NL9102122A

NL9102122A - METHOD FOR TESTING ANTIVIRALS; USEFUL ANIMALS FOR THAT.

Info

Publication number: NL9102122A
Application number: NL9102122A
Authority: NL
Original assignee: Tno
Priority date: 1991-12-18
Filing date: 1991-12-18
Publication date: 1993-07-16
Also published as: AU3268693A; WO1993012252A1

Description

Titel: Werkwijze voor het testen van antivirale middelen; daarvoor bruikbare proefdierenTitle: Method for testing antivirals; laboratory animals usable therefor

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het testen van antivirale middelen die tegen een immuun-suppresserend virus gericht zijn, waarbij men het effect vaststelt dat het te testen middel heeft op proefdieren, welke getransplanteerd zijn met cellen van een donor-immuunsysteem die door het immuunsuppresserende virus kunnen worden geïnfecteerd en met het immuunsuppresserende virus zijn geïnfecteerd.The invention relates to a method for testing antiviral agents directed against an immunosuppressive virus, wherein the effect of the agent to be tested has been determined on test animals transplanted with cells of a donor immune system which have been immunosuppressive virus can be infected and infected with the immunosuppressive virus.

Het humane immuundeficiëntie virus (HIV), het meest bestudeerde immuunsuppresserende virus, blijkt slechts humane cellen en chimpansee cellen te kunnen infecteren. Beide zijn om meerdere redenen niet geschikt om grote aantallen van verschillende experimentele anti-virale middelen te testen: - chimpansees worden tot op heden, negen jaar na geïnfecteerd te zijn, niet ziek van HIV. Ze ontwikkelen geen AIDS (="Acquired Immune Deficiency Syndrome")/ hetgeen vergelijking met het infectieverloop bij de mens moeilijk maakt.Human immunodeficiency virus (HIV), the most studied immunosuppressive virus, appears to infect only human and chimpanzee cells. Both are not suitable for testing large numbers of different experimental anti-viral agents for several reasons: - chimpanzees do not become ill from HIV to date, nine years after being infected. They do not develop AIDS (= "Acquired Immune Deficiency Syndrome") / which makes comparison with the course of infection in humans difficult.

- chimpansees zijn erg groot in vergelijking tot kleine proefdieren zoals bijvoorbeeld de muis, waardoor veel van het experimentele middel nodig is voor de behandeling van slechts enkele gevallen. Dit kan de proeven zeer kostbaar maken.- chimpanzees are very large compared to small test animals such as, for example, the mouse, requiring much of the experimental agent to treat only a few cases. This can make the tests very expensive.

- de HIV-infectie bij de mens heeft een verloop van maanden tot jaren, zodat een snelle evaluatie van te testen substanties niet goed mogelijk is.- HIV infection in humans lasts from months to years, so that a rapid evaluation of substances to be tested is not possible.

- er is een ethisch bezwaar tegen experimenten op mensen en chimpansees; een vroegtijdig en ten gevolge van het experiment overlijden is immers zeer ongewenst.- there is an ethical objection to experiments on humans and chimpanzees; after all, premature death as a result of the experiment is highly undesirable.

Om bovenstaande nadelen aan het testen van anti-virale middelen op te lossen zijn er verschillende alternatieve testmethoden ontwikkeld.Several alternative test methods have been developed to overcome the above disadvantages of testing anti-viral agents.

In vitro methoden. Bij in vitro' testsystemen worden in kweekflesjes gehouden, met HIV infecteerbare cellen gebruikt. Normale menselijke cellen kunnen niet als zodanig worden gekweekt, omdat deze niet spontaan overleven. Om die reden worden als alternatief wel kankercellen gebruikt afkomstig van het menselijke immuunsysteem (die immers wel spontane groei vertonen) of worden cellen van dat immuunsysteem gestimuleerd met groeifactoren, maar proeven die zo werden uitgevoerd blijken moeilijk te kwantificeren. Bovendien is de situatie bij dit soort proeven wezenlijk een andere dan de situatie in een lichaam waar een interactief immuunsysteem uit meerdere verschillende cel-populaties bestaat, die complexe interacties met elkaar aangaan.In vitro methods. In vitro test systems, held in culture bottles, use HIV-infectable cells. Normal human cells cannot be cultured as such because they do not survive spontaneously. For that reason, alternatively, cancer cells from the human immune system (which do show spontaneous growth) or cells from that immune system are stimulated with growth factors, but tests carried out in this way prove difficult to quantify. Moreover, the situation in these types of tests is fundamentally different from the situation in a body where an interactive immune system consists of several different cell populations that interact with each other.

Om kwantificatie te vereenvoudigen, zijn gemodificeerde kanker-cellijnen met een "reporter-gen" ontwikkeld. Een dergelijk gen geeft verandering (bijvoorbeeld blauwkleuring na toevoegen van substraat) van de cellen als ze door het virus worden geïnfecteerd. Tot op heden is deze methode slechts operationeel met kankercellen die niet afkomstig zijn van het immuunsysteem, zie b.v. het vooraanstaande artikel van Emilie in AIDS 4, p 791, 1990. Dit is een groot nadeel, omdat andere typen cellen op andere activerende signalen reageren.Modified cancer cell lines with a "reporter gene" have been developed to simplify quantitation. Such a gene changes (for example, blue staining after addition of substrate) the cells when they are infected by the virus. To date, this method is only operational with non-immune cancer cells, see e.g. Emilie's leading article in AIDS 4, p 791, 1990. This is a major drawback, because other types of cells respond to other activating signals.

Een nadeel van in vitro tests is vooral dat de daarmee verkregen gegevens geen afspiegeling zijn van de werkelijke interactie tussen immuunsysteem en virus. Hierdoor kunnen vals-positieve en vals-negatieve resultaten ontstaan.A disadvantage of in vitro tests is mainly that the data obtained with it do not reflect the actual interaction between immune system and virus. This can cause false positive and false negative results.

In vivo methoden (waarbij, in tegenstelling tot "in vitro", cellen in levende wezens worden bestudeerd) met soortspecifiek virus. Er zijn analoog werkende, doch anderssoortige immuundeficiëntie virussen dan het humane, die specifiek zijn voor respectievelijk de kat (FIV), de rhesusaap (SIV) en het rund (BIV) . Tests met deze virussen op het bijpassende dier kunnen eerste inzichten verschaffen in de onderzochte middelen, doch zijn niet zonder meer extrapoleerbaar naar de situatie bij de mens. Ze moeten herhaald worden met het humane virus, omdat deze andere virussen een andere basevolgorde van het erfelijk overdraagbare materiaal (RNA) vertonen in vergelijking met HIV en omdat het immuunsysteem van de kat en de rhesusaap niet identiek is aan dat van de mens. Bij deze methoden wordt het "normale" verloop van de immuundeficiëntie ziekte bestudeerd. Het virus dat muizen-AIDS (MAIDS: "murine acquired immune-deficiency syndrom") veroorzaakt, het MLV ("murine leukemia virus"), is zeer verschillend van HIV. Het is in dit stadium nog niet duidelijk of MAIDS geaccepteerd kan worden als model voor HIV.In vivo methods (whereby, in contrast to "in vitro", cells in living beings are studied) with species-specific virus. There are analogous, but different types of immune deficiency viruses other than human, which are specific for the cat (FIV), the rhesus monkey (SIV) and the bovine (BIV), respectively. Tests with these viruses on the matching animal can provide first insights into the investigated agents, but cannot simply be extrapolated to the human situation. They must be repeated with the human virus, because these other viruses exhibit a different base order of the hereditary transmissible material (RNA) compared to HIV and because the immune system of the cat and rhesus monkey is not identical to that of humans. In these methods, the "normal" course of the immune deficiency disease is studied. The virus that causes murine AIDS (MAIDS: "murine acquired immune deficiency syndrom"), the MLV ("murine leukemia virus"), is very different from HIV. It is not yet clear at this stage whether MAIDS can be accepted as a model for HIV.

In vivo methoden die gebruik maken van een muis waarin humane weefsels zijn getransplanteerd, waarin HIV wordt geïnjecteerd.In vivo methods using a mouse in which human tissues have been transplanted into which HIV is injected.

1. Bij het systeem volgens McCune (Science 247, p. 564, 1990 en PNAS 88, p. 4523, 1991) wordt foetale lever en/of lymfklier en/of thymus onder het nierkapsel van een z.g. SCID muis ("severe combined immune deficient") getransplanteerd, waarna een injectie met het virus volgt in het transplantaat.1. In the system of McCune (Science 247, p. 564, 1990 and PNAS 88, p. 4523, 1991), fetal liver and / or lymph node and / or thymus is injected under the renal capsule of a so-called SCID mouse ("severe combined immune deficient "), followed by an injection of the virus into the graft.

2. Bij het systeem volgens Mosier (Science 251, p. 791, 1991) worden, eveneens in SCID muizen, humane PBL ("perifere bloed leukocyten") in de buikholte geïnjecteerd die tot 1 jaar later in kleine aantallen in de muis kunnen worden teruggevonden. Ook deze muizen worden vervolgens met HIV geïnfecteerd.2. In the Mosier system (Science 251, p. 791, 1991) human PBL ("peripheral blood leukocytes") are injected into the abdominal cavity, also in SCID mice, which can be injected into the mouse in small numbers up to 1 year later recovered. These mice, too, are subsequently infected with HIV.

Na de behandeling van deze muizen met anti-virale stoffen, zoals AZT (azidothymidine), kan de werking ervan worden afgemeten aan de vermindering van het aantal met HIV geïnfecteerde menselijke cellen.After treatment of these mice with anti-viral agents, such as AZT (azidothymidine), their activity can be measured by the reduction in the number of HIV-infected human cells.

De systemen van McCune en Mosier hebben meerdere nadelen. Een test volgens hun methoden duurt meerdere maanden en vergt relatief veel testsubstantie. Dit is juist bij experimentele antivirale middelen een groot probleem, omdat het gewoonlijk grote investeringen vergt.McCune and Mosier's systems have several drawbacks. A test according to their methods takes several months and requires a relatively large amount of test substance. This is a major problem with experimental antivirals, because it usually requires large investments.

Bovendien resulteren beide methoden in een niet erg actief humaan immuunsysteem in de SCID-muizen, hetgeen geen goede afspiegeling van de situatie bij de mens is.In addition, both methods result in a not very active human immune system in the SCID mice, which does not accurately reflect the human situation.

Ook hebben beide systemen het nadeel dat de mate, waarin de menselijke cellen zich ontwikkelen, om een nog niet opgehelderde reden wisselvallig is. Het systeem van McCune heeft bovendien als nadeel dat het inbrengen van de weefselstukjes bij de muis lastig, tijdrovend en niet altijd succesvol is. Het systeem van Mosier heeft als nadeel dat het zowel lastig is om de in lage frequentie voorkomende mensencellen (ongeveer 0.1%) aan te tonen, als om in deze cellen het HIV aan te tonen. Dit laatste gebeurt met een PCR (Polymerase Chain Reaction; een methode, waarbij de DNA hoeveelheid artificieel wordt vermeerderd) die gevoelig is voor fouten.Both systems also have the drawback that the degree to which human cells develop is variable for an as yet unexplained reason. The disadvantage of McCune's system is that the insertion of the tissue pieces into the mouse is difficult, time consuming and not always successful. The disadvantage of Mosier's system is that it is both difficult to detect the low-frequency human cells (about 0.1%) and to detect HIV in these cells. The latter is done with a PCR (Polymerase Chain Reaction; a method in which the DNA quantity is artificially increased) that is prone to errors.

Zeer onlangs werd door Lubin (Science 252, p. 427, 1991) een mens-muis chimaer beschreven, verkregen door transplantatie van humane beenmergcellen in een "normale" BALB/c muis. De muis was van te voren aan een hoge dosis straling onderworpen. Na 2 maanden ontstonden uit de beenmergcellen humane lymfocyten in het bloed van deze muizen, m.a.w. er trad deling en differentiatie van het getransplanteerde humane beenmerg op. Er zijn met dit systeem nog geen tests beschreven met middelen die een HIV inactiverende of neutraliserende werking hebben. Op voorhand zouden daaraan echter grote bezwaren kleven. Immers er zijn grote hoeveelheden humaan beenmerg per muis nodig om een dergelijke chimaer te maken (10 miljoen of meer cellen), die moeilijk zijn te verkrijgen. Bovendien varieerden de aantallen van de menselijke cellen sterk in de tijd en per muis na de transplantatie bij gelijke getransplanteerde hoeveelheden. Tenslotte zou ook bij de methode van Lubin de antivirale therapie maandenlang moeten worden gecontinueerd.Very recently, Lubin (Science 252, p. 427, 1991) described a human mouse chimer obtained by transplantation of human bone marrow cells into a "normal" BALB / c mouse. The mouse was previously subjected to a high dose of radiation. After 2 months, human lymphocytes from the bone marrow cells formed in the blood of these mice, i.e., division and differentiation of the transplanted human bone marrow occurred. No tests have yet been described with this system with agents that have an HIV inactivating or neutralizing effect. However, there would be major objections in advance. After all, large amounts of human bone marrow are needed per mouse to make such a chimer (10 million or more cells), which are difficult to obtain. In addition, the numbers of human cells varied widely over time and per mouse after transplantation at equal amounts transplanted. Finally, the Lubin method should also continue antiviral therapy for months.

De uitvinding betreft een methode waarbij een vreemd immuun-systeem in een klein proefdier wordt getransplanteerd, dat daardoor binnen 2 weken overlijdt aan Graft-versus-Host Disease, tenzij tevens een immuunsuppresserend virus wordt toegediend. De Graft-versus-Host ziekte ontstaat als gevolg van een afstotingsreactie van het donor immuunsysteem tegen het ontvanger-proefdier. Bij deze uitvinding zullen de toegediende middelen, die infectie met immuunsuppresserende virussen voorkomen of bestrijden, het proefdier alsnog laten overlijden, omdat het getransplanteerde immuunsysteem dan onvoldoende gesupprimeerd wordt door het virus, waardoor de afstotingsreactie op zal treden.The invention relates to a method in which a foreign immune system is transplanted into a small animal, which consequently dies of Graft versus Host Disease within 2 weeks, unless an immunosuppressive virus is also administered. Graft-versus-Host disease arises as a result of a rejection reaction of the donor immune system against the recipient animal. In this invention, the administered agents that prevent or combat infection with immunosuppressive viruses will still cause the subject to die, because the transplanted immune system is then insufficiently suppressed by the virus, thereby causing the rejection reaction to occur.

De uitvinding behelst een snelle testmethode in (liefst kleine) proefdieren van antivirale middelen, die gericht zijn tegen immuunsuppresserende virussen. Zowel middelen die de verspreiding van het virus in het lichaam blokkeren (zoals soluble CD4 en vaccins/antilichamen) als middelen die het virus inactiveren (zoals farmaceutica en anti-sense constructen) kunnen worden getest. Omdat kleine proefdieren gebruikt worden en de behandelingsduur kort is, is er weinig van de te testen stof nodig. Bovendien is de methode daardoor bruikbaar voor het onderzoeken van grotere aantallen middelen.The invention comprises a rapid test method in (preferably small) experimental animals of antiviral agents, which are directed against immunosuppressive viruses. Both agents that block the spread of the virus in the body (such as soluble CD4 and vaccines / antibodies) and agents that inactivate the virus (such as pharmaceuticals and anti-sense constructs) can be tested. Because small animals are used and the treatment time is short, little of the test substance is needed. In addition, the method is therefore useful for investigating larger numbers of agents.

Lymfocyten van de mens kunnen gemakkelijk in grote hoeveelheden van een bloedbank worden verkregen. De werkwijze is in principe ethisch te verantwoorden, omdat de bloedcellen, in tegenstelling tot de andere componenten van het donorbloed, in de geneeskunde niet worden toegepast (wegens gevaar voor Graft-versus-Host disease of wegens het veroorzaken van een ongewenste immunisatie).Human lymphocytes can be easily obtained in large amounts from a blood bank. In principle, the method can be justified ethically, because the blood cells, unlike the other components of the donated blood, are not used in medicine (due to the risk of Graft-versus-Host disease or because of an undesired immunization).

De dierproef volgens de uitvinding geschiedt volgens een eenvoudig uit te voeren procedure, dit in tegenstelling tot de bestaande alternatieven. Ook wordt een geactiveerd immuunsysteem bestudeerd, hetgeen meer werkelijkheidsgetrouw is dan de bestaande alternatieven. Bovendien is het nog niet mogelijk in kwaliteit vergelijkbare resultaten te verkijgen, zonder gebruik te maken van een dierproef.The animal test according to the invention is carried out according to an easy to carry out procedure, in contrast to the existing alternatives. An activated immune system is also being studied, which is more realistic than the existing alternatives. Moreover, it is not yet possible to obtain comparable quality results without using an animal test.

De uitvinding verschaft een werkwijze voor het testen van antivirale middelen die tegen een immuunsuppresserend virus gericht zijn, waarbij men het effect vaststelt dat het te testen middel heeft op proefdieren, welke getransplanteerd zijn met cellen van een donor-immuunsysteem die door het immuunsuppresserende virus kunnen worden geïnfecteerd en met het immuunsuppresserende virus zijn geïnfecteerd, welke werkwijze gekenmerkt wordt doordat men proefdieren gebruikt met een zodanig verstoord immuunsysteem dat ze na transplantatie met cellen van een donor-immuunsysteem een fatale graft-versus-host reactie kunnen ontwikkelen, en men deze proefdieren met een zodanig grote dosis cellen van het donor-immuunsysteem transplanteert dat de fatale graft-versus-host reactie optreedt behalve in die proefdieren die tevens met het immuunsuppresserende virus worden geïnfecteerd.The invention provides a method for testing anti-viral agents directed against an immunosuppressive virus, wherein the effect of the agent under test has been established on test animals transplanted with cells of a donor immune system capable of being immunized by the immunosuppressive virus infected and infected with the immunosuppressive virus, which method is characterized by using laboratory animals with an impaired immune system such that they can develop a fatal graft-versus-host reaction after transplantation with cells of a donor immune system, and these animals are transplant a large dose of cells from the donor immune system such that the fatal graft versus host response occurs except in those test animals which are also infected with the immunosuppressive virus.

Het heeft volgens de uitvinding de voorkeur dat men kleine proefdieren, zoals muizen, ratten, hamsters, cavias en konijnen gebruikt, en meer in het bijzonder dat men muizen met een SCID of een XID mutatie, of normale muizen met een leeftijd van 2-6 weken toepast.It is preferred according to the invention to use small test animals, such as mice, rats, hamsters, guinea pigs and rabbits, and more particularly, to use mice with an SCID or an XID mutation, or normal mice aged 2-6 weeks.

Het heeft verder de voorkeur dat men de proefdieren behandelt met middelen, zoals gamma-, röntgen- of neutronenstraling, cytostatica of antilichamen tegen lymfocyten, welke middelen het immuunsysteem van het proefdier verstoren. Een zeer geschikte methode is bijvoorbeeld bij muizen dat men de proefdieren behandelt met ca. 9 Gy gamma straling.It is further preferred that the animals are treated with agents such as gamma, X-ray or neutron radiation, cytostatics or antibodies against lymphocytes, which disrupt the immune system of the animal. A very suitable method is, for example, in mice that the test animals are treated with approximately 9 Gy gamma radiation.

Het heeft verder de voorkeur dat men de proefdieren met soorteigen beenmergcellen transplanteert. Hierdoor kan men een ernstige achteruitgang van de conditie van de proefdieren tegengaan. Daarbij heeft het bij bijvoorbeeld muizen de voorkeur dat men ten minste 105, liefst ten minste 106 soorteigen beenmergcellen toedient.It is further preferred that the test animals are transplanted with species-specific bone marrow cells. This can prevent a serious deterioration in the condition of the test animals. In addition, in mice, for example, it is preferred to administer at least 105, most preferably at least 106 species of bone marrow cells.

Verder heeft het de voorkeur dat men humane lymfocyten als de cellen van een donor immuunsysteem toedient. Het heeft voorts de voorkeur dat men bij bijvoorbeeld muizen de cellen van een donor immuunsysteem toedient in een hoeveelheid van ten minste 107, liefst ten minste 108 cellen per proefdier.It is further preferred that human lymphocytes be administered as the cells of a donor immune system. It is further preferred that, for example, mice are administered the cells of a donor immune system in an amount of at least 107, most preferably at least 108 cells per animal.

Verder heeft het de voorkeur dat men HIV als het immuunsuppresserende virus toedient.It is further preferred to administer HIV as the immunosuppressive virus.

De uitvinding verschaft verder proefdieren, welke getransplanteerd zijn met cellen van een donor-immuunsysteem die door een immuunsuppresserend virus kunnen worden geïnfecteerd en met het immuunsuppresserende virus zijn geïnfecteerd, gekenmerkt doordat de proefdieren een zodanig verstoord immuunsysteem hebben dat ze na transplantatie met cellen van een donor-immuunsysteem een fatale graft-versus-host reactie kunnen ontwikkelen en met een zodanig grote dosis cellen van het donor-immuunsysteem zijn getransplanteerd dat de fatale graft-versus-host reactie had kunnen optreden als de proefdieren niet tevens met het immuunsuppresserende virus waren geïnfecteerd.The invention further provides experimental animals transplanted with cells of a donor immune system that can be infected by an immunosuppressive virus and infected with the immunosuppressive virus, characterized in that the test animals have an impaired immune system such that after transplantation with cells of a donor immune system may develop a fatal graft versus host response and have been transplanted with such a large dose of cells from the donor immune system that the fatal graft versus host response could have occurred if the test animals had not also been infected with the immunosuppressive virus.

Er wordt volgens de uitvinding gebruik gemaakt van kleine proefdieren (1), lymfocyten (2) en immuunsuppressieve virussen (3).Small animals (1), lymphocytes (2) and immunosuppressive viruses (3) are used according to the invention.

1. De test wordt momenteel bij voorkeur uitgevoerd met laboratorium muizen. Diverse muizenstammen kunnen voor de test volgens de uitvinding worden gebruikt. Er kunnen zelfs normale muizen gebruikt worden, mits van zeer jonge leeftijd, omdat pasgeboren muizen een nog onrijp immuunsysteem hebben, dat nog geen antilichamen maakt tegen soortvreemde lymfocyten. In plaats van normale muizen kunnen echter ook de bekende SCID of XID ("X-linked Immune Deficient”) immuun-deficiënte muizen gebruikt worden. Kruisingen van deze laatstgenoemde muizen met andere immuun-deficiënte muizen kunnen eveneens voor dit doel gebruikt worden. Bij voorkeur worden muizen met de XID mutatie gebruikt, behorende tot de CBA/N muizenstam.1. The assay is currently preferably performed on laboratory mice. Various strains of mice can be used for the test according to the invention. Normal mice can even be used, provided they are very young, because newborn mice have an immature immune system that does not yet make antibodies against foreign lymphocytes. However, instead of normal mice, the known SCID or XID ("X-linked Immune Deficient") immune deficient mice can also be used. Crosses of the latter mice with other immune deficient mice can also be used for this purpose. Preferably mice with the XID mutation belonging to the CBA / N mouse strain are used.

2. Lymfocyten kunnen worden geïsoleerd uit het bloed, de milt, het beenmerg, de zwezerik en de lymfklieren van het te onderzoeken proefdier (rhesusaap, kat, rund, muis, e.d.) of van de mens. De lymfocyten kunnen in een kweekflesje vermenigvuldigd worden of in een buisje tijdelijk bewaard worden (door de cellen in te vriezen en op te slaan bij extreem lage temperaturen). De test wordt zoals gezegd bij voorkeur uitgevoerd met menselijke lymfocyten.2. Lymphocytes can be isolated from the blood, spleen, bone marrow, thymus and lymph nodes of the test animal (rhesus monkey, cat, bovine, mouse, etc.) or from humans. The lymphocytes can be multiplied in a culture bottle or temporarily stored in a tube (by freezing the cells and storing them at extremely low temperatures). As mentioned, the test is preferably performed with human lymphocytes.

3. Het immuunsuppressieve virus kan geïntroduceerd worden als kweekvloeistof, waarin het virus is uitgescheiden door een virus producerende cellijn, of door middel van geïnfecteerde cellen. Het onderzoek vindt bij voorkeur plaats met HIV. Omdat FIV en BIV niet infectieus zijn voor de mens zijn er situaties denkbaar, waarbij het werken daarmee een voordeel is. Van SIV is tot dusverre niet aangetoond dat het infectieus is voor de mens. Ook zou men MLV kunnen gebruiken.3. The immunosuppressive virus can be introduced as a culture fluid, into which the virus has been secreted by a virus-producing cell line, or by means of infected cells. The research preferably takes place with HIV. Because FIV and BIV are not infectious to humans, situations are conceivable where working is an advantage. SIV has so far not been shown to be infectious to humans. One could also use MLV.

De werkwijze volgens de uitvinding omvat bij voorkeur een behandeling van de kleine proefdieren met een hoge dosis totale lichaamsbestraling (röntgen-, neutronen- of liefst gammastraling) en/of met hoge doseringen cytostatica (bijv. endoxan) of antilichamen tegen lymfocyten, zoals ATG (anti-thymocyten globuline), teneinde de eigen afweer te onderdrukken en binnen de organen ruimte te maken voor het transplantaat.The method according to the invention preferably comprises treatment of the small test animals with a high dose of total body irradiation (X-ray, neutron or preferably gamma radiation) and / or with high doses of cytostatics (e.g. endoxan) or antibodies against lymphocytes, such as ATG ( anti-thymocyte globulin), in order to suppress the body's own defenses and make room for the graft within the organs.

Ter ondersteuning van hun conditie ontvangen de proefdieren bij voorkeur een transplantatie van hun type beenmerg. Verder worden de te infecteren lymfocyten toegediend. Van deze lymfocyten wordt een eerder bepaalde hoeveelheid gegeven die in controle experimenten heeft geresulteerd in Graft-versus-Host Disease. Aansluitend wordt het immuunsuppressieve virus toegediend.To support their condition, the test animals preferably receive a transplant of their type of bone marrow. The lymphocytes to be infected are also administered. A previously determined amount of these lymphocytes is given, which has resulted in control experiments in Graft versus Host Disease. The immunosuppressive virus is then administered.

De uitvinding wordt aan de hand van een voorbeeld en bijbehorende figuur nader toegelicht. De figuur 1 laat in de vorm van een grafiek het effect zien van een infectie met HIV (de HTLV-IIIb stam) op het ontstaan van de graft-versus-host ziekte bij CBA/N-muizen. In deze grafiek is het aantal nog levende muizen uitgezet tegen het aantal dagen dat na de transplantatie met humane lymfocyten en de injectie met HIV was verstreken.The invention is explained in more detail with reference to an example and an accompanying figure. Figure 1 graphically shows the effect of HIV infection (the HTLV-IIIb strain) on the onset of graft versus host disease in CBA / N mice. This graph plots the number of mice still alive versus the number of days that passed after human lymphocyte transplantation and HIV injection.

Er werden in het onderstaand als voorbeeld beschreven experiment muizen met de XID-mutatie gebruikt, behorende tot de CBA/N muizenstam die een gebrekkige antistof productie heeft tegen sommige lichaamsvreemde stoffen, waaronder menselijke bloedcellen. Deze muizen werden met een dosis van 9 Gy gamma straling behandeld om het eigen immuunsysteem te vernietigen. Dit kon pas vanaf de eenentwintigste dag na de geboorte. Uitstel van deze behandeling is niet gewenst, omdat er naarmate de muis ouder en dus groter wordt, meer immuun-cellen van de mens nodig zijn om de Graft-versus-Host ziekte op te wekken. Bij de genoemde hoge bestralingsdosis hadden de muizen een ondersteunende beenmergtransplantatie nodig.In the experiment described below, mice with the XID mutation belonging to the CBA / N mouse strain which has deficient antibody production against some foreign substances, including human blood cells, were used. These mice were treated with a dose of 9 Gy gamma radiation to destroy their own immune system. This was only possible from the twenty-first day after birth. Postponement of this treatment is not desirable because as the mouse grows older and thus larger, more human immune cells are needed to induce Graft versus Host disease. At the said high radiation dose, the mice required a supportive bone marrow transplant.

Daartoe kregen de muizen 500.000 soorteigen beenmergcellen toegediend in een ader. Uit eerdere experimenten bleek, dat 200 miljoen van de menselijke bloedcellen in de buikholte van een bestraalde CBA/N muis moesten worden gespoten om deze de Graft-versus-Host ziekte te laten krijgen. In het beschreven experiment werd de^HIV-laboratorium stam HTLV III-B gebruikt. Het HIV zat in de weefselkweekvloeistof van de HTLV Ill-B producerende H9 cellijn (zie schema).To this end, the mice were given 500,000 species-specific bone marrow cells in a vein. Previous experiments showed that 200 million of the human blood cells had to be injected into the abdominal cavity of an irradiated CBA / N mouse in order for it to develop Graft-versus-Host disease. In the described experiment, the HIV laboratory strain HTLV III-B was used. The HIV was in the tissue culture fluid of the HTLV Ill-B producing H9 cell line (see diagram).

In het experiment werden tweeëndertig CBA/N muizen op dag eenentwintig na de geboorte gespeend en aansluitend met 9 Gy gamma bestraald op een Cesium 137 bron met een doserings-snelheid van 0.87 Gy per minuut. Acht muizen dienden als controle op de bestraling, ze kregen geen verdere behandeling en overleden aan de gevolgen van de bestraling rond dag 12 na de behandeling. De overige muizen kregen een ondersteunende beenmergtransplantatie vier uur na de bestraling. Acht dienden als controle op deze transplantatie en waren na een maand observatie nog in leven. De overige zestien muizen kregen vijf uur na de bestraling 200 miljoen humane PBL in de buikholte gespoten. Zes uur na de bestraling kregen acht muizen 0.25 ml steriele kweekvloeistof in de buikholte toegediend (zie schema). De overige acht muizen kregen 0.25 ml HIV III-B kweekvloeistof eveneens in de buikholte toegediend. Dit volume bevat ongeveer 25 duizend infectieuze Units. Van de muizen die het supernatant met het HIV III-B ingespoten kregen, waren er twee na een maand nog in leven en de overigen leefden steeds twee of drie dagen langer dan de muizen die het virus niet ingespoten kregen (zie figuur 1). Het verschil in overleving was significant.In the experiment, thirty-two CBA / N mice were weaned on day twenty-one after birth and subsequently irradiated with 9 Gy gamma to a Cesium 137 source at a dose rate of 0.87 Gy per minute. Eight mice served as a control on radiation, they received no further treatment and died from the effects of radiation around day 12 after treatment. The remaining mice received a supportive bone marrow transplant four hours after irradiation. Eight served as controls on this transplant and were still alive after one month of observation. The remaining sixteen mice were injected 200 million human PBL into the abdominal cavity five hours after the irradiation. Six hours after the irradiation, eight mice received 0.25 ml sterile culture fluid in the abdominal cavity (see diagram). The remaining eight mice also received 0.25 ml HIV III-B culture fluid in the abdominal cavity. This volume contains approximately 25 thousand infectious units. Of the mice injected with the HIV III-B supernatant, two were still alive after one month and the others lived two or three days longer than the mice that were not injected with the virus (see Figure 1). The difference in survival was significant.

De in Nederland veel voorkomende HIV-stam MN is, naar wordt aangenomen, virulenter (kwaadaardiger) dan de HTLV III-B laboratoriumstam. Naar deze MN stam gaat de voorkeur uit bij de verdere experimenten. Verondersteld wordt, dat er dan een verschil van alles (overleven) of niets (overlijden) tussen de twee groepen zal ontstaan.The HIV strain MN, which is common in the Netherlands, is believed to be more virulent (more malignant) than the HTLV III-B laboratory strain. This MN strain is preferred in the further experiments. It is assumed that there will then be a difference of everything (survival) or nothing (death) between the two groups.

Schematische voorstelling van het transplantatie-protocol voor CBA/N muizen, betrokken bii de HlV-studieSchematic of the transplantation protocol for CBA / N mice involved in the HlV study

Claims

A method for testing anti-viral agents against an immunosuppressive virus, determining the effect of the agent under test on test animals transplanted with cells of a donor immune system that can be infected by the immunosuppressive virus and have been infected with the immunosuppressive virus, characterized in that laboratory animals are used with an impaired immune system such that they can develop a fatal graft-versus-host reaction after transplantation with cells of a donor immune system, and these animals are developed with such a large dose of cells from the donor immune system transplant that causes the fatal graft versus host response to occur, except in those experimental animals which are also infected with the immunosuppressive virus.

Method according to claim 1, characterized in that small test animals, such as mice, rats, hamsters, guinea pigs and rabbits are used.

Method according to claim 2, characterized in that mice with a SCID or an XID mutation, or normal mice with an age of 2-6 weeks are used.

Method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the test animals are treated with agents, such as gamma, X-ray or neutron radiation, cytostatics or antibodies against lymphocytes, which agents disrupt the immune system of the animal.

Method according to claim 4, characterized in that the test animals are treated with about 9 Gy gamma radiation.

The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the test animals are transplanted with bone marrow cells of the specific species.

Method according to claim 6, characterized in that at least 105, preferably at least 106, type of bone marrow cells are administered.

A method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that human lymphocytes are administered as the cells of a donor immune system.

Method according to any one of claims 1-8, characterized in that the cells of a donor immune system are administered in an amount of at least 107, preferably at least 108 cells per animal.

Method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that HIV is administered as the immunosuppressive virus.

11. Laboratory animals which have been transplanted with cells of a donor immune system which can be infected by an immunosuppressive virus and which have been infected with the immunosuppressive virus, characterized in that the experimental animals have an impaired immune system such that after transplantation with cells of a donor immune system may develop a fatal graft versus host reaction and have been transplanted with such a large dose of cells from the donor immune system that the fatal graft versus host reaction could have occurred if the test animals had not also been infected with the immunosuppressive virus .

Laboratory animals according to claim 11, characterized in that they are small laboratory animals, such as mice, rats, hamsters, guinea pigs and rabbits.

Experimental animals according to claim 12, characterized in that it uses mice with an SCID or an XID mutation, or normal mice of 2-6 weeks of age.

Test animals according to any one of claims 11 to 13, characterized in that the test animals have been treated with agents such as gamma, X-ray or neutron radiation, cytostatics or antibodies against lymphocytes, which agents interfere with the immune system of the animal.

Test animals according to claim 14, characterized in that the test animals are treated with approximately 9 Gy gamma radiation.

Experimental animals according to any one of claims 11-15, characterized in that the experimental animals have been transplanted with bone marrow-type cells.

Test animals according to claim 16, characterized in that at least 105, preferably at least 106, species-specific bone marrow cells have been administered.

Laboratory animals according to any one of claims 11-17, characterized in that human lymphocytes have been administered as the cells of a donor immune system.

Experimental animals according to any one of claims 11-18, characterized in that the cells of a donor immune system have been administered in an amount of at least 107, most preferably at least 10 cells per experimental animal.

Experimental animals according to any one of claims 11-19, characterized in that HIV is administered as the immunosuppressive virus.