NL9201173A

NL9201173A - Vector for positive selection of recombinants

Info

Publication number: NL9201173A
Application number: NL9201173A
Authority: NL
Original assignee: Leuven K U Res & Dev
Priority date: 1992-07-01
Filing date: 1992-07-01
Publication date: 1994-02-01

Abstract

The invention relates to a vector for positive selection of recombinants, comprising a mutant gene which is provided with at least one unique restriction site and codes for an inactive form of a selection marker protein, and which gene, after insertion of a DNA fragment to be cloned into the unique restriction site, codes for an active form of the selection marker protein. The mutant gene is preferably a cat gene near the 3' end of which at least one stop codon is incorporated. The unique restriction site is located immediately upstream of the stop codon. The invention also relates to a method for selecting recombinant host cells.

Description

VECTOR VOOR POSITIEVE SELECTIE VAM RECOMBINANTENVECTOR FOR POSITIVE SELECTION OF RECOMBINANTS

De onderhavige uitvinding betreft een vector voor positieve selectie van recombinante gastheercellen, welke getransformeerd zijn met recombinante vectoren. De uitvinding betreft verder een werkwijze voor de positieve selectie van recombinante gastheercellen met gekloneerde DNA-frag-menten onder toepassing van een vector volgens de uitvinding.The present invention relates to a vector for positive selection of recombinant host cells transformed with recombinant vectors. The invention further relates to a method for the positive selection of recombinant host cells with cloned DNA fragments using a vector according to the invention.

Klonering van DNA-fragmenten vereist de identificatie van klonen met recombinante plasmiden in een achtergrond van niet-recombinante klonen. Er zijn tal van selec-tiesystemen beschikbaar, gebaseerd op insertie van het vreemde DNA in een merkergen dat als gevolg van inactivatie aanleiding geeft tot de expressie van een waarneembaar, gewijzigd fenotype. De eerst ontwikkelde en nog steeds toegepaste selectiesystemen zijn gebaseerd op insertie-inactivatie van een antibioticumresistentiegen (Bolivar, 1979) . Recombinanten worden aangetoond door hun onvermogen om te groeien op een voedingsbodem die het desbetreffende antibioticum bevat. Dit is een negatief selectiecriterium. Een tweede selectiemerker is in dit geval nodig om transformanten van niet-transformanten te onderscheiden.Cloning of DNA fragments requires the identification of clones with recombinant plasmids in a background of non-recombinant clones. Numerous selection systems are available based on insertion of the foreign DNA into a marker gene which, due to inactivation, gives rise to the expression of an observable altered phenotype. The first developed and still used selection systems are based on insertion inactivation of an antibiotic resistance gene (Bolivar, 1979). Recombinants are demonstrated by their inability to grow on a nutrient medium containing the appropriate antibiotic. This is a negative selection criterion. A second selection marker is needed in this case to distinguish transformants from non-transformants.

Eenvoudiger is identificatie op basis van een niet-essentiële fenotypische merker. Zeer frequent gebruikt zijn systemen waarbij ingevolge insertie-inactivatie van het lacZ-gen (of een functioneel deel ervan) geen B-galactosida-se-activiteit meer geproduceerd wordt (Yanish-Perron et al., 1985). In aanwezigheid van het chromogene substraat X-Gal kleuren niet-recombinanten blauw, terwijl recombinanten wit blijven. De efficiëntie van klonering kan in dergelijke systemen worden verbeterd door defosforylatie van de geknipte vector, waardoor de achtergrond van teruggeligeerde plasmiden belangrijk wordt gereduceerd. Klonering wordt echter aanzienlijk vergemakkelijkt door gebruik te maken van een positief selectiesysteem dat uitsluitend de recombinante klonen toelaat te groeien en geen achtergrond van niet-recombinanten geeft.Simpler identification is based on a non-essential phenotypic marker. Very frequently used are systems in which B-galactosidase activity is no longer produced due to insert inactivation of the lacZ gene (or a functional part thereof) (Yanish-Perron et al., 1985). In the presence of the chromogenic substrate X-Gal, non-recombinants stain blue, while recombinants remain white. Cloning efficiency can be improved in such systems by dephosphorylation of the digested vector, thereby significantly reducing the background of back-ligated plasmids. Cloning, however, is greatly facilitated by using a positive selection system that allows only the recombinant clones to grow and does not provide a background of non-recombinants.

Een voorbeeld van dergelijke positieve selectie wordt gevonden bij insertie-inactivatie van een conditioneel lethaal gen. Bij een dergelijk selectiesysteem zullen onder selectieve condities alleen recombinanten overleven (Schumann, 1979). Bij de vector pTR262 bijvoorbeeld inactiveert insertie van een DNA-fragment de repressor van een tetracy-cline-resistentiegen, waardoor recombinanten resistentie verwerven tegen tetracycline (Roberts et al., 1980). In . dergelijke kloneringssystemen is defosforylatie van het vec-tor-DNA dan ook minder cruciaal.An example of such positive selection is found upon insertion inactivation of a conditional lethal gene. In such a selection system, only selective recombinants will survive under selective conditions (Schumann, 1979). For example, in the vector pTR262, insertion of a DNA fragment inactivates the repressor of a tetracycline resistance gene, whereby recombinants acquire resistance to tetracycline (Roberts et al., 1980). In . such cloning systems, therefore, dephosphorylation of the vector DNA is less crucial.

De onderhavige uitvinding verschaft een vector, waarmee een nieuw type selectie bereikt kan worden, waarbij op effectieve wijze positief geselecteerd kan worden op gastheercellen, welke getransformeerd zijn met recombinante vectoren. De vector volgens de uitvinding omvat een gemuteerd gen, dat voorzien is van een unieke restrictieplaats en codeert voor een inactieve vorm van een selectiemerker-eiwit en na insertie van een DNA-fragment in de unieke restrictieplaats daarvan codeert voor een actieve vorm van de selectiemerker-eiwit. Bij de gebruikelijke selectiesystemen verstoort de DNA-insertie het leesraam en dus de aanmaak van een aktief eiwit. Bij de vector volgens de uitvinding wordt de activiteit van de selectiemerker juist hersteld.The present invention provides a vector capable of achieving a new type of selection, effectively selecting positively for host cells transformed with recombinant vectors. The vector of the invention comprises a mutated gene, which is provided with a unique restriction site and encodes an inactive form of a selection marker protein and encodes an active form of the selection marker after insertion of a DNA fragment into its unique restriction site. protein. In the usual selection systems, the DNA insertion disturbs the reading frame and thus the production of an active protein. In the vector of the invention, the activity of the selection marker is just restored.

Het voordeel van het systeem volgens de uitvinding is dat slechts één selectiemerker nodig is en dat de recombinante gastheercellen overleven. Dit in tegenstelling tot systemen welke gebruik maken van selectiemerkers, die door insertie van een DNA-fragment geïnactiveerd worden en hun vermogen te overleven in selecterend medium verliezen.The advantage of the system according to the invention is that only one selection marker is required and that the recombinant host cells survive. This is in contrast to systems using selection markers which are inactivated by insertion of a DNA fragment and lose their ability to survive in selection medium.

Gevonden is dat met het systeem volgens de uitvinding selectie-efficiënties van tenminste 99,8% bereikt kunnen worden.It has been found that with the system according to the invention selection efficiencies of at least 99.8% can be achieved.

In een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding is het selectiegen het chlooramfenicol acetyltransferase (cat)-gen, waarin nabij het 3'-uiteinde daarvan een stopcodon is opgenomen.In a preferred embodiment of the invention, the selection gene is the chloramphenicol acetyl transferase (cat) gene, which includes a stop codon near its 3 'end.

Het gen van het chlooramfenicol acetyltransferase (Cat) isoenzyme I wordt zeer frequent gebruikt in de recom-binant-DNA-technologie. Het fungeert in de meeste gevallen als chlooramfenicol-resistentiemerker in kloneringsvectoren of als merkerenzym voor studies van genexpressie. Daarnaast is Cat ook gebruikt als dragereiwit voor de productie van fusie-eiwitten in E. coli. In dit laatste geval blijkt dat eiwitfusie zowel aminoterminaal (Schottel et al., 1984; Friefeld et al., 1985; Wong et al., 1985; Schaeffer et al., 1986; Pugh et al., 1987) als carboxyterminaal (Bennet et al., 1984; Dykes et al., 1988; Robben et al., submitted) mogelijk is zonder verlies van de Cat-activiteit, waardoor het hybride eiwit gezuiverd kan worden door middel van affiniteitschromatografie op chlooramfenicol-kolommen. Voor de carboxyterminale fusies werd hierbij gebruik gemaakt van de Scal-restrictieknipplaats (AGTACT) die voorkomt in het 31-coderende uiteinde van het natuurlijk cat-gen. De aldus verkregen fusie-eiwitten bevatten tenminste de eerste 210 van de 219 aminozuren van het Cat-eiwit, gevolgd door de residuen van de fusiepartner.The gene of the chloramphenicol acetyltransferase (Cat) isoenzyme I is used very frequently in recombinant DNA technology. In most cases it acts as a chloramphenicol resistance marker in cloning vectors or as a marker enzyme for gene expression studies. In addition, Cat has also been used as a carrier protein for the production of fusion proteins in E. coli. In the latter case, it appears that protein fusion is both amino terminal (Schottel et al., 1984; Friefeld et al., 1985; Wong et al., 1985; Schaeffer et al., 1986; Pugh et al., 1987) and carboxy terminal (Bennet et al., 1984; Dykes et al., 1988; Robben et al., submitted) is possible without loss of Cat activity, allowing the hybrid protein to be purified by affinity chromatography on chloramphenicol columns. For the carboxy terminal fusions, use was made of the Scal restriction cut site (AGTACT) which occurs in the 31-coding end of the natural cat gene. The fusion proteins thus obtained contain at least the first 210 of the 219 amino acids of the Cat protein, followed by the fusion partner residues.

Gevonden is nu echter dat bij insertie van een stopcodon in de Scal-plaats de resulterende Cat-mutant die negen carboxyterminale residuen mist geen resistentie tegen chlooramphenicol (Cm) meer verleent. Pas wanneer voor het stopcodon een DNA-fragment met een willekeurige lengte wordt geïnsereerd wordt de activiteit van het Cat hersteld. Deze vinding vormt de basis voor de onderhavige uitvinding.However, it has now been found that upon insertion of a stop codon into the Scal site, the resulting Cat mutant lacking nine carboxy terminal residues no longer confers resistance to chloramphenicol (Cm). The activity of the Cat is only restored when a DNA fragment of any length is inserted for the stop codon. This finding forms the basis for the present invention.

Het door de uitvinding voorgestelde positieve selectiesysteem gebaseerd op klonering in het 3'-uiteinde van een mutant cat-gen is het eerste waarbij een geïnactiveerd genproduct rechtstreeks wordt gemuteerd in een actieve vorm ten gevolge van de insertie van een willekeurige, te kloneren DNA-sequentie.The positive selection system proposed by the invention based on cloning into the 3 'end of a mutant cat gene is the first in which an inactivated gene product is mutated directly into an active form as a result of the insertion of a random DNA sequence to be cloned .

Het moleculaire mechanisme van inactivatie van het Cat-enzyme ingevolge deletie van negen carboxyterminale residuen is niet volledig opgehelderd. In de kristalstructuur van Cat type III dat met het door de uitvinders aangewende Cat type I enzymatisch-actieve hybride trimeren kan vormen (Shaw and Leslie, 1991), komt carboxyterminaal een α-helix voor die zich uitstrekt van Gly-200 tot Cys-214 (Leslie, 1990). Bij de inactieve Cat-103 mutant zijn hiervan de corresponderende twee laatste residuen gedeleteerd (fig. 1).· Aan de residuen stroomafwaarts van deze a5-helix, het laatste secundaire structuurelement van de molecuul, werd geen funktie toegeschreven in substraat-binding, katalyse of structuurstabilisatie (Leslie, 1990). Een intacte structuur van de a5-helix zou dus een mogelijke vereiste kunnen zijn voor de Cat-activiteit. Anderzijds worden bij klonering in de natuurlijk Scal-plaats van Cat de twee laatste residuen van de a5-helix gewijzigd zonder verlies van de Cat-activiteit (Bennet et al., 1984; Dykes et al., 1988; Robben et al., submitted).The molecular mechanism of inactivation of the Cat enzyme due to deletion of nine carboxy terminal residues has not been fully elucidated. In the crystal structure of Cat type III that can form enzymatically active hybrid trimers with the Cat type I employed by the inventors (Shaw and Leslie, 1991), carboxy terminal contains an α helix ranging from Gly-200 to Cys-214 (Leslie, 1990). In the inactive Cat-103 mutant, the corresponding two last residues of these have been deleted (fig. 1) · The residues downstream of this a5-helix, the last secondary structural element of the molecule, have no function in substrate binding, catalysis or structure stabilization (Leslie, 1990). Thus, an intact structure of the a5 helix could be a possible requirement for the Cat activity. On the other hand, when cloned into the natural Scal site of Cat, the last two residues of the α5 helix are altered without loss of Cat activity (Bennet et al., 1984; Dykes et al., 1988; Robben et al., Submitted ).

Er wordt door de uitvinders een voorname rol van het Gln-211 aangenomen. Dit aminozuur is in de polypeptideketen van natuurlijk voorkomende Cat-varianten het laatste zeer sterk geconserveerde residu (tabel 5). Bovendien werd aangetoond dat Gln-211 via zijn zijketen-amidegroep een dubbele waterstofbrug vormt met de hoofdketen-amide van Asp-40, hetgeen een structuurstabiliserende funktie doet vermoeden (Leslie, 1990). Verondersteld wordt dat het (sub)terminaal plaatsen van Gln-211 door de deletie en de hieruit voortvloeiende verhoogde thermische energie van dit residu vorming van de dubbele waterstofbrug en/of a5-helix zou belemmeren, resulterend in een onjuiste eiwitvouwing en het waarnemen van de vorming van "inclusion bodies". Verlenging van de keten vanaf Gln-211 met een minimaal aantal, willekeurige aminozuren is voldoende om de funktie van het Gln-211 te herstellen.The inventors assume a major role of the Gln-211. This amino acid is the last highly conserved residue in the polypeptide chain of naturally occurring Cat variants (Table 5). In addition, Gln-211 has been shown to form a double hydrogen bond with the main chain amide of Asp-40 through its side chain amide group, suggesting a structure stabilizing function (Leslie, 1990). It is believed that the (sub) terminal placement of Gln-211 by the deletion and the resulting increased thermal energy of this residue would hinder formation of the double hydrogen bond and / or α5 helix, resulting in incorrect protein folding and observation of the formation of "inclusion bodies". Extension of the chain from Gln-211 with a minimal number of random amino acids is sufficient to restore the function of the Gln-211.

De vector volgens de uitvinding kan vermeerderd worden in geschikte suppressor-gastheerstammen, welke als het ware over het gebruikte stopcodon heen lezen. Het selec-tiemerker-eiwit, zoals bijvoorbeeld chlooramfenicol ace-tyltransferase, wordt in een dergelijke gastheer tot expressie gebracht waardoor de cellen in staat zijn te overleven in een selecterend, bijvoorbeeld chlooramfenicol-bevattend, medium. In non-suppressorstammen wordt niet over het stop- codon heengelezen en wordt een kort en daardoor inactief se-lectiemerker-eiwit, zoals bijvoorbeeld Cat, tot expressie gebracht. Een insertie van een DNA-fragment in de unieke restrictieplaats vóór het stopcodon zal het selectiemerker-eiwit, zoals het Cat, voldoende verlengen om een actieve vorm daarvan te verkrijgen. In een selecterend, zoals chlooramfenicol-bevattend, medium zullen de cellen met een insert overleven. Niet gerecombineerde cellen zullen niet groeien omdat hun selectiemerker-eiwit, bijvoorbeeld Cat, inactief is.The vector of the invention can be propagated in suitable suppressor host strains, which read, as it were, over the stop codon used. The selection marker protein, such as, for example, chloramphenicol acetyl transferase, is expressed in such a host allowing the cells to survive in a selective medium containing, for example, chloramphenicol. In non-suppressor strains, the stop codon is not read over and a short and thereby inactive selection marker protein, such as, for example, Cat, is expressed. An insertion of a DNA fragment into the unique restriction site before the stop codon will elongate the selection marker protein, such as the Cat, sufficiently to obtain an active form thereof. In a selective medium, such as chloramphenicol-containing medium, the cells will survive with an insert. Uncombined cells will not grow because their selection marker protein, e.g., Cat, is inactive.

Bij voorkeur wordt tenminste één ambercodon (TAG) -gebruikt. Meerdere ambercodons zijn echter eveneens mogelijk. Het is uiteraard eveneens mogelijk de andere stopco-dons alleen of in combinatie met elkaar te gebruiken.Preferably at least one amber codon (TAG) is used. However, multiple amber codons are also possible. It is of course also possible to use the other stop-downs alone or in combination.

De unieke restrictieplaats bevindt zich bij voorkeur onmiddellijk stroomopwaarts van het stopcodon. De unieke restrictieplaats is bijvoorbeeld een Psfcl-plaats, maar kan ook tenminste één andere restrictieplaats of een meervoudige kloneringsplaats zijn.Preferably, the unique restriction site is immediately upstream of the stop codon. The unique restriction site is, for example, a Psfcl site, but it can also be at least one other restriction site or a multiple cloning site.

De onderhavige uitvinding zal verder worden verduidelijkt aan de hand van een aantal voorbeelden, waarbij Cat als selectiemerker gebruikt wordt. De voorbeelden hebben niet de bedoeling de omvang van de onderhavige uitvinding te beperken, maar worden slechts bij wijze van illustratie gegeven.The present invention will be further elucidated on the basis of a number of examples, wherein Cat is used as a selection marker. The examples are not intended to limit the scope of the present invention, but are given by way of illustration only.

Tenzij anders vermeld werden alle DNA-manipulaties en -transformaties uitgevoerd volgens standaardprocedures, zoals beschreven in het laboratoriumhandboek van Sambrook et al., 1989. De gebruikte E. coli stammen waren de non-sup-pressorstammen WK6 (Zell and Fritz, 1987) en JM83 (Yanisch-Perron et al., 1985) en de amber-suppressorstammen LE392 (Sambrook et al., 1989) en BMH 71-18 (Yanish-Perron et al., 1985). De gebruikte plasmiden waren pJRtac99 (Robben et al., submitted), pUC9, pUC18 en pUC19 (Yanish-Perron et al., 1985).Unless otherwise noted, all DNA manipulations and transformations were performed according to standard procedures, as described in the laboratory manual of Sambrook et al., 1989. The E. coli strains used were the non-superpressor strains WK6 (Zell and Fritz, 1987) and JM83 (Yanisch-Perron et al., 1985) and the amber suppressor strains LE392 (Sambrook et al., 1989) and BMH 71-18 (Yanish-Perron et al., 1985). The plasmids used were pJRtac99 (Robben et al., Submitted), pUC9, pUC18 and pUC19 (Yanish-Perron et al., 1985).

Voor bepaling van de minimale inhiberende concentratie (MIC) van chlooramfenicol (Cm) werden WK6-cellen getransformeerd met de pUCAT-vectoren en onder ampicilline- selectie opgegroeid. Inocula van 4xl06 cellen in de exponentiële groeifase werden geënt in 4 ml LB-medium met verschillende Cm-concentraties en 0,1 mM IPTG. Tenzij anders vermeld werd de groei nagegaan na 16 uur incubatie bij 37°C in een schudtoestel.To determine the minimum inhibitory concentration (MIC) of chloramphenicol (Cm), WK6 cells were transformed with the pUCAT vectors and grown under ampicillin selection. Inocula from 4x106 cells in the exponential growth phase were seeded in 4 ml LB medium with different Cm concentrations and 0.1 mM IPTG. Unless otherwise stated, growth was monitored after 16 hours incubation at 37 ° C in a shaker.

Oligonucleotiden werden gesynthetiseerd met behulp van een 381A DNA Synthesizer (Applied Biosystems, Foster City, VS) volgens de β-cyanoëthylfosforoamidiet-methode met reagentia en oplosmiddelen van dezelfde firma.Oligonucleotides were synthesized using a 381A DNA Synthesizer (Applied Biosystems, Foster City, USA) by the β-cyanoethylphosphoroamidite method using reagents and solvents from the same company.

Bereiding van plasmide-DNA voor bepaling van de effectiviteit van klonering gebeurde met behulp van een Qia-gen-tip-100 kolom (Diagen GmbH, Düsselforf, Duitsland) zoals beschreven in de handleiding van de leverancier. Zuivering van DNA-restrictiefragmenten uit agarosegel werd uitgevoerd met behulp van een GeneCleane-kit (Bio 101 Inc., La Jolla, VS) volgens de voorgeschreven procedure.Plasmid DNA preparation for cloning effectiveness was done using a Qia gene tip-100 column (Diagen GmbH, Düsselforf, Germany) as described in the manufacturer's manual. Purification of DNA restriction fragments from agarose gel was performed using a GeneCleane kit (Bio 101 Inc., La Jolla, USA) according to the prescribed procedure.

Voor de bereiding van genomisch DNA van Toxoplasma gondii werden 7,5xl07 tachyzoïeten gelyseerd gedurende 1 uur bij 50°C in 10 mM Tris.HCl pH 7,4, 10 mM EDTA, 160 mM NaCl, 0,5% SDS en 100 μg/ml proteinase K. Na fenol-chloroform extractie en ethanolprecipitatie wordt het DNA-pellet opgelost in water + 50 μg/ml RNase A (DNase vrij) en gedurende 1 uur geïncubeerd bij 37°C. Na een nieuwe fenol-chloroform extractie wordt het DNA opgelost in 20 μΐ water.For the preparation of Toxoplasma gondii genomic DNA, 7.5x107 tachyzoites were lysed for 1 hour at 50 ° C in 10 mM Tris.HCl pH 7.4, 10 mM EDTA, 160 mM NaCl, 0.5% SDS / 100 μg / ml proteinase K. After phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation, the DNA pellet is dissolved in water + 50 μg / ml RNase A (DNase free) and incubated at 37 ° C for 1 hour. After a new phenol-chloroform extraction, the DNA is dissolved in 20 μΐ water.

Polymerase-kettingreactie (PCR) werd uitgevoerd met Tag polymerase en dideoxynucleotiden van Boehringer-Mannheim (Mannheim, Duitsland) in een TRIO-Thermoblock (Biometra, Göttingen, Duitsland). DNA-sequentieanalyse gebeurde met een 371 Sequencing System van Applied Biosystems (Foster City, VS) op PCR-geamplifieerd materiaal volgens de methode van Verhasselt et al. (1992).Polymerase chain reaction (PCR) was performed with Tag polymerase and dideoxynucleotides from Boehringer-Mannheim (Mannheim, Germany) in a TRIO Thermoblock (Biometra, Göttingen, Germany). DNA sequencing was done with a 371 Sequencing System from Applied Biosystems (Foster City, USA) on PCR amplified material according to the method of Verhasselt et al. (1992).

Cellen werden onderzocht op de aanwezigheid van "inclusion bodies" met fasecontrast-microscopie met behulp van een Nikon Alphaphot-2 YS2 microscoop (Nikon Corporation, Tokyo, Japan).Cells were examined for the presence of inclusion bodies by phase contrast microscopy using a Nikon Alphaphot-2 YS2 microscope (Nikon Corporation, Tokyo, Japan).

VOORBEELD 1EXAMPLE 1

Ontdekking van een inactieve Cat mutantDiscovery of an inactive Cat mutant

Om de Cat-fusievector pJRtac99 (Robben et al., submitted) te kunnen gebruiken voor chemische DNA-sequentie-analyse volgens de methode van Volckaert (1985), werd een synthetische DNA-cassette met een reeks pseudopalindromische restrictieknipplaatsen geïnsereerd in de Seal-plaats, vlak voor de polylinker aan het 3’-uiteinde van het cat-gen (tabel 1). In de cassette was tevens een amber-stopcodon aanwezig om een translatiefusie tussen Cat en de stroomafwaarts gelegen sequentie met een gecontroleerde amber-sup-pressie naar keuze toe te laten of te verhinderen. Klonen met de cassette in beide oriëntaties werden geïsoleerd uit getransformeerde E. coli BMH 71-18, en respectievelijk pJRtaclOO en pJRtaclOl genoemd. In pJRtaclOl wordt een amber-codon gevormd door de junctie van het Scal-uiteinde (...AGT-3') en de twee eerste basen van de geïnverteerde cassette (5'-AGAC...), en bevindt zich drie tripletten meer stroomopwaarts dan in pJRtaclOO; het verkort daardoor het aangemaakte Cat-eiwit met negen in plaats van zes aminozuren. Transformatie van de non-suppressorstammen WK6 en JM83 met deze vectoren leverde onder Cm-selectie alleen levensvatbare transformanten met pJRtaclOO. In tegenstelling tot de verwachtingen ontwikkelden zich op Cm-platen na overnacht incubatie geen kolonies van pJRtaclOl-getransformeerde cellen. Transformanten van amber-suppressorstammen BMH 71-18 en LE392 met pJRtaclOO of pJRtaclOl waren wel resistent. Klaarblijkelijk is een Cat-eiwit met een carboxyluiteinde dat ingekort is met negen aminozuren niet meer aktief, terwijl vervanging van het natuurlijke carboxyluiteinde door een vreemde sequentie (gecodeerd door een synthetische linker of een heteroloog gen) geen verlies van de Cm-resis-tentie met zich meebrengt. Bovendien is in de amber-suppressorstammen met pJRtaclOl een beperkte doorlezing van het amber-stopcodon reeds voldoende voor het verlenen van Cm-resistentie.In order to use the Cat fusion vector pJRtac99 (Robben et al., Submitted) for chemical DNA sequence analysis according to the method of Volckaert (1985), a synthetic DNA cassette with a series of pseudopalindromic restriction sites was inserted in the Seal site , just before the polylinker at the 3 'end of the cat gene (Table 1). An amber stop codon was also present in the cassette to optionally allow or prevent a translation fusion between Cat and the downstream sequence with a controlled amber compression. Clones with the cassette in both orientations were isolated from transformed E. coli BMH 71-18, and designated pJRtaclOO and pJRtaclO1, respectively. In pJRtaclOl, an amber codon is formed by the junction of the Scal terminus (... AGT-3 ') and the two first bases of the inverted cassette (5'-AGAC ...), and contains three triplets more upstream than in pJRtaclOO; it shortens the produced Cat protein by nine instead of six amino acids. Transformation of the non-suppressor strains WK6 and JM83 with these vectors yielded only viable transformants with pJRtaclOO under Cm selection. Contrary to expectations, colonies of pJRtaclO1 transformed cells did not develop on Cm plates after overnight incubation. Transformers of amber suppressor strains BMH 71-18 and LE392 with pJRtaclOO or pJRtaclOl were resistant. Apparently, a Cat protein with a carboxy terminus shortened by nine amino acids is no longer active, while replacement of the natural carboxy terminus with a foreign sequence (encoded by a synthetic linker or a heterologous gene) does not cause loss of the Cm resistance with entails. In addition, in the amber suppressor strains with pJRtaclOl, a limited read through of the amber stop codon is already sufficient to confer Cm resistance.

VOORBEELD 2EXAMPLE 2

Constructie van positieve-selectievectorenConstruction of positive selection vectors

Om deze bevindingen te kunnen gebruiken in een systeem van positieve selectie voor gekloonde DNA-fragmen-ten, werd in het cat-gen van vector pJRtac99 ter hoogte van Tyr-213 een amber-stopcodon aangebracht zoals in vector pJRtaclOl, alsook een unieke Pstl-plaats vóór het amber-codon voor klonering van doelwit-DNA. Deze Pstl-plaats kon gecreëerd worden zonder wijziging van de gecodeerde amino-zuursequentie. De mutaties werden uitgevoerd door uitwisseling in pJRtac99 van een BsmI-Pstl-fragment met een synthetische oligonucleotidecassette. Transformatie van het gemanipuleerde DNA naar een amber-suppressorstam leverde de gewenste vector, pJRtacl03 genaamd (fig. 1).In order to use these findings in a positive selection system for cloned DNA fragments, an amber stop codon such as in vector pJRtaclOl was introduced into the cat gene of vector pJRtac99 at Tyr-213 as well as a unique Pstl- place before the amber codon for cloning of target DNA. This Pst1 site could be created without altering the encoded amino acid sequence. The mutations were performed by exchange in pJRtac99 of a BsmI-Pst1 fragment with a synthetic oligonucleotide cassette. Transformation of the engineered DNA into an amber suppressor strain yielded the desired vector called pJRtac103 (Fig. 1).

Uitgaande van deze vector werd een aantal varianten aangemaakt met alternatieve kloneringsplaatsen en/of een tweede in frame amber-stopcodon ter hoogte van Gln-212. Een eerste reeks mutanten werd aangemaakt met behulp van een inverse PCR op het Pstl-gelineariseerde plasmide-DNA met primers met vier gedegenereerde posities. Uit het resulterende klonenmengsel konden de gewenste variante vectoren worden geïsoleerd: pJRtaclOS met een Pstl-plaats en twee ambercodons, pJRtaclOö met een Sacl-plaats en één amberco-don, en pJRtacl07 met een Sacl-plaats en twee ambercodons (fig. 1).From this vector, a number of variants were generated with alternative cloning sites and / or a second in frame amber stop codon at Gln-212. A first series of mutants were generated by inverse PCR on the Pstl linearized plasmid DNA with primers with four degenerate positions. From the resulting cloning mixture, the desired variant vectors could be isolated: pJRtaclOS with a Pstl site and two amber codons, pJRtaclO6 with one Sacl site and one amberco-don, and pJRtacl07 with one Sacl site and two amber codons (Fig. 1).

Eveneens uitgaande van pJRtacl03 werd door een PstI-SaJI-cassettemutagenese een variant geconstrueerd met een PvuII-plaats voor klonering van blunt fragmenten (fig. 1).Also starting from pJRtac103, a variant was constructed by a PstI-SaJI cassette mutagenesis with a PvuII site for cloning of blunt fragments (Fig. 1).

De verkregen PvuII-plaats werd uniek gemaakt na verwijdering van de natuurlijke PvuII-plaats in het cat-gen. Dit bracht wel een wijziging met zich mee van Gln-212 naar een Leu-residu, maar leidde niet tot verlies van de Cm-resistentie in amber-suppressorstammen.The resulting PvuII site was made unique after removal of the natural PvuII site in the cat gene. This did change Gln-212 to a Leu residue, but did not result in loss of Cm resistance in amber suppressor strains.

VOORBEELD 3EXAMPLE 3

Karakterisering van de inactieve Cat-mutantenCharacterization of the inactive Cat mutants

Competente WK6-cellen (non-suppressor) getransformeerd met één van de hierboven vermelde vectoren met gewij- zigde cat-terminus groeiden niet op cm-agarplaten (25 jug/ml) geïncubeerd onder standaardcondities (37°C, overnacht). Na 24 uur bijkomende incubatie ontwikkelden zich slechts een uitzonderlijk klein aantal kolonies. Bij 30eC incubatie ontwikkelden zich na meer dan 24 uur daarentegen vrij talrijke kolonies op platen met pJRtacl03-getransformeerde cellen, echter weinig of geen op platen met WK6 getransformeerd met pJRtaclOö, pJRtacl06 of pJRtacl07. Dergelijke kolonies opgegroeid bij 30°C groeiden meestal eveneens bij 37°C op vloeibaar LB-medium met 25 μg Cm/ml. Dezelfde competente cellen getransformeerd met pJRtac99 als controle leverden onder identieke voorwaarden tot meer dan 2000 kolonies. Een vergelijkbaar groot aantal kolonies werd waargenomen bij transformatie van competente LE392 (supE, SupF) met één van de positieve selectievectoren, of met pJRtac99.Competent WK6 cells (non-suppressor) transformed with any of the above-modified cat-terminus vectors did not grow on cm agar plates (25 µg / ml) incubated under standard conditions (37 ° C, overnight). After 24 hours of additional incubation, only an exceptionally small number of colonies developed. In 30eC incubation, on the other hand, after more than 24 hours, quite numerous colonies on plates with pJRtac103 transformed cells developed, but little or none on plates with WK6 transformed with pJRtaclO6, pJRtac106 or pJRtac107. Such colonies grown at 30 ° C usually also grew at 37 ° C on LB liquid medium at 25 µg Cm / ml. The same competent cells transformed with pJRtac99 as control yielded over 2000 colonies under identical conditions. A similarly large number of colonies were observed when transforming competent LE392 (supE, SupF) with one of the positive selection vectors, or with pJRtac99.

Aangezien in de pJRtac-vectoren het Cat de enige selectiemerker is, kunnen de positieve selectievectoren enkel in amber-suppressorstammen vermeerderd worden. Om toch de expressie en de specifieke activiteit van de niet-doorge-lezen Cat-eiwitmutanten te kunnen bestuderen, werd het cat-gen met de tac-promoter van pJRtacl03 (negen-aminozuren-deletie) en pJRtacl07 (tien-aminozuren-deletie) als een ffindlII-BgrlII-fragment overgebracht naar pUC9 in de HindlII-BamHI-plaatsen van de polylinker. De respectievelijke vectoren werden pUCAT103 en pUCAT107 genoemd. Op analoge wijze werden de vectoren pUCAT99 en pUCATI geconstrueerd, respectievelijk coderend voor de Cat-99 mutant (5/6 aminozuren substitutie) en het wildtype Cat.Since the Cat is the only selection marker in the pJRtac vectors, the positive selection vectors can only be propagated in amber suppressor strains. However, to study the expression and specific activity of the unread Cat protein mutants, the cat gene with the tac promoter of pJRtacl03 (nine amino acid deletion) and pJRtacl07 (ten amino acid deletion) was deleted. transferred as a ffindlII-BgrlII fragment to pUC9 in the HindlII-BamHI sites of the polylinker. The respective vectors were designated pUCAT103 and pUCAT107. Similarly, the vectors pUCAT99 and pUCATI were constructed encoding the Cat-99 mutant (5/6 amino acid substitution) and the wild-type Cat, respectively.

SDS-PAGE-analyse van totale cellulaire eiwitten van WK6-cellen getransformeerd met deze vectoren en gegroeid onder selectie met ampicilline (Ap) en in aanwezigheid van de cat-inductor IPTG, toonde aan dat het Cat en zijn varianten kwantitatief veruit de belangrijkste celeiwitten vertegenwoordigden. Desondanks gaf bepaling van de minimale inhibitorische concentratie (MIC) van Cm voor deze cellen aan dat het Cat-107 in vivo volledig inactief was, en het Cat-103 slechts een zeer geringe activiteit vertoonde (tabel 2). Bij scheiding van de oplosbare en de niet-oplosbare cellulaire proteïnen en daaropvolgende SDS-PAGE-analyse werd het Cat-99 en het wildtype Cat voor minstens 90% in de oplosbare fractie teruggevonden. Cat-103 en Cat-107 kwamen daarentegen uitsluitend voor in de onoplosbare eiwitfractie. Fasecontrastmicroscopisch onderzoek toonde aan dat de onoplosbare Cat-varianten in de cel voorkwamen als grote, meestal subterminaal gelocaliseerde "inclusion bodies" (fig. 2). Of incubatie bij 30°C de cytoplasmatische oplosbaarheid van deze eiwitten beïnvloedde (Schein and Noteborn, 1988) kon niet met zekerheid worden vastgesteld. De afwezigheid van zichtbare "inclusion bodies" onder deze omstandigheden werd tenminste gedeeltelijk verklaard door de vastgestelde sterke daling van de Cat-productie bij 30°c. In vergelijking met incubatie bij 37°c (tabel 2) waren de Mic-waarden voor Cm bij 30°C wel hoger, en bedroegen + 25 μg Cm/ml voor WK6[-PÜCAT103] en + 5 fig Cm/ml voor WK6[pUCAT107], maar ook + 5 μg Cm/ml voor WK6[pUC18]. De Cm-resistentie van WK6[pUCAT-103] bij 30°C bereikt daarmee de Cm-concentraties routinematig gebruikt voor selectie van transformanten, hetgeen het opgroeien van kolonies van deze cellen bij langere incubatie kan verklaren.SDS-PAGE analysis of total cellular proteins from WK6 cells transformed with these vectors and grown under selection with ampicillin (Ap) and in the presence of the cat-inducer IPTG, showed that the Cat and its variants quantitatively represented the major cell proteins by far . Nevertheless, determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) of Cm for these cells indicated that the Cat-107 was completely inactive in vivo, and the Cat-103 showed only very little activity (Table 2). At separation of the soluble and insoluble cellular proteins and subsequent SDS-PAGE analysis, the Cat-99 and the wild-type Cat were recovered at least 90% in the soluble fraction. Cat-103 and Cat-107, on the other hand, occurred only in the insoluble protein fraction. Phase contrast microscopic examination showed that the insoluble Cat variants in the cell existed as large, mostly subterminally located inclusion bodies (Fig. 2). Whether incubation at 30 ° C affected the cytoplasmic solubility of these proteins (Schein and Noteborn, 1988) could not be determined with certainty. The absence of visible inclusion bodies under these conditions was explained at least in part by the marked drop in Cat production at 30 ° C. Compared to incubation at 37 ° C (Table 2), the Mic values for Cm at 30 ° C were higher, and were + 25 μg Cm / ml for WK6 [-PÜCAT103] and + 5 fig Cm / ml for WK6 [ pUCAT107], but also + 5 μg Cm / ml for WK6 [pUC18]. The Cm resistance of WK6 [pUCAT-103] at 30 ° C thus achieves the Cm concentrations routinely used for transformant selection, which may explain growing colonies of these cells with longer incubation.

VOORBEELD 4EXAMPLE 4

Klonering van willekeurige fragmentenCloning of random fragments

Genomisch DNA van T. gondii werd gedigereerd met PstI, de fragmenten geligeerd in de PstI-plaats van pJR-tacl03, en klonen geselecteerd op Cm (25 μg/ml) door overnacht incubatie bij 37°C. Op analoge wijze werden MnlI-fragmenten gekloneerd in de PvuII-plaats van pJRtacl09. Na PCR-kloonanalyse werden een reeks klonen in sequentie gebracht. De resulterende DNA-sequenties en hun afgeleide aminozuursequenties toonden de carboxyterminale translatie-fusies aan tussen cat en de geïnsereerde Toxoplasma-sequen-ties. Tabel 3 illustreert de "random" substitutie van de carboxyterminus van Cat stroomafwaarts van het Gln-211, en dus de potentie van het positieve selectiesysteem voor het aanleggen van DNA-(expressie)banken.Genomic DNA from T. gondii was digested with PstI, the fragments ligated into the PstI site of pJR-taclO 3, and clones selected at Cm (25 µg / ml) by overnight incubation at 37 ° C. Analogously, MnlI fragments were cloned into the PvuII site of pJRtacl09. After PCR clone analysis, a series of clones were sequenced. The resulting DNA sequences and their deduced amino acid sequences demonstrated the carboxy-terminal translation fusions between cat and the inserted Toxoplasma sequences. Table 3 illustrates the "random" substitution of the Cat carboxy terminus downstream of the Gln-211, and thus the potential of the positive selection system for creating DNA (expression) libraries.

Genoitiische Nsil-fragmenten leverden bij insertie in de Pstl-plaats van pJRtacl03 daarentegen geen enkele positieve kloon op. Ligatie van het Pstl-uiteinde van de vector met de compatibele NsiI-fragmenten wijzigt echter het Gln-211-triplet (CAG) in een His-triplet (CAT). Deze mutatie is klaarblijkelijk funest voor de Cat-activiteit.Genoitic Nsil fragments, on the other hand, did not yield any positive clones upon insertion into the Pstl site of pJRtacl03. However, ligation of the Pstl end of the vector with the compatible NsiI fragments changes the Gln-211 triplet (CAG) to a His triplet (CAT). This mutation is apparently disastrous for the Cat activity.

VOORBEELD 5EXAMPLE 5

Klonering van PCR-fragmenten PCR laat toe specifieke DNA-fragmenten te amplifi-ceren en deze bovendien aan de uiteinden te voorzien van extra sequenties zoals ondermeer unieke restrictieherken-ningssequenties. De methode leent zich dan ook bij uitstek tot de bereiding van DNA voor klonering in de positieve selectievectoren. Twee experimenten worden bij wijze van voorbeeld vermeld. In een eerste experiment werd een AT-rijk gebied in het DIOB-fragment van chromosoom III van Saccharo-myces cerevisiae, gekloneerd in pYIP5 (Defoor et al., in press) geamplificeerd met specifieke primers beide voorzien van een niet-complementair 5'-uiteinde met een Pstl-plaats. Bovendien werden zes bijkomende nucleotiden stroomafwaarts van de Pstl-plaats aangebracht die bij klonering in de Pstl-plaats van pJRtac 103 coderen voor een bijkomende Gln-212 en Tyr-213 aan Cat, voldoende voor herstel van de Cm-resisten-tie (fig. 3). Ligatie van het aldus verkregen PCR-product in deze vector leverde uitsluitend klonen met het specifieke DNA-fragment in één van de gewenste twee oriëntaties, hetgeen bidirectionele sequentieanalyse van de beide strengen toeliet.Cloning of PCR fragments PCR allows amplification of specific DNA fragments and additionally providing them with additional sequences at the ends, such as unique restriction recognition sequences, among others. The method is therefore ideally suited to the preparation of DNA for cloning in the positive selection vectors. Two experiments are mentioned by way of example. In a first experiment, an AT-rich region in the DIOB fragment of chromosome III of Saccharomyces cerevisiae cloned in pYIP5 (Defoor et al., In press) was amplified with specific primers both provided with a non-complementary 5'- end with a Pstl site. In addition, six additional nucleotides were placed downstream of the Pst1 site which, upon cloning into the Pstl site of pJRtac 103, encode an additional Gln-212 and Tyr-213 to Cat, sufficient for restoration of the Cm resistance (Fig. 3). Ligation of the thus obtained PCR product in this vector yielded only clones with the specific DNA fragment in one of the desired two orientations, allowing bidirectional sequence analysis of both strands.

In een tweede experiment werd het gen coderend voor het alkalische fosfatase (phoA) van E. coli JM83 (Shutt-leworth et al., 1986) rechtstreeks uit verse cellen geampli-ficeerd en gekloond als een Pstl-fragment in pJRtacl03. De primers waren daarbij zo ontworpen dat bij klonering van phoA-gen in de gewenste oriëntatie het amber-stopcodon met twee tripletten (coderend voor een Gly en een Asn) werd opgeschoven, voldoende voor herstel van de Cm-resistentie. Het TAG-codon werd onmiddellijk gevolgd door het ATG-start- codon van het phoA-qen. Met deze configuratie werd een translatie-reïnitiatie ter hoogte van het phoA-startcodon beoogd, waarvan een verhoogde efficiëntie werd betracht door het voorzien van een (theoretische) Shine-Dalgarno sequentie (Stormo et al., 1982) volgend op de Pstl-plaats (fig. 4). De reverse primer was zo ontworpen dat bij klonering van het PCR-produkt in de omgekeerde oriëntatie onmiddellijk na de Pstl-plaats in het cat-103-gen een ochre-stopcodon werd gecreëerd, met de vorming van een vroegtijdig getermineerd inactief Cat-eiwit als gevolg. Het phoA-qen werd op deze. wijze met succes gekloneerd en tot expressie gebracht in WK6-cellen. SDS-PAGE-analyse toonde een prominente eiwitband aan met het verwachte moleculaire gewicht overeenkomstig met dat van het PhoA. De efficiënte expressie en de enzymatische activiteit van het PhoA werden bevestigd door de intense blauwkleuring van de kolonies op platen met BCIP. De nieuwe vectorconstructie werd pCATP genoemd.In a second experiment, the gene encoding the alkaline phosphatase (phoA) of E. coli JM83 (Shutt-leworth et al., 1986) was amplified directly from fresh cells and cloned as a Pstl fragment in pJRtacl03. The primers were designed to cleave the amber stop codon with two triplets (encoding a Gly and an Asn) upon cloning of phoA gene in the desired orientation, sufficient for restoration of Cm resistance. The TAG codon was immediately followed by the ATG start codon of the phoA-qen. With this configuration, a translation re-initiation at the phoA start codon was envisaged, an increased efficiency of which was sought by providing a (theoretical) Shine-Dalgarno sequence (Stormo et al., 1982) following the Pstl site ( Fig. 4). The reverse primer was designed so that cloning of the PCR product in the reverse orientation immediately after the Pstl site in the cat-103 gene created an ocher stop codon, producing an early terminated inactive Cat protein as consequence. The phoA-qen was on this. successfully cloned and expressed in WK6 cells. SDS-PAGE analysis revealed a prominent protein band with the expected molecular weight corresponding to that of the PhoA. The efficient expression and enzymatic activity of the PhoA were confirmed by the intense blue staining of the colonies on BCIP plates. The new vector construct was called pCATP.

VOORBEELD 6EXAMPLE 6

Effectiviteit van positieve selectieEffectiveness of positive selection

De effectiviteit van de pJRtac-plasmiden als kloneringsvec-toren werd als volgt onderzocht. Als te kloneren DNA-"probe" werd geopteerd voor het hierboven vermelde phoA-gen omwille van de visuele detecteerbaarheid op BClP-platen van klonen met correct geïnsereerd phoA-gen. Om mogelijke fouten in de coderende sequentie te wijten aan de PCR-amplificatie (Barnes, 1992) en daaruit voortvloeiende inactiviteit van het phoA-expressieproduct te vermijden werd het gen als Pstl-fragment uit vector-DNA geïsoleerd. Aangezien in het beschikbare pCATP plasmide het phoA-gen ongeveer evenveel baseparen telde als de rest van de vector, en bijgevolgd scheiding en isolatie via agarosegel-electroforese moeilijk uitvoerbaar was, werd het phoA-gen eerst overgebracht naar de grotere pUCATIO3-vector. Daartoe werden pCATP en pUCAT103 samengevoegd, en na Pstl-digestie opnieuw geligeerd. Het gewenste construct, püCATP genoemd, werd verkregen na selectie op Cm, Ap en BCIP. Pstl-gedigesteerd, Qiagen-gezuiverd DNA van pUCATP gaf na agarosegel-electroforese twee banden (1437 bp en 3422 bp) waarvan de kleinste met het phoA-gen werd uitgesneden en het DNA gezuiverd met een GeneClean*-kit. Dit fragment werd uiteindelijk in verschillende molaire verhoudingen geligeerd met Pstl-geknipte pJRtacl03 of pJR-tacl05 voor het testen van de effectiviteit van de positieve selectie. WK6-cellen getransformeerd met ligatiemegnsel werden uitgeplaat op agarplaten met 25 μg Cm/ml en 40 jug BCIP/ml. Kolonies werden onderzocht na incubatie bij 37°C gedurende 16 uur. Het resultaat van twee dergelijke experimenten is samengevat in Tabel 4. Meer dan 99,5% van de kolonies vertoonden een duidelijke blauwe kleur, wijzend op correcte klonering van het phoA-qen, zowel in pJRtacl03 als in pJRtacl05. Het aantal witte kolonies was miniem. Vier van de vijf verder onderzochte witte pJRtacl03-klonen en alle vier onderzochte witte pJRtacl05-klonen bleken eenzelfde onbekend DNA-fragment te hebben geïncorporeerd met dezelfde lengte als het phoA-gen, maar met een totaal verschillend restrictiepatroon. Vermoedelijk werd dit fragment uit de gel meegezuiverd met het phoA-bevattende DNA-fragment. Slechts één van de pJRtacl03-klonen bevatte geen (zichtbare) DNA-insertie. Geen van de onderzochte klonen bevatte het phoA-gen in de omgekeerde oriëntatie. Het dient bijgevolg opgemerkt te worden dat, rekening houdend met de gelijke kans op ligatie van het phoA-gen in de beide oriëntaties, de reële efficiëntie van de positieve selectie nog tweemaal hoger ligt dan de hier bekomen waarde. De vijf onderzochte kolonies die zich ontwikkelden op de controleplaten bevatten allen een "lege" vector. SDS-PAGE-analyse van de cellulaire eiwitten en DNA-sequentieanalyse van deze en andere negatieve klonen uit verschillende experimenten toonden het voorkomen aan van chromosomale amber-suppressormutaties bij de gasheercel, mutaties in het cat-gen van het amber-stopcodon in een aminozuur-coderend triplet, en carboxyterminale leesraamverschuivingingen door insertie of deletie van één enkel basepaar tussen het Gln-211-codon en het amber-codon. Deze mutaties verklaarden een belangrijk gedeelte van de achtergrond van niet-recombinante klonen.The effectiveness of the pJRtac plasmids as cloning vectors was examined as follows. The DNA "probe" to be cloned was selected for the above-mentioned phoA gene because of the visual detectability on BC1P plates of clones with correctly inserted phoA gene. To avoid possible coding sequence errors due to PCR amplification (Barnes, 1992) and consequent inactivity of the phoA expression product, the gene was isolated as a Pstl fragment from vector DNA. Since in the available pCATP plasmid, the phoA gene had about as many base pairs as the rest of the vector, and consequently separation and isolation via agarose gel electrophoresis was difficult to perform, the phoA gene was first transferred to the larger pUCATIO3 vector. To this end, pCATP and pUCAT103 were pooled, and ligated again after Pstl digestion. The desired construct, called püCATP, was obtained after selection for Cm, Ap and BCIP. PstI-digested, Qiagen-purified DNA from pUCATP yielded two bands (1437 bp and 3422 bp) after agarose gel electrophoresis, the smallest of which was excised with the phoA gene and the DNA purified with a GeneClean * kit. This fragment was finally ligated in various molar proportions with Pstl-cut pJRtacl03 or pJR-tacl05 to test the effectiveness of the positive selection. WK6 cells transformed with ligation membrane were plated on agar plates containing 25 µg Cm / ml and 40 µg BCIP / ml. Colonies were examined after incubation at 37 ° C for 16 hours. The result of two such experiments is summarized in Table 4. More than 99.5% of the colonies showed a clear blue color, indicating correct cloning of the phoA-qen in both pJRtacl03 and pJRtacl05. The number of white colonies was minimal. Four of the five white pJRtac103 clones further investigated and all four white pJRtac105 clones examined were found to have incorporated the same unknown DNA fragment with the same length as the phoA gene, but with a completely different restriction pattern. Presumably, this fragment was purified from the gel with the phoA-containing DNA fragment. Only one of the pJRtac103 clones did not contain (visible) DNA insertion. None of the clones examined contained the phoA gene in the reverse orientation. It should therefore be noted that, taking into account the equal probability of ligation of the phoA gene in both orientations, the real efficiency of the positive selection is two times higher than the value obtained here. The five colonies examined that developed on the control plates all contained an "empty" vector. SDS-PAGE analysis of the cellular proteins and DNA sequence analysis of these and other negative clones from various experiments showed the occurrence of chromosomal amber suppressor mutations in the host cell, mutations in the cat gene of the amber stop codon in an amino acid coding triplet, and carboxy-terminal reading frame shifts by insertion or deletion of a single base pair between the Gln-211 codon and the amber codon. These mutations explained an important part of the background of non-recombinant clones.

REFERENTIESREFERENCES

Bannan et al (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:471-476 Barnes, (1992) Gene 17:29-32Bannan et al (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35: 471-476 Barnes, (1992) Gene 17: 29-32

Bennet et al., (1984) Engelse octrooiaanvrage 2140810ABennet et al., (1984) British Patent Application 2140810A

Bolivar et al., (1977) Gene 2:95-113Bolivar et al., (1977) Gene 2: 95-113

Brenner et al. (1985) EMBO J. 4:561-568Brenner et al. (1985) EMBO J. 4: 561-568

Brückner et al. (1984) Gene 32:151-160Brückner et al. (1984) Gene 32: 151-160

Charles et al. (1985) J. Bacteriol. 164:123-129Charles et al. (1985) J. Bacteriol. 164: 123-129

Defoor et al., (in druk)Defoor et al., (In press)

Dykes et al., (1988) Eur. J. Biochem. 174:411-416 Friefeld et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:2652-656Dykes et al., (1988) Eur. J. Biochem. 174: 411-416 Friefeld et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 2652-656

Harwood et al. (1983) Gene 24 : 163-169 Horinouchi et al. (1982) J. Bacteriol. 150:815-825 Leslie, (1990) J. Mol. Biol. 213:167-186 Murray et al. (1988) Biochem. J. 252:173-179 Murray et al. (1990) Biochem. J. 272:505-510 Murray et al. (1989) Gene 85:283-291 Novick (1976) J. Bacteriol. 127:1177-1187 Pugh et al. (1987) J. Virol. 61:1384-1390 Robben et al. (submitted)Harwood et al. (1983) Gene 24: 163-169 Horinouchi et al. (1982) J. Bacteriol. 150: 815-825 Leslie, (1990) J. Mol. Biol. 213: 167-186 Murray et al. (1988) Biochem. J. 252: 173-179 Murray et al. (1990) Biochem. J. 272: 505-510 Murray et al. (1989) Gene 85: 283-291 Novick (1976) J. Bacteriol. 127: 1177-1187 Pugh et al. (1987) J. Virol. 61: 1384-1390 Robben et al. (Submitted)

Sambrook et al. (1989) Molecular cloning : a laboratory manual; Cold Spring Harbor NY, USA Schaeffer et al. (1986) J. Virol. 57:173-182 Schein et al. (1988) Bio/Technology 6:291-294 Schottel et al. (1984) Gene 28:177-193 Schumann (1979) Mol. Gen. Genet. 174:221-224\Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual; Cold Spring Harbor NY, USA Schaeffer et al. (1986) J. Virol. 57: 173-182 Schein et al. (1988) Bio / Technology 6: 291-294 Schottel et al. (1984) Gene 28: 177-193 Schumann (1979) Mol. Gene. Genet. 174: 221-224 \

Schwarz et al. (1991a) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1277-1283Schwarz et al. (1991a) Antimicrob. Agents Chemother. 35: 1277-1283

Schwarz et al. (1991b) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1551-1556Schwarz et al. (1991b) Antimicrob. Agents Chemother. 35: 1551-1556

Schwarz et al. (1991) J. Gen. Microbiol. 137:977-981 Schwarz et al. (1992) J. Gen. Microbiol. 138:275-281 Shaw et al. (1991) Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 20:363-386Schwarz et al. (1991) J. Gen. Microbiol. 137: 977-981 Schwarz et al. (1992) J. Gen. Microbiol. 138: 275-281 Shaw et al. (1991) Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 20: 363-386

Shaw et al. (1979) Nature 282:870-872Shaw et al. (1979) Nature 282: 870-872

Shuttleworth et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:8689 Steffen et al. (1989) Gene 75:349-354 Stormo et al. (1982) Nucl. Acids Res. 10:2971-2995 Verhasselt et al. (submitted)Shuttleworth et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 8689 Steffen et al. (1989) Gene 75: 349-354 Stormo et al. (1982) Nucl. Acids Res. 10: 2971-2995 Verhasselt et al. (Submitted)

Wong et al. (1985) J. Virol. 55:223-231 Wren et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17:4877 Yanish-Perron et al. (1985) Gene 33:103-119 Zeil et al. (1987) EMBO J. 6:1809-1815Wong et al. (1985) J. Virol. 55: 223-231 Wren et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17: 4877 Yanish-Perron et al. (1985) Gene 33: 103-119 Zeil et al. (1987) EMBO J. 6: 1809-1815

Tabel 1. Carboxyterminale aminozuurséquenties van natuurlijk voorkomende Cat-varianten.Table 1. Carboxy-terminal amino acid sequences of naturally occurring Cat variants.

De sequenties zijn uitgelijnd ten opzichte van het catalytische His-195 (H). De nummering van de aminozuren is volgens Murray et al., 1988. <~oc5~>: positie van de c^-helix van het Catm-isoenzyme (Leslie, 1990).The sequences are aligned to the catalytic His-195 (H). The numbering of the amino acids is according to Murray et al., 1988. <~ oc5 ~>: position of the c-helix of the Catm isoenzyme (Leslie, 1990).

De vectoren pJRtadOO en pJRtac101 werden bekomen na kloning in beide oriëntaties van een oligonudeotidecassette in de Scal-plaats van pJRtac99. Deze ‘sequencing linker bevat voor de vector unieke, asymmetrische herkenningssequenties voor Bsu36l, Ss/EII, EcoNI en Tttr\ 111.The vectors pJRtadOO and pJRtac101 were obtained after cloning in both orientations of an oligonudeotide cassette in the Scal site of pJRtac99. This sequencing linker contains unique, asymmetric recognition sequences for Bsu36l, Ss / EII, EcoNI and Tttr \ 111 for the vector.

Tabel 3. Minimale inhibitorische concentratie (MIC) van chlooramfenicol voor getransformeerde E. coli WK6 cellen in vloeibaar LB-medium bij 37°C incubatietemperatuur.Table 3. Minimum inhibitory concentration (MIC) of chloramphenicol for transformed E. coli WK6 cells in liquid LB medium at 37 ° C incubation temperature.

* Waarden in pg/ml. Q: Gln-211* Values in pg / ml. Q: Gln-211

Tabel 4.Carboxyterminale translatiefusies met Cat gegenereerd bij kloning van genomisch DNA-fragmenten van Toxoplasma gondii in de positieve selectievectoren pJRtacl03 en pJRtacl09.Table 4.Carboxy-terminal translation fusions with Cat generated upon cloning of genomic DNA fragments of Toxoplasma gondii into the positive selection vectors pJRtacl03 and pJRtacl09.

A »Jf£iöVKLLVEKHGS...A »Jf £ iöVKLLVEKHGS ...

... WEI.QHLNYTSETKR...... WEI.QHLNYTSETKR ...

... N E L Q L L S C* ... NELQLCLPAEPDLP...... N E L Q L L S C * ... NELQLCLPAEPDLP ...

... WELQSLTEPREESR...... WELQSLTEPREESR ...

... N E L Q TTLSTTLRLS...... N E L Q TTLSTTLRLS ...

... N E L Q LALRDRSLRE...... N E L Q LALRDRSLRE ...

... N E L Q F Y C L* B ... NELQFLIHHTLAFA* ... NELQICLQRFSKAR...... N E L Q F Y C L * B ... NELQFLIHHTLAFA * ... NELQICLQRFSKAR ...

... JiELOGSFGKVIlAE.... JiELOGSFGKVIlAE.

... WELQGACWAASSIK...... WELQGACWAASSIK ...

... N E L 0 C R C G F L I* ... NELQGCVDSNYVFF..._... N E L 0 C R C G F L I * ... NELQGCVDSNYVFF ..._

Genomisch DNA van T. gondii werd gedigereerd (A) met Pstl en geligeerd in de Pstl-plaats van pJRtacl03, of (B) met MnH en geligeerd in de PvwII-plaats van pJRtacl09. De laatste Cat-aminozuren zijn weergegeven in cursief. Van de Toxoplasma-gecodeerde residu's zijn alleen de eerste tien voorgesteld. *: terminaal residu.Genomic DNA from T. gondii was digested (A) with Pstl and ligated into the Pstl site of pJRtacl03, or (B) with MnH and ligated into the PvwII site of pJRtacl09. The final Cat amino acids are shown in italics. Of the Toxoplasma encoded residues, only the first ten have been proposed. *: terminal residue.

Tabel 5.Selectie voor gekloondphoA-gen met behulp van pJRtacKB en pJRtac!05.Table 5.Selection for cloned phoA gene using pJRtacKB and pJRtac! 05.

Claims

A vector for positive selection of recombinants, comprising a mutated gene, which has at least one unique restriction site and encodes an inactive form of a selection marker protein, and which gene after insertion of a DNA fragment to be cloned into the unique restriction site encodes an active form of the selection marker protein.

Selection vector according to claim 1, characterized in that the mutated gene is a cat gene near the 3 'end of which at least one stop codon is included.

Selection vector according to claim 2, characterized in that the stop codon is at most 211 codons from the 5 'coding end of the gene.

Selection vector according to claim 2 or 3, characterized in that the stop codon is an amber codon (TAG).

Selection vector according to any one of claims 2-4, characterized in that the unique restriction site is located immediately upstream of the stop codon.

Selection vector according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the unique restriction site is a Pstl site.

A method of selecting recombinant host cells, comprising the steps of: a) linearizing a recombinant vector comprising a mutated gene that has at least one unique restriction site and encodes an inactive form of a selection marker protein, and which gene encodes an active form of the selection marker protein after an insertion of a random DNA fragment to be cloned into the unique restriction site, having an endonuclease that cuts into the unique restriction site of the vector; b) ligating a desired DNA fragment into the linearized vector to obtain a ligation mixture; σ) transforming a suitable host with the ligation mixture; d) culturing the host under conditions such that only a recombinant host expresses the insertion-activated selection marker gene and colonies, respectively. forms plaques; and e) analyzing the recombinant colonies, respectively. plaques.

The method according to claim 7, characterized in that the host is Escherichia coli.

A method according to claim 8, characterized in that the host is an Escherichia coli strain which is unable to suppress a nonsense mutation.

A method according to any one of claims 7-9, characterized in that the selection marker gene is the cat gene near the 3 'end from which at least one stop codon is included.

Method according to claim 10, characterized in that the stop codon is an amber codon (TAG).

12 ·. Method according to any one of claims 7-11, characterized in that the unique restriction site is immediately upstream of the stop codon.

Method according to any one of claims 7-12, characterized in that the unique restriction site is a PstI site.

A method according to any one of claims 8-13, characterized in that the host is grown in a medium containing chloramphenicol.