NL9201173A - Vector voor positieve selectie van recombinanten. - Google Patents

Description

VECTOR VOOR POSITIEVE SELECTIE VAM RECOMBINANTEN

De onderhavige uitvinding betreft een vector voor positieve selectie van recombinante gastheercellen, welke getransformeerd zijn met recombinante vectoren. De uitvinding betreft verder een werkwijze voor de positieve selectie van recombinante gastheercellen met gekloneerde DNA-frag-menten onder toepassing van een vector volgens de uitvinding.

Klonering van DNA-fragmenten vereist de identificatie van klonen met recombinante plasmiden in een achtergrond van niet-recombinante klonen. Er zijn tal van selec-tiesystemen beschikbaar, gebaseerd op insertie van het vreemde DNA in een merkergen dat als gevolg van inactivatie aanleiding geeft tot de expressie van een waarneembaar, gewijzigd fenotype. De eerst ontwikkelde en nog steeds toegepaste selectiesystemen zijn gebaseerd op insertie-inactivatie van een antibioticumresistentiegen (Bolivar, 1979) . Recombinanten worden aangetoond door hun onvermogen om te groeien op een voedingsbodem die het desbetreffende antibioticum bevat. Dit is een negatief selectiecriterium. Een tweede selectiemerker is in dit geval nodig om transformanten van niet-transformanten te onderscheiden.

Eenvoudiger is identificatie op basis van een niet-essentiële fenotypische merker. Zeer frequent gebruikt zijn systemen waarbij ingevolge insertie-inactivatie van het lacZ-gen (of een functioneel deel ervan) geen B-galactosida-se-activiteit meer geproduceerd wordt (Yanish-Perron et al., 1985). In aanwezigheid van het chromogene substraat X-Gal kleuren niet-recombinanten blauw, terwijl recombinanten wit blijven. De efficiëntie van klonering kan in dergelijke systemen worden verbeterd door defosforylatie van de geknipte vector, waardoor de achtergrond van teruggeligeerde plasmiden belangrijk wordt gereduceerd. Klonering wordt echter aanzienlijk vergemakkelijkt door gebruik te maken van een positief selectiesysteem dat uitsluitend de recombinante klonen toelaat te groeien en geen achtergrond van niet-recombinanten geeft.

Een voorbeeld van dergelijke positieve selectie wordt gevonden bij insertie-inactivatie van een conditioneel lethaal gen. Bij een dergelijk selectiesysteem zullen onder selectieve condities alleen recombinanten overleven (Schumann, 1979). Bij de vector pTR262 bijvoorbeeld inactiveert insertie van een DNA-fragment de repressor van een tetracy-cline-resistentiegen, waardoor recombinanten resistentie verwerven tegen tetracycline (Roberts et al., 1980). In . dergelijke kloneringssystemen is defosforylatie van het vec-tor-DNA dan ook minder cruciaal.

De onderhavige uitvinding verschaft een vector, waarmee een nieuw type selectie bereikt kan worden, waarbij op effectieve wijze positief geselecteerd kan worden op gastheercellen, welke getransformeerd zijn met recombinante vectoren. De vector volgens de uitvinding omvat een gemuteerd gen, dat voorzien is van een unieke restrictieplaats en codeert voor een inactieve vorm van een selectiemerker-eiwit en na insertie van een DNA-fragment in de unieke restrictieplaats daarvan codeert voor een actieve vorm van de selectiemerker-eiwit. Bij de gebruikelijke selectiesystemen verstoort de DNA-insertie het leesraam en dus de aanmaak van een aktief eiwit. Bij de vector volgens de uitvinding wordt de activiteit van de selectiemerker juist hersteld.

Het voordeel van het systeem volgens de uitvinding is dat slechts één selectiemerker nodig is en dat de recombinante gastheercellen overleven. Dit in tegenstelling tot systemen welke gebruik maken van selectiemerkers, die door insertie van een DNA-fragment geïnactiveerd worden en hun vermogen te overleven in selecterend medium verliezen.

Gevonden is dat met het systeem volgens de uitvinding selectie-efficiënties van tenminste 99,8% bereikt kunnen worden.

In een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding is het selectiegen het chlooramfenicol acetyltransferase (cat)-gen, waarin nabij het 3'-uiteinde daarvan een stopcodon is opgenomen.

Het gen van het chlooramfenicol acetyltransferase (Cat) isoenzyme I wordt zeer frequent gebruikt in de recom-binant-DNA-technologie. Het fungeert in de meeste gevallen als chlooramfenicol-resistentiemerker in kloneringsvectoren of als merkerenzym voor studies van genexpressie. Daarnaast is Cat ook gebruikt als dragereiwit voor de productie van fusie-eiwitten in E. coli. In dit laatste geval blijkt dat eiwitfusie zowel aminoterminaal (Schottel et al., 1984; Friefeld et al., 1985; Wong et al., 1985; Schaeffer et al., 1986; Pugh et al., 1987) als carboxyterminaal (Bennet et al., 1984; Dykes et al., 1988; Robben et al., submitted) mogelijk is zonder verlies van de Cat-activiteit, waardoor het hybride eiwit gezuiverd kan worden door middel van affiniteitschromatografie op chlooramfenicol-kolommen. Voor de carboxyterminale fusies werd hierbij gebruik gemaakt van de Scal-restrictieknipplaats (AGTACT) die voorkomt in het 31-coderende uiteinde van het natuurlijk cat-gen. De aldus verkregen fusie-eiwitten bevatten tenminste de eerste 210 van de 219 aminozuren van het Cat-eiwit, gevolgd door de residuen van de fusiepartner.

Gevonden is nu echter dat bij insertie van een stopcodon in de Scal-plaats de resulterende Cat-mutant die negen carboxyterminale residuen mist geen resistentie tegen chlooramphenicol (Cm) meer verleent. Pas wanneer voor het stopcodon een DNA-fragment met een willekeurige lengte wordt geïnsereerd wordt de activiteit van het Cat hersteld. Deze vinding vormt de basis voor de onderhavige uitvinding.

Het door de uitvinding voorgestelde positieve selectiesysteem gebaseerd op klonering in het 3'-uiteinde van een mutant cat-gen is het eerste waarbij een geïnactiveerd genproduct rechtstreeks wordt gemuteerd in een actieve vorm ten gevolge van de insertie van een willekeurige, te kloneren DNA-sequentie.

Het moleculaire mechanisme van inactivatie van het Cat-enzyme ingevolge deletie van negen carboxyterminale residuen is niet volledig opgehelderd. In de kristalstructuur van Cat type III dat met het door de uitvinders aangewende Cat type I enzymatisch-actieve hybride trimeren kan vormen (Shaw and Leslie, 1991), komt carboxyterminaal een α-helix voor die zich uitstrekt van Gly-200 tot Cys-214 (Leslie, 1990). Bij de inactieve Cat-103 mutant zijn hiervan de corresponderende twee laatste residuen gedeleteerd (fig. 1).· Aan de residuen stroomafwaarts van deze a5-helix, het laatste secundaire structuurelement van de molecuul, werd geen funktie toegeschreven in substraat-binding, katalyse of structuurstabilisatie (Leslie, 1990). Een intacte structuur van de a5-helix zou dus een mogelijke vereiste kunnen zijn voor de Cat-activiteit. Anderzijds worden bij klonering in de natuurlijk Scal-plaats van Cat de twee laatste residuen van de a5-helix gewijzigd zonder verlies van de Cat-activiteit (Bennet et al., 1984; Dykes et al., 1988; Robben et al., submitted).

Er wordt door de uitvinders een voorname rol van het Gln-211 aangenomen. Dit aminozuur is in de polypeptideketen van natuurlijk voorkomende Cat-varianten het laatste zeer sterk geconserveerde residu (tabel 5). Bovendien werd aangetoond dat Gln-211 via zijn zijketen-amidegroep een dubbele waterstofbrug vormt met de hoofdketen-amide van Asp-40, hetgeen een structuurstabiliserende funktie doet vermoeden (Leslie, 1990). Verondersteld wordt dat het (sub)terminaal plaatsen van Gln-211 door de deletie en de hieruit voortvloeiende verhoogde thermische energie van dit residu vorming van de dubbele waterstofbrug en/of a5-helix zou belemmeren, resulterend in een onjuiste eiwitvouwing en het waarnemen van de vorming van "inclusion bodies". Verlenging van de keten vanaf Gln-211 met een minimaal aantal, willekeurige aminozuren is voldoende om de funktie van het Gln-211 te herstellen.

De vector volgens de uitvinding kan vermeerderd worden in geschikte suppressor-gastheerstammen, welke als het ware over het gebruikte stopcodon heen lezen. Het selec-tiemerker-eiwit, zoals bijvoorbeeld chlooramfenicol ace-tyltransferase, wordt in een dergelijke gastheer tot expressie gebracht waardoor de cellen in staat zijn te overleven in een selecterend, bijvoorbeeld chlooramfenicol-bevattend, medium. In non-suppressorstammen wordt niet over het stop- codon heengelezen en wordt een kort en daardoor inactief se-lectiemerker-eiwit, zoals bijvoorbeeld Cat, tot expressie gebracht. Een insertie van een DNA-fragment in de unieke restrictieplaats vóór het stopcodon zal het selectiemerker-eiwit, zoals het Cat, voldoende verlengen om een actieve vorm daarvan te verkrijgen. In een selecterend, zoals chlooramfenicol-bevattend, medium zullen de cellen met een insert overleven. Niet gerecombineerde cellen zullen niet groeien omdat hun selectiemerker-eiwit, bijvoorbeeld Cat, inactief is.

Bij voorkeur wordt tenminste één ambercodon (TAG) -gebruikt. Meerdere ambercodons zijn echter eveneens mogelijk. Het is uiteraard eveneens mogelijk de andere stopco-dons alleen of in combinatie met elkaar te gebruiken.

De unieke restrictieplaats bevindt zich bij voorkeur onmiddellijk stroomopwaarts van het stopcodon. De unieke restrictieplaats is bijvoorbeeld een Psfcl-plaats, maar kan ook tenminste één andere restrictieplaats of een meervoudige kloneringsplaats zijn.

De onderhavige uitvinding zal verder worden verduidelijkt aan de hand van een aantal voorbeelden, waarbij Cat als selectiemerker gebruikt wordt. De voorbeelden hebben niet de bedoeling de omvang van de onderhavige uitvinding te beperken, maar worden slechts bij wijze van illustratie gegeven.

Tenzij anders vermeld werden alle DNA-manipulaties en -transformaties uitgevoerd volgens standaardprocedures, zoals beschreven in het laboratoriumhandboek van Sambrook et al., 1989. De gebruikte E. coli stammen waren de non-sup-pressorstammen WK6 (Zell and Fritz, 1987) en JM83 (Yanisch-Perron et al., 1985) en de amber-suppressorstammen LE392 (Sambrook et al., 1989) en BMH 71-18 (Yanish-Perron et al., 1985). De gebruikte plasmiden waren pJRtac99 (Robben et al., submitted), pUC9, pUC18 en pUC19 (Yanish-Perron et al., 1985).

Voor bepaling van de minimale inhiberende concentratie (MIC) van chlooramfenicol (Cm) werden WK6-cellen getransformeerd met de pUCAT-vectoren en onder ampicilline- selectie opgegroeid. Inocula van 4xl06 cellen in de exponentiële groeifase werden geënt in 4 ml LB-medium met verschillende Cm-concentraties en 0,1 mM IPTG. Tenzij anders vermeld werd de groei nagegaan na 16 uur incubatie bij 37°C in een schudtoestel.

Oligonucleotiden werden gesynthetiseerd met behulp van een 381A DNA Synthesizer (Applied Biosystems, Foster City, VS) volgens de β-cyanoëthylfosforoamidiet-methode met reagentia en oplosmiddelen van dezelfde firma.

Bereiding van plasmide-DNA voor bepaling van de effectiviteit van klonering gebeurde met behulp van een Qia-gen-tip-100 kolom (Diagen GmbH, Düsselforf, Duitsland) zoals beschreven in de handleiding van de leverancier. Zuivering van DNA-restrictiefragmenten uit agarosegel werd uitgevoerd met behulp van een GeneCleane-kit (Bio 101 Inc., La Jolla, VS) volgens de voorgeschreven procedure.

Voor de bereiding van genomisch DNA van Toxoplasma gondii werden 7,5xl07 tachyzoïeten gelyseerd gedurende 1 uur bij 50°C in 10 mM Tris.HCl pH 7,4, 10 mM EDTA, 160 mM NaCl, 0,5% SDS en 100 μg/ml proteinase K. Na fenol-chloroform extractie en ethanolprecipitatie wordt het DNA-pellet opgelost in water + 50 μg/ml RNase A (DNase vrij) en gedurende 1 uur geïncubeerd bij 37°C. Na een nieuwe fenol-chloroform extractie wordt het DNA opgelost in 20 μΐ water.

Polymerase-kettingreactie (PCR) werd uitgevoerd met Tag polymerase en dideoxynucleotiden van Boehringer-Mannheim (Mannheim, Duitsland) in een TRIO-Thermoblock (Biometra, Göttingen, Duitsland). DNA-sequentieanalyse gebeurde met een 371 Sequencing System van Applied Biosystems (Foster City, VS) op PCR-geamplifieerd materiaal volgens de methode van Verhasselt et al. (1992).

Cellen werden onderzocht op de aanwezigheid van "inclusion bodies" met fasecontrast-microscopie met behulp van een Nikon Alphaphot-2 YS2 microscoop (Nikon Corporation, Tokyo, Japan).

VOORBEELD 1

Ontdekking van een inactieve Cat mutant

Om de Cat-fusievector pJRtac99 (Robben et al., submitted) te kunnen gebruiken voor chemische DNA-sequentie-analyse volgens de methode van Volckaert (1985), werd een synthetische DNA-cassette met een reeks pseudopalindromische restrictieknipplaatsen geïnsereerd in de Seal-plaats, vlak voor de polylinker aan het 3’-uiteinde van het cat-gen (tabel 1). In de cassette was tevens een amber-stopcodon aanwezig om een translatiefusie tussen Cat en de stroomafwaarts gelegen sequentie met een gecontroleerde amber-sup-pressie naar keuze toe te laten of te verhinderen. Klonen met de cassette in beide oriëntaties werden geïsoleerd uit getransformeerde E. coli BMH 71-18, en respectievelijk pJRtaclOO en pJRtaclOl genoemd. In pJRtaclOl wordt een amber-codon gevormd door de junctie van het Scal-uiteinde (...AGT-3') en de twee eerste basen van de geïnverteerde cassette (5'-AGAC...), en bevindt zich drie tripletten meer stroomopwaarts dan in pJRtaclOO; het verkort daardoor het aangemaakte Cat-eiwit met negen in plaats van zes aminozuren. Transformatie van de non-suppressorstammen WK6 en JM83 met deze vectoren leverde onder Cm-selectie alleen levensvatbare transformanten met pJRtaclOO. In tegenstelling tot de verwachtingen ontwikkelden zich op Cm-platen na overnacht incubatie geen kolonies van pJRtaclOl-getransformeerde cellen. Transformanten van amber-suppressorstammen BMH 71-18 en LE392 met pJRtaclOO of pJRtaclOl waren wel resistent. Klaarblijkelijk is een Cat-eiwit met een carboxyluiteinde dat ingekort is met negen aminozuren niet meer aktief, terwijl vervanging van het natuurlijke carboxyluiteinde door een vreemde sequentie (gecodeerd door een synthetische linker of een heteroloog gen) geen verlies van de Cm-resis-tentie met zich meebrengt. Bovendien is in de amber-suppressorstammen met pJRtaclOl een beperkte doorlezing van het amber-stopcodon reeds voldoende voor het verlenen van Cm-resistentie.

VOORBEELD 2

Constructie van positieve-selectievectoren

Om deze bevindingen te kunnen gebruiken in een systeem van positieve selectie voor gekloonde DNA-fragmen-ten, werd in het cat-gen van vector pJRtac99 ter hoogte van Tyr-213 een amber-stopcodon aangebracht zoals in vector pJRtaclOl, alsook een unieke Pstl-plaats vóór het amber-codon voor klonering van doelwit-DNA. Deze Pstl-plaats kon gecreëerd worden zonder wijziging van de gecodeerde amino-zuursequentie. De mutaties werden uitgevoerd door uitwisseling in pJRtac99 van een BsmI-Pstl-fragment met een synthetische oligonucleotidecassette. Transformatie van het gemanipuleerde DNA naar een amber-suppressorstam leverde de gewenste vector, pJRtacl03 genaamd (fig. 1).

Uitgaande van deze vector werd een aantal varianten aangemaakt met alternatieve kloneringsplaatsen en/of een tweede in frame amber-stopcodon ter hoogte van Gln-212. Een eerste reeks mutanten werd aangemaakt met behulp van een inverse PCR op het Pstl-gelineariseerde plasmide-DNA met primers met vier gedegenereerde posities. Uit het resulterende klonenmengsel konden de gewenste variante vectoren worden geïsoleerd: pJRtaclOS met een Pstl-plaats en twee ambercodons, pJRtaclOö met een Sacl-plaats en één amberco-don, en pJRtacl07 met een Sacl-plaats en twee ambercodons (fig. 1).

Eveneens uitgaande van pJRtacl03 werd door een PstI-SaJI-cassettemutagenese een variant geconstrueerd met een PvuII-plaats voor klonering van blunt fragmenten (fig. 1).

De verkregen PvuII-plaats werd uniek gemaakt na verwijdering van de natuurlijke PvuII-plaats in het cat-gen. Dit bracht wel een wijziging met zich mee van Gln-212 naar een Leu-residu, maar leidde niet tot verlies van de Cm-resistentie in amber-suppressorstammen.

VOORBEELD 3

Karakterisering van de inactieve Cat-mutanten

Competente WK6-cellen (non-suppressor) getransformeerd met één van de hierboven vermelde vectoren met gewij- zigde cat-terminus groeiden niet op cm-agarplaten (25 jug/ml) geïncubeerd onder standaardcondities (37°C, overnacht). Na 24 uur bijkomende incubatie ontwikkelden zich slechts een uitzonderlijk klein aantal kolonies. Bij 30eC incubatie ontwikkelden zich na meer dan 24 uur daarentegen vrij talrijke kolonies op platen met pJRtacl03-getransformeerde cellen, echter weinig of geen op platen met WK6 getransformeerd met pJRtaclOö, pJRtacl06 of pJRtacl07. Dergelijke kolonies opgegroeid bij 30°C groeiden meestal eveneens bij 37°C op vloeibaar LB-medium met 25 μg Cm/ml. Dezelfde competente cellen getransformeerd met pJRtac99 als controle leverden onder identieke voorwaarden tot meer dan 2000 kolonies. Een vergelijkbaar groot aantal kolonies werd waargenomen bij transformatie van competente LE392 (supE, SupF) met één van de positieve selectievectoren, of met pJRtac99.

Aangezien in de pJRtac-vectoren het Cat de enige selectiemerker is, kunnen de positieve selectievectoren enkel in amber-suppressorstammen vermeerderd worden. Om toch de expressie en de specifieke activiteit van de niet-doorge-lezen Cat-eiwitmutanten te kunnen bestuderen, werd het cat-gen met de tac-promoter van pJRtacl03 (negen-aminozuren-deletie) en pJRtacl07 (tien-aminozuren-deletie) als een ffindlII-BgrlII-fragment overgebracht naar pUC9 in de HindlII-BamHI-plaatsen van de polylinker. De respectievelijke vectoren werden pUCAT103 en pUCAT107 genoemd. Op analoge wijze werden de vectoren pUCAT99 en pUCATI geconstrueerd, respectievelijk coderend voor de Cat-99 mutant (5/6 aminozuren substitutie) en het wildtype Cat.

SDS-PAGE-analyse van totale cellulaire eiwitten van WK6-cellen getransformeerd met deze vectoren en gegroeid onder selectie met ampicilline (Ap) en in aanwezigheid van de cat-inductor IPTG, toonde aan dat het Cat en zijn varianten kwantitatief veruit de belangrijkste celeiwitten vertegenwoordigden. Desondanks gaf bepaling van de minimale inhibitorische concentratie (MIC) van Cm voor deze cellen aan dat het Cat-107 in vivo volledig inactief was, en het Cat-103 slechts een zeer geringe activiteit vertoonde (tabel 2). Bij scheiding van de oplosbare en de niet-oplosbare cellulaire proteïnen en daaropvolgende SDS-PAGE-analyse werd het Cat-99 en het wildtype Cat voor minstens 90% in de oplosbare fractie teruggevonden. Cat-103 en Cat-107 kwamen daarentegen uitsluitend voor in de onoplosbare eiwitfractie. Fasecontrastmicroscopisch onderzoek toonde aan dat de onoplosbare Cat-varianten in de cel voorkwamen als grote, meestal subterminaal gelocaliseerde "inclusion bodies" (fig. 2). Of incubatie bij 30°C de cytoplasmatische oplosbaarheid van deze eiwitten beïnvloedde (Schein and Noteborn, 1988) kon niet met zekerheid worden vastgesteld. De afwezigheid van zichtbare "inclusion bodies" onder deze omstandigheden werd tenminste gedeeltelijk verklaard door de vastgestelde sterke daling van de Cat-productie bij 30°c. In vergelijking met incubatie bij 37°c (tabel 2) waren de Mic-waarden voor Cm bij 30°C wel hoger, en bedroegen + 25 μg Cm/ml voor WK6[-PÜCAT103] en + 5 fig Cm/ml voor WK6[pUCAT107], maar ook + 5 μg Cm/ml voor WK6[pUC18]. De Cm-resistentie van WK6[pUCAT-103] bij 30°C bereikt daarmee de Cm-concentraties routinematig gebruikt voor selectie van transformanten, hetgeen het opgroeien van kolonies van deze cellen bij langere incubatie kan verklaren.

VOORBEELD 4

Klonering van willekeurige fragmenten

Genomisch DNA van T. gondii werd gedigereerd met PstI, de fragmenten geligeerd in de PstI-plaats van pJR-tacl03, en klonen geselecteerd op Cm (25 μg/ml) door overnacht incubatie bij 37°C. Op analoge wijze werden MnlI-fragmenten gekloneerd in de PvuII-plaats van pJRtacl09. Na PCR-kloonanalyse werden een reeks klonen in sequentie gebracht. De resulterende DNA-sequenties en hun afgeleide aminozuursequenties toonden de carboxyterminale translatie-fusies aan tussen cat en de geïnsereerde Toxoplasma-sequen-ties. Tabel 3 illustreert de "random" substitutie van de carboxyterminus van Cat stroomafwaarts van het Gln-211, en dus de potentie van het positieve selectiesysteem voor het aanleggen van DNA-(expressie)banken.

Genoitiische Nsil-fragmenten leverden bij insertie in de Pstl-plaats van pJRtacl03 daarentegen geen enkele positieve kloon op. Ligatie van het Pstl-uiteinde van de vector met de compatibele NsiI-fragmenten wijzigt echter het Gln-211-triplet (CAG) in een His-triplet (CAT). Deze mutatie is klaarblijkelijk funest voor de Cat-activiteit.

VOORBEELD 5

Klonering van PCR-fragmenten PCR laat toe specifieke DNA-fragmenten te amplifi-ceren en deze bovendien aan de uiteinden te voorzien van extra sequenties zoals ondermeer unieke restrictieherken-ningssequenties. De methode leent zich dan ook bij uitstek tot de bereiding van DNA voor klonering in de positieve selectievectoren. Twee experimenten worden bij wijze van voorbeeld vermeld. In een eerste experiment werd een AT-rijk gebied in het DIOB-fragment van chromosoom III van Saccharo-myces cerevisiae, gekloneerd in pYIP5 (Defoor et al., in press) geamplificeerd met specifieke primers beide voorzien van een niet-complementair 5'-uiteinde met een Pstl-plaats. Bovendien werden zes bijkomende nucleotiden stroomafwaarts van de Pstl-plaats aangebracht die bij klonering in de Pstl-plaats van pJRtac 103 coderen voor een bijkomende Gln-212 en Tyr-213 aan Cat, voldoende voor herstel van de Cm-resisten-tie (fig. 3). Ligatie van het aldus verkregen PCR-product in deze vector leverde uitsluitend klonen met het specifieke DNA-fragment in één van de gewenste twee oriëntaties, hetgeen bidirectionele sequentieanalyse van de beide strengen toeliet.

In een tweede experiment werd het gen coderend voor het alkalische fosfatase (phoA) van E. coli JM83 (Shutt-leworth et al., 1986) rechtstreeks uit verse cellen geampli-ficeerd en gekloond als een Pstl-fragment in pJRtacl03. De primers waren daarbij zo ontworpen dat bij klonering van phoA-gen in de gewenste oriëntatie het amber-stopcodon met twee tripletten (coderend voor een Gly en een Asn) werd opgeschoven, voldoende voor herstel van de Cm-resistentie. Het TAG-codon werd onmiddellijk gevolgd door het ATG-start- codon van het phoA-qen. Met deze configuratie werd een translatie-reïnitiatie ter hoogte van het phoA-startcodon beoogd, waarvan een verhoogde efficiëntie werd betracht door het voorzien van een (theoretische) Shine-Dalgarno sequentie (Stormo et al., 1982) volgend op de Pstl-plaats (fig. 4). De reverse primer was zo ontworpen dat bij klonering van het PCR-produkt in de omgekeerde oriëntatie onmiddellijk na de Pstl-plaats in het cat-103-gen een ochre-stopcodon werd gecreëerd, met de vorming van een vroegtijdig getermineerd inactief Cat-eiwit als gevolg. Het phoA-qen werd op deze. wijze met succes gekloneerd en tot expressie gebracht in WK6-cellen. SDS-PAGE-analyse toonde een prominente eiwitband aan met het verwachte moleculaire gewicht overeenkomstig met dat van het PhoA. De efficiënte expressie en de enzymatische activiteit van het PhoA werden bevestigd door de intense blauwkleuring van de kolonies op platen met BCIP. De nieuwe vectorconstructie werd pCATP genoemd.

VOORBEELD 6

Effectiviteit van positieve selectie

De effectiviteit van de pJRtac-plasmiden als kloneringsvec-toren werd als volgt onderzocht. Als te kloneren DNA-"probe" werd geopteerd voor het hierboven vermelde phoA-gen omwille van de visuele detecteerbaarheid op BClP-platen van klonen met correct geïnsereerd phoA-gen. Om mogelijke fouten in de coderende sequentie te wijten aan de PCR-amplificatie (Barnes, 1992) en daaruit voortvloeiende inactiviteit van het phoA-expressieproduct te vermijden werd het gen als Pstl-fragment uit vector-DNA geïsoleerd. Aangezien in het beschikbare pCATP plasmide het phoA-gen ongeveer evenveel baseparen telde als de rest van de vector, en bijgevolgd scheiding en isolatie via agarosegel-electroforese moeilijk uitvoerbaar was, werd het phoA-gen eerst overgebracht naar de grotere pUCATIO3-vector. Daartoe werden pCATP en pUCAT103 samengevoegd, en na Pstl-digestie opnieuw geligeerd. Het gewenste construct, püCATP genoemd, werd verkregen na selectie op Cm, Ap en BCIP. Pstl-gedigesteerd, Qiagen-gezuiverd DNA van pUCATP gaf na agarosegel-electroforese twee banden (1437 bp en 3422 bp) waarvan de kleinste met het phoA-gen werd uitgesneden en het DNA gezuiverd met een GeneClean*-kit. Dit fragment werd uiteindelijk in verschillende molaire verhoudingen geligeerd met Pstl-geknipte pJRtacl03 of pJR-tacl05 voor het testen van de effectiviteit van de positieve selectie. WK6-cellen getransformeerd met ligatiemegnsel werden uitgeplaat op agarplaten met 25 μg Cm/ml en 40 jug BCIP/ml. Kolonies werden onderzocht na incubatie bij 37°C gedurende 16 uur. Het resultaat van twee dergelijke experimenten is samengevat in Tabel 4. Meer dan 99,5% van de kolonies vertoonden een duidelijke blauwe kleur, wijzend op correcte klonering van het phoA-qen, zowel in pJRtacl03 als in pJRtacl05. Het aantal witte kolonies was miniem. Vier van de vijf verder onderzochte witte pJRtacl03-klonen en alle vier onderzochte witte pJRtacl05-klonen bleken eenzelfde onbekend DNA-fragment te hebben geïncorporeerd met dezelfde lengte als het phoA-gen, maar met een totaal verschillend restrictiepatroon. Vermoedelijk werd dit fragment uit de gel meegezuiverd met het phoA-bevattende DNA-fragment. Slechts één van de pJRtacl03-klonen bevatte geen (zichtbare) DNA-insertie. Geen van de onderzochte klonen bevatte het phoA-gen in de omgekeerde oriëntatie. Het dient bijgevolg opgemerkt te worden dat, rekening houdend met de gelijke kans op ligatie van het phoA-gen in de beide oriëntaties, de reële efficiëntie van de positieve selectie nog tweemaal hoger ligt dan de hier bekomen waarde. De vijf onderzochte kolonies die zich ontwikkelden op de controleplaten bevatten allen een "lege" vector. SDS-PAGE-analyse van de cellulaire eiwitten en DNA-sequentieanalyse van deze en andere negatieve klonen uit verschillende experimenten toonden het voorkomen aan van chromosomale amber-suppressormutaties bij de gasheercel, mutaties in het cat-gen van het amber-stopcodon in een aminozuur-coderend triplet, en carboxyterminale leesraamverschuivingingen door insertie of deletie van één enkel basepaar tussen het Gln-211-codon en het amber-codon. Deze mutaties verklaarden een belangrijk gedeelte van de achtergrond van niet-recombinante klonen.

REFERENTIES

Bannan et al (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:471-476 Barnes, (1992) Gene 17:29-32

Bennet et al., (1984) Engelse octrooiaanvrage 2140810A

Bolivar et al., (1977) Gene 2:95-113

Brenner et al. (1985) EMBO J. 4:561-568

Brückner et al. (1984) Gene 32:151-160

Charles et al. (1985) J. Bacteriol. 164:123-129

Defoor et al., (in druk)

Dykes et al., (1988) Eur. J. Biochem. 174:411-416 Friefeld et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:2652-656

Harwood et al. (1983) Gene 24 : 163-169 Horinouchi et al. (1982) J. Bacteriol. 150:815-825 Leslie, (1990) J. Mol. Biol. 213:167-186 Murray et al. (1988) Biochem. J. 252:173-179 Murray et al. (1990) Biochem. J. 272:505-510 Murray et al. (1989) Gene 85:283-291 Novick (1976) J. Bacteriol. 127:1177-1187 Pugh et al. (1987) J. Virol. 61:1384-1390 Robben et al. (submitted)

Sambrook et al. (1989) Molecular cloning : a laboratory manual; Cold Spring Harbor NY, USA Schaeffer et al. (1986) J. Virol. 57:173-182 Schein et al. (1988) Bio/Technology 6:291-294 Schottel et al. (1984) Gene 28:177-193 Schumann (1979) Mol. Gen. Genet. 174:221-224\

Schwarz et al. (1991a) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1277-1283

Schwarz et al. (1991b) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1551-1556

Schwarz et al. (1991) J. Gen. Microbiol. 137:977-981 Schwarz et al. (1992) J. Gen. Microbiol. 138:275-281 Shaw et al. (1991) Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 20:363-386

Shaw et al. (1979) Nature 282:870-872

Shuttleworth et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:8689 Steffen et al. (1989) Gene 75:349-354 Stormo et al. (1982) Nucl. Acids Res. 10:2971-2995 Verhasselt et al. (submitted)

Wong et al. (1985) J. Virol. 55:223-231 Wren et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17:4877 Yanish-Perron et al. (1985) Gene 33:103-119 Zeil et al. (1987) EMBO J. 6:1809-1815

Tabel 1. Carboxyterminale aminozuurséquenties van natuurlijk voorkomende Cat-varianten.

De sequenties zijn uitgelijnd ten opzichte van het catalytische His-195 (H). De nummering van de aminozuren is volgens Murray et al., 1988. <~oc5~>: positie van de c^-helix van het Catm-isoenzyme (Leslie, 1990).

De vectoren pJRtadOO en pJRtac101 werden bekomen na kloning in beide oriëntaties van een oligonudeotidecassette in de Scal-plaats van pJRtac99. Deze ‘sequencing linker bevat voor de vector unieke, asymmetrische herkenningssequenties voor Bsu36l, Ss/EII, EcoNI en Tttr\ 111.

Tabel 3. Minimale inhibitorische concentratie (MIC) van chlooramfenicol voor getransformeerde E. coli WK6 cellen in vloeibaar LB-medium bij 37°C incubatietemperatuur.

* Waarden in pg/ml. Q: Gln-211

Tabel 4.Carboxyterminale translatiefusies met Cat gegenereerd bij kloning van genomisch DNA-fragmenten van Toxoplasma gondii in de positieve selectievectoren pJRtacl03 en pJRtacl09.

A »Jf£iöVKLLVEKHGS...

... WEI.QHLNYTSETKR...

... N E L Q L L S C* ... NELQLCLPAEPDLP...

... WELQSLTEPREESR...

... N E L Q TTLSTTLRLS...

... N E L Q LALRDRSLRE...

... N E L Q F Y C L* B ... NELQFLIHHTLAFA* ... NELQICLQRFSKAR...

... JiELOGSFGKVIlAE.

... WELQGACWAASSIK...

... N E L 0 C R C G F L I* ... NELQGCVDSNYVFF..._

Genomisch DNA van T. gondii werd gedigereerd (A) met Pstl en geligeerd in de Pstl-plaats van pJRtacl03, of (B) met MnH en geligeerd in de PvwII-plaats van pJRtacl09. De laatste Cat-aminozuren zijn weergegeven in cursief. Van de Toxoplasma-gecodeerde residu's zijn alleen de eerste tien voorgesteld. *: terminaal residu.

Tabel 5.Selectie voor gekloondphoA-gen met behulp van pJRtacKB en pJRtac!05.

Claims (14)

1. Vector voor positieve selectie van recombinanten,, omvattende een gemuteerd gen, dat voorzien is van tenminste één unieke restrictieplaats en codeert voor een inactieve vorm van een selectiemerker-eiwit, en welk gen na insertie van een te kloneren DNA-fragment in de unieke restrictieplaats codeert voor een actieve vorm van het selectiemerker-eiwit.

2. Selectievector volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het gemuteerde gen een cat-gen is nabij het 3'-uiteinde waarvan tenminste één stopcodon is opgenomen.

3. Selectievector volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het stopcodon zich ten hoogste 211 codons vanaf het 5' coderende uiteinde van het gen bevindt.

4. Selectievector volgens conclusie 2 of 3, met het kenmerk, dat het stopcodon een ambercodon (TAG) is.

5. Selectievector volgens één der conclusies 2-4, met het kenmerk, dat de unieke restrictieplaats zich onmid-delijk stroomopwaarts van het stopcodon bevindt.

6. Selectievector volgens een der conclusies 1-5, met het kenmerk, dat de unieke restrictieplaats een Pstl plaats is.

7. Werkwijze voor het selecteren van recombinante gastheercellen, omvattende de stappen : a) het lineariseren van een recombinante vector, welke een gemuteerd gen omvat, dat voorzien is van tenminste één unieke restrictieplaats en codeert voor een inactieve vorm van een selectiemerker-eiwit, en welk gen na insertie van een willekeurig te kloneren DNA-fragment in de unieke restrictieplaats codeert voor een actieve vorm van het selectiemerker-eiwit, met een endonuclease dat knipt in de unieke restrictieplaats van de vector; b) het ligeren van een gewenst DNA-fragment in de gelineariseerde vector ter verkrijging van een ligatiemeng-sel; σ) het transformeren van een geschikte gastheer met het ligatiemengsel; d) het kweken van de gastheer onder zodanige omstandigheden dat slechts een recombinante gastheer het door insertie geactiveerde selectiemerkergen tot expressie brengt en kolonies, resp. plaques vormt; en e) het analyseren van de recombinante kolonies, resp. plaques.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat de gastheer Escherichia coli is.

9. werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat de gastheer een Escherichia coli-stam is welke niet in staat is tot suppressie van een nonsense mutatie.

10. Werkwijze volgens één der conclusies 7-9, met het kenmerk, dat het selectiemerkergen het cat-gen is nabij het 3'-uiteinde waarvan tenminste één stopcodon is opgenomen.

11. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat het stopcodon een ambercodon (TAG) is.

12·. Werkwijze volgens één der conclusies 7-11, met het kenmerk, dat de unieke restrictieplaats zich onmiddelijk stroomopwaarts van het stopcodon bevindt.

13. Werkwijze volgens één der conclusies 7-12, met het kenmerk, dat de unieke restrictieplaats een PstI plaats is.

14. Werkwijze volgens één der conclusies 8-13, met het kenmerk, dat de gastheer gekweekt wordt in een medium dat chlooramfenicol bevat.