N to its penillic acid at acidic pH.

2. Method as stated in claim 1, characterized in that the solvent fractionation takes place by distribution between at least two solvent phases, preferably between water and phenol, respectively alkyl-substituted phenols.

3. Method as stated in claims 1 and 2, characterized in that the solvent fractionation is carried out in the presence of small amounts of a tertiary, organic base.

4. Procedure as stated in the condition 1-3, characterized in that solvent fractionation takes place at pH values at which cephalosporin N is at least partially transferred into its penillic acid, particularly between 2.5 and 5.

5. Method as stated in claims 1-3, characterized by fractionation with a pH value above 5.

6. Method as stated in claim 1, characterized in that a synthetic resin is used as anion exchange material, and that this material is optionally set to pH values between 4.9 and 8.

7. Method as stated in claims 1 and 6, characterized in that an aqueous buffer solution with a pH between 2.5 and 8, preferably 4.9 and 8, preferably prepared from a tertiary base, is used as a leaching agent, which is neutralized to the required pH value, in particular a pyridine sulfate solution.

8. Method as stated in claims 1, 6 and 7, characterized in that the anion exchange material is cooled during the treatment.

9. Method as stated in claims 1-8, characterized by treating the obtained solution of cephalosporin C with alkaline earth metal salt solutions to precipitate the acid from the buffer solution, after which the formed alkaline earth metal salt of cephalosporin C is optionally converted to the sodium salt by passing it over a cation exchange material in the sodium state.

10. Method as stated in claims 1-8, characterized in that the cephalosporin N and C-containing mixtures are heated in aqueous solution at pH values between 2.5 and 4.5 before the separation of cephalosporin C.