NO115002B

NO115002B -

Info

Publication number: NO115002B
Application number: NO146638A
Authority: NO
Inventors: J Focht
Original assignee: Precision Valve Corp
Priority date: 1961-11-30
Filing date: 1962-11-29
Publication date: 1968-07-01
Also published as: ES282758A1; GB1018561A; US3179132A; CH398349A

Description

Fremgangsmåte ved krystallisasjon av insulin. Method of crystallization of insulin.

Det kjennes injiserbare insulinpreparater hvis protraherte virkning utelukkede eller i hovedsaken er basert på tilstedeværelsen av insulinkrystaller i vandig suspen-sjon. Det er likeledes kjent at protrahe-ringsgraden av slike vandige insulinkry-stallsuspensjoner til en viss grad er avhen-gig av de suspenderte insulmkrystallers størrelse. Injectable insulin preparations are known whose prolonged effect is excluded or mainly based on the presence of insulin crystals in aqueous suspension. It is also known that the degree of elongation of such aqueous insulin crystal suspensions depends to a certain extent on the size of the suspended insulin crystals.

Ved de hittidige fremgangsmåter for fremstilling av krystallinsk insulin har man intet foretatt seg for regulering av de fremkomne krystallers størrelse. In the current methods for producing crystalline insulin, nothing has been done to regulate the size of the resulting crystals.

Først ved fremkomsten av praktisk kli-nisk anvendelige insulinpreparater på basis av vandige insulinkrystallsuspens joner kommer det problem opp, hvorledes man kan komme til krystaller av i hovedsaken ens størrelse, eller oppnå at hovedparten av krystallene — vektmessig sett — har en størrelse innenfor visse fastlagte grenser. Only with the advent of clinically applicable insulin preparations based on aqueous insulin crystal suspensions did the problem arise, how to get crystals of essentially the same size, or achieve that the majority of the crystals - in terms of weight - have a size within certain established limits .

Den foreliggende oppfinnelse tar sikte The present invention aims

på å tilveiebringe en løsning av det ovenfor nevnte problem, og har til formål å fremstille insulinkrystaller eller en suspen-sjon av insulinkrystaller, som er egnet til bruk som podemateriale for fremstilling av større krystaller, og hvilke krystaller er i hovedsaken av ens størrelse, fortrinnsvis i området 2—7 \ i, og fremtrer som fri krystallegemer. on providing a solution to the above-mentioned problem, and aims to produce insulin crystals or a suspension of insulin crystals, which are suitable for use as seed material for the production of larger crystals, and which crystals are essentially of the same size, preferably in the range 2-7 \ i, and appears as free crystal bodies.

Oppfinnelsen bygger på den iakttagelse The invention is based on that observation

at tilstedeværelsen av frysetørret insulin under krystallisasjonsprosessen har innfly-telse på krystallisasjonens forløp med hensyn til de dannede krystallers størrelse og that the presence of freeze-dried insulin during the crystallization process has an influence on the progress of the crystallization with regard to the size of the formed crystals and

mengden av krystaller av i hovedsaken ens størrelse. the amount of crystals of essentially the same size.

Krystallisasjonen av insulin er almin-nelig kjent og beskrevet mange steder i in-sulinlitteraturen. Selv om de forskjellige krystallisasjonsmetoder kan avvike en del fra hverandre, bygger de dog på samme prinsipp, nemlig å bringe insulinet til å krystallisere fra et vandig medium ved forskyvning av mediets pH-verdi til mellom 5 og 7. The crystallization of insulin is generally known and described in many places in the insulin literature. Although the different crystallization methods may differ somewhat from each other, they are based on the same principle, namely bringing the insulin to crystallize from an aqueous medium by shifting the medium's pH value to between 5 and 7.

Krystallisasjonen krever tilstedeværelsen av et krystallisasjonsfremmende metall (sink, kobolt, nikkel, kadmium, kopper, mangan eller jern, blant hvilke det nesten alltid gjøres bruk av sink), og inneholder insulinet selv ikke et slikt metall i tilstrekkelig mengde, må det vandige krystallisasjonsmedium bibringes det fornødne innhold herav. Den nødvendige mengde kry-stallisasjonsf remmende metall andrar til ca. 0,4 % av insulinets vekt. Ved den praktiske krystallisasjon vil man vanligvis an-vende 2—5 ganger den nødvendige mengde. The crystallization requires the presence of a crystallization-promoting metal (zinc, cobalt, nickel, cadmium, copper, manganese or iron, among which zinc is almost always used), and if the insulin itself does not contain such a metal in sufficient quantity, the aqueous crystallization medium must be added the necessary content thereof. The required amount of crystallization-promoting metal changes to approx. 0.4% of the insulin's weight. In practical crystallization, 2-5 times the required quantity will usually be used.

Krystallisasjons-pH-verdien ligger som nevnt mellom 5 og 7, og vanligvis foretrek-kes en pH-verdi mellom 5,4 og 6,2. Til fikse-ring herav gjøres det i alminnelighet bruk av et pufferstoff eller pufferstoffblandin-ger. Eksempler på pufferstoffet er acetat-, borat-, citrat-, fosfat-, dietylbarbiturat- og maleatpuffer. As mentioned, the crystallization pH value is between 5 and 7, and usually a pH value between 5.4 and 6.2 is preferred. To fix this, a buffer substance or buffer substance mixtures are generally used. Examples of the buffer substance are acetate, borate, citrate, phosphate, diethyl barbiturate and maleate buffers.

Det alminneligste er at man fremstil-ler en sur vandig insulinoppløsning med det fornødne metallinnhold og eventuelt ønskede pufferstoff og innstiller denne opp-løsning på krystallisasjons-pH, men man kan også felle insulinet amorft i et vandig medium uten tilstrekkelig metallinnhold og derpå overføre insulinet til krystallinsk form ved tilførsel av den nødvendige me-tallmengde, f. eks. i form av en vandig opp-løsning av et metallsalt. Endelig kan man også nærme seg krystallisasjons-pH fra den basiske side ved benyttelse av basiske insu-linoppløsninger. The most common is to prepare an acidic aqueous insulin solution with the required metal content and any desired buffer substance and adjust this solution to the crystallization pH, but you can also precipitate the insulin amorphously in an aqueous medium without sufficient metal content and then transfer the insulin to crystalline form when supplying the required amount of metal, e.g. in the form of an aqueous solution of a metal salt. Finally, the crystallization pH can also be approached from the basic side by using basic insulin solutions.

Den foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte av den ovenfor anførte art, og det karakteristiske ved den blir i over-ensstemmelse med den ovenfor anførte iakttagelse at krystallisasjonen foregår ved podning med frysetørret insulin i en mengde som er avpasset etter den ønskede kry-stallstørrelse, idet krystallisasjonen fortrinnsvis foregår i pH-området 6—7. The present invention relates to a method of the above-mentioned type, and the characteristic of it is, in accordance with the above-mentioned observation, that the crystallization takes place by inoculation with freeze-dried insulin in an amount that is adapted to the desired crystal size, since the crystallization preferably takes place in the pH range 6-7.

Ved en utførelsesform for fremgangs-måten settes det frysetørrede insulin til det insulinholdige krystallisasjonsmedium etter dettes innstilling på krystallisasjons-pH, men før krystalldannelsen er begynt. Ved en annen utførelsesform fremstilles det insulinholdige krystallisasjonsmedium ved sammenblanding av en sur vandig insulin-oppløsning og en basisk, eventuelt pufferstoff og krystallisasjonsfremmende metall inneholdende oppløsning for oppnåelse av krystallisasjons-pH, og det frysetørrede insulin settes til den basiske oppløsning innen sammenblandingen. In one embodiment of the method, the freeze-dried insulin is added to the insulin-containing crystallization medium after it has been adjusted to the crystallization pH, but before crystal formation has begun. In another embodiment, the insulin-containing crystallization medium is prepared by mixing an acidic aqueous insulin solution and a basic, possibly buffer substance and crystallization-promoting metal containing solution to achieve the crystallization pH, and the freeze-dried insulin is added to the basic solution within the mixture.

Som utgangsmateriale for det frysetør-rende insulin er det hensiktsmessig å be-nytte krystallinsk insulin eller insulin av en tilsvarende renhet. Frysetørringen kan foretas på i og for seg kjent måte. Man kan f. eks. frysetørre krystallinsk insulin opp-løst i fortynnet syre eller fortynnet base, således at oppløsningen har en pH-verdi på f. eks. henholdsvis 3 og 7,5, eller man kan frysetørre en insulinoppløsning av tilsvarende sammensetning som det krystallisasjonsmedium hvortil det frysetørrede insulin senere settes. Man kan også frysetørre en oppløsning av amorft (metallfritt) insulin. As starting material for the freeze-drying insulin, it is appropriate to use crystalline insulin or insulin of a similar purity. The freeze-drying can be carried out in a manner known per se. One can e.g. freeze-dried crystalline insulin dissolved in dilute acid or dilute base, so that the solution has a pH value of e.g. respectively 3 and 7.5, or you can lyophilize an insulin solution of similar composition to the crystallization medium to which the lyophilized insulin is later added. You can also lyophilize a solution of amorphous (metal-free) insulin.

Vanligvis frysetørres klare oppløsnin-ger, men det er ikke noe i veien for at en del av insulinet kan foreligge utfelt i amorf form innen frysetørringen. Usually, clear solutions are freeze-dried, but there is nothing to prevent a part of the insulin being precipitated in amorphous form during freeze-drying.

Det er ikke nødvendig at krystallisasjonsmediet på forhånd inneholder insulin, idet det ved tilsetningen av frysetørret insulin kan tilveiebringes den ønskede insu-linkonsentrasjon i krystallisasjonsmediet. It is not necessary for the crystallization medium to contain insulin in advance, as the desired insulin concentration in the crystallization medium can be provided by the addition of freeze-dried insulin.

I det følgende kan det under henvis-ning til forskjellige utførelseseksempler gjøres nærmere rede for hvordan det fryse-tørrede insulin kan fremstilles og hvorledes krystallisasjonsprosessen kan utføres under benyttelse av en tilsetning av det frysetør-rede insulin, idet det bemerkes at det som utgangsmateriale benyttede krystallinske insulin inneholder ca. 0,4 % sink. In the following, with reference to various design examples, a more detailed account can be given of how the freeze-dried insulin can be produced and how the crystallization process can be carried out using an addition of the freeze-dried insulin, noting that the starting material used crystalline insulin contains approx. 0.4% zinc.

Eksempel 1: Example 1:

500 mg krystallinsk insulin oppløses i 50 ml vann inneholdende 4 ml 0,1 n saltsyre. Denne oppløsning blandes med 50 ml tørres på vanlig måte ved et trykk på om-kring 0,05 mm Hg eller mindre. Ved tilsetning av det således frysetør-rende insulin til et vandig krystallisasjonsmedium, som inneholder 50 mg % sitronsyre (som natriumcitrat) Dissolve 500 mg of crystalline insulin in 50 ml of water containing 4 ml of 0.1 N hydrochloric acid. This solution is mixed with 50 ml dried in the usual way at a pressure of about 0.05 mm Hg or less. By adding the thus freeze-dried insulin to an aqueous crystallization medium, which contains 50 mg% citric acid (as sodium citrate)

2 mg % Zn (som sinkklorid) 2 mg% Zn (as zinc chloride)

Y2 % insulin Y2% insulin

1 %o p-oksybenzoesyremetylester, 1%o p-oxybenzoic acid methyl ester,

og som er innstilt på pH 6,5, i en mengde av 20 % av insulinmengden i det vandige krystallisasjonsmedium, utkrystalliserer insulinet i form av krystaller som er ensartet med hensyn til størrelse og form, og som har en størrelse på ca. 5 |x. and which is adjusted to pH 6.5, in an amount of 20% of the amount of insulin in the aqueous crystallization medium, the insulin crystallizes in the form of crystals which are uniform in size and shape, and which have a size of approx. 5 |x.

Eksempel 2: Example 2:

500 mg krystallinsk insulin oppløses i 50 ml vann inneholdende 4,3 ml 0,1 n saltsyre. Denne oppløsning blandes med 50 ml av en pufferoppløsning inneholdende Dissolve 500 mg of crystalline insulin in 50 ml of water containing 4.3 ml of 0.1 N hydrochloric acid. This solution is mixed with 50 ml of a buffer solution containing

50 mg sitronsyre 50 mg citric acid

10 ml 0,1 n natriumhydroksyd 10 ml of 0.1 N sodium hydroxide

2 mg Zn (som sinkklorid) 2 mg Zn (as zinc chloride)

1,6 <n>/oo p-oksybenzoesyremetylester, og blandingens pH-verdi innstilles på 6,3, hvorved det fremkommer uklarhet som følge av utfelning av amorft insulin. Den fremkomne blanding frysetørres på vanlig måte ved samme trykk som i eksempel 1. 1.6 <n>/oo p-oxybenzoic acid methyl ester, and the pH value of the mixture is set to 6.3, whereupon turbidity appears as a result of precipitation of amorphous insulin. The resulting mixture is freeze-dried in the usual way at the same pressure as in example 1.

Ved tilsetning av det således frysetør-rede insulin til det samme krystallisasjonsmedium som i eksempel 1 og i den samme mengde, utkrystalliserer insulinet i form av 5—7 [j, krystaller. By adding the thus freeze-dried insulin to the same crystallization medium as in example 1 and in the same quantity, the insulin crystallizes in the form of 5-7 [j, crystals.

Eksempel 3: Example 3:

Det gås frem som angitt i eksempel 2 bare med den forskjell at insulinoppløs-ningen som skal frysetørres innstilles på pH 6,6 i stedet for pH 6,3, hvorved oppløs-ningen forblir klar idet det ikke felles ut amorft insulin. Proceed as indicated in example 2, only with the difference that the insulin solution to be freeze-dried is set to pH 6.6 instead of pH 6.3, whereby the solution remains clear as amorphous insulin does not precipitate.

Resultatet av krystallisasjonen er insulinkrystaller av en størrelse på ca. 2 yi. The result of the crystallization is insulin crystals of a size of approx. 2 years.

Eksempel 4: Example 4:

Det gås frem som angitt i ekesmpel 2 bare med den forskjell at insulinoppløsnin-gen som skal frysetørres innstilles på pH 7,0. Også i dette tilfelle blir resultatet av insulinkrystallisas j onen insulinkrystaller av en størrelse på ca. 2 li. Proceed as indicated in example 2, only with the difference that the insulin solution to be freeze-dried is set to pH 7.0. In this case too, the result of insulin crystallization is insulin crystals of a size of approx. 2 li.

Eksempel 5: Example 5:

Det gås frem som angitt i eksempel 2 bare med den forskjell at insulinoppløs-ningen som skal frysetørres innstilles på pH 7,5. I dette tilfelle blir resultatet av krystallisasjonen krystaller av en størrelse på 1—1,5 li. Proceed as indicated in example 2, only with the difference that the insulin solution to be freeze-dried is set to pH 7.5. In this case, the result of the crystallization is crystals of a size of 1-1.5 l.

Eksempel 6: Example 6:

500 mg høyt renset amorft insulin uten innhold av krystallisasjonsfremmende me-taller oppløses i 50 ml vann inneholdende 4,3 ml 0,1 n saltsyre. Den fremkomne opp-løsning blandes med 50 ml av en oppløs-ning inneholdende 50 mg sitronsyre, 10 ml 0,1 n natriumhydroksyd og 1,6 %o p-oksybenzoesyremetylester, hvoretter blandingens pH-verdi innstilles på 6,7. Den således fremkomne blanding frysetørres på samme måte som i eksempel 1. Dissolve 500 mg of highly purified amorphous insulin without crystallization-promoting metals in 50 ml of water containing 4.3 ml of 0.1 N hydrochloric acid. The resulting solution is mixed with 50 ml of a solution containing 50 mg of citric acid, 10 ml of 0.1 N sodium hydroxide and 1.6% o p-oxybenzoic acid methyl ester, after which the pH value of the mixture is set to 6.7. The resulting mixture is freeze-dried in the same way as in example 1.

Ved tilsetning av det således frysetør-rede insulin til det samme krystallisasjonsmedium som i eksempel 1 og i den samme mengde, utkrystalliserer insulinet i form av 5 |i krystaller. By adding the thus freeze-dried insulin to the same crystallization medium as in example 1 and in the same quantity, the insulin crystallizes in the form of 5 µl crystals.

Eksempel 7: Example 7:

500 mg krystallinsk insulin oppløses i 50 ml vann inneholdende 4,3 ml 0,1 n saltsyre. Den fremkomne oppløsning blandes med 50 ml av en oppløsning inneholdende 50 mg sitronsyre, 2 mg sink (som sinkklorid), 10 ml 0,1 n natriumhydroksyd og 1,6%» p-oksybenzoesyremetylester. Blandingens pH-verdi innstilles på ca. 5,0, hvoretter det tilsettes 100 mg insulin frysetørret som angitt i eksempel 3, og omrøres. Insulinet utkrystalliserer i form av 2,5 li krystaller, som imidlertid har tilbøyelighet til å klebe sammen, hvilket gjør dem mindre egnet for bruk som podekrystaller. Dissolve 500 mg of crystalline insulin in 50 ml of water containing 4.3 ml of 0.1 N hydrochloric acid. The resulting solution is mixed with 50 ml of a solution containing 50 mg of citric acid, 2 mg of zinc (as zinc chloride), 10 ml of 0.1 N sodium hydroxide and 1.6% p-oxybenzoic acid methyl ester. The mixture's pH value is set to approx. 5.0, after which 100 mg of freeze-dried insulin is added as indicated in example 3, and stirred. The insulin crystallizes in the form of 2.5 l crystals, which, however, have a tendency to stick together, making them less suitable for use as seed crystals.

Eksempel 8: Example 8:

Det gås frem som beskrevet i eksempel 7 bare med den forskjell at krystallisasjonen utføres ved pH 5,5 i stedet for 5,0. De herved fremkomne krystaller har en stør-relse på ca. 2 li og er noe mindre sammen-klebende enn i eksempel 7. The procedure is as described in example 7 only with the difference that the crystallization is carried out at pH 5.5 instead of 5.0. The resulting crystals have a size of approx. 2 li and is somewhat less cohesive than in example 7.

Eksempel 9: Example 9:

Det gås frem som angitt i eksempel 7 bare med den forskjell at krystallisasjonen utføres ved pH 6,0, hvorved man får 2 li krystaller, som er helt fri av hverandre. Proceed as indicated in example 7, only with the difference that the crystallization is carried out at pH 6.0, whereby 2 l crystals are obtained, which are completely independent of each other.

Eksempel 10: Example 10:

Det gås frem som i eksempel 7, idet krystallisasjonen dog utføres ved pH 6,3. Herved kommer man til samme resultat som i eksempel 9. Proceed as in example 7, although the crystallization is carried out at pH 6.3. This leads to the same result as in example 9.

Eksempel 11: Example 11:

Det gås frem som angitt i eksempel 7 med den forskjell at krystallisasjonen utfø-res ved pH 7,0. Herved fåes insulinkrystaller av en størrelse på 1—2 li, men bare en del av insulinet er i stand til å krystallisere på grunn av insulinets forholdsvis store opp-løselighet under de nevnte krystallisasjons-betingelser. Proceed as indicated in example 7 with the difference that the crystallization is carried out at pH 7.0. In this way, insulin crystals of a size of 1-2 µl are obtained, but only a part of the insulin is able to crystallize due to insulin's relatively high solubility under the aforementioned crystallization conditions.

Eksempel 12: Example 12:

500 mg krystallinsk insulin oppløses i 50 ml vann inneholdende 4,3 ml 0,1 n saltsyre og den fremkomne oppløsning blandes med 50 ml av en vandig oppløsning inneholdende 178 mg Nai-HPO4, 2 HaO, 2 mg sink 500 mg of crystalline insulin is dissolved in 50 ml of water containing 4.3 ml of 0.1 N hydrochloric acid and the resulting solution is mixed with 50 ml of an aqueous solution containing 178 mg of Nai-HPO4, 2 HaO, 2 mg of zinc

(som sinkklorid), 3,8 ml 0,1 n saltsyre og (as zinc chloride), 3.8 ml of 0.1 N hydrochloric acid and

1,6 %n p-oksybenzoesyremetylester. Blandingens pH-verdi innstilles på 6,3, hvoretter det tilsettes 100 mg frysetørret insulin ifølge eksempel 3 og omrøres inntil krystallisasjonen er fullført. Det fåes insulinkrystaller av en størrelse på ca. 2 li. 1.6%n p-oxybenzoic acid methyl ester. The pH value of the mixture is set to 6.3, after which 100 mg of freeze-dried insulin according to example 3 is added and stirred until crystallization is complete. Insulin crystals of a size of approx. 2 li.

Eksempel 13: Example 13:

500 mg krystallinsk insulin oppløses i 50 ml vann inneholdende 4,3 ml 0,1 n saltsyre og oppløsningen blandes med 50 ml av en vandig oppløsning inneholdende 136 mg CHiOONa, 3 H^O, 2 mg sink (som sinkklorid), 4,5 ml 0,1 n natriumhydroksyd og 1,6 "/no p-oksybenzoesyremetylester. Blandingens pH-verdi innstilles på ca. 6,3, hvoretter det tilsettes 100 mg frysetørret insulin ifølge eksempel 3 og omrøres. De fremkomne insulinkrystaller har en størrelse på ca. 2 li. 500 mg of crystalline insulin is dissolved in 50 ml of water containing 4.3 ml of 0.1 N hydrochloric acid and the solution is mixed with 50 ml of an aqueous solution containing 136 mg of CHiOONa, 3 H^O, 2 mg of zinc (as zinc chloride), 4.5 ml of 0.1 n sodium hydroxide and 1.6 "/no p-oxybenzoic acid methyl ester. The pH value of the mixture is set to approx. 6.3, after which 100 mg of freeze-dried insulin according to example 3 is added and stirred. The resulting insulin crystals have a size of approx. 2 li.

Eksempel 14: Example 14:

Til 50 ml av en vandig oppløsning inneholdende 50 mg sitronsyre, 4,5 mg nikkel (som nikkelklorid), 10 ml 0,1 n natriumhydroksyd og 1,6 %o p-oksybenzoesyremetylester settes det 50 ml av en insulin-oppløsning av samme sammensetning som den som ifølge eksempel 6 underkastes fry-setørring, hvoretter det umiddelbart tilset- To 50 ml of an aqueous solution containing 50 mg of citric acid, 4.5 mg of nickel (as nickel chloride), 10 ml of 0.1 N sodium hydroxide and 1.6% o p-oxybenzoic acid methyl ester, 50 ml of an insulin solution of the same composition is added such as the one which, according to example 6, is subjected to freeze-drying, after which it is immediately added

tes 100 mg insulin frysetørret ifølge eksem- tes 100 mg insulin lyophilized according to eczema

pel 3. Blandingens pH-verdi innstilles på column 3. The pH value of the mixture is set to

ca. 6,2. Ved krystallisasjonen fåes det insulinkrystaller av en størrelse på ca. 2 li. about. 6.2. During the crystallization, insulin crystals of a size of approx. 2 li.

Eksempel 15: Example 15:

Til 100 ml av en vandig oppløsning inneholdende 50 mg sitronsyre, 2 mg sink (som sinkklorid) og 0,8 %o p-oksybenzoesyremetylester og innstilt på pH 6,5 med natriumhydroksyd settes det under omrø- To 100 ml of an aqueous solution containing 50 mg of citric acid, 2 mg of zinc (as zinc chloride) and 0.8% o p-oxybenzoic acid methyl ester and adjusted to pH 6.5 with sodium hydroxide is added under stirring

ring 600 mg insulin frysetørret ifølge ek- ring 600 mg insulin freeze-dried according to the

sempel 3. Etter et par timers omrøring er det tilsatte insulin utkrystallisert i form av krystaller av en størrelse på ca. 2 li. Example 3. After stirring for a couple of hours, the added insulin has crystallized in the form of crystals of a size of approx. 2 li.

Eksempel 16: Example 16:

Til 50 ml av en vandig oppløsning inneholdende 50 mg sitronsyre, 2 mg sink( som sinkklorid), 10 ml 0,1 n natriumhydroksyd og 1,6 %o p-oksybenzoesyremetylester set- To 50 ml of an aqueous solution containing 50 mg citric acid, 2 mg zinc (as zinc chloride), 10 ml 0.1 N sodium hydroxide and 1.6% o p-oxybenzoic acid methyl ester set-

tes under omrøring 100 mg insulin fryse- while stirring 100 mg insulin frozen

tørret ifølge eksempel 3, og umiddelbart deretter 500 mg krystallinsk insulin oppløst 1 50 ml vann inneholdende 4,3 ml 0,1^ n saltsyre, hvoretter blandingens pH-verdi innstilles på ca. 6,0. Krystallisasjonen ut- dried according to example 3, and immediately afterwards 500 mg of crystalline insulin dissolved in 150 ml of water containing 4.3 ml of 0.1 n hydrochloric acid, after which the pH value of the mixture is set to approx. 6.0. The crystallization out-

føres under omrøring, og de fremkomne insulinkrystaller har en størrelse på ca. is stirred, and the resulting insulin crystals have a size of approx.

2 2

Eksempel 17: Example 17:

Til 50 ml av en vandig oppløsning inneholdende 50 mg sitronsyre, 2 mg sink (som sinkklorid) samt ca. 9 ml 0,1 n natriumhydroksyd (til pH = 11,8) settes 100 mg frysetørret insulin, fremstilt som beskrevet i eksempel 3. To 50 ml of an aqueous solution containing 50 mg citric acid, 2 mg zinc (as zinc chloride) and approx. 100 mg of freeze-dried insulin, prepared as described in example 3, is added to 9 ml of 0.1 n sodium hydroxide (to pH = 11.8).

Det frysetørrede insulin går herved til-synelatende i oppløsning. Derpå tilsettes 50 ml av en insulinoppløsning inneholdende 500 mg krystallinsk insulin, 4,3 0,1 n salt- The freeze-dried insulin thereby apparently dissolves. Then add 50 ml of an insulin solution containing 500 mg crystalline insulin, 4.3 0.1 n saline

syre og 1,6 %o p-oksybenzoesyremetylester, acid and 1.6% o p-oxybenzoic acid methyl ester,

og pH innstilles på ca. 6,3. and the pH is set to approx. 6.3.

Etter et par timers forløp er krystallisasjonen fullført. Krystallstørrelsen er ca. After a couple of hours, the crystallization is complete. The crystal size is approx.

2—3 li. 2-3 li.

Såfremt de ifølge ovenstående eksemp- If, according to the above example, they

ler fremstilte insulinkrystaller skal benyt- insulin crystals produced in

tes som podemateriale for fabrikkmessig fremstilling av injiserbare insulinkrystall-suspensjoner inneholdende insulinkrystal- used as seed material for the factory production of injectable insulin crystal suspensions containing insulin crystal

ler av i hovedsaken ens størrelse, vil det laughs at essentially one's size, it will

være hensiktsmessig å sikre seg at det ikke skjer noen forandring av de fremstilte podekrystaller i suspensjonsmediet under en eventuell oppbevaring. I dette øyemed kan man sette en slik mengde krystallisasjons-f remmende metall til suspens jonsmediet for podekrystallene at suspensjonen er sta- be appropriate to ensure that no change occurs to the produced seed crystals in the suspension medium during possible storage. To this end, one can add such a quantity of crystallization-promoting metal to the suspension medium for the seed crystals that the suspension is stable

bil ved pH 7, og derpå innstille på denne pH-verdi. Således kan enhver av de ifølge eksemplene fremstilte suspensjoner av insulinkrystaller fortynnes i forholdet 1:1 car at pH 7, and then adjust to this pH value. Thus, any of the suspensions of insulin crystals prepared according to the examples can be diluted in the ratio 1:1

med en vandig oppløsning inneholdende 50 with an aqueous solution containing 50

mg % Zn (som sinkklorid) og 1 %<> p-oksybenzoesyremetylester, under tilsetning av tilstrekkelig natriumhydroksyd for tilveie-bringelse av en pH-verdi på 7—7,5. mg% Zn (as zinc chloride) and 1%<> p-oxybenzoic acid methyl ester, with the addition of sufficient sodium hydroxide to provide a pH value of 7-7.5.

Det skal til slutt bemerkes at man ved fremgangsmåtens praktiske utførelse i in-dustriell målestokk vanligvis vil utføre krystallisasjonen under sterile betingelser, så- Finally, it should be noted that in the practical implementation of the method on an industrial scale, the crystallization will usually be carried out under sterile conditions, so

ledes at det fremkommer sterile krystall-suspensjoner, enten for direkte terapeutisk bruk eller for bruk ved fremstilling av ste- led to the emergence of sterile crystal suspensions, either for direct therapeutic use or for use in the manufacture of ste-

rile suspensjoner av større insulinkrystaller for direkte teapeutisk anvendelse. rile suspensions of larger insulin crystals for direct therapeutic use.

Claims

1. Process for the production of small crystal bodies of insulin or a suspension of such insulin crystals, which are suitable for use as seed material for the production

position of larger crystals, and which crystals are mainly of the same size, preferably in the range 2-7 ll and appear as free crystal bodies, whereby the crystallization of the insulin takes place from an aqueous medium by shifting the medium's pH value to between 5 and 7, characterized in that the crystallization takes place by inoculation with freeze-dried insulin in an amount that is adapted to the desired crystal size, the crystallization preferably taking place in the pH range 6-7.

2. Method according to claim 1, characterized in that the freeze-dried insulin is added to the insulin-containing crystallization medium after it has been set to the crystallization pH value, but before crystal formation has begun.

3. Method according to claim 1 or 2, whereby the insulin-containing crystallization medium is prepared by mixing an acidic aqueous insulin solution and a basic solution that optionally contains a buffer substance and crystallization-promoting metal to achieve the crystallization pH value, characterized in that the freeze-dried insulin is added to the basic dissolution within the mixture.

4. Method according to any of the preceding claims, characterized in that the freeze-dried insulin is prepared from crystalline insulin or insulin of equivalent purity.

5. Method according to claim 4, characterized in that the insulin is freeze-dried in a medium of similar composition to the crystallization medium to which the freeze-dried insulin is added.

6. Method according to claim 1, characterized in that the crystallization medium's insulin content is provided by adding the freeze-dried insulin.