NL9400932A - T-lymfotroop primatevirus L (PTLV-L) en zijn toepassingen. - Google Patents

Description

T-LYMFOTROOP PRIMATEVIRUS L (PTLV-L) EN ZIJN TOEPASSINGEN

De onderhavige uitvinding betreft een nieuw prima-tevirus, van het virus afgeleide polynucleotiden en polype-tiden, vaccins en diagnostische tests, die hen bevatten, alsmede werkwijzen voor het aantonen van het virus in monsters .

Het humane T-lymfotrope virus type I (HTLV-I) werd in 1980 beschreven (l). Het virus veroorzaakt onder andere T-cel leukemie in volwassenen en een chronische progressieve myelopathie, die eerst bekend stond als tropische spastische paraparese, en later eveneens als HTLV-I geassocieerde myelopathie. Twee jaar later werd een tweede type (HTLV-II), dat nauw gekoppeld is aan myelopathie, gerapporteerd (2). Vele soorten apen en mensapen uit de oude wereld zijn geïnfecteerd met stammen van het T-lymfotrope apevirus type I (STLV-I). Dit zijn retrovirussen die nauw verwant zijn aan HTLV-I en in feite ononderscheidelijk zijn op moleculair niveau (3).

Recentelijk is er een STLV-II met meer dan 95% sequentiehomologie met HTLV-II beschreven voor apen uit de nieuwe wereld (29) . Voor de gehele groep is daarom de naam T-lymfotrope primatevirussen (PTLV) voorgesteld (4). Dit omvat zowel de HTLV's als de STLV's.

De relatie tussen verschillende PTLV-I's lijkt meer afhankelijk te zijn van geografie dan van gastheer-soort, hetgeen aangeeft dat transmissie tussen mens en aap herhaaldelijk tijdens de evolutie is opgetreden (5). Door hun beperkte horizontale transmissie hebben de PTLV's zich ontwikkeld in onafhankelijke clusters die de evolutie in contacten van de geïnfecteerde primatepopulaties weergeven. Gedacht werd dat de evolutie van de PTLV's gescheiden was in twee geografische takken waarbij PTLV-I voorkwam in de oude wereld en PTLV-II in de nieuwe wereld, omdat de enige bekende originele populaties met endemische HTLV-II de Amerikaanse indianen waren, terwijl HTLV-I het Amerikaanse continent pas bereikt leek te hebben via de slavenhandel in de tijd na Columbus. Deze zienswijze komt echter niet overeen met de aanwezigheid van de HTLV-II type serologieën onder Afrikaanse pygmeën, die recentelijk beschreven zijn (6, 7). Aan beide zijden van de Atlantische Oceaan lijken individuen die behoren tot de oudste en Beest geïsoleerde groepen van elk continent geïnfecteerd te zijn met verwante PTLV's.

Ook uit pathologisch oogpunt, kunnen de humane PTLV-stammen niet gezien worden als onafhankelijke entiteit. Bij de bavianen van het Sukhumi primatencentrum in Georgië, die gevoelig zijn voor leukemie, komt bijvoorbeeld vaak STLV-I, die overeenkomt met HTLV-I, voor. De ziekte heeft een aantal kenmerken van T-celleukemie bij volwassen mensen. Omdat er een dergelijk grote verwantschap bestaat tussen de humane- en apevirussen kan kennis van apavirussen van groot belang zijn voor het bestrijden van pathologieën in humane patiënten, veroorzaakt door aan apevirussen verwante of daaraan identieke humane virussen.

Volgens de uitvinding is nu een nieuw T-lymfotroop primatevirus (PTLV) gevonden. Het virus werd geïsoleerd uit een in het wild geboren baviaan van het species Papio hama-drvas uit Eritrea.

Uit een cDNA bibliotheek werd een 1802 baseparen lang fragment geïsoleerd dat het env-oebied. het volledige gen voor het transmembraan eiwit, en een deel van het tax/-rex-qen bevat (zie figuur 1).

Daarnaast werd de sequentie bepaald van een 3846 nucleotiden lang genomische DNA-fragment dat overeenkomt met het gebied van nucleotiden 5024 tot 8629 van HTLV-I. Het bevat het tweede open leesraam van rex. het envelopgen, het pX-gebied, het derde open leesraam van tax en rex en het gedeeltelijke LTR van het PTLV-virus. De sequentie wordt getoond in de figuur 5. De sequentie van de cDNA maakt onderdeel uit van de sequentie van het genomische fragment.

Op het nucleotidesequentieniveau zijn de homologieën van het prototype van het virus (STLV-PH969) met respectievelijk HTLV-I en -II 62 en 64% over het gehele gebied, 65% en 70% in het env-gebied, en 80 en 80% in de gedeeltelijke tax ƒ rex-seauentie. In het 5* deel van het pX-gebied werd slechts een significante homologie waargenomen met HTLV-II (52%). Fylogenetische analyse gebaseerd op het gen dat codeert voor het transmembraaneiwit geeft aan dat het nieuwe virus een PTLV-type vertegenwoordigt met een lange onafhankelijke evolutie, langer dan welke stam binnen de PTLV-I en -II groepen dan ook.

Zolang het nieuwe virus nog niet taxonomisch is ingedeeld wordt in deze aanvrage de aanduiding "PTLV-L" gebruikt.

Het nieuwe virus volgens de uitvinding is gedeponeerd bij de American Type Culture Collection op 18 maart 1994 onder depottoegangsnummer ATCC CRL 11592 in de vorm van een geïnfecteerd cocultuur van baviaanlymfocyten met virusvrije lymfocyten uit humaan navelstrengbloed. De cultuur wordt aangeduid met " PTLV-L/PH969".

Naast het nieuwe virus in in hoofdzaak zuivere vorm betreft de uitvinding een polypeptide, al dan niet in recombinante of synthetische vorm, dat tenminste één PTLV-L epitoop bevat. Dergelijke polypeptiden kunnen bijvoorbeeld toegepast worden in vaccins en diagnostische kits. Daarnaast heeft de uitvinding betrekking op PTLV-L polynucleotiden, al dan niet in gezuiverde vorm. Bij voorkeur bevat een gezuiverd PTLV-L-polynucleotide volgens de uitvinding de coderende sequentie voor een PTLV-L epitoop. Eventueel kan~het polynucleotide een recombinant of synthetisch polynucleotide i zijn. Het bevat dan een sequentie die is afgeleid van het PTLV-genoom of van PTLV-L cDNA en bij voorkeur de coderende delen voor een PTLV-L epitoop.

De uitvinding betreft eveneens een monoklonaal antilichaam dat gericht is tegen een PTLV-epitoop. De uit-i vinding heeft ook betrekking op gezuiverde preparaten van polyklonale antilichamen die zijn gericht tegen tenminste één PTLV-L epitoop.

Het PTLV-L kan op diverse manieren toegepast worden in vaccins. Een vaccin voor de behandeling van PTLV-L i infectie kan bijvoorbeeld een farmaceutisch aanvaardbaar verdunningsmiddel omvatten samen met een immunogeen polypeptide dat een PTLV-L epitoop bevat, waarbij het immunogene polypeptide aanwezig is in een farmacologisch effectieve dosis. Daarnaast kan een dergelijk vaccin naast een farmaceutisch aanvaardbare verdunningsmiddel een geïnactiveerd PTLV-L bevatten in een farmacologisch effectieve dosis, of een verzwakt PTLV-L in een farmacologisch effectieve dosis.

De verschillende onderdelen van het PTLV-L, dat wil zeggen polypeptiden, polynucleotiden en dergelijke alsmede tegen het PTLV-L opgewekte antilichamen kunnen gebruikt worden in diagnostische kits. Een kit voor het analyseren van monsters op de aanwezigheid van polynucleotiden, afgeleid van PTLV-L, omvat bijvoorbeeld een polynucleo-tideprobe, die een nucleotidesequentie van PTLV-L van acht nucleotiden of meer bevat, in een geschikte houder. Een kit voor het analyseren van monsters op de aanwezigheid van PTLV-antigenen omvat in plaats van de polynucleotideprobe een antilichaam dat gericht is tegen het te detecteren antigeen, terwijl een kit voor het analyseren van monsters op de aanwezigheid van PTLV-L antilichamen een polypeptide omvat dat een PTLV-L epitoop uit een PTLV-L antigeen bevat.

De uitvinding betreft verder PTLV-L epitoop-bevat-tende polypeptiden en antilichamen gericht tegen dergelijke epitopen gebonden aan drager.

Ook heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het detecteren van PTLV-L nucleïnezuren in een monster, omvattende de stappen: a) het in contact brengen van het monster met een probe voor een PTLV-L polynucleotide onder omstandigheden die de vorming van een polynucleotide duplex mogelijk maken; en b) het detecteren van de duplex die de probe i bevat.

Immunobepalingen voor het detecteren van PTLV-L antigeen volgens de uitvinding omvatten de stappen: a) het incuberen van een monster, waarvan vermoed wordt dat het PTLV-L antigenen bevat, met een antilichaam-i probe gericht tegen het PTLV-L antilichaam onder omstandigheden, die de vorming van een antigeen-antilichaam-complex mogelijk maken; en b) het detecteren van het gevormde antigeen-anti-lichaam-complex.

Immunobepalingen voor het detecteren van PTLV-L antilichamen omvatten de stappen: a) het incuberen van een monster, waarvan vermoed wordt dat het PTLV-L antilichamen bevat, met een polypepti-de-probe, die een PTLV-L epitoop bevat, onder omstandigheden die de vorming van een antigeen-antilichaam-complex mogelijk maken; en b) het detecteren van het gevormde antigeen-antilichaam-complex.

De uitvinding betreft tenslotte een cellijn, omvattende het PTLV-L. Een dergelijke cellijn heeft bijvoorbeeld het ATCC-toegangsnummer ATCC CRL 11592.

In onderstaand voorbeeld wordt de uitvinding verder geïllustreerd. Dit voorbeeld is echter niet bedoeld om de uitvinding op enigerlei wijze te beperken.

VOORBEELD

1. METHODEN

Er werden dertien in het wild geboren Hamadryasba-vianen fPapio hamadrvasï afkomstig uit Eritrea (voormalig Noord-Ethiopië) en twaalf Hamadryasbavianen, die waren geboren en opgegroeid in gevangenschap in het Sukhumi primatencentrum in Georgië (voormalige USSR), onderzocht. De bavianen werden in isolatie gehouden in onderzoekslaboratoria van de Universiteit van Leuven, gedurende perioden van 6 tot 10 maanden.

Sera van deze bavianen werden getest op PTLV-I antilichamen met een immunofluorescentiebepaling op MT-2 (IFA/MT-2) een continu HTLV-I producerende cellijn (8) en met een HTLV-I volledig-viruslysaat ELISA (Organon Teknika) of een deeltjes-agglutinatiebepaling (Serodia-HTLV, Fujire-bio). Reactieve sera werden verder getest met een gemodificeerde HTLV-I immunoblotbepaling, gespot met recombinant transmembraaneiwit (rgp21), welke kruisreageert met zowel HTLV-I als -II, en met de recombinante eiwitten MTA-1 en K55, afgeleid van het buitenste membraaneiwit, en specifiek herkend door respectievelijk HTLV-I en HTLV-II antilichamen (9). Van deze gemodificeerde Western blot is aangetoond dat het correct STLV-I positieve sera identificeert met meer dan 90 % gevoeligheid (10). De sera werden eveneens getypeerd met type-specifieke ELISAs, die gebruik maken van synthetische peptiden, die zijn afgeleid van het matrixeiwit van HTLV-I en van het buitenmembraaneiwit van HTLV-II (Select HTLV, IAF-Biochem, Montreal) (11).

Virusisolatie werd uitgevoerd door cocultuur met lymfocyten uit navelstrengbloed. Mononucleaire cellen uit perifeer bloed (PBMC) werden gescheiden van gehepariniseerd bloed op ficoll met natriummetrizoaat (Lymphoprep, Nycomed Pharma). Acht ml van een 106/ml suspensie van de cellen werden gecocultiveerd met een gelijk volume van met fytohae-magglutinine (PHA) gestimuleerde lymfocyten uit humaan navelstrengbloed (106/ml) in de aanwezigheid van 10 U/ml recombinant interleukine-2 (Boehringer Mannheim) en 2 μΐ/ml polybreen. Het medium werd tweemaal per week gewisseld en in de eerste weken werden verse gestimuleerde navelstrengcellen toegevoegd wanneer het celaantal daalde. De cellen werden onderzocht op onsterfelijk worden, op antigeen-expressie door indirecte immunofluorescent iebepaling (IFA) met een polyklonaal anti-HTLV-I positief humaan serum (van een patiënt met met HTLV-I geassocieerde myelopathie) en met plasma van de apen, en op de produktie van p24 kernantigeen in de kweekvloeistof door een capture-ELISA, die zowel HTLV-1 als -II detecteert (Coulter, Hyaleah). De specificiteit van de p24 antigeen-ELISA werd bevestigd door het herhalen van de bepaling na pre-incubatie van het kweeksupernatant gedurende 15 minuten bij 37 °C met 1:20 verdunningen van seropositief en seronegatief plasma. Gekweekte cellen die positief waren in de IFA met polyklonaal serum werden eveneens getest met een HTLV-I specifiek anti-pl9 (matrixeiwit) monoklonaal antilichaam 13B12 (Sigma) (12).

Een cellijn (PH969), die verkregen was van een in het wild gevangen Hamadryas, waarvan het serum antilichamen met een PTLV-II-type patroon bevatte, werd verder geanalyseerd.

De celoppervlaktemerkers van de onsterfelijk gemaakte cellen werden geanalyseerd met een reeks monoklona-le antilichamen (Simultest, Becton Dickinson) op een Fluorescent Antilichaam Cel Sorter (FACS, Becton Dickinson) .

Voor PTLV-provirusdetectie door polymerase kettingreactie (PCR) werd een pellet van 106 gekweekte cellen behandeld met proteinase K (0,1 Mg/ml overnacht bij 56°C) gevolgd door fenol/chloroform-extractie en methanolprecipi-tatie. Een geneste PCR werd uitgevoerd op het DNA van 105 cellen met de primerset TR101-104 (13), die een deel van het tax/rex gebied van zowel HTLV-I als -II amplificeert, onder de volgende omstandigheden: 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KC1, .3 mM MgCl2, 200 μM dNTPs, 1 μΚ van elke primer en 0,025 ϋ/μΐ AmpliTag in een volume van 100 /tl. De buitenste PCR werd uitgevoerd op een Gene Amp PCR system 9600 (Perkin-Elmer/Cetus) met 35 cycli (30 sec. bij 95°C, 30 sec. bij 50°C, 45 sec. bij 72°C); er werd 2 μΐ overgebracht naar 100 μΐ voor de binnenste PCR op een Trio-Thermoblok (Biometra) met 25 cycli (1 min. bij 95°C, 1 min. 30 sec. bij 50°C, 1 min. 30 sec. bij 72°C). Het geneste TR103-104 PCR-produkt werd.gezuiverd op een 3% agarosegel met gebruikmaking van de Sephaglas Bandprepkit (Pharmacia) en verder geanalyseerd met het dsDNA Cycle Sequencing System (Life Technologies) met de [ -32P]ATP-gelabelde PCR primers.

Het poly-A RNA van de PH969-cellen werd geïsoleerd met de Quick Prep zuiveringskit (Pharmacia) en gebruikt voor constructie van een cDNA-bibliotheek in de ZAP II vector (Stratagene). 105 plaques werden gescreend met het TR103-104 PCR-fragment, dat gelabeld was door inbouw van [a-32P]dCTP tijdens amplificatie (14). Een positieve plaque werd verder gezuiverd en het cDNA-insert in pBluescript werd uitgeknipt uit de ZAP II vector. Van beide strengen van het cDNA-insert werd de sequentie bepaald door de dideoxynucleotide-keten-terminatiemethode (Sequenase kit, USB) met primerwalking. De nucleotidesequentie werd geanalyseerd met gebruikmaking van de GeneWorks software (Intelligenetics). In de berekening van de percentages van homologie, scoren transities en transversies gelijk en worden inserties of deleties van verschillende naburige nucleotiden (NT) als één gebeurtenis gescoord. De fylogenetische analyse werd uitgevoerd door de "neighbor-joining"-methode (15) met het Kimura 2-parameter model (16) met gebruikmaking van het Treecon software pakket (17); inserties en deleties werden niet in beschouwing genomen. De boom werd van wortels voorzien met gebruikmaking van de automatische wortelallocatie-optie. De statische analyse werd uitgevoerd met de bootstrap sampling methode (1000 replicaten) (18).

Geneste PCR-primers werden ontworpen uit de sequentie, die was verkregen uit PH969, en gebruikt voor de detectie van het provirus in ongekweekte mononucleaire cellen uit perifeer bloed van dezelfde baviaan. De buitenste primers MVB1, AGCTATTCCCGCCAGTAATA (sense, NT49-68 van het cDNA-insert), en MVB2, GATGCCTAGTGAAGGTGAGAACT (antisense, NT778-800), werden gebruikt voor 35 cycli op een Trio-Ther-moblok (1 min. bij 95°C, 1 min. 30 sec. bij 55°C, 1 min. 30 sec. bij 72°C). Een volume van 2 μΐ werd overgebracht naar 100 μΐ voor de binnenste PCR met 25 cycli (1 min. bij 95°C, 1 min. 30 sec. bij 58°C, 1 min. 30 sec. bij 72eC) met de primers MVB3, CAAGCCATCTCCTCGGAGAA (sense, NT 113-132) , en MVB4, TTGGTCCACTTCACGCAAC (antisense, NT 310-328). DNA-monsters uit de PH969-cellijn en van HUT78-cellen werden gebruikt als respectievelijk positieve en negatieve controles. De ander testomstandigheden waren hetzelfde als in de PCR met de set TR101-104 geneste primers.

2. RESULTATEN

Vier van 12 in een kolonie opgegroeide P. hamadrv-as waren positief in de test op HTLV-antilichamen en hadden typische HTLV-I Western blot patronen inclusief reactiviteit met pl9, p24 en rgp21 en met het HTLV-I specifieke MTA-1 eiwit. Twee gekweekte isolaten van seropositieve bavianen werden gekarakteriseerd als STLV-I.

Sera van 2 van de 13 in het wild gevangen Hamadry-asbavianen waren reactief, hoewel zwak, in de screeningsbe- palingen. De immunoblot van beiden toonde slechts reactiviteit met het aaa p24 en met het rgp21. Daarnaast reageerde één van de twee met het HTLV-II specifieke K55, resulterend in een patroon dat niet te onderscheiden was van het HTLV-II positieve controleserum in dezelfde run.

Deze tweede vrouwelijke baviaan was beschikbaar voor verdere onderzoeken en van haar werd bloed afgenomen voor lymfocytische cocultuur (PH969). Aan het begin van de derde week van de cocultuur waren een paar fluorescente cellen detecteerbaar met zowel HTLV-I positief serum als met het plasma van de donorbaviaan zelf. Gestaag nam het aantal fluorescente cellen toe met rond 30 % positieve cellen vanaf week 8 in het baviaanplasma, maar een lager aantal 5-10 % en een veel zwakkere fluorescentie met HTLV-I serum. Fluorescentie met HTLV-I positief serum was constant minder uitgesproken dan met het bavianenplasma na verschillende passages van de celkweken, getest op verschillende momenten. Aan de andere kant was er slechts een zwakke fluorescentie zichtbaar met het baviaanplasma op de HTLV-I producerende MT-2 cellen. Serum van de ander seropositieve baviaan gaf dezelfde reacties. Een IFA op de cogekweekte cellen met drie HTLV-II sera van Amerikaanse oorsprong gaf met twee daarvan een zwakke reactie. Drie van de acht HTLV-II positieve sera van pygmeëen (7) toonden een zwakke reactie met de PH969 cellen in IFA. Vrij p24 antigeen werd detecteerbaar door ELISA vanaf dag 10 en steeg snel tot een niveau boven 10 maal de cut-off waarde van de test op dag 17 en bleef zo tijdens verdere kweek.

De specificiteit van de p24 antigeon-detectie werd bevestigd door blokkeringsbepalingen, die werden uitgevoerd op een supernatant-vloeistof genomen na 14 weken kweek. Plasma of serum van beide seropositieve bavianen en van een HTLV-I positief individu blokkeerden de ELISA reactie, terwijl seronegatief apeplasma geen effect had. Indirecte immunofluorescentie met het HTLV-I specifieke anti-pl9 monoklonale antilichaam 13B12 was negatief of de PH969-cellen, maar duidelijk positief met MT-2 cellen en roet een STLV-I cellijn verkregen uit een in gevangenschap geboren Hamadryasbaviaan.

Een duidelijke spontane groei werd waargenomen vanaf de tiende week met een toename van 106/ml naar 1,5 x 106 cellen/ml elke drie tot vier dagen. Analyse van celop-pervlaktemerkers toonde een enkele CD3'CD4+CD8' leukocyten-populatie met een hoge expressie van HLA-DR en een interleu-kine-2 receptor o-keten (CD25). B-celmerkers, CD19 en CD20, en de monocytmerker CD14 waren negatief. De cellen hebben een mannelijk humaan diploïd karyotype. Cocultivatie van met mitomycine C behandelde PH969 cellen met met vers fytohemag-glutinine behandelde lymfocyten uit navelstrengbloed leverde een nieuwe antigeen-producerende cellijn op.

PBMC uit een tweede onafhankelijke bloedafname van dezelfde baviaan werden afzonderlijk gecocultiveerd met PBMC van twee seronegatieve gezonde Hamadryasbavianen. Beide coculturen produceerden continu groeiende cellen die hetzelfde antigeen tot expressie brachten, zoals aangetoond door immunofluorescentie en ELISA.

Met de elektronenmicroscoop worden virale van een envelop voorziene deeltjes gevonden in alle drie de culturen. De deeltjes hebben variabele grootten, waarbij de grootste 10-120 nm groot is, en kernen van variërende dichtheden. Er werd knopvorming waargenomen.

Met een geneste PCR (TR101-104 primers) op de PH969 cellen werd een fragment verkregen dat homoloog is aan een zeer geconserveerde sequentie van het tax /rex-aebied van het PTLV-genoom. De homologie van het 120 baseparen (bp) lange fragment, waarvan de sequentie bepaald was, was 81,7 % met HTLV-I en 80 % met HTLV-II, terwijl HTLV-I en HTLV-II in dit gebied 85 % homologie vertonen.

Met gebruikmaking van het PCR-produkt als een probe werd een 1802 bp cDNA-fragment geïsoleerd uit een cDNA-bibliotheek die was afgeleid van de PH969-cellen. Het geïsoleerde cDNA-fragment is homoloog aan de NT 5918-7560 sequentie van HTLV-I (ATK1 stam) en de NT 5903-7573 sequentie van HTLV-II (Mo-T stam) (fig. 1). Voor HTLV-I omvat dit gebied een deel van het env-oen inclusief de volledige sequentie die codeert voor het transmembraaneiwit (gp21) , de open leesramen I en II van pX (ORF I en II) en een deel van het tax / rex-aebied. De totale homologie van het SLTV-PH969 cDNA fragment is 62,4 % met HTLV-I en 64 % met HTLV-II, terwijl 66 % homologie wordt waargenomen tussen HTLV-I en -II in hetzelfde fragment.

Op matrixvergelijkingsplots (fig. 2) worden twee belangrijke homologe gebieden gevonden tussen HTLV-I, HTLV-II en STLV-PH969: in de env en in de tax /rex-aebieden. Het eny-sequentiefragment van STLV-PH969 strekt zich uit van NT 1 tot 745 en vertoont 65 % homologie met HTLV-I en 70 % met HTLV-II, terwijl voor hetzelfde fragment HTLV-I en -II voor 65 % homoloog zijn. Het deel van het tax/rex-aebied waarvan de sequentie bepaald is, omvat NT 1441-1802 en is 80 % homoloog met zowel HTLV-I als HTLV-II (de homologie tussen HTLV-I en -II is 83 %). In de matrixvergelijkingsplot die STLV-PH969 en HTLV-II vergelijkt is de lijn die de homologie in het tax/rex weergeeft naar beneden geschoven door belangrijke deleties in het HTLV-IIpX (totaal 120 bp) . Het verschil in lengte tussen HTLV-I en STLV-PH969 in dit gebied is slechts 50 bp. In het 5' deel van het pX-gebied wordt significante homologie slechts gevonden tussen STLV-PH969 en HTLV-II (52 %).

Een fylogenetische analyse gebaseerd op de NT-sequentie, die codeert voor het transmembraanenvelopeiwit, wordt gegeven in fig. 3. Vertegenwoordigers van de meest divergente takken van HTLV-I (een Melanesische stam en een stam van het cosmopolitische type) en STLV-I (van een Azi-sche Macaca nemestrina) en van HTLV-II (HTLV-IIa en HTLV-Ilb) werden vergeleken met STLV-PH969. Runderleukemievirus, dat structureel verwant is aan PTLV, werd niet meegenomen, omdat onvoldoende homologie gevonden werd in dit deel van het genoom om het op de juiste manier op één lijn te kunnen brengen. Voor elke vertakkingsknoop worden hoge bootstrap-waarden verkregen.

Translatie van een gedeeltelijk ORF van NT 1-745 verschaft een aminozuur (AZ) -sequentie die homoloog is aan de env van HTLV-I en HTLV-II. De proteolytische splitsings- plaats van de env-glycoproteïne-voorloper is goed geconserveerd. De AZ-sequentie van het vermeende transmembraan-eiwit van STLV-PH969 heeft 75 % homologie met het overeenkomende eiwit in HTLV-I. Met 88 % is de homologie met HTLV-II hoger met een volledige overeenkomst van een intermediair gebied van 68 AZ inclusief de glycosyleringsplaats. Vergelijking van hydrofobiciteitsplots van de transmembraan-envelopeiwit-ten van HTLV-I, HTLV-II en STLV-PH969 toont geen belangrijke verschillen (niet getoond). Dit en de homologie van de AZ-sequenties is in overeenstemming met de waargenomen immunologische reactiviteiten van HTLV-I-, HTLV-II- en STLV-PH969-positieve sera met HTLV-I gp2l.

In het pX-gebied gaat een korte sequentie, die overeenkomt met de splice acceptor consensus sequentie (23) (NT 1432-1443), vooraf aan twee gedeeltelijke ORFs, die coderen voor eiwitten die homoloog zijn aan tax en rex. De gedeeltelijke tax-AZ-secmentie is goed geconserveerd met 84 % en 88 % homologiën met resp. HTLV-I en HTLV-II (80 % homologie tussen HTLV-I en -II). De rex-AZ-sequentie vertoonde daarentegen slechts homologiën van 54 % en 55 % (de homologie tussen HTLV-I en -II is 65 %). Eén extra ORF (NT 796-1140) kon geïdentificeerd worden in het 5'-deel van het pX-gebied volgend op een vermoedelijke splice acceptor plaats (cursief in fig. 1). De theoretische AZ-sequentie is 125 AZ lang en heeft geen homologie met andere beschreven PTLV-eiwitten.

Genest PCR, die direct werd uitgevoerd op de PBMC van de baviaan met de primers ontworpen op basis van STLV-PH969 tax/rex-sequentie, amplificeerde een fragment van de verwachte lengte (216 bp) (fig. 4).

3. FIGUREN

In figuur 1 wordt de nucleotidesequentie van het STLV-PH969 cDNA-fragment getoond. De afgeleide aminozuurse-quentie wordt onder de nucleotidesequentie gegeven; niet-coderende gebieden worden gegeven in kleine letters. De vermeende 3' splice acceptor plaatsen zijn onderstreept en de theoretische ORF tussen het env- en het tax/rex-qebied is cursief gedrukt. De env-proteolvtische splitsingsplaats wordt aangegeven door een pijl op het aminozuurniveau. Een omcirkeld asparagine geeft een mogelijke glycosylerings-plaats van het transmembraaneiwit weer.

In figuur 2 worden de homologiematrixplots van het STLV-PH969 cDNA-fragment vergeleken met de overeenkomende gebieden van HTLV-I (ATK1 stam; AC K02722) (19) en HTLV-II (Mo-T stam; AC M10060) (20). Elke punt geeft een gebied van 20 nucleotiden weer met een gemiddelde score van ten minste 58 % identiciteit. In gebieden met een significante homologie vormen de stippen een meer of minder continue lijn. De nucleotide-aantallen op de as refereren naar het einde van het 5' homologiegebied en het begin van het 3' homologiege-bied. In de vergelijkingsplot tussen HTLV-II en STLV-PH969 wordt het einde van het env-gen aangegeven door een pijl. De plots werden gemaakt met de GeneWorks software (Intelligenties) .

In figuur 3 wordt de fylogenetische analyse van de PTLV-nucleotidesequenties, die coderen voor het transmembraaneiwit, getoond. De analyse werd uitgevoerd met de neighbor-joining methode zoals geïmplementeerd in het TREE-CON software pakket (17). De STLV-PH969 sequentie werd op één lijn gezet met volgende stammen: HTLV-I (ATK1; AC KO-2722) (19), HTLV-I (Mel5; AC L02534) (5), STLV-I (PtM3; AC 11373) (21), HTLV-IIa (Mo-T, AC M10060) (20), HTLV-IIb (GNO; AC LI1456) (22). Het percentage van bootstrapbomen (1.000 replicaten) die de monofyletische oorsprong van de stammen aan de rechter zijde van de knoop ondersteunen, worden bij elke vertakking aangegeven.

In figuur 4 ten slotte wordt de gel-elektroforese van geneste PCR-produkten, die geamplificeerd zijn met de STLV-PH969 primers MVB 1-4, getoond. Lanen 1 en 3 zijn negatieve controles; laan 2 zijn gekweekte perifere mononucleai-re bloedcellen van de Hamadryasbaviaan waaruit STLV-PH969 werd afgeleid; laan 4 toont de PH969 cellijn; laan 5 toont grootte-merkers (pBR328 Bgll, pBR328 Hinfl).

4. DISCUSSIE

Door cocultivatie van gestimuleerde humane lymfo-cyten uit navelstrengbloed, met PBMC uit een in het wild geboren Hamadryasbaviaan, die antilichamen had die zwak kruisreageerde met HTLV-I en HTLV-II, werd een continue CD4+ cellijn verkregen die een PTLV-verwant provirus bevatte (STLV-PH969). Deze cellijn produceert antigenen en virionen, die herkend worden door immunologische bepalingen die gericht zijn op HTLV-I en -II. Kruisreacties in beide richtingen zijn zwak, hetgeen suggereert dat er belangrijke verschillen bestaan tussen STLV-PH969 en de bekende PTLV.

Infectiviteit van het virus werd gedemonstreerd door secundaire transmissie naar verse lymfocyten uit navelstrengbloed .

Het plasma van de PH969-baviaan herkent de antigenen, die worden geproduceerd door de provirus-dragende cellijn, zowel in een indirecte immunofluorescentiebepaling als in een blokkeringsbepaling. Het virus kon uit dezelfde baviaan geïsoleerd worden op twee afzonderlijke gelegenheden, éénmaal met humane cellen en éénmaal met baviane-cellen. De provirussequentie van STLV-PH969 kon direct in de PBMC van de baviaan gedetecteerd werd door PCR. Dit alles bewijst dat het virus inderdaad afkomstig is van deze Hamadryasbaviaan. De baviaan werd van anderen geïsoleerd tijdens gevangenschap in Leuven, maar er bestaan geen details over wat er gebeurde tussen de vangst en het moment dat zij in Leuven aankwam. Het is echter onwaarschijnlijk dat het tijdens gevangenschap geïnfecteerd zou zijn, omdat onder 14 in kolonie opgegroeide bavianen slechts typische STLV-I gevonden werd.

De seguentiebepaling van een 1802 bp genoomfrag-ment dat zich uitstrekt van het env-gebied naar het tax/rex-gebied, bevestigd dat STLV-PH969 behoort tot de PTLV-groep, maar zeer verschillend is van zowel PTLV-I (62,4 % homologie) en PTLV-II-typen (64 % homologie). De verschillen op het nucleotide seguentieniveau tussen STLV-PH9696 en de andere bekende PTLV is van dezelfde grootteorde als het verschil tussen HTLV-I en -II (66 % homologie). Het gebied van het genoom waarvan de sequentie bepaald is, overspant een deel van het geconserveerde tax/rex-gebied, evenals van het extreem divergente 5'-deel van het pX en deel van het gematigd divergente env-gebied. De getransleerde aminozuur-sequentie van een mogelijk ORF in het 5'-deel van het pX-gebied van het STLV-PH969 genoom toont geen homologie met enig bekend PTLV-eiwit.

Er worden meer homologiën waargenomen tussen STLV-PH969 en HTLV-II dan tussen STLV-PH969 en HTLV-I of tussen HTLV-I en -II. Dit is niet duidelijk wanneer gekeken wordt naar de totale percentages, omdat deze beïnvloed zijn door een groot aantal deleties in HTLV-II in vergelijking met STLV-PH969. Het kan visueel beter gewaardeerd worden in de matrix-vergelijkingsplots, waar de homologie die bestaat tussen STLV-PH969 en HTLV-II in het env-gebied zich uit-breidt naar een deel van het 5'-einde van het pX, maar hier is de homologie slechts 52 %. Paarsgewijze vergelijking van de percentages homologie in verschillende gebieden, zowel op het nucleotideniveau als het aminozuurniveau, wijst eveneens op een hogere homologie van STLV-PH969 met HTLV-II dan met HTLV-I in het bijzonder in de env. Het feit dat STLV-PH969 enigszins meer verwant is met het PTLV-II dan met het PTLV-l wordt eveneens tot uitdrukking gebracht door een antili-chaampatroon in de geïnfecteerde apen dat lijkt op een HTLV-II antilichaampatroon door conventionele serologie.

De fylogenetische analyse (fig. 3) werd uitgevoerd op het fragment dat codeert voor het transmembraaneiwit, omdat dit deel een entiteit is, die correct op één lijn gebracht kan worden tussen de twee virussen van deze groep (fig. 2) en die veel gebruikt is in fylogenetisch analyses door verschillende onderzoekers. Hier werden vertegenwoordigers van de meest divergente stammen van elk van de PTLV-I en PTLV-II typen voor deze vergelijking gekozen. Onder de af stands-mater ixbenaderingen, waar de lengte van de takken van de boom evenredig zijn met de afstand tussen de taxa is de neighbor-joining methode in het algemeen de beste keuze (24, 25). Aangezien transities veel algemener zijn dan transversies werd het Kimura 2-parametermodel gebruikt voor het berekenen van de afstanden. De bootstrapwaarden naar beide knopen geven het percentage weer van bomen waarvoor de geanalyseerde sequenties rechts een monofyletische groep weergeven. De hoge waarden die hier verkregen worden zijn een indicatie dat de vertakking juist is. Zoals verwacht toont de analyse dat de STVL-PH969 een PTLV type vertegenwoordigt met een lange onafhankelijke evolutie, maar die enigszins dichter bij PTLV-II ligt dan bij PTLV-I. Vanwege zijn hoge divergentie van zowel PTLV-I als PTLV-II en vanwege zijn lange onafhankelijke evolutie, langer dan enige stam binnen de PTLV-I of PTLV-II groepen, kwalificeert dit virus zich als een vertegenwoordiger van een nieuw PTLV-type. Zolang de formele klassificatie van dit virus nog niet voltooid is, wordt de naam PTLV-L voorgesteld voor dit nieuwe type, waarbij STLV-PH969 de prototypestam is.

REFERENTIES

1. Poiesz, B.J., Ruscetti, F.W., Gazdar, A.F., Bunn, P.A., Minna, J.D., & Gallo, R.C. (1980) Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 77, 7415-7419.

2. Kalyanaraman, V.S., Sarngadharan, M.G., Robert-Guroff, M., Miyoshi, I., Golde, D., Gallo, R.C. (1982) Science 218, 571-573.

3. Watanabe, T., Seiki, M., Hirayama, Y., & Yoshida, M. (1986) Virology 148, 385-388.

4. Sherman, M.P., Saksena, N.K., Dube, D.K. Yanagihara, R., & Poiesz, B.J. (1992) J. Virol. 66, 2556-2563.

5. Gessain, A., Boeri, E., Yanagihara, R., Gallo, R.C., & Franchini, G. (1993) J. Virol. 67, 1015-1023.

6. Goubau, P., Desmyter, J., Ghesquiere, J., & Kasereka, B. (1992) Nature 359, 201.

7. .Goubau, P., Liu, H.F., De Lange, G.G., Vandamme, A.M., & Desmyter, J. (1993) AIDS Res. Hum. Retrovir. 9, 709-713.

8. Miyoshi, I., Kubonishi, I., Yoshimoto, S., Akagi, T., Ohtsuki, Y., Shiraishi, Y., Nagata, T., & Hinuma, Y. (1981) Nature 294, 770-771.

9. Lipka, J.J., Miyoshi, I., Hadlock, K.G., Reyes, G.R., Chow, T.P., Blattner, W.A., Shaw, G.M., Hanson, C.V., Gallo, D., Chan, L., & Foung, S.K.H. (1992) J. Infect. Dis. 165, 268-272.

10. Rudolph, D.L., Yee, J., Hone, J., Foung, S.K.H., Lipka, J.J., Reyer, 6.R., Hadlock, K., Chan, L., Villinger, F., Lairmore, M.D., Sinha, S., & Lal, R.B. (1992) J. Clin. Microbiol. 30, 858-861.

11. Lal, R.B., Heneine, W., Rudolph, D.L., Present, W.B., Hofhienz, D., Hartley, T.M., Khabbaz, R.F., & Kaplan, J.E. (1991) J. Clin. Microbiol. 29, 2253-2258.

12. Palker, T.J., Scearce, R.M., Ho, W., Copeland, T.D., Oroszlan, S., Popovic, N., & Hayners, B.F. (1985) J. Immunol. 135, 247-254.

13. Maloney, E.M., Biggar, R.J., Neel, J.V., Taylor, M.E., Hahn, B.H., Shaw, G.M., & Blattner, W.A. (1992) J. Infect. Dis. 166, 100-107.

14. Abbott, M.A., Poiesz, B.J., Byrne, B.C., Kwok, S. Sninsky, J.J., Ehrlich, G.D. (1988) J. Infect. Dis.

158, 1158-1168.

15. Saitou, N., & Nei, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4, 406-. 425.

16. Kimura, M. (1980) J. Molec. Evol. 16, 111-120.

17. Van de Peer, Y., & De Wachter, R. (1993) Comput. Ap-plic. Biosci. 9, 177-182.

18. Felsenstein, J. (1985) Evolution 39, 783-791.

19. Seiki, M., Hattori, S., Hirayama, Y., & Yoshida, M. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3618-3622.

20. Shimotohno, K., Takahashi, Y., Shimuzu, N., Gojobori, T., Golde, D.W., Chen, S.Y., Miwa, M., & Sugimura, T. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3101-3105.

21. Watanabe, T., Seiki, Μ., Tsujimoto, Η., Miyoshi, I., Hayami, M., & Yoshida, M. (1985) Virology 144, 59-65.

22. Pardi, D., Switzer, W.M., Hadlock, K.G., Kaplan, J.E., Lal, R.B., & Folks, T.M. (1993) J. Virol. 67, 4659-4664.

23. Shapiro, M.B., & Senapathy, P. (1987) Nucleic Acids Res. 15, 715507174.

24. Saitou, N., & Imanishi, T. (1989) Mol. Biol. Evol. 6, 514-525.

25. Sourdis, J., & Nei, M. (1988) Mol. Biol. Evol. 5, 298-. 311.

26. Rummer, H. (1992) Wiesse Affen am roten Meer (R. Piper, München), p. 427.

27. Gallo, D., Penning, L.M., & Hanson, C.M. (1991) J.

Clin. Microbiol. 29, 2345-2347.

28. . Saksena, N.K., Hervé, V., Sherman, M.P., Durand, J.P.,

Mathiot, C., Muller, M., Love, J.L., LeGuenno, B., Barré-Sinoussi, F., Dube, D.K., & Poiesz, B.J. (1993) Virology 192, 312-320.

29. Chen et al. (1993) International Conference on AIDS, Berlijn.

Claims (24)

1. T-Lymfotroop primatevirus L (PTLV-L) in in hoofdzaak geïsoleerd vorm te verkrijgen uit de lymfocyten-cellijn PH969 met het ATCC-toegangsnummer ATCC CRL 11592.

2. Polypeptide, omvattende tenminste één PTLV-L epitoop.

3. Recombinant polypeptide, omvattende tenminste één PTLV-L epitoop.

4. Synthetisch polypeptide, omvattende tenminste één PTLV-L epitoop.

5. Gezuiverd PTLV-L polynucleotide, of de complementaire streng daarvan.

6. Gezuiverd PTLV-L polynucleotide volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat het de coderende sequentie voor een PTLV-L epitoop omvat, of de complementaire streng daarvan.

7. Recombinant PTLV-L polynucleotide, of de complementaire streng daarvan.

8. Recombinant polynucleotide, omvattende een sequentie die is afgeleid van het PTLV-L genoom of van PTLV-L cDNA, of de complementaire streng daarvan.

9. Recombinant polynucleotide dat codeert voor een epitoop van PTLV-L, of de complementaire streng daarvan.

10. Honoklonaal antilichaam gericht tegen een PTLV-L epitoop.

11. Gezuiverd preparaat van polyklonale antilicha-men gericht tegen tenminste één PTLV-L epitoop.

12. Vaccin voor de behandeling van PTLV-L infectie, omvattende een farmaceutisch aanvaardbaar verdunnings-middel en een immunogeen polypeptide, dat een PTLV-L epitoop bevat, waarbij het immunogene polypeptide aanwezig is in een farmacologisch effectieve dosis.

13. Vaccin voor de behandeling van PTLV-L infectie, omvattende een farmaceutisch aanvaardbaar verdunnings-middel en geïnactiveerd PTLV-L, in een farmacologisch effectieve dosis.

14. Vaccin voor de behandeling van PTLV-L infectie, omvattende een farmaceutisch aanvaardbaar verdunnings-middel en verzwakt PTLV-L in een farmacologisch effectieve dosis.

15. Kit voor het analyseren van monsters op de aanwezigheid van polynucleotiden afgeleid van PTLV-L, omvattende een polynucleotide-probe, die een nucleotide-seguentie van PTLV-L van 8 nucleotiden of meer, of de complementaire streng daarvan, bevat, in een geschikte houder.

16. Kit voor het analyseren van monsters op de aanwezigheid van PTLV-L-antigenen, omvattende een antili-chaam gericht tegen het te detecteren antigeen, in een geschikte houder.

17. Kit voor het analyseren van monsters op de aanwezigheid van PTLV-L-antilichamen, omvattende een polypeptide, dat een PTLV-L epitoop uit het PTLV-L antigeen bevat, in een geschikte houder.

18. Polypeptide, dat een PTLV-L epitoop uit het PTLV-L antigeen bevat, gebonden aan een drager.

19. Antilichaam gericht tegen een epitoop van PTLV-L, gebonden aan een drager.

20. Werkwijze voor het detecteren van PTLV-L nucleïnezuren in een monster, omvattende de stappen: a) het in contact brengen van het monster met een probe voor een PTLV-L polynucleotide onder omstandigheden die de vorming van een polynucleotide duplex mogelijk maken; en b) het detecteren van de duplex die de probe bevat.

21. Immunobepaling voor het detecteren van PTLV-L antigeen, omvattende de stappen: a) het incuberen van een monster, waarvan vermoed wordt dat het PTLV-L antigenen bevat, met een antilichaam-probe gericht tegen het PTLV-L antilichaam onder omstandigheden die de vorming van een antigeen-antilichaam-complex mogelijk maken; en b) het detecteren van het gevormde antigeen-anti-lichaam-complex.

22. Immunobepaling voor het detecteren van PTLV-L antilichamen, omvattende de stappen: a) het incuberen van een monster, waarvan vermoed wordt dat het PTLV-L antilichamen bevat, met een polypepti-de-probe, die een PTLV-L epitoop bevat, onder omstandigheden die de vorming van een antigeen-antilichaam-complex mogelijk maken; en b) het detecteren van het gevormde antigeen-anti-lichaam-complex.

23. Cellijn, omvattende het PTLV-L volgens conclusie 1.

24. Cellijn PTLV-L/PH969 te verkrijgen bij de American Type Culture Collection onder toegangsnummer ATCC CRL 11592.